Drying Made Easy
Kanojia, Gaurav
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2018
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Kanojia, G. (2018). Drying Made Easy: Spray drying a promising technology for the production of stable vaccine and therapeutic protein formulations. University of Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Appendix
Nederlandse samenvatting
List of Publications
Curriculum vitae
Acknowledgements
Nederlandse samenvatting
De ontdekking van vaccins behoort tot een van de belangrijkste ontwikkelingen in de reduc-tie van infecreduc-tieziekten en de gevolgen ervan. Al in de 18e eeuw werden vaccins toegepast om mensen te beschermen tegen het pokkenvirus, dat in die tijd verantwoordelijk was voor een hoog sterftecijfer. Tegenwoordig hebben veel landen actieve vaccinatieprogramma’s die de bevolking beschermen tegen pathogenen die in het verleden veel ziekte en sterfte vero-orzaakten, waaronder difterie, kinkhoest, tetanus en polio (DKTP). Tegenwoordig worden hoge eisen gesteld aan de vaccins ten aanzien van productie, transport en opslag. In elk onderdeel van deze keten is het essentieel dat de actieve componenten in het vaccin (anti-genen, vaak eiwitten) hun werkzaamheid behouden in termen van immunogeniciteit. Mod-erne vaccins worden daarom onder strikte condities geproduceerd en veelal onder gekoelde condities vervoerd en opgeslagen (de zogenaamde koude-keten of cold chain). Het is een buitengewoon grote uitdaging om vaccins en de eiwitten in een stabiele vorm te behouden buiten deze cold chain. Toch wordt steeds meer aandacht besteed aan het kunnen omzeilen van deze cold chain, omdat deze kostenverhogend werkt in de vaccinketen en bovendien op praktische problemen stuit in met name de ontwikkelingslanden. Het onderzoek dat dit faciliteert, richt zich op het stabiliseren van de vaccins en de actieve componenten zodat deze buiten deze cold chain werkzaam blijven. Een veelbelovende techniek is het drogen van het vaccinproduct middels sproeidrogen. Toepassing van deze techniek resulteert in een droog, poedervormig vaccinproduct met een grote thermostabiliteit. Het is bekend dat eiwitten die zich in een oplossing bevinden, vaak een hoge mate van (thermische) instabiliteit vertonen. Een gedroogd vaccinproduct zal derhalve makkelijker buiten de cold chain kunnen worden gehouden dan een vloeibaar product. Bovendien geeft de sproeidroogtechniek de mogeli-jkheid om de fysische eigenschappen van het gedroogde poeder te beïnvloeden, waarmee toepassing via alternatieve toedieningsvormen (anders dan via injectie, b.v. door inhalatie) kan worden bewerkstelligd.
Dit proefschrift beschrijft het onderzoek naar de toepassing van de sproeidroogtechniek op verschillende biofarmaceutische producten, waaronder drie vaccins en een antilichaam. Sys-tematische variaties in proces parameters en samenstelling (formulering) van de onderzochte producten zijn gekoppeld aan de werkzaamheid van deze gedroogde producten in vitro en in vivo.
Hoofdstuk 2 geeft een uitgebreid overzicht van de recente ontwikkelingen van alle techniek-en techniek-en toepassingtechniek-en die in dit proefschrift aan bod komtechniek-en. Uiteraard betreft dit de verschil-lende aspecten van het sproeidrogen, met een beschrijving van het proces zelf en de invloed die procesparameters kunnen hebben op de kwaliteit van het gedroogde product. Daarnaast wordt een overzicht gegeven van het formuleren van vaccins. Dit formuleren is een essentiële stap in de vaccinproductie om de stabiliteit en werkzaamheid van het uiteindelijke product te verbeteren door toevoeging van verschillende hulpstoffen (waaronder suikers,
oppervlak-actieve stoffen, eiwitten, zouten). Alternatieve toedieningsvormen van vaccins staan te-genwoordig ook in de belangstelling. Historisch gezien worden de meeste vaccins toegedi-end via injectie van een vloeibaar vaccinproduct in de spier (intramusculair) of net onder de huid (subcutaan). Hoewel naaldvrije toedieningsvormen steeds meer ter beschikking komen en de veiligheid van vaccinatie verhogen, kunnen deze alternatieve toedieningsvormen sig-nificante impact op de werkzaamheid van de vaccins hebben. Tot slot beschrijft dit hoofdstuk de toepassing van het zogenaamde Design of Experiment (DoE) concept in de ontwikkeling van een sproeidroogprotocol. In dit concept worden experimenten zodanig opgezet dat de effecten van een groot aantal experimentele variabelen op een te onderzoeken parameter (bijvoorbeeld vaccinstabiliteit of vaccinwerkzaamheid) systematisch wordt vastgesteld, in-clusief de onderlinge interacties van de variabelen. Het concept maakt gebruik van math-ematische modellen welke het mogelijk maken met minder experimenten meer informatie te genereren. Met name deze benadering kan de afhankelijkheid van variabelen inzichtelijk maken. Dit kan tijd en middelen besparen.
In Hoofdstuk 3 is een aantal procesparameters van het sproeidrogen middels DoE system-atisch onderzocht en geoptimaliseerd op basis van de antigeniciteit, die vaak aan werkzaam-heid gekoppeld is en thermostabiliteit van een Influenza vaccin. Het sproeidrogen van dit vaccin resulteerde in een poedervormig product met een vergelijkbare antigeniciteit als de vloeibare variant, met bovendien een thermische stabiliteit van minstens 3 maanden bij 60 °C. Met dit beschrijvend DoE model is aangetoond dat op voorhand procesparameters van het sproeidrogen kunnen worden gekozen die resulteren in een poedervormig vaccinprod-uct met vooraf gedefinieerde eigenschappen. De procesparameters resulteerden in minimale verschillen in antigeniciteit van het vaccin. Als er kon geen model worden gemaakt voor antigeniciteit. Dit was wel mogelijk voor deeltjesgrootte, restvocht en outlet tempratuur. Om de limieten van het proces te onderzoeken stof de antigene bevoegdheden moeten bredere procesparameters moeten worden ondergebracht in vervolg onderzoek. Bovendien zal ook gekeken moeten worden naar de consistentie in eiwitstructuur (de hoeveelheid functioneel hemagglutinine) en de integriteit van het gedroogde product als resultaat van het sproe-idroogproces. Concluderend kan worden gesteld dat de hier beschreven toepassing van de DoE-strategie, voor het systematisch optimaliseren van het sproeidroogproces in combinatie met het formuleren van een vaccin, algemeen kan worden ingezet voor het sproeidrogen van vaccinproducten. Uiteraard zal het DoE-ontwerp aangepast moeten worden aan de vooraf gedefinieerde specificaties waar een vaccin aan moet voldoen.
Hoofdstuk 4 behandelt de toepassing van de sproeidroogtechniek op het zogenaamde Sa-bin-geïnactiveerde poliovaccin (sIPV). Het poliovirus kan de grijze stof in het ruggenmerg infecteren, wat uiteindelijk kan leiden tot poliomyelitis (kinderverlamming). Het poliovirus komt in 3 serotypes voor en het vaccin wordt daarom ook tot een trivalent vaccin gecombi-neerd. Sinds de jaren ’50 wordt er al actief gevaccineerd tegen polio, waarbij in toenemende
mate het verzwakte levende, door Sabin ontwikkelde vaccin wordt vervangen door een geïn-activeerd product middels een door Jonas Salk ontwikkelde methode. Het onderzoek dat in dit hoofdstuk beschreven staat, laat zien dat de verkregen stabiliteit van elk van de serotypes van het virus na sproeidrogen onderling sterk verschilt. De optimale procesparameters van het sproeidrogen zijn afhankelijk van het serotype. Ook is in dit onderzoek een DoE-strate-gie gebruikt om per serotype de optimale formuleringscondities vast te stellen op basis van antigeniciteit. Bij de polio serotypes 1 en 2 blijft na sproeidrogen de antigeniciteit volledig behouden, Polio serotype 3, daarentegen, blijkt problemen op te leveren bij het sproeidro-gen, wat zichtbaar wordt in een gereduceerde antigeniciteit (56% direct na sproeidrogen) en een verdere afname na opslag van het gedurende een week bij 40 °C. Nader onderzoek is noodzakelijk om de oorzaken te achterhalen die ten grondslag liggen aan deze significante afname van antigeniciteit. Toch laten de resultaten zien dat het goed mogelijk is om een poedervormig, veilig sIPV vaccin te produceren met de sproeidroogtechniek die zeer waar-schijnlijk buiten de cold chain bewaard en gedistribueerd kunnen worden [1, 2].
Hoofdstuk 5 richt zich op de toepassing van de sproeidroogtechniek op een bacterieel vac-cin: Outer Membrane Vesicles (OMVs). Deze OMVs bestaan uit membraanstructuren van de bacterie en bevatten hiermee nagenoeg alle biopolymeren (membraaneiwitten, lipopolysac-chariden) die nodig zijn om een immuunrespons op te wekken. Deze vesicles zijn echter niet in staat om zich verder te vermenigvuldigen, waarmee ze een uitermate geschikte component zijn voor een vaccinproduct. In dit hoofdstuk wordt de sproeidroogtechniek toegepast op een OMV-gebaseerd vaccin tegen Bordetella pertussis (omvPV). B. pertussis is de veroorzaker van kinkhoest. Toevoeging van trehalose is nodig om een stabiel, poedervormig product te krijgen na sproeidrogen, met consistente deeltjesgrootte. Structuuranalyse van de membraa-neiwitten heeft aangetoond, dat de 3-dimensionale vouwing van de eiwitten kan veranderen als gevolg van dit sproeidrogen. Deze zogenaamde tertiaire structuur van een eiwit is vaak essentieel voor het opwekken van de juiste antistoffen. Experimenten met een monoklo-naal antilichaam tegen een Vag8 epitoop laten zien dat de beschikbaarheid van dat epitoop minder geworden na het sproeidrogen van het omvPV. Dit in tegenstelling tot het antigene eiwit Pertactine (Prn), waaruit duidelijk blijkt dat een verandering in de tertiaire structuur na sproeidrogen eiwit-afhankelijk is. Stabiliteitsstudies laten echter zien, dat bij opslag bij 65 °C gedurende 4 weken de antigeniciteit van Vag8 in het droge poedervormig product behouden blijft, in tegenstelling tot die in de vloeibare variant van omvPV. Dierproefexperiment tonen bovendien aan dat een goede immuunrespons wordt geïnduceerd, wanneer het poedervor-mige product na reconstitutie via de luchtwegen wordt toegediend aan muizen (de zogenaam-de pulmonale toediening). Deze resultaten tonen aan dat een door sproeidrogen verkregen poedervormig vaccinproduct buiten deze zogenaamde cold chain opgeslagen kan worden. Vervolgonderzoek is echter noodzakelijk om de werkzaamheid en het gebruik in alternatieve toedieningsvormen ervan te bevestigen uiteindelijk in humane klinische studies [3, 4].
In Hoofdstuk 6 wordt het onderzoek beschreven naar de toepassing van de sproeidroogtech-niek op het monoklonaal antilichaam Infliximab. Dit farmaceutisch product (een zogenaam-de TNFa-blokker) wordt met name gebruikt als therapeutisch midzogenaam-del bij zogenaam-de behanzogenaam-deling van auto-immuunziekten en chronische ontstekingen door de natuurlijke lichaamsafweer te on-derdrukken. Het gevriesdroogde product wordt na reconstitutie via een infuus toegediend aan de patiënt. In de studie die in dit hoofdstuk is beschreven, wordt de stabiliteit vergeleken van het gedroogde product zoals verkregen na het ‘klassieke’ vriesdrogen of na sproeidro-gen. In beide processen moeten polysachariden (dextran en inuline) en sucrose toegevoegd worden om het eiwit te stabiliseren. De resultaten uit dit onderzoek laten zien dat de fysische integriteit en de biologische activiteit van de actieve stof behouden bleven, zelfs na incubatie bij verhoogde temperatuur (60°C gedurende 4 weken). Dit in tegenstelling tot de opgeloste variant waarin het product niet meer actief bleek. De opslag van het gedroogde product bij deze hoge temperatuur leidde wel tot enige chemische reactie van de actieve component. Verwacht wordt dat dit niet op zal treden wanneer het gedroogde product opslagen wordt bij kamertemperatuur (<25°C).
Er zijn inmiddels studies gaande gericht op de toepassing, de werkzaamheid en de veiligheid van het gedroogde Infliximab in tabletvorm, dat oraal kan worden toegediend [5, 6]. De re-sultaten van de sproeidroogtechniek kunnen als basis dienen voor het verder optimaliseren en produceren van bulkhoeveelheden van de actieve component voor de behandeling van patiënten met de ziekte van Crohn.
Slotopmerkingen
Zoals dit promotieonderzoek laat zien, is het formuleren van vaccins en/of therapeutische eiwitten in combinatie met sproeidrogen een complex en tijdrovend proces. Voor wat betreft de procescondities van het sproeidrogen, is het moeilijk om deze op voorhand te voorspellen om tot een optimaal gedroogd product te komen: deze blijken in sterke mate afhankelijk te zijn van het te drogen product. Het slim kiezen van de optimalisatieparameters via een Design of Experiment strategie is essentieel in dit proces. Bovendien zullen met betrekking tot de biologische activiteit en de mogelijkheid tot repliceren van een verzwakt virus dat in een toekomstig vaccinproduct gebruikt zal gaan worden (hoewel niet meegenomen in dit onderzoek), extra eisen gesteld moeten gaan worden in de formulering van gesproeidroogde producten [7-9].
In aanvulling hierop moeten ook de kwaliteitscontroles van de eindproducten goed gekozen worden. Hoewel uit een breed scala aan testen geselecteerd kan worden (met name gericht op het valideren van de fysisch-chemische en immunologische activiteit van de antigenen), is ook hier de keuze sterk afhankelijk van het te onderzoeken eindproduct. Zo zijn de in het in dit proefschrift beschreven controles inderdaad gericht op de specifieke
onderzoeksma-terialen: (i) de antigeniciteit van het Sabin geïnactiveerde poliovirus (sIPV) op basis van de vouwing van de antigene eiwitten, (ii) de hoeveelheid functioneel hemagglutinine in het Whole Inactivated influenza Virus (WIV) op basis van een gerichte hemagglutinatie en (iii) de binding aan TNFα van een gesproeidroogd monoclonale antistof tegen chronische ont-stekingen (Infliximab).
Het sproeidrogen van vaccinproducten kan in sterke mate bijdragen aan de kostenreductie van vaccins en aan het beschikbaar maken van deze farmaceutische producten in moeilijk te bereiken landen/locaties [10]. Immers, vanwege de aangetoonde stabiliteit na sproeidrogen kunnen de producten buiten de zogenaamde cold chain getransporteerd en bewaard worden. Naast deze kostenreductie, heeft de sproeidroogtechniek ook de potentie om vaccinproducten via alternatieve routes toe te dienen, bijvoorbeeld oraal of pulmonaal. Bij het sproeidrogen kan de deeltjesgrootte in het poedervormige product nauwkeurig worden gereguleerd, het-geen essentieel is voor een toediening via de luchtwegen [11]. Deze alternatieve manieren van toediening (oraal of pulmonaal) zouden de gebruikelijke naaldinjecties kunnen vervan-gen en hiermee de veiligheid van de vaccinaties sterk verbeteren.
Ondanks dat een aantal gesproeidroogde vaccinproducten zich in de klinische fase van ontwikkeling bevinden [12], zijn er nog geen vaccins op de markt beschikbaar die met deze droogtechniek zijn verkregen. De farmaceutische industrie, echter, is inmiddels wel bezig om ook deze techniek in de toekomst in hun productieprocessen te implementeren. Een uit-daging hierbij is het goed kunnen doseren van de gedroogde producten in de uiteindelijke flesjes/containers. Zeker bij het opschalen van de productievolumes in het sproeidroogpro-ces, is het valideren van deze doseringsfase uitermate belangrijk, samen met aspecten die betrekking hebben op de bio-veiligheid en de wettelijke regelgeving hieromtrent.
Dit promotieonderzoek heeft duidelijk aangetoond dat het proces van sproeidrogen van ei-witten, antigenen en virussen en het formuleren ervan in stabiele vaccinproducten veel po-tentie heeft. Desalniettemin is nog veel vervolgonderzoek nodig om alle andere stappen in het productieproces die beïnvloed kunnen worden door dit specifieke droogproces aan te passen en te optimaliseren.
1. Kraan, H., et al., Intranasal and sublingual
deliv-ery of inactivated polio vaccine. Vaccine, 2017. 35(20): p. 2647-2653.
2. Verdijk, P., et al., Safety and immunogenicity of a
primary series of Sabin-IPV with and without alu-minum hydroxide in infants. Vaccine, 2014. 32(39):
p. 4938-44.
3. Warfel, J.M., et al., Nonhuman primate model of
pertussis. Infect Immun, 2012. 80(4): p. 1530-6. 4. Hoppentocht, M., et al., Tolerability and
Phar-macokinetic Evaluation of Inhaled Dry Powder Tobramycin Free Base in Non-Cystic Fibrosis Bronchiectasis Patients. PLoS One, 2016. 11(3): p.
e0149768.
5. Maurer, J.M., et al., Development and potential
application of an oral ColoPulse infliximab tablet with colon specific release: A feasibility study. Int J
Pharm, 2016. 505(1-2): p. 175-86.
6. Pizarro, T.T., et al., Mouse models for the study of
Crohn’s disease. Trends Mol Med, 2003. 9(5): p.
218-22.
7. Wong, Y.L., et al., Drying a tuberculosis vaccine
without freezing. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(8): p. 2591-5.
8. Ohtake, S., et al., Heat-stable measles vaccine
produced by spray drying. Vaccine, 2010. 28(5): p.
1275-84.
9. Lovalenti, P.M., et al., Stabilization of Live
Atten-uated Influenza Vaccines by Freeze Drying, Spray Drying, and Foam Drying. Pharm Res, 2016. 10. PATH;, W., Some vaccine costs are hidden below
the surface. Project Optimize - Ideal supply sys-tems for the future. 2012.
11. Kanojia, G., et al., Developments in the formulation
and delivery of spray dried vaccines. Hum Vaccin
Immunother, 2017. 13(10): p. 2364-2378. 12. group, M.a., et al., Safety and immunogenicity of
dry powder measles vaccine administered by in-halation: a randomized controlled Phase I clinical trial. Vaccine, 2014. 32(50): p. 6791-7.
13. Siew, A. Exploring the Use of Aseptic Spray Drying
in the Manufacture of Biopharmaceutical Inject-ables. 2016; Volume 40, Issue 7, pg 24–27.
List of Publications
1) Gaurav Kanojia, Rimko ten Have, Peter C. Soema, Henderik Frijlink, Jean-Pierre Amorij and Gideon Kersten “Developments in the Formulation and De-livery of Spray Dried Vaccines” Human Vaccine and Immunotherapeutics, 2017 Oct; 13(10):2364-2378. (This thesis)
2) Gaurav Kanojia, Geert-Jan Willems, Henderik W. Frijlink, Gideon F.A.
Ker-sten, Peter C. Soema, and Jean-Pierre Amorij “A Design of experiment approach to predict product and process parameters for spray dried influenza vaccine” In-ternational Journal of Pharmaceutics, 2016 Sep; 511(2):1098-1111. (This thesis)
3) Gaurav Kanojia, Rimko ten Have, Arjen Bakker, Koen Wagner, Henderik W.
Frijlink,Gideon F.A. Kersten, Jean-Pierre Amorij “The production of a stable infliximab powder: the evaluation of spray and freeze-drying for production” PloS ONE, 2016 Oct;11(10):e0163109. (This thesis)
4) Senthil Murugappan, Harshad Patil, Gaurav Kanojia, Wouter ter Veer,
Tjar-ko Meijerhof, Henderik W. Frijlink, Anke Huckriede and Wouter L.J. Hinrichs. “ Physical and immunogenic stability of spray freeze dried influenza vaccine powder for pulmonary delivery: comparison of inulin, dextran or a mixture of dextran and trehalose as protectants” European Journal of Pharmaceutics and Bio pharmaceutics , 2013 Nov, 85(3): 716–725.
Curriculum vitae
Gaurav Kanojia was born in New Delhi, India on July 11th 1989. He attended St. Mary’s School in Delhi. In 2007, he started his education at the University of Delhi attaining his bachelor degree in pharmaceutical sciences in 2011. In the same year he moved to Neth-erlands to pursue research master’s (Medical Pharmaceutical Drug Innovation) program in Groningen and received the prestigious Top Masters scholarship to pursue the same. During his studies, Gaurav conducted his Master’s research at the Department of Pharmaceutical Technology and Biopharmacy under the supervision of dr. Wouter Hinrichs, prof.dr. Erik Frijlink and prof.dr. Anke Huckreide. He further worked at the lab of Allergy and Lung Dis-eases at UMCG Groningen under the supervision of prof.dr. Antoon van Oosterhout. After graduating in 2013, he started his PhD at Institute for Translational Vaccinology (Intravacc) Bilthoven and University of Groningen. His research focussed on stabilizing viral and bac-terial vaccines by formulating them using spray drying, under the supervision of prof.dr. Erik Frijlink, prof. dr. Gideon Kersten and dr. Jean-Pierre Amorij. His research has thus far resulted in 3 published journal articles. Next to his research, Gaurav was a board member (treasurer) of the PhD student council (Proneri) of the National Institute of Public Health and Environment. In his spare time, Gaurav worked as an education volunteer for a NGO, Taal Doet Meer in Utrecht.
Acknowledgements
The last 4 years of PhD has been a journey. Becoming a researcher, learning a new language, adapting to a new work environment. If I look back, the path would not be the same without the people that were fellow co-travelers. I would like to thank each one of them and express my happiness for the connection we made during this time.
First and foremost, I would like to express my gratitude to my co-promotor and promotores, Jean-Pierre Amorij, Gideon Kersten and Erik Frijlink.
Jean-Pierre, thank you for always believing in me, it kept me going in all ups and downs during this time. Your enthusiasm with mentoring and balancing the supervisor/ friend per-sonality is what I appreciated the most. I could never forget all the work discussions and laughs we had in the cafes in De Bilt. You taught me a lot and gave me opportunity to grow both personally and as a scientist and I am really grateful for that.
I would also like to express my gratitude to Gideon. Thank you for all the scientific dis-cussions, the quality of my work wouldn’t be the same without your input. Your eye for details and consistent drive to deliver the best was a great learning experience. I am sincerely thankful for your patience with me and the motivation in the last years. Erik, I am happy that you continued your supervision from my master's till my PhD by creating this opportunity at Intravacc for me. Your incredible support and endless encouragement made this journey a pleasant one. Personally, I admire your enthusiasm and your approach towards people. Your ability to engage people with your stories and keeping everyone inspired is truly amazing. I am thankful for everything.
I would also like to thank the reading committee Prof. W.J. Quax, Prof. T. de Beer and Dr. D. Christensen for taking time to evaluate the manuscript and providing with valuable sug-gestions.
The time spent at Intravacc couldn’t be the same without all the great colleagues. Janny, Maarten D, Hilde, Sietske, Thomas, Justin, Sabine, Geert-Jan, Faas, Yara, Elly, Dede-ke, Diana, Tjeert, Mireille and Sanne.
Rimko, I am really grateful that we worked together in almost all my projects and even shared offices. You can ease any tense situation with your humor and that is a wonderful quality to have. I cannot imagine, how things would have been if you were not there to hear all the work/personal stories, stepping in to help and keeping the constant motivation, I truly appreciate it. Peter thanks for your help with everything. I learnt a lot from you and not to forget all the software learning. All the team food outings and especially the trip to Limburg heuvels with you guys was fun. René, my cool colleague, friend and paranymph. I am grate-ful for your support during the past years. I admire your passion for good food/ travelling and
definitely share a bit. We shared some good experiences with our food hunts in the city (from gyros for dinner to fancy food at pronto pronto). It was great to work on the pertussis project together, thanks for helping with the tight deadlines (we managed to get good manuscript(s) out of it).
Heleen you were always there to answer my questions with a smile. It was great sparring for new ideas for IPV formulations and other troubleshoots. Thank you for everything. Debbie, you could arrange almost anything I needed in the lab, thank you for your help. Paul, i ap-preciate your patience and willingness to help me construct/deconstruct the instruments in the lab. Together with Rimko and Debbie (the drying gang) we all shared some good laughs at the lab. Thank you Hugo for your help with translating the thesis summary to Dutch, I ad-mire your good dressing style (always professional). Joost, a speciaal dank aan jou. Zonder jouw hulp en motivatie, ik zou nooit Nederlands hebben geleerd. Het is een geweldig gevoel om een nieuw taal te speken (niet altijd de best met schrijven). Martin H, I have always admired your kindness and warm heart. Thank you for treating me like a family member. All the dinners and laughs with your family were great and I really appreciated the time spent with you guys. Bernard, I always enjoyed our small happy conversations over the coffee breaks. Berdine you are a wonderful person, thanks for being so kind and crazy (fun) at times. I could always be myself around you. Wichard, I appreciate your help around the lab and sharing all Groningen stories. Hola Larissa! Thanks for your help with the pertussis ex-periments and assays. It was so much fun sharing jokes and some good laughs at the breaks. Margarita, thanks for listening my everyday stories and sharing the nice office environment. Dionne, we shared office for a short time but it was great to be around with someone with such cheerful personality. Lisette, I enjoyed our conversation during the spontaneous bike rides back to city from work. Elder, thanks for your help with inburgering exams and sharing Cuba stories. Alex, thanks for teaching me DLS technique and your patience with helping me search chemicals at times. I like your passion for pub quizzes and movies. Ivo, I enjoyed our fun conversations over drinks, thanks for your tips with things at times. Afshin, you are a jolly person to be around and your short catchphrases are contagious but super fun. I appre-ciated our long conversations and gym workouts. Tim, thanks for your help with pertussis project, you always had some fun stories to share. Office roomates Maarten R and Mandy thank you for the nice long conversations, it made the writing period less stressful. Maarten i enjoyed our discussions on all topics from career choices to technology transfers. Thanks for your tips. I also like to thank my lunch team Wouter, Merijn, Coen, Peter van der ley, Tim, Afshin, Arjen, Betsy, Hendrik-Jan, Islam and Marit. You guys made a gezellig zone during working hours.
I would also like to thank my student Alessia R for her contribution and support. It was fun learning things and solving problems together. I am glad we still keep in touch.
be around with. It was pleasant organizing all workshop, lectures, retreats and borrels. Best wishes for your future PhD defenses.
Without the endless support of the department in Groningen, this PhD journey would not have been the same. I would like to thank all colleagues there, who were always there to answer my questions and have good conversations. Wouter, thanks for your help during work discussions and organizing Friday drinks. You trained me as a master student and I am thankful for everything you taught. Anko, thanks for your help with SEM analysis and shar-ing good travel stories. Philip, my friend I always enjoyed our really long conversations over life, work and to be honest so many random things (if I think about, it just makes me laugh). Our powder sample exchanges at Amersfoort train station were hilarious. My best wishes for your PhD finalization. Thank you all the wonderful colleagues in Groningen Marcel, Milica, Paul, Jasmine, Max, Anne, Imco, Emilia, Emilia, Christina, Radit, Nia, Rick, Floris, Marinella, Jan, Peter, Naomi, Herman, Maarten M, Wouter T, Su, Senthil, Dorenda and Niels (thanks for teaching me spray drying). Caroline, Mitchel, Yu and Annemarie, the trip to Granada was great with you all. Caroline, the stories with USB preaching material and annemarie's bird jokes, still gives me a good laugh. Sonja, special appreciation for your efforts in making all paperwork so easy for me and being so welcoming (every time I showed up at your office).
When you live abroad your friends become your extended family. They make you feel at home with their efforts, constantly teaching new things in life. I was fortunate to share such friendship with some. Hendrik, you are a good listener and I treasure your advice. All our travel adventures have been a great experience and we should travel more often. Thanks man for your support at all times and much more. Angelica, I appreciate your warm and kind nature. With you I can always be my childhood self and be comfortable about it. Thanks for being there. Rajendra Bhai, thanks for being so supportive all times (no matter what, I could count on you). T.T, Joana and Catarina, I am glad we meet randomly in America. You guys are awesome and I cherish meeting you every time I am back in Groningen. My friends from Groningen Kushi, Pranov, Mallikarjuna, Tushar, Khayum, Danica, Mar-ije, Maarten F, Hans and JoAnn. Thank you for your friendship. Goutham, bro special thanks for making me realize importance of workout and healthy eating. I cherish our travel journeys. Kushi, your artistic skill are inspiring, wish to see you more often around in the NL. Malli, your hitchhiking stories were always entertaining. Thanks for sharing such con-versations. Maarten F, your kindness and helping nature has always inspired me. Hans and JoAnn, you are the two most kind and inspiring people i have meet in the past years. There is so much to learn from you. Thank you for such great and wise conversations.
Utrecht was a new random city when I moved here from Groningen for my PhD. The people I meet here made it feel home every passing day. Balázs my dear friend and esteemed para-nymph, I am glad we did the same Dutch course, who knew that will make the best friend
circle in Utrecht. You and Julia have been there for me always and I am truly thankful for that. Fede, thank you for being there in all good and bad times. I truly appreciate your advice (on almost everything), you are the best. Matteo B, I really learnt to appreciate reading books from you and staying calm in situations. PhD can be stressful and requires a buffer zone, for me one such zone was “Matteo Party channel” (Matteo, Balázs, Fede, Jacopo, Tania, Anna and Ben). Matteo M, thanks for arranging so awesome dinners/parties. Your passion for hospitality is truly amazing. All the best with your upcoming defense. Andreas, I learnt a lot about music (especially jazz) from you and our beer(s) discussion were great. I really learnt the value of chilling from you and your friends. Scott, Welling, Anna, thanks for helping me integrate in Utrecht, I value our friendship. Vinay and Chetna, thank you for your hospitality and support during my starting days in Utrecht. My friends from the movie group Kati, Al-fredo and Candela. Who knew such a simple initiative will result in a lasting friendship. Ale (crazy/fun flatmate), I am so glad we shared the house. I couldn’t imagine how the last two years of PhD would have been without our endless conversations (with sense and no-sense), thank you for listening my everyday stories. I appreciate your dedication towards developing your passion into business and I am sure you will do well. Thanks for answering my endless questions with thesis, your help with the cover and teaching me how to make tortellini and many more such dishes.
I am also thankful to my friends from Delhi, who have been always supportive with me moving to Netherlands and my adventures here. Vishal, Pulkit, Nishant, Vasudha, Simar, Saurabh and Shilpi. Japneet thanks for your always inspiring conversations.
My Family, I have no words to express how thankful I am for your support. Opender uncle and Lalti aunty, thank you for being there in all good and bad times. I truly appreciate you guys being there. My dear little sister Garima, thank you for your endless love and care. I appreciate how hardworking you are and I am sure you will achieve whatever you want in life. Mummy, thank you for your unconditional love and support.
Papa, thank you for your support at all times. You made me believe that I could achieve any-thing in life, just to keep working towards it. I wish you were alive to see this, it would have made you very happy and proud. This is dedicated to you!
Last but not the least, thank you readers of this book for reading it till the end.
