Zebrafish embryos and Larvae : a new generation of disease model and drug screens
Ali, S.
Citation
Ali, S. (2011, December 7). Zebrafish embryos and Larvae : a new generation of disease model and drug screens. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/18191
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/18191
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
177
Samenvatting van thesis
De zebravis (Danio rerio) is een klein en makkelijk te houden vis die zich snel ontwikkeld en een hoge vruchtbaarheid heeft. De embryo’s zijn in de vroege stadia doorzichtig, waardoor het relatief makkelijk is om data van genexpressie patronen te verzamelen te verzamelen door middel van foto’s van hoge-kwaliteit. De jaarlijke kosten voor het onderhouden van volwassen zebravissen zijn iets lager dan die voor het onderhouden van knaagdieren. Maar, het grote voordeel is dat vrouwtjes zebravissen tot ongeveer 10.000 eitjes per jaar kunnen leggen. Om deze, en andere redenen, worden zebravis embryo’s steeds vaker gebruikt als in vitro modelsystemen die het gat kunnen opvullen tussen simpele assay’s (gebaseerd op cellen of celculturen) aan de ene kant, en het gebruik van knaagdieren aan de andere. Binnen het bio- medisch onderzoek was men op zoek naar een lage-kosten, high-throughput, dierlijk (whole – animals) modelsysteem en het zebravis embryo is zeer geschikt om deze plek op te vullen. In vitro assay’s zijn goedkoop, minder vatbaar voor ethische beperkingen, en kunnen opgeschaald worden naar high-throughput. Maar, bij whole-animal assay’s kunnen de resultaten makkelijker geëxtrapoleerd worden naar mensen, en ze laten het onderzoeken van complexe organismale functies toe (bijv. gedrag en ontwikkeling). In deze thesis bepleiten wij dat zebravis embryo’s en jonge larven gebruikt kunnen worden als waardevol onderzoeksmiddel in de pre-klinische fase van medicijnontwikkeling en medicijnveiligheid in mensen, en daarom zijn er zebravis ziekte modellen ontwikkeld. Ze kunnen gebruikt worden als een soort zeef om het aantal stoffen te reduceren dat uiteindelijk getest wordt in de veel duurdere knaagdier modellen.
Wij hebben vastgesteld dat onze methode van acute, en stadium-specifieke blootstelling van
embryo’s aan ethanol gebruikt kan worden om stadium-specifieke en stadium-inspecifieke
effecten te onderzoeken en de vatbare periode in de ontwikkeling weergeeft. De effecten
178 imiteren sleutelsymptomen van het foetus alcohol syndroom (FAS) zoals craniofaciale afwijking, microphthalmia, vetraging in groei en gedragsbeschadiging. We hebben ook een kritiek
tijdsbestek geïdentificeerd (prim-6 en prim-16) voor ethanol sensitiviteit, en we impliceren cel dood in de post-migrerende craniale neurale crest als mogelijk mechanisme. Dit staat in contrast tot wat andere studies vonden, zij impliceren de migrerende crest. Alsook, onze ontdekking van een brede phenotypisch spectrum doet denken aan het menselijk FAS, en dit kan een bruikbaar model zijn voor het onderzoeken van deze ziekte. In de toekomst kan onze grootschalige aanpak ook worden gebruikt om kandidaat genen te identificeren die bescherming bieden tegen
ethanol effecten in de minderheid van individuen die hier mindere vatbaarheid tegen tonen.
Een lab-on-chip voor zebravis embryo’s is door ons ontwikkeld en gemaakt door Micronit Microfluidics. We hebben micro particle imaging velocimetry gebruikt om de patronen van de stromingen van de vloeistoffen en buffers in de chip te bepalen. We hebben ook thermal
imaging gebruikt om de stabiliteit van de temperaturen door de gehele chip te bepalen wanneer die in gebruik is. Phenotypische teratologie screening is gebruikt om te testen of de embryo’s zich normaal ontwikkelde in de biochip. We hebben een acute ethanol test uitgevoerd om te bepalen of de zich ontwikkelende embryo’s in de chip gebruikt kunnen worden om medicijn of chemische assay’s uit te voeren die traditioneel werden uitgevoerd in 96-wells embryo culturen.
De mogelijkheid tot het groeien van embryo’s in een lab-on-chip is de heilige graal van de next- generation microfluidics, omdat huidige technieken – petrischaaltjes en microtiter platen – ontwikkeld waren voor celculturen en niet voor de in vivo cultuur van embryo’s. Onze
ontdekking van de op microfluidics gebaseerde embryo cultuur kan het menselijk IVF, medicijn
ontwikkeling en biomedisch onderzoek revolutionaliseren, en kan het gebruik van muizen en
ratten in veel onderzoeksgebieden laten vervangen door het gebruik van zebravis embryo’s. We
laten voor de eerste keer zien dat een dierlijk embryo kan groeien in een glazen microfluidic
179 flow-through omgeving. De zebravis embryo’s die in de biochip groeiden hadden alleen last van kleine phenotypische effecten – zoals het mogelijke stress-phenotype van verspreide
melanocyten. Er waren niet méér bovenmatige misvormingen. Het feit dat wij voorgenoemde als ‘kleine phenotypische effecten’ scoren is natuurlijk subjectief, en er is geen garantie dat er geen significante maar ondetecteerbare effecten waren. Wij vonden een sterk, niet-lineair verband tussen buffer flow-rate en de overleving van 5 dagen oude embryo’s in de chip. De meest gunstige flow-rate was in de range van 2.0-4.0 µl/well/min. De overlevingspercentages bereikten 100% in twee chip runs bij 2.0 µl/well/min. Deze resultaten kunnen naar een nieuwe generatie assay’s leiden voor de farmaceutische industrie, gebaseerd op lage-kosten,
microfluidics culturen van zebravis embyro’s. We onderzochten de LC
50
van 60 stoffen
behorende tot een range aan verschillende chemische klassen en toxicologische mechanismen, en vergelijken deze statistisch met gepubliceerde LD
50(log mmol/kg) van knaagdieren. We vonden dat de data sets sterk gecorreleerd zijn (met de Kendall’s rank correlatie tau en Pearson’s product-moment correlatie). De helling voor de regressielijn van de volledige set stoffen was 0.73403. Maar we vonden ook dat de helling sterk beïnvloedt wordt door de klasse van stoffen. Dus, waar de meeste stoffen een vergelijkbare toxiciteit hebben in beide soorten, zijn sommige stoffen aanzienlijk meer toxisch in zebravissen dan in knaagdieren, en vice versa.
Ons onderzoek laat zien dat het zebravis embryo een moddel is dat grote potentie biedt in de evaluatie van medicijnveiligheid. Maar, we laten ook zien dat de voorspelbaarheid van medicijnveiligheid varieert tussen de verschillende klassen van stoffen die we bestudeerd hebben. Deze resultaten zijn nuttig bij het gebruik van zebravissen in een mogelijk voorspelbaarheids-model voor toxiciteit screening en testing.
Wij laten zien dat het zebravis embryo/larve gebruikt kan worden in de high-throughput gedrags
screening van verschillende stoffen. We hebben 60 water-oplosbare toxische stoffen getest,
180 behorende tot algemene medicijnen, toxins en chemicaliën, en bestaande uit verscheidene farmacologische mechanismen. We gebruiken hierbij de visuele motor response test, waarbij de beweging van individuele larven wordt geanalyseerd door een geautomatiseerd video-tracking systeem. We vinden voor alle stoffen, dat de LC
50
daalt naar mate de embryo’s zich
ontwikelden. De meerderheid van de stoffen (57/60) produceeren een effect in zowel de basal als de challenge phases. Deze effecten zijn (i) onderdrukking van locomotor activiteit
(monotonic concentratie-response); of (ii) stimulering gevolgd door onderdrukking (biphasic response); (iii) stimulering (monotonic response). We concluderen dat de gedrags assay’s van zebravis embryo’s nuttig kunnen zijn voor de farmaceutische doeltreffendheid en toxiciteit screening. De precieze readout die voort komt uit de gedrags assay varieert tussen de
verschillende klassen van stoffen. Onze vondsten laten zien dat gedrags opnames van zebravis embryo’s een gevoelige evaluatie kunnen bieden van de toxiciteit van verschillende stoffen. Het is ook mogelijk dat dit type assay gebruikt kan worden voor het onderzoeken van mogelijke therapeutische effecten (het bekijken van medicijn doeltreffendheid). Dus het kan, in principe, ook helpen in de ontdekking van nieuwe medicijnen voor menselijke ziektes. Deze methode is complementair aan traditionele toxiciteit assay’s en vormen een verbetering van de traditionele eindpunt methode dat afhangt van mortaliteit tijdens een specifiek stadium. Het toevoegen van een aanpak gebaseerd op de fysiologie van het embryo verhoogt de gevoeligheid van onze assay’s, doordat het potentiële neurotoxiciteit ontdekt bij doseringen die niet konden worden ontdekt tijdens traditionele LC
50
