mastersc rip tie Art History & Arch aeology
de complexe geschiedenis van het huisrund
(
Bos taurus
) en het oerrund (
Bos primigenius
):
een
kruising
van
moleculair-genetische
(
mt
DNA) en archeologische studies
Geen koeien, geen moeien. –spreekwoord
de complexe geschiedenis van het huisrund (Bos taurus) en het oerrund (Bos primigenius): een kruising van moleculair-genetische (mtDNA) en archeologische studies
Inhoud
Dank 4
Voorwoord en leeswijzer 5
I Lekenintroductie 6
1 Geschiedenis 6
1.1 De integratie van archeologie en moleculaire genetica 7
2 Authenticiteit 8
2.1 Conservatie van DNA 8
2.2 Contaminatie 9
2.3 Een authentiek resultaat 9
3 Populatieonderzoek met mitochondriaal DNA 10
4 Een ronde door het laboratorium 11
4.1 Extractie 12
4.2 PCR 13
4.3 Kloneren 15
4.4 Sequencing 16
II DNA-onderzoek Noord-Nederlandse runderen 17
1 Keuzeverantwoording 17 1.1 D-loop, mtDNA 17 1.2 Het rund 17 1.3 Noord-Nederland 18 2 Onderzoeksvragen 18 2.1 Doelstellingen 19 2.2 Onderzoeksvragen 1 en 2 19 2.3 Onderzoeksvraag 3 20 2.4 Onderzoeksvraag 4 20 2.5 Onderzoeksvraag 5 20 2.6 Onderzoeksvragen 6 en 7 21 2.7 Onderzoeksvraag 8 21 3 Materiaal 22
3.1 Algemene karakterisering van de monsters 22
3.1.1 Pleistocene gebied inclusief rivier- en beekdalen 22
3.1.2 Hoogveen 24 3.1.3 Kwelders 25 3.2 Varia 26 4 Methode 26 4.1 Monstername 26 4.2 Decontaminatie 26 4.3 Primers 26 4.4 Extractie 26 4.5 Multiplex PCR 27 4.6 Kloneren 27 5 Resultaten 27
5.1 Sequentieanalyse per monster 28
5.2 Post mortem-schade 33
5.3 Metagenomische analyse 33
5.4 NUMT 34
5.5 Huisrundhaplotypen 35
5.6 Oerrundhaplotypen 35
III De archeologie van het rund 38
1 Het Euraziatische oerrund 38
1.1 Historische kenschets 38
1.2 Het begrip Bos primigenius 40
1.3 Van pleistocene megafauna tot domesticaat 41
1.4 Een geografisch-genetische reconstructie 43
2.1 Biotoop 45 2.1.1 Het oerrund van het Drents-Fries plateau 46
2.1.2 Het kwelderoerrund 47
2.2 Seizoenstrek 47
2.2.1 De kwelders een seizoensbiotoop? 47
2.3 Isotopenstudies 48
2.3.1 Denemarken 48
2.3.2 Engeland 48
2.3.3 Nederland 48
2.4 Populatieomvang 50
3 Het gedomesticeerde rund 51
3.1 Het begrip domesticatie 51
3.2 Initiële domesticatie 52
3.3 Neolithisatie van Europa 53
3.4 Secundaire domesticatie in Europa 54
3.4.1 De mogelijkheid tot hybridevorming 54
3.4.2 Overgangsvormen 55
3.4.3 Archeologische onzichtbaarheid 56
4 De relatie tussen mens en rund 56
4.1 Jacht 57
4.2 Co-existentie 58
4.3 Runderverering 59
4.3.1 Feestmalen in het Nabije Oosten 60
4.3.2 Bronstijdbegrafenissen in Engeland 60
4.3.3 Tempeltje van Bargeroosterveld 61
4.3.4 Hoorns uit venen 61
IV Haplotypegeografie van huis- en oerrund 62
1 Huisrund mtDNA 62 1.1 Moderne huisrundpopulaties 62 1.1.1 Azië 63 1.1.2 Afrika 64 1.1.3 Europa 64 1.2 Oud-DNA 66 1.2.1 Zuidwest-Azië 66 1.2.2 Europa 67 2 Oerrund mtDNA 67 2.1 Haplogroep P 68 2.2 Haplogroep E 70 2.3 Haplogroep R 70 2.4 Haplogroep T 71 3 IJtijdrefugia 72 3.1 T en Q 73 3.2 E 73 3.3 R 74 3.4 P 74
4 Introgressie van haplogroep P 75
4.1 FC3 en KYY 76
4.2 03031C 76
4.3 D90 76
4.4 Oud-DNA 77
4.5 Verklaring 77
V Synchronie van mens en rund in het kweldergebied 79
1 Een culturele breuk 79
2 Historische bronnen 80 3 Archeologie 81 3.1 Angelsaksisch aardewerk 81 3.2 Metaal- en muntvondsten 82 3.3 Kruisvormige mantelspelden 82 3.4 Bracteaten 83
3.5 Heroriëntatie van nederzettingen 83
4 Moleculaire genetica 84
4.2 Het hoornloze rund 86
4.3 Romeinse import 88
4.4 Case study: runder-mtDNA als bewijsproxy? 88
VI Conservatie in context 90
1 Algemeen 90
1.1 Het verband tussen uiterlijke conservatie en DNA-conservatie 90
1.2 DNA-conservatiegraad 91
2 DNA-conservatie per skeletdeel 92
2.1 Bot 92
2.2 Kies 92
2.3 Hoornschede 92
3 DNA-conservatie per bodemcontext 93
3.1 Kwelders 93
3.2 Zand 93
3.3 Rivier- en beekdalen 93
3.4 Hoogveen 94
4 Museummateriaal 94
VII XRF-detectie van beenderlijmcontaminatie in bot 96
1 De productie van beenderlijm 97
2 Materiaal 97 2.1 Beenderlijm 97 2.2 Controlegroep 97 2.2 Oude botvondsten 98 3 Methode 99 4 Resultaten 99 4.1 Beenderlijm 99 4.2 Controlegroep 101 4.3 Oude botvondsten 101 5 Discussie 101
5.1 Detectie van beenderlijm met XRF 101
5.2 Implicaties voor DNA- en 14C-analyse 102
5.3 Verder onderzoek 103
Conclusie 104
Aanbevelingen 110
Dank
Degenen die er schuldig aan zijn dat ik ooit geïnteresseerd ben geraakt in de moleculaire genetica en mij daarmee buiten het vertrouwde veld van de steentijdarcheologie brachten, dienen als eerste te worden bedankt. De aanmoedigingen van dr. Dick Stapert en het vertrouwen van dr. Wietske Prummel om dit onderzoek aan mij over te laten vormden de eerste schreden tot deze scriptie. Uiteraard bedank ik ook hen die zich in het Groninger Instituut voor Archeologie (GIA) van de Rijksuniversiteit Groningen hebben ingezet om dit onderzoek doorgang te laten vinden. Een dankbaar geaccepteerde toelage uit het wetenschappelijk fonds van de Drents Praehistorische Vereniging heeft de armslag van het onderzoek vergroot. Voor de behulpzaamheid in onderdelen van het onderzoek bedank ik Tom Jacobs (GIA), Robert Kosters (GIA), Jaap Beuker (Drents Museum, Assen) en Bertil van Os (Rijksdienst voor Cultureel Erfgoed, Amersfoort).Voor de introductie in de laboratoriumtechnieken, de verwoede pogingen mij thuis te laten voelen in een laboratorium en voor de begeleiding in de keuzes dank ik dr. Klaas Vrieling (Instituut Biologie, Leiden) en Marcel Eurlings (Instituut Biologie/Herbarium, Leiden). Ik ben erkentelijk aan degenen die deze tekst hebben gelezen en beoordeeld, dr. Wietske Prummel (GIA) en dr. Thijs van Kolfschoten (faculteit Archeologie, Universiteit Leiden).
Voorwoord en leeswijzer
Als de literatuur erop wordt nageslagen wordt snel duidelijk dat de resultaten uit moleculair-genetische studies niet eenvoudig eigen te maken zijn door hen die niet over de juiste specialistische kennis beschikken. Andersom blijkt ook uit de manier waarop veel van deze studies proberen om archeologische gegevens te verwerken dat moleculair-genetici moeite hebben om de verkregen harde data om te buigen en in te passen in de sociaal-culturele, economische en ecologische kaders van de archeologie; kaders die voor hen wellicht geheel lijken te bestaan uit redeneringen die allerlei gradaties van waarschijnlijkheid beschrijven, zonder iets als zekerheid te willen stellen.De intentie van de voorliggende tekst is dan ook begrijpelijk te zijn voor iedereen zonder specialistische kennis. Hierbij heb ik niet geprobeerd één van de disciplines te versimpelen. Voor zover dat ging is terminologie vermeden. Onvermijdelijke terminologie is uitgelegd in tekst, voetnoten en zelfs in een speciaal hiertoe opgenomen hoofdstuk; de lekenintroductie (hoofdstuk I). Dat hoofdstuk kan tevens dienst doen als een index voor de begrippen die bij verdere bespreking van DNA worden gebezigd. Onverschrokken lezers kunnen dit hoofdstuk overslaan.
Degene die niet van plan is zelf met DNA-sequenties aan de slag te gaan wordt bovendien geadviseerd om hoofdstuk II, of grote delen daarvan, over te slaan.
Een overzichtelijk archeologisch kader om de resultaten uit DNA-onderzoek met de archeologische theorie te kunnen integreren is opgesteld in hoofdstuk III. Het zou naïef zijn en geforceerd overkomen om de resultaten uit moleculair-genetisch onderzoek in een volledig kloppend verband met archeologische theorie te presenteren. Om die reden heeft moleculair-genetisch onderzoek een eigen hoofdstuk (hoofdstuk IV). Met kruisverwijzingen zijn aanverwante onderwerpen met elkaar verbonden. Een poging is ondernomen om de genetische typen van het oerrund in te passen in wat er op basis van de archeologie en fossielen over de populaties en de verspreiding van oerrunderen bekend is. Hierbij was het nodig om genetische typen opnieuw te benoemen en een netwerk van mogelijke afstamming van deze typen voor te stellen.
Hoofdstuk V kan worden beschouwd als een case study waarin met gegevens uit oud-DNA onderzoek (in dit geval van huisrunderen) wordt geprobeerd inzicht te krijgen in een relatief kleinschalig archeologisch dilemma (herbevolking van het Noord-Nederlands kustgebied). De evaluatie hiervan in hetzelfde hoofdstuk trekt de case study echter in het algemene.
I
Lekenintroductie
De moleculaire biologie is ontstaan uitverschillende traditionele takken van de biologie en er bestaan verschillende meningen over de vraag of er op dit moment sprake is van een eigen vakgebied. Hoe het ook zij, de onderzoekstak heeft zich een omvangrijke methodologie eigen gemaakt met bijbehorende vaktermen. Zij betekenen voor buitenstaanders vaak helemaal niets. Bij de bespreking van de resultaten van deze studie is het gebruik van terminologie niet te vermijden. Aan degene die niet vertrouwd is op dit terrein worden de volgende paragrafen opgedragen. Na enkele algemene thema’s die bij het onderzoek horen volgt een chronologische bespreking van de laboratoriumtechnieken die gehanteerd worden bij onttrekking van DNA aan archeologisch materiaal. Op de rijkheid aan statistische analysemethoden zal voorlopig niet worden ingegaan; indien nodig zullen deze analyses bij de bespreking van de resultaten worden toegelicht.
1 Geschiedenis
Het genetisch onderzoek binnen de archeologie en de antropologie begon niet met de ontdekking van de structuur van DNA in de jaren 1950 (Watson & Crick 1953), en ook niet op het moment dat het mogelijk werd DNA direct te onderzoeken, na 1980. Al eerder richtte indirect genetisch onderzoek zich op erfelijke eigenschappen, verschillen in het fenotype en later ook op bloedgroepen en aminozuren. Een fenotypische variant van genetisch onderzoek werd gevormd door de antropometrie of morfometrie. Metrische
kenmerken zoals de schedelindex bleken geografische clusteringen te vormen (fig. 1). Dergelijke patronen hebben hun oorsprong in het verleden en kunnen zodoende relevant zijn voor de archeologie. De Basken hebben als object van onderzoek een grote rol gespeeld bij de vertaling van antropologisch onderzoek naar de archeologie en de taalkunde (zie Renfrew 1996; Sykes & Renfrew 2000). Zowel hun taal als biomoleculaire signatuur verschilde van die van de gemiddelde Europeaan. Een hoog percentage met bloedgroep O gecombineerd met de resusfactor negatief kenmerkte de Bask. Langdurige isolatie zou verantwoordelijk zijn voor deze genetische variant. Er werd aangenomen dat de Basken ‘paleolithisch’ bloed hadden dat niet door de neolithische nieuwkomers was beïnvloed. Typisch paleolithisch bloed had blijkbaar de bloedgroep O en een resusfactor negatief. Vanaf de opkomst van DNA-onderzoek moesten veel van de oude fysische en moleculaire methodes het veld ruimen en dit is waarschijnlijk de reden dat
genetisch onderzoek tegenwoordig synoniem is geworden met DNA-onderzoek.
Vrijwel meteen toen het mogelijk werd het DNA direct te onderzoeken werden er toepassingen bedacht voor de archeologie. Pääbo (1985) was de eerste die oud menselijk DNA kon publiceren dat onttrokken was uit een 2500 jaar oude Egyptische mummie. Dit is slechts één voorbeeld uit een reeks van allerlei
high-profile-artikelen die er vooral op uit waren
om de methode te verkennen.
Een andere tak van onderzoek richtte zich op de huidige variatie in het DNA. De variatie die hierin werd gevonden werd meteen gekoppeld aan (in de ogen van de onderzoekers)
fig. 1.
omvangrijke migratiegeschiedenissen uit het verleden. In het invloedrijke artikel van Cann et
al. (1987) werd gesteld dat Aziaten en
Europeanen relatief laat zijn ontstaan uit een Afrikaanse vrouwelijke voorouder. Dit model, dat bekend staat als mitochondriale Eva, bevestigde het paleoantropologische Out-of-Africa(II)-model. De moleculaire genetica leek, onafhankelijk van archeologische gegevens, de
data te kunnen leveren waarmee
archeologische theorieën ontzenuwd of bewezen konden worden.
De vertaalslag van de moleculair-genetische data naar de archeologie gebeurde op een manier die op zijn minst onhandig te noemen is (Pluciennik 1996; Renfrew 2000). In vele publicaties, zeker van voor de eeuwwisseling, werd verwacht dat de genetische data een overeenkomstig patroon zouden opleveren met taalfamilies en cultuurgebieden, alsof de patronen gelijkstonden aan ‘volkeren’. Dergelijke simplistische ideeën over het verband tussen de disciplines had de archeologie al sinds de nationaalsocialistische vorsers uit de school van Gustaf Kossinna niet meer meegemaakt. Het begrip van ‘volk’ als eenheid op fysisch, cultuurhistorisch en taalkundig gebied werd al snel na de Tweede Wereldoorlog verworpen, overigens op beargumenteerde gronden: de resultaten van de disciplines antropologie, archeologie en taalkunde komen meestal niet of maar ten dele overeen. Het zou alleen maar vreemd zijn als de moleculaire genetica wel gemakkelijk verklaringen zou kunnen bieden voor andere disciplines.
1.1 De integratie van archeologie en moleculaire genetica
De noodzaak voor moleculair-genetici om hun handelswijze te herzien werd duidelijk toen zij zich in de jaren 1980 en 1990 gingen mengen in het debat over de neolithisatiegeschiedenis van Europa, een thema dat al een omvangrijk archeologisch fundament had. De archeologie wees erop dat naast kolonisatie ook acculturatie had plaatsgevonden, waardoor het duidelijk was dat de culturele groepen in die periode niet als absolute demografische groepen konden worden beschouwd. De genetische afdruk zou een complexe menging van een migratoire en een eerdere populatie moeten opleveren. Het Demic Diffusion-model of het Wave of Advance-model (bijv. Cavalli-Sforza 2000; id. 2002; Renfrew 2002) waren demografische analyses die hier rekening mee hielden, voorzover de rigide constructie van de modellen dat toeliet. De twee uitersten zijn in deze modellen vertegenwoordigd; een volledige
kolonisatie door nieuwkomers en een culturele diffusie waarbij er een verspreiding de neolithische levenswijze plaatsvindt die niet per sé gepaard gaat met een vervanging van de oude bevolking. Er is in het Demic Diffusion-model wel sprake van een migratie vanuit het Nabije-Oosten, maar naarmate deze golf verder Europa in trok, nam de genetische bijdrage van de nieuwkomers af. In de vorm waarin de genoemde modellen gepubliceerd werden doorstaan ze niet de toets met de tegenwoordig beschikbare data, maar ze waren vernieuwend in die zin dat er ondanks de genetische basis ruimte werd geboden aan taalkundige en culturele interpretaties.
soortenspectrum dat Poinar et al. (2003) verkregen uit een coproliet (fossiliserend uitwerpsel), waarmee ze een alternatieve methode introduceerden om het dieet van een dier te analyseren. Ook kunnen genen worden gebruikt, zoals het MC1R-gen op chromosoom 16 om de haarkleur en huidpigmentatie van neanderthalers te onderzoeken (Lalueza-Fox et
al. 2007). Tot slot is DNA-onderzoek stevig
verankerd in een neodarwinistisch paradigma en richt veel onderzoek zich op de evolutie, zoals onderzoek naar de divergentie-geschiedenis van mensen en neanderthalers (Green et al. 2010) of van mensen en chimpansees (Patterson et al. 2006).
2 Authenticiteit
Het veld van archeologische genetica bestaat enerzijds uit studies naar huidige patronen in het DNA en anderzijds uit studies naar DNA in archeologische resten. Het laatste wordt oud-DNA of aoud-DNA genoemd, de a van ancient. Bij huidig DNA ligt de crux in het herkennen van tijdsdiepte in de statische situatie van nu. De geografische verspreiding van genetische variatie leent zich goed voor evolutieonderzoek en voor toepassing in de archeologie. Het wringt echter bij de interpretatie. In de analogie van de evolutionaire boom vertegenwoordigen de genetische patronen van nu slechts de uiterlijke puntjes van de buitenste takken. Dit is enigszins vergelijkbaar met wat filologen en archeologen een palimpsest zouden noemen. Met de hulp van zeer omvangrijke statistiek lukt het de moleculair-genetici terugrekeningen te maken naar het verleden. Toch ontbreekt de feitelijke verleden situatie en in zekere zin kun je de methode time-trapped noemen (Hofreiter
et al. 2001b).
Aan de andere kant zijn de mogelijkheden van oud-DNA eveneens beperkt, vanwege analytische bezwaren die ontstaan doordat er maar kleine hoeveelheden DNA kunnen worden bepaald1, wat de kracht van de statistiek
aantast. De grootste moeilijkheid van oud-DNA-onderzoek is echter van praktische aard: het verkrijgen van een authentiek resultaat. Conservatie en contaminatie zijn in oud-DNA-onderzoek elkaars tegenpolen. Doordat het oorspronkelijke DNA in archeologisch en paleontologisch materiaal gebrekkig bewaard is
1Door voortschrijdende technieken hoeft dit niet altijd
meer een beperking te zijn; door gebruik te maken van
high-throughput sequencing is bijvoorbeeld een groot deel
van het genoom van de neanderthaler ontrafeld (Green et
al. 2010), een prestatie die tien jaar geleden voor
onmogelijk zou worden gehouden.
gebleven, worden gevoelige methodes gebruikt die met gemak de geringste contaminaties opsporen.
In het begin van de jaren 1990 – terwijl authenticiteit nog geen overheersend issue was – ontstond een hype rond het idee dat DNA miljoenen jaren kon overleven mits de natuur voor de juiste omstandigheden had gezorgd. Het boegbeeld van deze gedachte was de mug die opgesloten zat in amber. Een van de redenen dat Spielberg’s Jurassic Park uit 1993 nog niet bewaarheid is komt door de misvatting dat uiterlijke conservatie een maat is voor het bewaard blijven van DNA (zie Jones 2001; id. 2003). Het is indertijd enkele keren gelukt om DNA uit fossielen uit het tijdperk der dinosauriërs te verkrijgen; naderhand bleken dit contaminaties te zijn.
Het langzaam gegroeide begrip dat authenticiteit nooit vanzelfsprekend is, heeft het aanvankelijke optimisme aardig verstomd. De zucht naar authenticiteit is sindsdien een hete adem in de nek van de laborant.
2.1 Conservatie van DNA
Organisch materiaal en DNA ondergaat na het overlijden van de drager een gedeeltelijke of gehele afbraak, die diagenese wordt genoemd. Diagenese is een reeks van allerlei mogelijke processen die tot totale afbraak of tot fossilisering van delen van het organisme leiden. De eerste diagenetische stap is bijna altijd dezelfde: putrefactie. Putrefactie is de vertering van het organisme door microbiële activiteit. Deze vorm van afbraak wordt opgestart vanuit bacteriën die aanwezig zijn in het organisme en vindt dus in bijna alle omgevingen plaats, ook in omgevingen die zeer geschikt zijn voor uiterlijke conservatie zoals in zuurstofarm water of diep in grotten. Zodra de voedingsstoffen uit de organische resten door de bacteriën zijn verteerd en er geen aanvoer is van nieuwe voedingsstoffen om het verteringsproces in stand te houden, stopt de putrefactie.
objecten enerzijds als voor het DNA in de objecten anderzijds zal duidelijk zijn; DNA is immers een ander molecuul dan bijvoorbeeld collageen of apatiet.
Onder invloed van factoren zoals de zuurgraad, het redoxpotentiaal, het zoutgehalte van de bodem, de temperatuur en radioactieve straling ondergaan zowel de DNA-streng (deoxyribosefosfaatstreng) als de basen die de DNA-code vormen (A, T, C en G)2 chemische
structuurveranderingen. Sommige basen worden afgestoten, terwijl andere chemisch worden omgezet. Eén van de hydrolithische reacties is depurinatie of depyrimidinatie3,
waarbij de stikstofband die de base aan de streng verbindt verbreekt. De base wordt afgestoten. Dit leidt onder meer tot opbrekingen van de strengen. Een typische lengte voor opgebroken DNA-strengen is 100 à 200 baseparen. De meest voorkomende omzetting is deaminatie van cytosine, wat leidt tot de omzetting van cytosine in uracil (Hofreiter et al. 2001a). Als deze schade zich post mortem voordoet wordt er bij een PCR-reactie (zie I.4.2) op het laboratorium een deoxyadenosine (A) ingebouwd op de plek waar oorspronkelijk een deoxyguanosine (G) ingebouwd zou zijn. Met het product van deze hybridisatie is op het oog niets mis, terwijl er op enkele willekeurige plaatsen in de sequentie een A staat die eigenlijk een G zou moeten zijn, of een T die een C zou moeten zijn.
Om een authentiek resultaat te krijgen kan een oud-DNA-studie dus niets met een enkele sequentie. De kans dat er op ten minste één plaats een foutieve base is ingebouwd is te groot. Met multiplex-PCR en kloneren zou authenticiteit vervolgens kunnen worden gegarandeerd, mits er niet een veel groter probleem meespeelde: contaminatie.
2.2 Contaminatie
Een monster van ‘oud DNA’ kan in werkelijkheid een DNA-monster zijn van de veldarcheoloog of conservator. Er kan ook DNA vermeerderd worden van een contaminatie die diep in het materiaal is doorgedrongen, een besmetting die ouder kan zijn dan de opgraving zelf. Door onzorgvuldige behandeling kan tevens het DNA van de laborant zelf of DNA uit het lunchpakket van de laborant worden opgevangen. Door het open laten staan van
2 De basen (nucleotides) zijn adenine (A), guanine (G),
thymine (T) en cytosine (C). In de complementaire DNA-strengen staat een A tegenover een T en een C tegenover een G.
3 A en G zijn purines. T en C zijn pyrimidines. Depurinatie is
het wegvallen van een purine, depyrimidinatie het wegvallen van een pyrimidine.
proefbuisjes (epjes) of door vervuilde pipetpunten bestaat de kans dat er DNA van een ander monster overgebracht wordt
(cross-contaminatie). Indien extractie van het DNA
plaatsvindt in een gebouw waar ook PCR-reacties plaatsvinden kunnen er aerosole
amplicons worden opgevangen in het extract
(carry-over contaminatie). Een erg verraderlijke, potentiële contaminatiebron zijn de chemicaliën die gebruikt worden voor
extractie of amplificatie (Leonard et al. 2007;
Champlot et al. 2010). Bij de fabricage van deze biochemische producten kan dierlijk of menselijk DNA worden meegenomen. De hoeveelheden zijn miniem, hooguit enkele moleculen, maar dat kan genoeg zijn om analyses te doen mislukken.
Andere moeilijkheden bij het verkrijgen van authentiek DNA liggen in de mysterieuze bestanddelen die een succesvolle PCR verhinderen of remmen, zogenaamde
PCR-inhibitors.
2.3 Een authentiek resultaat
Na enkele ontmoedigende publicaties van vals oud-DNA moest geconcludeerd worden dat laboratoriumomstandigheden geen garantie voor authenticiteit waren. Afgaande op de hoeveelheid citaties heeft een publicatie van Cooper en Poinar (2000) met negen criteria, aangescherpt door Poinar (2003), veel impact gehad. Criteria waren onder andere dat extractie op een fysiek geïsoleerde plaats moesten plaatsvinden, voornamelijk om carry-over contaminatie te voorkomen, en dat het kloneren van PCR-producten noodzakelijk was. Het oud-DNA-veld kon bovendien profiteren van de expertise die op het gebied van forensische analyses was opgedaan (Salas et
al. 2005; Mulligan 2005; Kemp & Smith 2005)4.
Met betrekking tot de kwantitatieve aspecten van authenticatie vonden berekeningen plaats om te bepalen hoeveel kloneer- en sequencingreacties er moesten plaatsvinden om de resultaten statistisch betrouwbaar te maken en contaminaties, mislezingen en DNA-schade te kunnen elimineren (Spencer & Howe 2004; Bower et al. 2005). Er werden tevens voorschriften opgesteld ter voorkoming van contaminatie die eenvoudig door te voeren zijn in de gangbare archeologie (Yang & Watt 2005). De criteria van Cooper en Poinar
4 Archeologisch materiaal verschilt op het punt van
hielden namelijk slechts rekening met contaminatie die in het laboratorium kon plaatsvinden en niet met contaminaties uit de voorgeschiedenis van een monster.
Een recente inventarisatie van oud-DNA-studies toont aan dat de criteria die de onderzoekstak zichzelf heeft opgelegd nog steeds selectief worden toegepast (Roberts & Ingham 2008). De oorzaak is misschien dat het suppressieve karakter van de criteria niet in
verhouding staat met de matige
doeltreffendheid ervan. Strikte naleving biedt namelijk nog steeds geen garantie op authenticiteit. Daartegenover krijgen resultaten
wellicht onterecht het brandmerk
«onbetrouwbaar», terwijl er andere argumenten zijn om authenticiteit te kunnen claimen. Bij onderzoek van een uitgestorven diersoort is contaminatie bijvoorbeeld een minder zwaarwegend thema dan bij de bestudering van oud menselijk DNA. Gilbert et al. (2005a) achtten de tijd rijp om de checklist-methode te verruilen voor een aanpak van gezond verstand. In plaats van de verplichting om in publicaties te vermelden aan welke criteria men zich heeft gehouden, zou het verplicht moeten zijn om de risicoafwegingen per casus te verantwoorden. 3 Populatieonderzoek met mitochondriaal DNA
Tot op heden gebeurt het meeste populatieonderzoek met mitochondriaal DNA. Mitochondriaal DNA, of mtDNA, is het DNA van de mitochondriën. Mitochondriën komen honderd tot een paar duizend keer voor in de meeste lichaamscellen. Deze hoge frequentie betekent dat ze ook in archeologische context meer kans hebben om bewaard te blijven en vermeerderd te worden. De mitochondriën spelen, als organellen in een cel, een rol in de cellulaire energievoorziening. Het DNA van de mitochondriën heeft de vorm van een dubbele cirkelvormige streng, wat geheel verschilt van de dubbele helix van DNA in de celkern. Men denkt daarom dat ze zijn geëvolueerd uit aparte bacterieachtige organismen die aan het begin van de ontwikkeling van eukaryoten de cellen binnendrongen en een symbiose aangingen. Mitochondriën komen in grote hoeveelheden voor in de eicel, maar niet of vrijwel niet in spermacellen. Het blijkt dan ook dat mtDNA het vrijwel altijd één-op-één via de vrouwelijke lijn overerft (Giles et al. 1980).
Geregeld komen stukjes van oorspronkelijk
mtDNA voor in kern-DNA waar het als junk-DNA verblijft; zij worden numts genoemd.
Omdat numts een situatie van misschien wel
miljoenen jaren geleden vast hebben gelegd zijn zij, indien ze als mtDNA worden aangezien, een potentieel gevaar voor populatieonderzoek. Het mitochondriale genoom is bij zoogdieren ongeveer 16.000 tot 17.000 baseparen lang. Een evolutionair interessant stukje (of locus) uit de sequentie van het mtDNA is het
cytochrome b-gen. Cytochrome b getuigt van
de hoge ouderdom van de mitochondriën, omdat het gen in de mens, het dier en zelfs in sommige bacteriën voorkomt. Vanwege opeenvolgende mutaties is het gen zeer geschikt voor taxonbepalingen: het komt bij dieren van dezelfde familie 85-95% overeen, binnen dezelfde soort is de overeenkomst 90-95%.
Voor oud-DNA-populatieonderzoek richt men zich meestal op de D-loop, een fragment van het mitochondriale genoom dat verondersteld wordt nergens voor te coderen. Dit betekent dat er geen eiwitten gevormd worden naar voorbeeld van dit stukje van het genoom. Dankzij de hoge mutatiesnelheid van de D-loop bouwt zich na verloop van tijd variatie op in een populatie. De DNA-sequentie van het ene individu verschilt van die van het andere; de twee typen die zijn ontstaan heten haplotypen. Enkelvoudige mutaties worden geërfd en beginnen dan hun eigen genealogische geschiedenis. Het mechanisme dat achter de variatie op deze locus schuilt is toeval. Omdat de D-loop niet codeert heeft een mutatie geen positieve, maar ook geen negatieve gevolgen en blijft deze in het nageslacht bewaard. Stel dat er na verloop van tijd uit een oerpopulatie van een willekeurige diersoort, genaamd 0, twee populaties zijn ontstaan, A en B, die geïsoleerd van elkaar leven. In beide populaties zijn met enige regelmaat door mutaties haplotypen ontstaan. Af en toe zijn er ook haplotypen uitgestorven. Dit laatste kan zijn gebeurd door een founder effect, een
bottleneck of genetic drift5. Volgens de
willekeur vindt telkens een homogenisatie
5 Genetic drift is een stochastisch proces dat speelt bij
kleine populaties en ervoor zorgt dat de genetische samenstelling in een aantal generaties verandert. Kleine populaties komen voor na een bottleneck (een zeer sterke terugval in de populatiegrootte) of een founder effect. Bij een founder effect splintert een groep individuen zich af van de bronpopulatie. Zodoende kunnen genetische varianten verhoudingsgewijs veel vaker voorkomen in de splinterpopulatie dan in de bronpopulatie. Een voorbeeld is de variant van het PABN1-gen dat bij positieve
plaats van de opgebouwde variatie in het mitochondriale DNA. Het gevolg is dat op zeker moment niet alleen populatie A van populatie B verschilt, maar dat er een bepaald
mutatiemotief is ontstaan. Naast allerlei
enkelvoudige mutaties in individuen van de populaties komen enkele mutaties steevast wel in populatie A voor en niet in B (fig. 2a). Ten opzichte van oerpopulatie 0 hebben zowel A als B een eigen mutatiemotief.
De demografische geschiedenissen zijn de oorzaak van het ontstaan van variatie tussen populatie A en B. Er zijn echter twee belangrijke voorwaarden om in de basevolgorde van de D-loop herkenbare patronen aan te kunnen treffen: voldoende tijd en geografische
isolatie. Geografische isolatie heeft verhinderd dat er individuen van de twee populaties in staat waren om nakomelingen te krijgen (gene
flow). Met een bekende mutatiesnelheid kan
van A en B vervolgens het moment van afsplitsing worden berekend door het minimale aantal mutaties te tellen waarin A van B verschilt. Op die manier kan een topologische
weergave van de data worden
gereconstrueerd, bijvoorbeeld in de vorm van een fylogenetische stamboom van populaties 0, A en B (fig. 2b). Zijn vooral de variatiepatronen binnen de populaties interessant, dan kan daarvan een hyplotypenetwerk worden gemaakt (fig. 2c).
Deze geïdealiseerde voorstelling gaat niet op als de populaties niet zo geïsoleerd zijn als we hadden gehoopt. Als er op een moment toch
gene flow mogelijk is tussen populaties A en B
kunnen A-lineages worden geïntroduceerd in populatie B en vice versa. De theoretische fout is dat er feitelijk geen populaties worden bestudeerd, maar een verzameling lineages. 4 Een ronde door het laboratorium
Er zijn meerdere moleculaire technieken en varianten hierop. Van oud-DNA is mtDNA het meest onderzocht. Een zogenaamde
multiplex-PCR of multiplex-PCR van overlappende fragmenten is
het meest gangbaar. Na kloneren en
sequencing is het beoogde resultaat een
betrouwbare basevolgorde van het onderzochte stukje DNA. Hieronder volgt een uitleg van deze techniek. Details worden gegeven die wellicht niet van toepassing zijn op de hier gepresenteerde studie. Voor een samenvatting van het laboratoriumprotocol wordt verwezen naar II.4.
fig. 2a. Fictieve sequenties van negen individuen per populatie (A en B), afgeleid uit oerpopulatie (0). Overeenkomsten op een positie (1 t/m 11) worden met een punt aangegeven. Blauw: individuele mutaties. Donkerrood: mutatiepatroon.
fig. 2b. Een fylogenetische stamboom van populaties uit fig. 2a. De bezems aan de uiteinden staan voor de verschillende haplotypen. In deze simpele weergave wordt ervan uitgegaan dat het niet bekend is hoe lang geleden de haplotypen precies zijn ontstaan. In principe is een dergelijke weergave van haplotypen pas interessant als dergelijke aftakmomenten wel bekend zijn.
4.1 Extractie
De pre-PCR-fase van een oud-DNA-analyse begint in een laboratorium dat is ingericht voor de extractie van monsters. In het gebouw vinden geen PCR-reacties plaats, noch werkzaamheden die een contaminatierisico inhouden. Beschermende kleding die over de gewone kleding wordt aangetrokken, een mondkapje en gebruik van medische handschoenen moeten contaminaties door de laborant verhinderen. Voor en na elk gebruik worden alle verticale en horizontale vlakken met bleek schoongemaakt. Alle benodigdheden worden gewassen in een bleekbad en met UV-licht (λ 254 nm) gedecontamineerd. Alle handelingen waarbij proefbuisjes met oplossingen open staan, gebeuren in een kast met UV-verlichting en overdruk met gefilterde lucht.
Een algemene eerste stap, nog voordat de extractie kan beginnen, is het decontamineren van de monsters. Doorgaans gebeurt dit door het afschuren van het oppervlak van het botmonster (cf. Bailey et al. 1996), door UV-bestraling (cf. Bollongino 2006; Edwards et al. 2007; Priskin et al. 2007) of met een bad van
verdunde bleek6 (Kemp & Smith 2005). Een
beproefde standaardmethode is er echter niet, zo blijkt uit een inventarisatie (Watt 2005). Verdunde bleek lijkt de beste resultaten te leveren. Omdat het behoorlijk invasief is vernietigt het veel van het contaminante DNA terwijl het authentieke DNA in zekere mate beschermd zit. Dit laatste kan komen doordat het authentieke DNA zich vooral concentreert in zogenoemde preservation niches.
Waarschijnlijk zijn dit plaatsen waar de DNA-moleculen een complex aangaan met andere redelijk stabiele moleculen. In compact bot is apatiet een preservation niche (Salamon et al. 2005). Bijkomend voordeel van de behandeling met bleek is dat deze voorziet in de verwijdering van veel PCR-inhibitors (Watt 2005). De overige genoemde methodes gaan ervan uit dat contaminatie oppervlakkig aanwezig is. Het met schuurpapier verwijderen van het botoppervlak heeft niet de voorkeur omdat botstof in de lucht een mogelijke bron van cross-contaminatie is. Een veilige manier van decontaminatie blijkt geduld te zijn: Kemp & Smith (2005) toonden aan dat er zich bij opzettelijk gecontamineerd bot na veertien
6 oplossing van natriumhypochloriet (NaOCl)
maanden rust geen problemen meer voordeden in de in de PCR-fase. Ondanks de mogelijke verontreinigingen in laboratoriumchemicaliën is het decontamineren daarvan (zie Leonard et al. 2007; Champlot et al. 2010) niet gebruikelijk. De extractie of isolatie van DNA zelf begint met het uitkiezen en prepareren van een geschikt submonster van 0,5 tot 1,0 g. Het submonster wordt eerst verpulverd, als het botcompacta of kiezen betreft is dit een mechanisch proces. Er zijn verschillende extractiemethodes, waarvan de phenol-, chloroform- en silicavarianten het bekendst zijn. Voor mtDNA-onderzoek is de minder giftige silicavariant geschikt (Höss & Pääbo 1993). Om het DNA beschikbaar te maken is verdere, chemische afbraak van de organische structuren noodzakelijk. De chemische benodigdheden om het DNA vrij te maken en te beschermen zijn EDTA en PK. EDTA7 zorgt
onder andere voor ontkalking van het monster terwijl de proteases van PK8 de proteïnen
ontleden. Hoe lang het duurt voordat de chemische ontleding voltooid is, is afhankelijk van het monster. Als de vloeistof in beweging wordt gehouden is in de regel een halve dag tot een dag voldoende. Het DNA dat in de kalkstructuur of in ander weefsel gevangen zat wordt gedurende die tijd vrijgemaakt en komt in oplossing.
Door de volgende dag te centrifugeren op 4000 rpm ontstaat een pellet van vaste stoffen dat aan de bodem van het proefbuisje geplakt zit. Dit zijn de verteerde organische resten. Het DNA is opgelost dus zal in de vloeistof, het
supernatant, blijven. Door dit af te pipetteren in
een nieuwe buis worden de vaste stoffen geëlimineerd. Toch verraadt de goudgele tot donkerbruine kleur van het supernatant dat er behalve DNA nog andere stoffen in de oplossing zitten.
De volgende stap is het binden (lyseren) van DNA aan silica. Om de binding te faciliteren wordt GuSCN9 tot 5M aan de lyseerbuffer
toegevoegd. De lyseerbuffer met de silica en het extractie-supernatant moeten enkele uren incuberen. Centrifugeren op 4000 rpm zal wederom leiden tot een pellet. DNA zit momenteel op de kleine silicapartikels die het pellet vormen waarmee verder wordt gewerkt en in dit geval kan het supernatant dus weg. Om het silicaplakkaat weer in suspensie te brengen wordt er weer een klein beetje lyseerbuffer toegevoegd en wordt er gevortexd (mechanisch geschud). Het geheel kan nu
7 ethyleendiaminetetraazijnzuur 8 Proteinase K
9 guanidine thiocyanaat
overgeplaatst worden van de 12 ml buis in een 2 ml epje; vanaf dit punt wordt er niet meer met milliliters, maar met microliters (μl) gewerkt. Na een centrifugestap (supernatant kan weg) wordt het extract opgeschoond met ethanol. Tot slot wordt aan droog silicapellet 50 of 100 μl TE-buffer10 toegevoegd. Deze
suspensiebuffer, met een kleine hoeveelheid
EDTA en het basische Tris11, scheidt het DNA
weer van de silica. De silica moet vervolgens volledig worden verwijderd omdat silica een krachtige PCR-inhibitor kan zijn. Het extract, een vloeistof van enkele tientallen microliters, is nu voltooid en van een deel van het extract wordt een 1:10-verdunning gemaakt. De rest van het extract hoeft alleen nog in aliquots12 te
worden opgedeeld en kan op -20°C worden bewaard. Bij voorkeur wordt echter meteen een multiplex-PCR ingezet.
Het inzetten van een PCR, dat is het voorbereiden van de reactiemix, gebeurt als laatste stap in de pre-PCR-fase.
4.2 PCR
In levende wezens vindt constant replicatie plaats, waarbij de dubbele DNA-streng wordt opengeritst en complementaire
nucleotides tegenover de enkele streng worden
aangezet. De Polymerase Chain Reaction, afgekort PCR, past dit principe toe in een kunstmatige omgeving. Het PCR-mechinisme gaat uit van amplificatie van DNA door de verschillende absolute stadia die nodig zijn om DNA te kopiëren achtereenvolgens te laten verlopen in thermische cycli.
Een minimale PCR-reactiemix bevat: water, pH-buffer, MgCl2, Taq DNA-polymerase,
primers en dNTP’s. Uiteraard is extract het laatste essentiële element. Er wordt echter aan het einde van de ingezette reeks ook een
negatieve controle ingezet. Aan een negatieve
controle (of no template control) is geen extract toegevoegd. Deze zal in principe geen PCR-product opleveren. Indien het dit wel doet is er sprake van cross-contaminatie of vervuilde chemicaliën.
Taq is een derivaat van de bacterie Thermus
aquaticus, een zogenoemd hyperthermofiel
organisme dat bijvoorbeeld leeft in de geisers van Yellowstone National Park. Het kan temperaturen weerstaan van nabij het
10 TE-buffer is een buffer die bestaat uit uit Tris (T) en
EDTA (E).
11 tris(hydroxymethylamino)-methaan
12 Aliquots zijn werkeenheden. Steeds vanuit dezelfde
kookpunt. Taq is het enzym van deze bacterie waarmee het DNA dupliceert
(DNA-polymerase).
Primers zijn voorbereide stukjes enkelstrengs DNA (oligonucleotideketens) met een bekende sequentie, precies ontworpen om de polymerase aan te laten slaan op de DNA-moleculen van de onderzochte soort en het gewenste deel van het DNA. Met verschillende
forward- en reverse-primers wordt op target DNA gemikt van ongeveer 100 tot 150
baseparen, een typische lengte voor gedegradeerd DNA. Het primersysteem is zo ontworpen dat aansluitende of overlappende producten worden gecreëerd, die uiteindelijk als één lange sequentie kunnen worden gelezen. Het systeem kan tevens langere producten voortbrengen, zo kan een
forward-primer uit het begin van het systeem een
product opleveren met een verderaf gelegen
reverse-primer zodat bijvoorbeeld een product
van 300 baseparen ontstaat. dNTPs tenslotte zijn losse (deoxy)nucleotides.
De thermische cycli worden gegenereerd door een thermocycler, die voor te stellen is als een computeraangedreven warmhoudplaat. Koken is de kunstmatige weg om dubbele DNA-strengen op te breken (denaturatie). Een willekeurig DNA-duplicatieenzym zou kapotgaan door deze te koken, maar niet dat van Thermus aquaticus. ‘Koken’ is dus de eerste stap in de thermische cyclus en omdat het ook Taq activeert is het meteen de eerste stap van de kettingreactie. De denaturatiefase vindt plaats op 94°C voor de duur van 20 à 30 seconden.
Hierop volgt de hybridisatiefase of
annealingfase, waarbij de oligonucleotides
samensmelten met hun complement in het enkelstrengs target-DNA. De exacte temperatuur van deze fase is afhankelijk van de
annealingtemperatuur van de primers, de
temperatuur van de verschillende primers moeten daarom op elkaar afgestemd zijn. Een temperatuur tussen de 50°C en 60°C en een duur van 30 seconden is standaard.
Elongatie is de laatste fase van de thermische cyclus: ongeveer 30 seconden op 72°C. 72°C is de voorkeursbiotoop van
Thermus aquaticus en zodoende de voorkeurstemperatuur van zijn polymerase. Tijdens de elongatiefase worden op de DNA-streng één voor één de complementaire nucleotides aangeplakt wat uiteindelijk resulteert in asymmetrische dubbelstrengs moleculen (semi-long products). Deze elongatie start op de primersite die op het 3’-uiteinde van
de streng gelegen is13. De volgende cyclus
start weer met denaturatie, met als voornaam verschil dat er in deze cyclus naast semi-long products ook kortere producten ontstaan. In de annealingfase hybridiseert een andere primer aan een semi-long product waardoor een product ontstaat dat door twee primers van het primersysteem begrensd is.
De eerste fase van de multiplex-PCR levert een mengsel op van producten van verschillende lengtes van verschillende combinaties forward- en reverse-primers. In de tweede fase wordt het product van de eerste fase nog eens aan een PCR-reactie onderworpen met de toevoeging van slechts één specifiek primerpaar, waardoor er gericht wordt geamplificeerd.
Bij een volledig efficiënte kettingreactie wordt bij elke herhaling de hoeveelheid korte producten verdubbeld. Een efficiëntie van 100% wordt bij oud-DNA-onderzoek echter niet gehaald. Als er geen sprake is van een verkeerde verhouding van de ingrediënten wordt de optimale reactie waarschijnlijk verhinderd door target-DNA van slechte kwaliteit of door inhibitors.
Inhibitors in archeologische of forensische monsters zijn meestal meegeëxtraheerd uit het monster en kunnen bestaan uit tannines, Maillardproducten14, humuszuren en fulvozuren
(O’Rourke et al. 2000). Een indicator van inhibitors is een donkergele of bruine kleur van het extract na de chemische vertering en de centrifugestap (fig. 3). Een PCR inzetten van een 1:10-verdund extract blijkt in de praktijk hiertegen te helpen. Bij extracten waar nog authentiek DNA aanwezig is, blijkt het PCR-mechanisme gevoelig genoeg om de kleinere hoeveelheid DNA toch te amplificeren, terwijl de inhibitors verhoudingsgewijs zijn verwijderd door het verdunnen.
Om na een PCR reactie te kijken of de reactie naar wens is verlopen en er DNA is geämplificeerd dat bovendien van de juiste lengte is, vindt gel elektroforese plaats. Handmatig kan dit op agarosegel. Een deel van het PCR-product wordt in slots in de gel gepipetteerd en in een bak met buffer geplaatst waarin zich aan de ene zijde een anode en aan de andere zijde een kathode bevindt. De DNA-moleculen zijn negatief geladen en migreren daarom in het opgewekte
13 Het 3’- en 5’-uiteinde zijn de plaatsmarkeringen voor de
twee uiteinden van een DNA-streng.
14 Een Maillardreactie is een geel- tot bruinkleuring die
elektrische veld door de gel richting de anode. De snelheid van de migratie is afhankelijk van de productlengte: de grote moleculen bewegen zich trager door de dikke gel dan de kleine. Door vervolgens de gel te ‘ontwikkelen’ in ethidiumbromide kunnen de bands van de verschillende aanwezige dubbelstrengs fragmenten zichtbaar worden gemaakt onder een UV-lamp.
Door bij het laden van de gel ook een ladder met bekende productlengtes en concentraties in een van de slots te pipetteren kan van de fragmenten de lengte en de concentratie geschat worden (fig. 4). Idealiter is er slechts één fragmentlengte aanwezig, het product dat hoort bij het primerpaar uit de tweede fase van de multiplex-assay en hooguit een lichte primer
dimer15. Indirect kan er nu ook bepaald worden
of inhibitie heeft plaatsgevonden. Op een gel zou dit moeten opvallen omdat er geen PCR-product is en zelfs geen primer dimer. Inhibitie voorkomt namelijk dat de annealing- en elongatiestappen kunnen plaatsvinden. Geen PCR-product maar wel primer dimer kan wijzen op een te lage uitgangsconcentratie van het target-DNA.
PCR is echter geen feilloos systeem. Regelmatig treedt PCR-falen op dat niet te voorzien en niet te voorkomen is, zoals
onspecifieke annealing van primers of jumping-PCR. Indien er naast product van de goede
lengte andere producten zijn ontstaan (i.e. aspecifieke producten, excessief primer dimer of contaminatie) kan er gekozen worden om een extractie van de gel te doen. Hierbij wordt het volledige PCR-product op agarosegel geladen en het product van de juiste lengte geïsoleerd. Wanneer het PCR-product van voldoende concentratie is kan het na opschoning worden gekloneerd.
4.3 Kloneren
Het basisprincipe van kloneren is het inbouwen van één DNA-molecuul uit het PCR-product in een plasmide die wordt ingebracht in een bacteriële cel, meestal van de Escherichia coli-bacterie. Door de omstandigheden te scheppen dat de cel zich kan dupliceren ontstaat een kolonie van cellen die allemaal de gastheer van dat ene molecuul zijn.
Bij PCR met Taq polymerase ontwikkelt zich een overhang van een deoxyadenosine (A) aan het 3’-eind van het product16. Een willekeurig
PCR-product kan zich in een zoutoplossing verbinden (ligeren) met een plasmide vector met het LacZα-gen, omdat dat een
deoxythymidine-overhang (T) heeft. Na enkele
minuten incuberen wordt de ligatiemix toegevoegd aan competente cellen (E. coli). Wat hierna volgt is de transformatie, die na 5 minuten incuberen op ijs en exact 30 seconden in een warmwaterbad (42°C) is voltooid. De cellen hebben hierbij de plasmiden opgenomen. Hierna worden de cellen weer op ijs gezet en worden ze in de gelegenheid gesteld om bij 37°C te groeien. De cellen worden uitgeplaat op ampicillineplaten en een halve dag later zijn hierop tientallen tot honderden kolonies gegroeid, één kolonie per levende cel.
15 Producten (‘dimeren’) van primers die in de
annealingfase aan zichzelf of andere primers zijn gehecht.
16 In het verder dubbelstrengs product wordt aan de
3’-einden van beide strengen een deoxyadenosinegroep aangezet. In de basesequentie staat tegenover deze A geen T.
fig. 3. Goudgele tot bruine verkleuring van de botextracten na het centrifugeren.
fig. 4. Gel na elektroforese. In twee slots (bovenzijde) is een ladder geïnjecteerd (links en rechts),de bands hiervan zijn
Het PCR-product zal niet in alle plasmiden zijn ingebouwd. Kolonies zonder de insert hebben een plasmide met intact LacZα-gen. Aan de platen is X-gal toegevoegd dat door kolonies met het intacte LacZα-gen wordt omgezet. Hierbij treedt een blauwe verkleuring op. Witte kolonies zijn dus de kolonies waarbij het gen gedeactiveerd is omdat er een PCR-product is ingebouwd (fig. 5).
De witte kolonies worden met een pipetpunt aangestipt en losgelaten in een PCR-ep met een kleine hoeveelheid water. Vervolgens worden de cellen kapotgekookt in de thermocycler op een temperatuur van 95°C. Het zogenaamde cel-lysaat wordt vervolgens ingezet in een colony PCR. Het principe van deze reactie verschilt niet van de eerder verrichte PCR-reacties. De primers die in de reactiemix zitten zijn in dit geval echter primers die hechten aan beide zijden van de kloneerlocus. Zo wordt alles geämplificeerd, ongeacht hetgeen gekloneerd is. Een laatste check op fragmentlengte met gel-elektroforese zal naast de waarschijnlijk beoogde producten ook kortere producten laten zien: plasmiden zonder insert of plasmiden waarin een primer dimer is ingebouwd.
Een groot voordeel van kloneren is de kwaliteit van het product. Het DNA-fragmentje
dat in een plasmide is gebracht – en dat kan van een lang geleden uitgestorven diersoort zijn – is feitelijk geen oud-DNA meer, maar is DNA geworden in een levend organisme. Alle typische problemen rond het werken met oud-DNA, zoals PCR-falen, contaminaties en te lage concentraties, spelen in dit stadium geen rol van betekenis meer. Kloneren voorziet de onderzoeker echter vooral in een middel om resultaten te authenticeren. Elke kolonie staat gelijk aan één molecuul uit het PCR-product. Nog een stap in het proces terug betekent het dat meerdere kolonies ook uit verschillende oorspronkelijke moleculen van het extract afkomstig zijn. Elk van die oorspronkelijke moleculen kan hier en daar een beschadigde base hebben gehad, de exacte plaatsen in een molecuul waar schade voorkomt berust immers grotendeels op toeval. Door van de inserts van meerdere kolonies de basevolgorde (sequentie) te bepalen kan geanalyseerd worden welke ‘mutaties’ in de sequenties consistent zijn, en dus authentiek, en welke incidenteel zijn, en dus op DNA-schade duiden.
4.4 Sequencing
Een cycle-sequencingreactie lijkt enigszins op een PCR-reactie. Ook hier wordt Taq gebruikt voor de polymerase. Een verschil is dat sequencing een asymmetrische reactie is waarbij gebruik wordt gemaakt van één primer. Bovendien worden naast dNTPs ook ddNTPs (dideoxynucleotides) aan de reactiemix toegevoegd. ddNTPs zijn vergelijkbaar met
dNTPs, maar zij zijn fluorescent gelabeld en
zodra ze worden ingebouwd stopt de elongatie. Omdat het PCR-product dat wordt gebruikt voor de sequencingreactie vele moleculen bevat zal er een verzameling van enkelstrengsproducten ontstaan van verschillende lengtes, steeds afgesloten door een fluorescente A, T, C of G. Als de reactie goed verloopt zal elke nucleotidepositie van het onderzochte DNA-fragment wel een keer zijn gelabeld. De gelabelde strengen worden na elektroforese op fragmentlengte gesorteerd, wat resulteert in een reeks pieken van verschillende kleuren, samengevoegd in een
elektroferogram. Hieruit kan de basevolgorde
worden gelezen (fig. 6).
fig. 5. Plaat met celkolonies. In witte kolonies is product ingebouwd.
II
DNA-onderzoek Noord-Nederlandse runderen
1 KeuzeverantwoordingHet idee voor de voorliggende DNA-studie is begonnen met het Friezenvraagstuk, in het bijzonder de vraag waar de kustbewoners van de volksverhuizingstijd vandaan kwamen. Dit idee vindt zijn weerslag in onderzoeksvragen 1 en 2. Het vraagstuk zal in hoofdstuk V uitgebreid worden behandeld. Waarom de resultaten van de DNA-analyse over dit thema veel beknopter zijn, is een vraag die alvast te pareren is: er is geen afstemming van de schaal. Als een oplossing van archeologische problematiek wordt gezocht met oud-DNA, moet de schaal van de gebeurtenissen, zowel geografisch als in tijd, corresponderen met de resolutie van het onderzochte oud-DNA. Indien er een omvangrijk corpus aan modern en oud DNA van runderen zou bestaan, zou dit de resolutie kunnen verhogen, maar tot nu toe is populatieonderzoek op die schaal niet mogelijk: we kunnen niet het tracé volgen dat de neolithische, noch de latere koeien met hun migrerende menselijke hoeders door Europa aflegden.
Wel kunnen de gegevens van oud-DNA-studies worden ingepast in ‘wat reeds bekend is’. Zo komen anomalieën aan het licht. Om een extreem voorbeeld te geven: de koeien van vóór de volksverhuizingstijd zouden van een genetisch type kunnen zijn dat bij geen van alle nu levende koeien nog bestaat. Zonder dat je in staat bent een lineage, laat staan een populatie, te volgen, zou je een resultaat hebben dat niet alleen een fylogenetisch belang heeft, maar ook om een archeologische opheldering vraagt.
Bij de invulling van het onderzoek is aan het Friezenvraagstuk weinig aandacht besteed. Dat deel van het onderzoek had bij voorbaat te weinig data om op voort te kunnen bouwen. Andere vraagstukken bleken interessanter om te onderzoeken. Zo is er bijvoorbeeld weinig bekend over de conservatie van DNA in de Nederlandse bodems en terwijl in ons omringende landen vlijtig werd gebouwd aan een genetische kaart van het Europese oerrund, bleef Nederland hierin een lege vlek. Met deze achtergrond is ervoor gekozen naast huisrunderen ook oerrunderen te bemonsteren en monsters te selecteren van verschillende bodemcontexten en skeletonderdelen.
1.1 D-loop, mtDNA
De keuze voor de D-loop op het mitochondriale DNA ligt min of meer vast. Het is momenteel
de meest gebruikte locus voor oud-DNA-onderzoek op oerrunderen en huisrunderen. De methodiek richt zich op een doorlopende sequentie en niet op een verzameling van markers. Met de primerparen wordt gemikt op een productlengte van ongeveer 350 à 400 baseparen met inbegrip van het gedeelte tussen nucleotidenummers 15900 en 16020 (cf. Anderson et al. 1982), dat in sommige andere studies (Beja-Pereira et al. 2006; Pruvost et al. 2007; Mona et al. 2010) onbelicht is.
1.2 Het rund
De keuze om runderen te onderzoeken ter wille van vraagstukken over de migraties van mensen klinkt misschien ongebruikelijker dan het in werkelijkheid is. Sinds de ‘contaminatiecrisis’ in het oud-DNA-vakgebied zijn studies op menselijk DNA gedeeltelijk uit de gratie geraakt, ten gunste van die op dierlijk DNA. Het hoogvariabele gedeelte van het
mtDNA (HVR-1) van mensen is bovendien niet
informatief genoeg om kleinschalige populatiebewegingen te herkennen. De voornaamste oorzaak hiervan is overmatige gene flow die alle patronen heeft uitgewist (Helgason et al. 2000). Ook zijn er praktische problemen: menselijke resten uit Noord-Nederland zijn er onvoldoende. Uit het terpengebied zijn weinig menselijke resten gevonden die van vóór het bewoningshiaat dateren. Het dodenbestel vond in de Romeinse tijd vermoedelijk plaats zonder begraving. Uit het veen is een gering aantal veenlijken bekend uit de bronstijd en ijzertijd en van de pleistocene gronden is niets bewaard gebleven, omdat mensen niet in beekbeddingen werden begraven maar op de ontwaterde en ontkalkte zandgronden of in de nabijheid van keileemruggen.
verweven. Misschien heeft deze verwevenheid zelfs een evolutionaire component, zo kan de verlengde melkgift bij koeien en een lactosetolerantie bij volwassen mensen als co-evolutie worden beschouwd (Groeneveld et al. 2010).
Ten aanzien van het oerrund, het wilde rund, richt het onderzoek zich vooral op de holocene variatie. Dit is meer dan zijdelings ook een archeologisch thema omdat oerrunderen, en grote zoogdieren in het algemeen, zeer afhankelijk waren van de mens. Na de massale sterfte van de grote zoogdieren in laat-pleistoceen kwam in het neolithicum het voortbestaan van de resterende dieren in gedrang door de menselijke populatiegroei, zijn akkers en zijn vee. Hieruit volgt dat de mens invloed heeft gehad op de grootte, de verspreiding en daarmee mogelijk op de genetische variatie van de oerrundpopulaties. 1.3 Noord-Nederland
De mate waarin DNA in Noord-Nederland geconserveerd kan zijn gebleven werd redelijk hoog ingeschat, want het gaat ondanks de landschappelijke diversiteit om een relatief
groot gebied waar de
conservatieomstandigheden voor organisch materiaal in het algemeen goed zijn. In het licht van de neolithisatie en latere pan-Europese culturele tendensen is Nederland interessant omdat het een uithoek is van de schetsmatig voorgestelde zuidoost-noordwest-verspreiding van de neolithische levenswijze. Van het Europese vasteland is de Western Fringe, zoals het laagland van Noordwest-Frankrijk tot Noordwest-Duitsland in fylogenetische studies wel wordt aangeduid, theoretisch een van de
laatste plaatsen waar de nieuwe
ontwikkelingen zich aandienden. Omdat de afstand van Zuidoost-Europa naar Noordwest-Europa met een getal aan kleine bottlenecks (founder effects) gepaard kan zijn gegaan, kan de haplotypesamenstelling bij de aankomst van de huisrunderen en van andere neolithische huisdieren in Noordwest-Europa hebben verschild van die van de oorspronkelijke populaties uit Zuidoost-Europa. Een bewijs in het voordeel van deze hypothetische stelling is er door een tekort aan resultaten van oud-DNA momenteel nog niet.
Ook wat betreft de Noordwest-Europese oerrunderen is de opkomst van het boerenbedrijf een interessant gegeven omdat de komst van de neolithische levenswijze een grove aantasting van de habitat van deze dieren betekende. Een van de mogelijke uitkomsten hiervan kan zijn dat oerrunderen met opzet of op indirecte wijze werden
verdreven. Logischerwijs gebeurde dit vóór de neolithische golf aan, bijvoorbeeld richting de uithoeken van het vasteland, zoals Nederland. De oerrunderen die vanaf de ijzertijd in het
Noord-Nederlandse en het Duitse
kweldergebied voorkomen kunnen onder de druk van de menselijke aanwezigheid hierheen zijn gevlucht, wellicht nog voordat de mens het gebied ging bewonen. Een actieve verdrijving van het oerrund door de mens verklaart echter wel de teruggang die dit dier vertoont vanaf het neolithicum, maar niet het feit dat het dier in Noord-Nederland nog tot in de vroege middeleeuwen weet te overleven en op andere plaatsen in Europa zelfs tot ver in de middeleeuwen.
2 Onderzoeksvragen
Bij het formuleren van de onderzoeksvragen was al bekend dat er bij de interpretatie van de resultaten voorzichtigheid was geboden vanwege de betrekkelijk bescheiden omvang van het onderzoek. De onderzoeksmethode (zie II.4/I.4) is te kostbaar, onvoorspelbaar en arbeidsintensief om een grootschalig onderzoek te kunnen verrichten. De haalbaarheid van de meeste onderzoeksvragen wordt beperkt door statistische problemen, vooral door kleine steekproeven. Tevens is er een afhankelijkheid van de specifieke uitkomsten van de analyse. Zeldzame genetische typen zijn daarbij veel informatiever dan de meest algemene typen. Het ligt daarom bij voorbaat al voor de hand dat niet alle vraagstellingen uitputtend worden beantwoord.
Het is moeilijk om te voorspellen of oud-DNA-analyse over een aantal decennia een standaard onderzoeksmethode gaat worden in de archeologie. Hoewel de nieuwigheid er toch al enige tijd af is, speelt het onderzoek op dit moment in de Noord-Nederlandse archeologie geen rol van betekenis. De eerste, algemene doelstelling (zie onder) is daarom de wenselijkheid en haalbaarheid van toekomstig
mtDNA-onderzoek vast te stellen.
vergelijken zijn de data niet onderscheidend. Noord-Nederland kan slechts worden geïnterpreteerd in een Europees of zelfs wereldwijd kader. Vandaar de tweede doelstelling, die een ideële klank heeft, maar in feite om wederkerigheid vraagt.
2.1 Doelstellingen
A.) Bepalen welke (Nederlandse)
bodemcontexten voor DNA studies geschikt zijn
B.) Uitbreiden van het genetische databestand van oerrunderen en huisrunderen uit archeologische context over Europa, met het doel de beantwoording van de hier vermelde en eventuele toekomstige onderzoeksvragen
2.2 Onderzoeksvragen 1 en 2
1.) Zijn er mitochondriale verschillen tussen de huisrundpopulaties in het terpengebied vóór en ná de bevolkingsleegte (resp. ijzertijd/Romeinse tijd en vroege middeleeuwen)?
2.) Vertoont het mitochondriale DNA van huisrunderen uit het terpengebied uit de periode na de bevolkingsleegte affiniteit met dat van runderen uit een ander gebied?
Deze vraagstellingen sluiten aan op een langlopende discussie in de archeologie van het Noord-Nederlands kustgebied: was er in Friesland en in Groningen een bewoningshiaat aan het eind van de Romeinse tijd en waar kwamen vervolgens de eventuele kolonisten vandaan? Het is duidelijk dat met deze moleculair-genetische studie een patroon wordt gezocht dat niet correspondeert met de (kleine) schaal van de archeologische gebeurtenissen. Als de resultaten van mtDNA-onderzoek uit Noord-Nederland inzicht moeten geven op deze vraagstellingen is het daarom nodig om de schaal te vergroten tot geheel Europa of in ieder geval tot Noordwest- en Centraal-Europa. De reden hiervoor is dat er vanaf het neolithicum weinig variatie in
Europese huisrunderen bestond en
kleinschalige gebeurtenissen, zoals migraties, zich daardoor niet duidelijk aftekenen. De geringe variatie is onder meer het gevolg van een bottleneck voor het rund die bij het begin van de neolithisatie van Europa moet worden geplaatst. Door deze geografische bottleneck zijn slechts een gering aantal haplotypen in Europa vertegenwoordigd: een centraal haplotype van T3 domineert en sporadisch komen andere haplotypen, zoals varianten van T2, voor (Troy et al. 2001). Vanuit deze smalle genetische basis konden nauwelijks patronen ontstaan.
De interne variatie – haplotypen met het mutatiemotief van een cemtraal haplotype, maar daarvan door afzonderlijke mutaties gescheiden – kan volledig post-neolithisch zijn (Bollongino 2006). Ook bij een enorm databestand van huidige runderen zal de post-neolithische variatie in deze haplotypen waarschijnlijk slechts incidenteel een geografisch patroon opleveren. Eventuele vroegere patronen zijn door millennia van gene
flow of genetic drift vervaagd.
Het onderzoek van Troy et al (2001) was overtuigend op grond van de databank die het tot zijn beschikking had. Sindsdien hebben verschillende onderzoeken de databank aangevuld, waarbij bijvoorbeeld oerrunderen zijn gevonden die mitochondriaal bijna vergelijkbaar zijn met huisrunderen (Beja-Pereira et al. 2006; Mona et al. 2010), maar ook huidige Italiaanse runderen met sequenties die niet passen in de haplotypen waaruit alle Europese runderen zouden moeten bestaan (Achilli et al. 2008).
Of de haplotypen of de haplotype-verhoudingen van de runderen uit het noordelijk kustgebied van na het bewoningshiaat affiniteit vertonen met Drente, Saksen, het beneden-Elbe-Wezer-gebied, Sleeswijk-Holstein of Denemarken kan op basis van de huidige gegevens niet worden bepaald. De huidige gegevens die 7000 jaar runderdynamiek moeten verklaren bestaan slechts uit de variatie van enkele honderden huidige runderen en enkele tientallen stuks oud-DNA van runderen. Oude haplotypenverdelingen zijn echter mogelijk geconserveerd gebleven tot en met ca. 1000 n.C.; in de late middeleeuwen en vooral in de moderne tijd zal door het opkomen van de moderne runderrassen een vervlakking in de totale variatie zijn opgetreden.
2.3 Onderzoeksvraag 3
3.) Zijn er mitochondriale aanwijzingen voor lokale introgressie of secundaire domesticatie van oerrunderen?
Hoe weinig er van de mitochondriale overgang van oerrund naar huisrund kan worden gezegd blijkt al uit de constatering dat het oerrund met de haplotypen die leidden tot de taurine huisrunderen alsook het oerrund met het I- of Z-haplotype dat leidde tot de zeboeïne runderen nog niet ontdekt zijn. De laatstgenoemde oerrundpopulatie kwam ongetwijfeld niet in Noord-Nederland voor en de eerste heel waarschijnlijk ook niet. Initiële domesticatie wordt niet in (Noordwest-)Europa verwacht.
Secundaire domesticatie kan wel zijn voorgevallen en incidentele introgressie is zelfs waarschijnlijk. Er bestond voldoende gelegenheid voor een dergelijk toeval, doordat beide groepen runderen naast elkaar leefden. Bij secundaire domesticatie gaat het niet om onafhankelijke domesticatie, maar om bewuste fok met oerrunderen door boeren-samenlevingen die reeds het rund kenden.
mtDNA recombineert niet, dus introgressie kan
alleen worden opgemerkt als de morfologische determinatie een andere is dan de mitochondriale. Dit houdt in dat aanwijzingen voor introgressie tegelijkertijd aanwijzingen kunnen zijn voor een foutieve morfologische determinatie.
Omdat de resultaten op twee manieren kunnen worden uitgelegd, zijn de aanwijzingen voor introgressie tot nu toe niet overtuigend. De impasse kan worden doorbroken als de archeologie en de archeozoölogie duidelijke aanwijzingen zou bieden voor introgressie. Secundaire domesticatie zou echter zichtbaarder zijn voor de archeologie dan incidentele introgressie, bijvoorbeeld door overgangsvormen of een bipolaire verdeling van het botgroottespectrum in de resten van het rundvee. Een bipolaire verdeling kan ook op iets anders duiden, bijvoorbeeld op verschillende seksen, op verschillende ‘rassen’, op import van runderen van afwijkende grootte of op castratie. Als het onderzoek tot ambivalente resultaten leidt, dan zal allereerst de archeologische context en op de tweede plaats de vorm van rundveehouderij in die tijd op die plaats moeten worden onderzocht voordat het als aanwijzing van introgressie kan worden gezien.
2.4 Onderzoeksvraag 4
4.) Komt morfologische en osteometrische soortbepaling overeen met moleculair-genetische soortbepaling?
In het Noord-Nederlands kustgebied komen de resten van oerrunderen onder andere voor in nederzettingscontexten. Dat het daadwerkelijk om oerrund gaat wordt aangetoond door de vondsten van schedels met hoorns, zoals het skelet van Britsum (labcode BRI35). Andere oerrundresten zijn gedetermineerd op basis van botgroottes en maatverhoudingen. Het morfometrische onderscheid is niet absoluut; de botgroottes van oerkoeien en (neolithische) huisrundstieren overlappen. Het mesolithische runderbot, ROS1,van Rosenhof (Dld.) wees erop dat de grootte van oerrundbotten incidenteel sterk kon afwijken van de normale groottes (Scheu et al. 2007). Eerdere onderzoeken (bijv. Degerbøl & Fredskild 1970) schatten de minimale grootte van het oerrund te hoog en en hiermee zag men (kleine) oerrundkoeien over het hoofd.
Als het voorliggende en het toekomstige onderzoek veel morfologische huisrundbotten mitochondriaal als oerrund bestempelt, zonder dat er archeologische aanwijzingen zijn voor introgressie, wijst dit er op dat er geregeld botten van kleine koeien van het oerrund onherkenbaar verscholen kunnen zitten tussen opgegraven botten van huisrunderen.
Aan de andere kant kan het onderzoek leiden tot mitochondriale typen van het huisrund uit botten die morfologisch als oerrund zijn gedetermineerd. Dit zou een aanwijzing kunnen zijn dat ook de groottevariatie van huisrunderen onderschat wordt. De kans hierop is niet groot, omdat van huisrunderen veel meer bekend is over de groottevariatie. In het beschikbare materiaal zou zoiets zich voor kunnen doen in het terpengebied in de Romeinse tijd. Het inheemse rund was destijds zeer klein. Een bovenmaats runderbot uit deze periode dat toch niet van een oerrund blijkt te zijn, zou afkomstig kunnen zijn van een castraat, een incidentele ‘mutant’ of van een uit het Romeinse Rijk geïmporteerd rund.
2.5 Onderzoeksvraag 5
5.) Tot welke genetische haplotyp(en) behoren de Noord-Nederlandse oerrunderen en wat kan op basis hiervan worden gezegd over de holocene variatie?
