WRKY transcription factors involved in salicylic acid- induced defense gene expression
Verk, M.C. van
Citation
Verk, M. C. van. (2010, June 15). WRKY transcription factors involved in salicylic acid-induced defense gene expression. Retrieved from
https://hdl.handle.net/1887/15688
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/15688
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
Samenvatting 7
139
7
SAMENVATTING
D
oor de voortdurende blootstelling aan verschillende vormen van stress, hebben planten verfijnde mechanismen ontwikkeld die een verscheidenheid aan verdedigingsreacties oproepen. Afweerprogramma’s ter bestrijding van ziekteverwekkers worden gereguleerd via drie belangrijke signaaltransductie-routes, de salicylzuur (SA), jasmonaat (JA) en ethyleen (ET) signaalroute. De huidige kennis van de SA, JA en ET biosynthese en de regulatie van de afweer reacties die door deze signaalmoleculen worden aangestuurd, wordt besproken in Hoofdstuk 1.De SA signaaltransductie-route, geïnitieerd door een aanval van biotrofe ziekteverwekkers, leidt tot een breed-spectrum resistentie tegen een veelheid aan ziekteverwekkende schimmels, bacteriën en virussen en staat bekend als systemisch verworven resistentie (SAR). Een van de kenmerken van SAR is de ophoping van PR-eiwitten en de geïnduceerde expressie van het PR-1 gen dat vaak wordt gebruikt als een marker voor SAR.
In Hoofdstuk 2 is gebruik gemaakt van een cDNA-bibliotheek van tabaksmozaïekvirus (TMV) geïnfecteerde tabaksplanten om met behulp van het “yeast-one-hybrid” systeem te zoeken naar eiwitten die kunnen binden aan de PR-1a promotor van tabak. Deze screening heeft geleid tot de identificatie van NtWRKY12, een eiwit dat behoort tot de groep van WRKY transcriptiefactoren.
Gedetailleerde expressiestudies van het NtWRKY12 gen toonden aan dat de inductie van NtWRKY12 parallel verloopt met de expressie van PR-1a, wat een verband suggereert tussen de regulering van beide genen. De expressie van NtWRKY12 werd geïnduceerd na besproeien van planten met SA, na infectie met tabaksmozaïekvirus en na infiltratie van blad met Agrobacterium tumefaciens of Escherichia coli.
Voor het ophelderen van de bindingsplaats van NtWRKY12 in de PR-1a promotor hebben we gebruik gemaakt van “Electro mobility shift assays” (EMSA) met PR-1a promotor fragmenten.
Door mutatie analyse is de basevolgorde TTTTCCAC gekarakteriseerd als de bindingsplaats. Deze sequentie wijkt sterk af van de consensus WRKY eiwitbindingsplaats TTGAC[C/T] (W-box), en daarom hebben wij deze bindingplaats ‘WK-box’ genoemd. De WK-box (WK1-box) ligt dichtbij een as-1 element dat fungeert als bindingsplaats voor TGA transcriptiefactoren, en in de buurt van een MBSII element dat wordt gebonden door een MYB transcriptiefactor. Verder stroomopwaarts in de promoter van PR-1a ligt een tweede WK-box (WK2-box).
Het functionele belang van de WK-box en de as-1 en MBSII elementen werd geëvalueerd met behulp van PR-1a promotor::GUS reporterconstructen. Het effect van mutaties in de bindingsplaatsen werd bestudeerd in stabiel getransformeerde tabaksplanten na besproeien met SA en na agroinfiltratie van tabaksbladeren met A. tumefaciens, welke in de plant een PR-1a::GUS construct tot expressie bracht. Uit deze experimenten is gebleken dat de WK1-box voor een belangrijk deel bijdraagt aan de geïnduceerde PR-1a genexpressie, terwijl de as-1 en MBSII elementen veel minder belangrijk waren voor de expressie. Gecombineerde mutatie van de WK-box en het as-1 element schakelde de geïnduceerde PR-1a promotor GUS expressie volledig uit. Een meer direct bewijs dat NtWRKY12 noodzakelijk was voor PR-1a geïnduceerde genexpressie kwam uit transactiveringsexperimenten in
140
7
Arabidopsis protoplasten met behulp van 35S::NtWRKY12 en PR-1a promotor::GUS constructen.
De nabijheid van het as-1 element en de WK-box in de PR-1a promotor suggereerde dat eiwit-eiwit interacties kunnen optreden tussen NtWRKY12 en TGA transcriptiefactoren. Deze mogelijkheid is nader onderzocht in Hoofdstuk 3. Met behulp van in vitro “pull-down” en in vivo ”Fluorescence Resonance Energy Transfer” experimenten werd aangetoond dat NtWRKY12 specifiek een interactie aangaat met TGA2.2. Er is kon geen interactie gevonden worden tussen het nauw verwante TGA2.1 en NtWRKY12.
Verdere analyses in Arabidopsis protoplasten bevestigden dat NtWRKY12 en TGA2.2 een additief effect hebben op PR-1a::GUS expressie. Huidige modellen voor transcriptionele activering van het PR-1 gen van Arabidopsis impliceren de interactie van co-activator NPR1 met TGA eiwitten op de promotor. Echter, co-expressie met tabaks NPR1 kon de reporter genexpressie niet verder verhogen, en de transactiveringsexperimenten in protoplasten uit npr1-1 planten toonden aan dat activering van de tabaks PR-1a promotor onafhankelijk is van endogeen NPR1. Bovendien, uit bepalingen met protoplasten waarin vier functionele Arabidopsis TGAs ontbreken, bleek dat NtWRKY12 gestuurde activering van de PR-1a promotor onafhankelijk is van endogene TGAs. Dit ondersteunt het idee dat NtWRKY12 de belangrijkste transcriptionele activator is van PR-1a expressie.
Een toenemende hoeveelheid genetische gegevens duidt erop dat WRKY transcriptiefactoren een rol spelen in de regulatie van de verdedigingsreacties die door SA, JA en ET signaaltransductieroutes worden gestuurd. Voor de meeste van deze transcriptiefactoren is hun betrokkenheid bij de verdediging afgeleid uit “gain of function” of “loss of function” mutanten en zijn er geen directe target genen geïdentificeerd. De sterke temporale correlatie van de geïnduceerde expressie profielen van NtWRKY12 en PR-1a deed ons besluiten via een bioinformatica-gerichte aanpak nieuwe verbanden te onderzoeken tussen transcriptiefactoren en genen betrokken bij de biosynthese van SA, JA en ET en hun signaaltransductieroutes in Arabidopsis. In Hoofdstuk 4 gebruikten we publiekelijk beschikbare datasets afkomstig van “micro-arrays” gerelateerd aan stress. Allereerst werd de optimale Pearson correlatiecoëfficiënt (PCC) cutoff vastgesteld voor de identificatie van biologisch relevante co-expressie gegevens. Met behulp van deze PCC cutoff, werd een co-expressienetwerk gebouwd, bestaande uit genen die betrokken zijn bij SA, JA en ET biosynthese en signaaltransductie, zoals beschreven in Hoofdstuk 1, aangevuld met een grote set van genen die coderen voor verschillende klassen van transcriptiefactoren. De co-expressie gegevens afkomstig uit het netwerk resulteerden in een aantal links tussen transcriptiefactoren en componenten uit signaaltransductieroutes die eerder zijn gerapporteerd in de literatuur, wat de validiteit van het geconstrueerde netwerk ondersteunt.
Daarnaast vonden we een groot aantal voorheen onbekende verbanden tussen genen die toekomstig onderzoek aan de complexe signaaltransductie en regulatie mechanismen in de stress respons verder kunnen helpen ontrafelen.
Een van deze nieuwe verbanden bestaat uit de gecoreguleerde genen coderend voor transcriptiefactor WRKY28 en isochorismaat synthase 1, een belangrijk enzym van de SA biosynthese. Een andere link is de co-regulering van WRKY46 en PBS3, welke codeert voor een andere component van de SA biosyntheseroute. Hoofdstuk 5 beschrijft de biochemische analyses ter bepaling van de relevantie van deze transcriptiefactoren voor de expressie van de ICS1 en PBS3 genen. Met behulp van
141
7
transactiveringsexperimenten in Arabidopsis protoplasten met promotor::GUS fusies en qRT-PCR analyses werd aangetoond dat WRKY28 en WRKY46 respectievelijk ICS1 en PBS3 genexpressie kunnen activeren. Uit daaropvolgende EMSA- en chromatine immunoprecipitatie experimenten bleek dat WRKY28 bindt aan sites in de ICS1 promotor die verschillen van de consensus W-box.
