University of Groningen. Epidermolysis bullosa simplex Bolling, Maria Caroline

Epidermolysis bullosa simplex Bolling, Maria Caroline

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date:

2010

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

Bolling, M. C. (2010). Epidermolysis bullosa simplex: new insights in desmosomal cardiocutaneous syndromes. s.n.

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

Nederlandse samenvatting (Dutch summary)

MC Bolling

Centrum voor Blaarziekten, Afdeling Dermatologie,

Universitair Medisch Centrum Groningen, Rijksuniversiteit Groningen,

Groningen, Nederland

Het Centrum voor Blaarziekten in Groningen (afdeling Dermatologie, Universitair Medisch Centrum Groningen) is het expertise centrum voor erfelijke en verworven blaarziekten in Nederland. Op 1 oktober 2009 stonden 248 niet-gerelateerde patiënten/families met een erfelijke huidfragiliteit (bulleuze genodermatose) geregistreerd in onze database. De meerderheid van deze patiënten heeft een vorm van epidermolysis bullosa (EB). EB is de verzamelnaam voor een groep erfelijke blaaraandoeningen gekarakteriseerd door blaarvorming en erosies van de huid, en soms ook van de slijmvliezen, meestal vanaf de geboorte of beginnend in de eerste levensjaren. Bij EB is de verbinding tussen de epidermis (= opperhuid) en de dermis (= onder- of lederhuid), of tussen de huidcellen (= keratinocyten) in de epidermis, verstoord, doordat moleculen die belangrijk zijn voor deze hechting afwezig of defect zijn. Deze defecte moleculen ontstaan door een mutatie (= ziekte veroorzakende verandering in DNA) in het gen (= stuk DNA) dat codeert voor deze eiwitten. Door de verstoorde verbinding treedt gemakkelijk loslating op met blaarvorming als gevolg. Het geringste trauma kan soms al genoeg zijn voor de vorming van blaren en wonden. De kennis over EB en de pathogenese (= wijze van het ontstaan van ziekte) is de laatste tientallen jaren sterk toegenomen. Observaties en studies betreffende EB patiënten die het Centrum voor Blaarziekten in Groningen bezochten, hebben hieraan bijgedragen. In de laatste EB consensus (Wenen, 2007) is overeengekomen om EB onder te verdelen in vier hoofdtypen, gebaseerd op het niveau van de blaarvorming in de huid: EB simplex (EBS) met intraepidermale blaarvorming, junctionele EB (JEB) met een split door de lamina lucida, dystrophische EB (DEB) met blaarvorming in de sublamina densa zone, en Kindler syndroom met een gemengd-type blaarniveau (zie figuren 1 en 2, en tabel 1).¹

Figuur 1. De verschillende blaarniveaus in de huid van patiënten met één van de hoofdtypes van EB. In EBS ligt het splijtingsniveau intraepidermaal (suprabasaal of basaal). Bij junctionele EB (JEB) ligt het blaarniveau in de lamina lucida. Bij dystrophische EB (DEB) bevindt de blaar zich onder de lamina densa (sublamina densa), in de dermis. De splijting in de huid van patiënten met Kindler syndroom kan op verschillende niveaus plaatsvinden. Met dank aan M.F. Jonkman.

DEB Kindler

syndrome JEB

EBS

suprabasal basal

Tabel 1. EB classificatie volgens de laatste consensus¹

Niveau blaar Hoofdtype EB Subtype EB Gemuteerde eiwitten

Intraepidermaal (‘epidermolytisch’) EBS

Suprabasale EBS Plakophiline-1; desmoplakine; ?

Basale EBS Keratine 5 and 14 (zeldzaam: plectine, integrine α6β4, BP180)

Intralamina lucida

(‘lucidolytisch’) JEB JEB-H Laminine-332

JEB, anders Laminine-332, BP180, integrine α6β4 Sublamina densa

(‘dermolytisch’) DEB Dominante DEB Type VII collageen Recessieve DEB Type VII collageen

Gemengd Kindler syndroom - FFH-1 (Kindlin-1)

De verschillende vormen van EB met de bijbehorende niveaus van blaarvorming zijn terug te leiden naar het onderliggende moleculaire defect (zie tabel 1 en figuur 2). Mutaties in 13 verschillende genen veroorzaken de verscheidene types van EB. Mutaties in de genen die coderen voor de eiwitten die van belang zijn om de cellen in de epidermis bij elkaar te houden, zoals desmoplakine, leiden tot defecten in deze eiwitten en zijn de oorzaak van suprabasale EBS. De moleculen die het celskelet vormen van de basale epidermale cellen, keratine 5 (K5) en 14 (K14), zijn defect in basale EBS. JEB wordt veroorzaakt door afwezigheid van, of defecten in, type XVII collageen (ook wel BP180 genoemd), laminine-332 of integrine α6β4.

Deze eiwitten vormen onderdeel van het hemidesmosoom, een belangrijke structuur die de basale epidermale keratinocyten verbindt met het onderliggende bindweefsel van de dermis.

DEB patiënten hebben mutaties in het gen COL7A1, coderend voor type VII collageen, dat zich bevindt in het bovenste deel van de dermis. Het Kindler syndroom (KS) wordt veroorzaakt door mutaties in het FERMT1-gen waardoor het eiwit fermitin-family-homologue-1 (FFH-1, of ook wel kindlin-1 genoemd), afwezig is of niet meer functioneert. FFH-1 bevindt zich in de focal adhesion. De focal adhesion is een structuur die het actine-skelet van de basale keratinocyt met de basaalmembraan en de onderliggende dermis verbindt, net zoals het hemidesmosoom dit doet voor het keratineskelet. FFH-1 heeft echter een breder arsenaal aan functies, gezien de verschillende niveaus van splijting in de huid van patiënten met KS en het klinisch beeld, dat behalve huidfragiliteit, ook huidatrofie en zonlichtovergevoeligheid omvat.

Vele inzichten in het functioneren van normale weefsels en de pathogenese van ziekten zijn voortgevloeid uit het bestuderen van aandoeningen. Pasmooij et al. hebben de non-Herlitz JEB patiënten met mutaties in de eiwitten type XVII collageen (gen: COL17A1) en laminine-332 (genen: LAMA3, LAMB3, LAMC2), die sinds 1989 het Centrum voor Blaarziekten in Groningen hebben bezocht, beschreven.^{2, 3} Van den Akker et al. hebben de DEB-patiënten met mutaties in type VII collageen (gen COL7A1) uit de Groninger EB-database beschreven.⁴

Figuur 2. Schematische weergave van het hemidesmosoom-adhesie-complex (rechts) en het focal adhesion- complex (links). Mutaties in de genen die coderen voor de eiwitten aangegeven in kleur veroorzaken de verschillende varianten van EB (zie ook tabel 1). Met dank aan M.F. Jonkman.

Het begin van het onderzoek beschreven in mijn proefschrift omvatte de analyse van de groep patiënten met een basaal intraepidermaal blaarniveau (basale EBS) uit Nederland (en België) die onze afdeling Dermatologie (Universitair Medisch Centrum Groningen) bezochten sinds 1989. Vereisten voor inclusie waren dat huidbiopten (ter bevestiging van het blaarniveau, en om eiwitexpressie te kunnen onderzoeken) en DNA (voor mutatieanalyse) beschikbaar waren. De EBS populatie in onze database is qua aantal ongerelateerde patiënten de grootste EBS populatie beschreven tot nog toe. Verder is dit ook de enige EBS-populatie waarin in alle patiënten het blaarniveau is bevestigd in een huidbiopt. Het leek ons daarom informatief om de klinische kenmerken van de verschillende EBS patiënten te vergelijken en hierbij de resultaten van de keratine 5 en keratine 14 mutatie analyse te betrekken. Het doel was om te kijken in hoeverre het klinisch beeld bepaald wordt door de lokatie en de aard van de mutatie in het gen, en om ideeën te krijgen voor mogelijke additionele beïnvloedende factoren die in de toekomst een ingang voor behandeling kunnen vormen (hoofdstukken 2 en 3). Met de reguliere DNA mutatiescreeningstechniek (single exon amplificatie en direct sequencing) werd in een kwart van het totale aantal EBS patiënten géén mutatie in keratine 5 of 14 gevonden (zie ook hoofdstuk 2). Zodoende werd een volgend doel voor dit proefschrift geformuleerd,

namelijk: het identificeren van het onderliggende gendefect in deze groep EBS patiënten met wildtype (=normaal) KRT5 en KRT14 genen. Aangezien de mogelijkheid tot behandeling van het onderliggende gen- en/of eiwitdefect dichterbij de realiteit lijkt te komen, wordt de identificatie van de etiologie van genetische aandoeningen belangrijker dan ooit.

Verder worden in dit proefschrift een aantal patiënten/families beschreven die, sommigen naast het hebben van EBS, een fenotype (=uiterlijke kenmerken) vertoonden dat niet te verklaren was met de huidige kennis (hoofdstukken 4-8). De patiënten beschreven in hoofdstukken 5, 7 en 8 hadden een zogenaamd cardiocutaan syndroom, met zowel huidfragiliteit als hart problematiek welke niet toe te schrijven was aan triviale oorzaken, en al op jonge leeftijd aanwezig was. Het doel van deze studies was om het onderliggende gendefect te identificeren om daarmee nader inzicht te krijgen in de pathogenese. In hoofdstuk 6 is een overzicht gegeven van de huidige kennis in de onderzoeksgebieden van de cardiogenetica en de genodermatosen betreffende defecten in de structuur die de huidcellen, maar ook de hartcellen, bij elkaar houdt: het desmosoom. Het resultaat van defecten in eiwitten die gedeeld worden door desmosomen in huid en hart zijn de zogenaamde desmosomale cardiocutane syndromen. Het doel van deze review was om de huidige kennis in beide onderzoeksgebieden wat betreft dezelfde eiwitten betrokken bij cel-cel contacten, te vergelijken en verbanden te leggen om zodoende een beter begrip te verkrijgen in de functies van deze eiwitten, de structuren waartoe zij behoren, en de pathogenese van de geassocieerde ziekten.

In hoofdstuk 1 wordt een algemene inleiding op dit proefschrift gegeven. De structuur van de huid, met in detail de cel-cel (desmosomen, adherens en tight junctions, gap junctions) en cel-dermis (hemidesmosoom, focal adhesion) verbindingen, worden besproken, evenals de huidige kennis betreffende de functie van de eiwitten die betrokken zijn bij EB. Op de keratines, het hemidesmosomale eiwit plectin, en het desmosomale eiwit desmoplakine wordt dieper ingegaan, omdat deze eiwitten onderwerp zijn van meerdere hoofdstukken in dit proefschrift.

In het kort: plectine is een eiwit dat in vele weefsels tot expressie komt, waaronder huid, hart en skeletspier. In de huid is plectine zowel aanwezig in het hemidesmosoom als in het desmosoom.

Deze beide structuren verankeren het keratine-skelet aan de cel membraan. Het belang van plectine voor de huidintegriteit blijkt wel uit plectine-knockout muizen en patiënten met mutaties in plectine. Beiden hebben huidfragiliteit in meer of mindere mate van ernst, mede afhankelijk van de mutatie. Soms komen daarbij ook afwijkingen in andere weefsels voor, zoals de spier, ook weer afhankelijk van de aard en de lokatie van de mutatie. Desmoplakine behoort tot dezelfde eiwitfamilie als plectine en is een belangrijk eiwit in het desmosoom. Desmoplakine is essentieel voor de verankering van het keratine-skelet aan het desmosoom, en dientengevolge de celmembraan. De staart van desmoplakine verankert keratinefilamenten, en de kop bindt aan plakoglobine en plakophiline in de desmosomale plaque. Deze eiwitten binden op hun beurt weer aan de transmembrane eiwitten, de cadherines, welke de extracellulaire cel-cel verbinding vormen van het desmosoom. Desmoplakine is dus een belangrijke schakel in deze keten (zie

ook figuur 6). De keratines vormen een robuust, maar toch ook flexibel skelet dat stevigheid en stressbestendigheid aan de huidcellen biedt. In de basale keratinocyten zijn dit K5 en K14, in de suprabasale keratinocyten K1 en K10. Deze eiwitten bestaan als heterodimeren (K5 met K14, en K1 met K10), die via een zelfassemblerend proces een stevig netwerk vormen (figuur 3).

Hoofdstuk 1 introduceert tevens EB en de nieuwste classificatie, evenals een andere erfelijke keratineaandoening: epidermolytic ichthyosis (EI, betrokken eiwitten: K1 (gen: KRT1) en K10 (gen: KRT10)), welke onderwerp is in hoofdstuk 4.

Figuur 3. Boven: de K5/K14 heterodimeer. De α-helix structuur van de rod domeinen ‘dwingt’ de beide keratines in een parallelle spiraalvorm. De α-helix van het rod domein wordt onderbroken door linker domeinen en een stutter. Onder: keratine skelet formatie. K5 en K14 vormen obligate heterodimeren.

Twee van deze heterodimeren binden anti-parallel en vormen een tetrameer. Door middel van laterale associatie vormen zich de zogenaamde ‘unit-length filaments’ (ULFs), die vervolgens longitudinaal binden tot een filament. Voor de initiële heterodimeer en tetrameer formatie zijn de uiteinden van coil 1A en coil 2B belangrijk: de zogenaamde helixinitiatie en helixterminatie motieven. Mutaties in deze domeinen veroorzaken dan ook het ernstige EBS-DM.

K5 K14

K5-K14 parallele heterodimeer

K5-K14 anti-parallelle tetrameer

NH COOH

Laterale associatie van tetrameren tot ULFs

Longitudinale binding van ULFs tot filamenten

H1 1A 1B 2A 2B H2

HIM L1 L2 L12 HTM

rod

head tail

K14 tail (52)

Coil 1A Coil 1B Coil 2A Coil 2B

K14 head (114) K5 head (167)

st L1 L2

L12 K5/K14

K5 tail (115) st

In hoofdstuk 2 wordt een overzicht gegeven van de basale EBS populatie die het Centrum voor Blaarziekten in Groningen heeft bezocht sinds 1989. Alle patiënten met een klinisch beeld van EBS, bevestigd door middel van een basaal intraepidermaal splijtingsniveau in een huidbiopt, waarvan tevens DNA beschikbaar was voor mutatieanalyse, werden geïncludeerd. Vijfenzestig niet-gerelateerde EBS patiënten voldeden aan deze vereisten. Huidbiopten waren beschikbaar voor electronenmicroscopie (EM) en immuunfluorescentie analyse. Zoals al genoemd, basale EBS wordt voornamelijk veroorzaakt door autosomaal dominante mutaties in de genen KRT5 and KRT14 coderend voor de eiwitten K5 en K14. Deze keratines vormen het skelet van de keratinocyten in de basale epidermale lagen. Het proces van keratine bundeling tot een sterk en robuust filament netwerk wordt negatief beïnvloed door de mutaties. De cellen zijn hierdoor minder bestand tegen invloeden van buitenaf. Scheuring van de cellen en blaarvorming door triviaal trauma is het gevolg. De ernst en aanvang van de blaarvorming kan aanzienlijk variëren per EBS patiënt en drie ‘major’ klinische EBS subtypen worden onderscheiden (figuur 4).

Figuur 4. Foto’s van de verschillende drie klinische subtypes van EBS: EBS-loc, EBS-gen, en EBS-DM. EBS-MP (EBS met pigmentatie spots) en EBS-migr (EBS met migratoir circinair erythema en vesikels) zijn zeldzamere klinische subtypen van EBS. Rechtsonder een elektronenmicroscopische foto van de keratine klontering (aggregatie) die gezien wordt in huidbiopten van patiënten met EBS-DM.

Gelokaliseerde EBS (EBS-loc) is de meest milde vorm met blaarvorming beperkt tot handen en voeten, meestal beginnend op de peuterleeftijd wanneer het kind gaat lopen. EBS Dowling Meara (EBS-DM) is de ernstigste vorm en wordt gekenmerkt door gegeneraliseerde blaarvorming vanaf de geboorte in een karakteristieke gegroepeerde formatie op rode huid, met vaak slijmvlies betrokkenheid en blaarvorming onder de nagels met nagel verlies. Dit kan zo ernstig zijn dat het kind overlijdt. De ernst van de blaarvorming neemt af na de puberteit, echter dan ontwikkelt zich vaak overmatige eeltvorming op de handpalmen en voetzolen (palmoplantaire keratoderma). Keratineklontering zichtbaar bij EM analyse van een huidbiopt

loc gen DM

MP migr DM

is een diagnostisch kenmerk voor EBS-DM. Tussen EBS-loc en EBS-DM ligt gegeneraliseerde EBS non-DM (EBS-gen) met generaliseerde, niet-gegroepeerde blaren, meestal beginnend in de eerste levensweken tot -maanden. De keratineklontering is niet aanwezig in huidbiopten van EBS-gen patiënten.

In de studie beschreven in hoofdstuk 2 heb ik de gevonden KRT5 en KRT14 mutaties en de fenotypes van onze basale EBS patiënten vergeleken met alle voorheen gerapporteerde mutaties in deze genen (zoals beschreven in de Human Intermediate Filament Database, www.interfil.org).⁵ Drie hoofdbevindingen van deze studie zal ik hier noemen: 1) een hoog percentage (39%) de novo mutaties, dat wil zeggen: beide ouders dragen de mutatie niet; 2) er is een correlatie tussen de locatie van de mutatie in de K5 en K14 eiwitten en het klinische EBS subtype; en 3) in 25% van de niet-gerelateerde patiënten/families werd geen mutatie gevonden in de genen KRT5 en KRT14.

Ad 1) het hoge percentage de novo mutaties kan verschillende oorzaken hebben:

non-paterniteit en kiembaanmosaïcisme zijn mogelijkheden. Een andere mogelijkheid is dat op weefselniveau weinig veranderingen in de zeer geconserveerde keratines getolereerd worden en dat vrijwel elke verandering resulteert in een EBS fenotype. Met andere woorden: mogelijk reflecteert het hoge percentage de novo mutaties de hoge mutatiefrequentie in dit gedeelte van het humane genoom gedurende reproductie.

Ad 2) De gevonden correlatie tussen het genotype en het fenotype in onze EBS patiëntengroep bevestigt voorgaande observaties in andere EBS populaties, en wanneer alle tot op heden gerapporteerde mutaties tezamen genomen worden. Patiënten met het ernstigste fenotype, EBS-DM, dragen mutaties in de delen van K5 en K14 die belangrijk zijn in de eerst stappen van keratinefilament (vezel) formatie tot een robuust netwerk (figuur 3).

De klontering (of aggregatie) van keratines in de huidcellen in EBS-DM patiënten (zie ook figuur 4) reflecteert de verstoorde filament formatie, hoewel het exacte mechanisme achter het ontstaan van de keratine klontering nog niet geheel duidelijk is. Mutaties in de meer centrale delen van de keratines leiden tot mildere fenotypes, en mutaties in de minder goed geconserveerde (= gedurende evolutie behouden) uiteinden van keratines leiden tot fenotypes met andere kenmerken dan huidfragiliteit, zoals hyperpigmentatie. Bovengenoemde correlatie is echter niet 100% en verschillende uitzonderingen werden opgemerkt. Bijvoorbeeld, missense mutaties (puntmutaties, enkele aminozuurveranderingen) in hetzelfde domein van K5/K14, en zelfs in hetzelfde aminozuur, kunnen verschillende fenotypes veroorzaken. Bovendien werd fenotypische variatie binnen dezelfde familie, en variatie tussen ongerelateerde patiënten met dezelfde mutatie, geobserveerd. Variatie in de ernst van blaarvorming naar gelang de omgevingstemperatuur en luchtvochtigheid, de afname van blaarvorming gedurende koortsende ziekte en de verbetering gedurende het leven in het algemeen, wijzen op een complexe interactie tussen genetische, epigenetische, en omgevingsfactoren. Opheldering van deze beïnvloedende factoren kunnen mogelijkheden bieden voor behandeling. Dit wordt bediscussieerd in hoofdstuk 2, evenals in de algemene discussie in hoofdstuk 9.

Ad 3) In 25% van de EBS patiënten/families (16 van de 65) werd geen mutatie gevonden in de genen KRT5 en KRT14. Een dergelijk percentage KRT5/KRT14-mutatie-negatieve EBS patiënten werd gevonden in de Engelse EBS populatie (persoonlijke communicatie Prof.

E.B. Lane, Dundee, United Kingdom). Wij hebben de reguliere KRT5 en KRT14 genomische DNA mutatieanalyse uitgebreid met analyses van de lengte van de complete genomische sequenties van de KRT5 en KRT14 genen, evenals analyses van de lengte van de KRT5 en KRT14 RNA- transcripten. Hierbij werden geen aanwijzingen gevonden voor mutaties die gemist zouden kunnen worden met de reguliere genomische DNA mutatieanalyse (single exon amplificatie + sequencing). Voorbeelden hiervan zijn grotere heterozygote in-frame deleties of inserties/

duplicaties, of intronische mutaties die de splicing (= proces waarbij niet coderende sequenties (intronen) uit de RNA transcripten worden ‘geknipt’) beïnvloeden en mogelijk tot een prematuur stop-codon leiden met een afwijkend, of zelfs afwezig, eiwit als gevolg. Verder hebben we gekeken naar K5 en K14 eiwit expressie in huidbiopten van de betreffende patiënten met behulp van immuunfluorescentie microscopie. Dit liet ook geen afwijkingen zien. Al met al suggereren deze data genetische heterogeniteit (= andere genen betrokken) in EBS. Andere opties zijn epigenetische processen (= overerfbare veranderingen in genfunctie zonder dat veranderingen in de DNA sequentie optreden) die de expressie en het functioneren van K5 en K14 beïnvloeden, copy-number variaties van de complete KRT5 of KRT14 genen, of complexe recombinaties van het genomische DNA. Deze opties zijn onderwerpen voor mogelijk toekomstig onderzoek.

In hoofdstuk 3 wordt één van bovengenoemde mogelijkheden onderzocht:

genetische heterogeniteit. Een goede kandidaat hiervoor was het gen PLEC1 dat codeert voor het cel-cel en cel-matrix linker eiwit plectine. Waarom plectine? Ten eerste gezien de lokalisatie en functie van plectine in de huid, namelijk verankering van K5 en K14 aan het hemidesmosoom (structuur die de basale keratinocyt verbindt met de onderliggende extracellulaire matrix van de dermis). Ten tweede is een dominante plectine puntmutatie beschreven die leidde tot een EBS fenotype dat nauwelijks te onderscheiden was van EBS door mutaties in K5 en K14.⁶ Deze dominante plectine mutatie werd gevonden in een grote Noorse familie en een ongerelateerde Duitse familie. Het fenotype werd EBS-Ogna genoemd, naar de Noorse plaats waar de voorvader van de eerste familie vandaan kwam.⁷ De PLEC1 mutatie analyse in de 16 Nederlandse EBS patiënten zonder K5 of K14 mutatie leverde in vier families een mutatie op (25%). Deze data impliceren dat naast mutaties in de genen KRT5 en KRT14, PLEC1 mutaties een derde belangrijke oorzaak voor EBS zijn.

In hoofdstuk 4 wordt een drietal families beschreven met een mutatie in een ander keratine, K1. K1 vormt samen met K10 het celskelet van de keratinocyten in de hogere lagen van de epidermis. Normaalgesproken zijn mutaties in K1 geassocieerd met een fenotype genaamd epidermolytische ichthyosis (EI, voorheen epidermolytische hyperkeratosis (EHK), of bulleuze congenitale ichthyosiforme erythrodermie (BCIE) genoemd). Klassieke EI wordt klinisch gekenmerkt door ernstige neonatale erythrodermie, blaarvorming en fragiele huid in de vroege kindertijd, welke gedurende de eerste levensjaren snel afnemen, gevolgd door

generaliseerde dikke schilfering en hyperkeratosis. De drie Nederlandse families beschreven in hoofdstuk 3 hadden een relatief mild fenotype met voornamelijk palmoplantaire keratoderma, peelingachtige huidafwijkingen, soms blaarvorming en géén erythrodermie bij de geboorte.

De gevonden puntmutatie, p.Asp340Gly was nog niet eerder beschreven en bevond zich in een zogenaamd linker domein, de L12, van K1. Linker domeinen zijn de delen van het keratine-eiwit die de α-helix structuur van het rod domein onderbreken (zie figuur 3). De exacte functie van deze domeinen voor keratinefilament en -skelet formatie, is niet bekend. Alle K1 en K10 mutaties in ogenschouw nemend is slechts één andere mutatie beschreven in een linker domein, en deze mutatie was ook gelokaliseerd in de L12 van K1. Die mutatie was eveneens geassocieerd met een atypisch, mild fenotype. Door middel van transfectie-studies met deze beide K1 L12 mutaties in keratinecellijnen, hebben we laten zien dat deze mutaties een mutilerend effect hebben op het keratineskelet van de cellen. Dit effect werd versterkt door het appliceren van hypo-osmotisch stress aan de cellen. Deze studie bevestigt de pathogeniciteit van mutaties in dit domein in vitro. De drie families waren uit verschillende delen van Nederland afkomstig, en kenden elkaar bij navraag niet. Haplotypering en genealogisch onderzoek werden verricht om te kijken of zij een gemeenschappelijke voorouder deelden, of dat de mutaties in deze families onafhankelijke gebeurtenissen waren. De onderzoeken gaven aan dat in elk geval twee families een gemeenschappelijke voorouder hadden aan het einde van de 18^e eeuw. De derde familie is hoogstwaarschijnlijk ook gerelateerd aan de andere twee families, maar gezien het kleinere gedeelte van het genoom dat gedeeld wordt, zou de gemeenschappelijke voorouder dan van vóór 1700 zijn.

In hoofdstuk 5 wordt een uitzonderlijke patiënt met Kindler syndroom (KS) beschreven.

KS is een zeldzame autosomaal recessieve genodermatosis die sommige kenmerken, zoals huidfragiliteit, deelt met EB, hoewel KS ook alle kenmerken van een poikiloderma heeft, zoals huidatrofie, fotosensitiviteit, en pigmentverschuivingen. KS wordt veroorzaakt door mutaties in het FERMT1-gen (ook wel KIND1 genoemd). Deze mutaties leiden tot functieverlies van het eiwit fermitin-family-homologue-1 (FFH-1, of ook wel kindlin-1). Dit eiwit heeft een belangrijke functie in integrine regulatie en ‘outside-in’ signalering ter plaatse van de basaalmembraan, en de verankering van actine filamenten aan de extracellulaire matrix van de dermis (in een structuur genaamd de ‘focal adhesion (FA)’). De expressie van FFH-1 is beperkt tot epithelia, zoals de huid, slijmvliezen, het urineweg- en het darmstelsel. KS is de eerste erfelijke aandoening door een defect in FAs. De patiënt beschreven in hoofdstuk 5 is de oudste en één van de ernstigst aangedane KS patiënten beschreven in de literatuur tot op heden. Vrijwel alle mucocutane kenmerken van KS waren aanwezig, zoals poikiloderma, multipele actinische keratosen, cutaan plaveiselcelcarcinoom, gingiva erosies met verlies van tanden, oesofageale en urethra stricturen, en tevens darmproblemen. En inderdaad werd bij deze patiënt een (schijnbaar) homozygote FERMT1 mutatie gevonden ([c.423_435del; c.448_450del], p.Ser142LeufsX14), die tot verlies van FFH-1 leidt. Echter, deze patiënt had andere klinische kenmerken die niet verklaard konden worden op basis van FFH-1 weefselexpressie en functieverlies, zoals een verdikte hartspier met

ECG-afwijkingen, milde dysmorfe kenmerken, mentale retardatie en skeletafwijkingen. Vandaar dat bij deze patiënt een screening op grotere deleties of inserties in het genomische DNA werd uitgevoerd met behulp van een ‘array comparative genomic hybridisation’ (aCGH) test. Met deze test kan gekeken worden of er stukken van chromosomen missen of teveel zijn. Uit deze test bleek dat er bij onze patiënt sprake was van een heterozygote ~3 megabase microdeletie op de korte arm van chromosoom 20 (20p12.3), hetgeen betekent dat er sprake is van een monoallelisch verlies van meerdere genen, waaronder dus het complete FERMT1-gen. Een ander gen dat zich in dit gebied bevindt, is BMP2 dat codeert voor bone-morphogenetic-protein-2. Dit eiwit komt in verscheidene weefsels tot expressie en is betrokken bij de ontwikkeling van het hart, bot en kraakbeen. In een recente studie was heterozygoot verlies van BMP2 geassocieerd met een erfelijke hartritmestoornis (Wolff-Parkinson-White syndroom), mild dysmorfieën, mentale retardatie en skeletafwijkingen.⁸ Onze patiënt bleek dus een zogenaamd ‘contiguous (= aanliggend) gene syndrome’ te hebben met epitheliale klinische kenmerken van KS, en aanvullend afwijkingen in andere orgaansystemen op basis van de heterozygote afwezigheid van andere genen, in het bijzonder BMP2. Deze studie laat het belang zien van het uitvoeren van een aCGH in patiënten met een monogenetische aandoening en schijnbaar homozygote mutaties, waarbij onverklaarbare klinische kenmerken aanwezig zijn. Dit is van belang voor: 1.

Adequaat erfelijkheidsadvies en een accurate prognose; en 2. Om verwarring te voorkomen bij ander patiënten met de betreffende monogenetische aandoening wat betreft de prognose. De genen op 20p12.3 komen voor zover bekend niet in de huid tot expressie, dus het mucocutane fenotype van de patiënt lijkt verklaard te kunnen worden op basis van FFH-1 functieverlies.

Aanvullende immuunfluorescentie kleuringen op een huidbiopt van de patiënt werden verricht om nader inzicht te krijgen in de effecten van FFH-1 verlies op de expressie van andere eiwitten in de huid. Expressie van integrines α3, α6, en β4 was gereduceerd en onderbroken langs de basale membraan zone (BMZ). Tevens toonden kleuringen voor andere BMZ eiwitten, zoals laminine-332 en type VII collageen (zie figuur 2), een verwijdde BMZ met onderbrekingen en scheuren. Een ander FA eiwit, α-actinine toonde een geclusterd patroon, en ook het actineskelet was afwijkend. EM analyse toonde onderontwikkelde hemidesmosomen en keratineskelet afwijkingen in de basale cellen. Normale FFH-1 functie is dus niet alleen essentieel voor de functie van de FA en het actineskelet, maar ook voor behoud van de integriteit van de gehele BMZ, inclusief hemidesmosomen, en basale keratinocyten.

Figuur 5. Immuunfluorescentie microscopische (links en rechts) en elektronenmicroscopische beelden (midden) van de desmosomale structuren in de huid (epidermis, links) en het hart (myocardium, rechts).

De meest linkse afbeelding is afkomstig van Green et al.⁹, en de tweede afbeelding van links is afkomstig van Franke et al.¹⁰ (beide met toestemming). De beide beelden aan de rechter zijde zijn eigen materiaal.

Desmoplakine aankleuring met antilichaam Dp2.17, originele vergroting 40x.

Hoofdstuk 6 bevat een overzicht van de huidige kennis wat betreft de intercellulaire structuren in huid en hart die het intermediate filament skelet (keratine in huid, desmine in hart) verankeren aan de celmembraan: het desmosoom. Deze structuur vertoont een opvallend gelijkenis in huid en hart, zowel ultrastructureel als qua opbouw (figuur 5 en 6).

Mutaties in de genen die coderen voor eiwitten die zowel in huid als hart onderdeel uitmaken van het desmosoom, leiden tot ziekte van huid en hart: de desmosomale cardiocutane syndromen (figuur 6).¹¹ De data van recente studies wijzen op een belangrijke rol voor veranderingen in celsignaal-pathways in de pathogenese van erfelijke aandoeningen door defecten of een reductie in desmosomale eiwitten. Mogelijk induceren defecte desmosomen, of defecten in desmosomale eiwitten op zich, de veranderingen in de celsignaal-pathways, en leiden daarmee tot afwijkende proliferatie en differentiatie van cellen en veranderingen in morfogenese. De sterk geconserveerde Wnt/β-catenine signaal-pathway zou hier deel van uitmaken. Deze bevindingen kunnen belangrijke implicaties hebben voor de toekomst, aangezien ze mogelijk aangrijpingspunten bieden voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën.

epidermis myocardium

DP

Figuur 6. Schematische weergave van het desmosoom in huid en hart. Aan de linkerzijde van de figuur staan eiwitten aangegeven die in het huid-desmosoom voorkomen en rechts de desmosomale eiwitten in het hart. In rood de eiwitten welke geassocieerd zijn met DCCS en in blauw de desmosomale eiwitten die gedeeld worden door huid en hart maar (nog) niet geassocieerd zijn met ziekte van huid en hart.

DCCS, desmosomale cardiocutane syndromen; DP, desmoplakine; EC, extracellulair; IDP, binnenste plaque;

ODP, buitenste plaque; PG, plakoglobine; PM, plasma membraan (=celmembraan); PKP, plakophiline.

In hoofdstuk 7 en 8 worden patiënten beschreven met nieuwe mutaties in plectine en desmoplakine, respectievelijk, welke beide in het desmosoom voorkomen. Beide patiënten hadden eveneens huidfragiliteit in combinatie met een cardiomyopathie, en dus eigenlijk een desmosomaal cardiocutaan syndroom. Hoofdstuk 7 bevat de resultaten van weefselstudies op huid-, skeletspier- en hartspierbiopten van een patiënt met een cardiocutaan syndroom door compound heterozygote PLEC1 mutaties (= twee verschillende mutaties: één mutatie op het van de vader overgeërfde allel, en één op de van de moeder overgeërfde allel). Deze patiënt had een milde EBS vanaf de geboorte. Daarnaast ontwikkelde hij tussen zijn 20^e en 30^e levensjaar een progressieve spierdystrofie. Eveneens werd bij hem in deze periode een dilaterende cardiomyopathie vastgesteld. Plectine is behalve in het hemidesmosoom, ook in het desmosoom aanwezig, zowel in de huid, als in vele andere weefsels, waaronder het hart.

Vandaar dat wij de aandoening van deze patiënt geschaard hebben onder de desmosomale

keratin

α-actinin talin

β-cateninPG/

actin

PG DP

PKP1/2/3

E-cadherin Desmosoom

Adherens junction

Dsg1/2/3, Dsc1/2/3

plectin(?)

vinculin

EC ODP

IDP

PM

p120 plectin(?)

IDPODP EC

PM

α-catenin

Dsg2, Dsc2

PKP2

N-cadherin PG DP

Myocardium Epidermis

plectin(?) desmin

geassocieerd met DCCS

gedeeld door epidermis en myocardium, niet geassocieerd met DCCS (vooralsnog)

cardiocutane syndromen, waartoe ook de beter bekende Carvajal syndroom, Naxos disease en Naxos-like syndroom door mutaties in de desmosomale eiwitten desmoplakine, plakoglobine, and desmocolline-2, behoren. Op het maternale allel droeg de patiënt een nonsense mutatie (= prematuur stop codon), p.Glu1614X, welke resulteerde in verlies van plectine eiwit expressie zoals bleek uit RNA- en eiwitanalyse van patiëntenhuid. Op het paternale allel was een puntmutatie, p.Arg323Gln, aanwezig. Deze puntmutatie in de N-terminus (= kop) van plectine was nog niet eerder beschreven en bevindt zich in een domein dat betrokken is bij de binding aan hemidesmosomale eiwitten. Dit gedeelte van plectine is daarnaast ook betrokken bij binding aan actine en diverse celmembraaneiwitten in skeletspier en hart. EM en immuunfluorescentie microscopische analyse van huid, skelet- en hartspierbiopten van deze patiënt toonden verstoorde bindingsstructuren (desmosomen en hemidesmosomen in huid, Z-discs en costameren in spier, en intercalated discs in hart) en gereduceerde en abnormale expressie patronen van plectine bindingspartners. Dit is de eerste studie die plectine-expressie in humaan hartweefsel aantoont en de effecten van plectine mutaties op menselijk hartweefsel heeft onderzocht. De resultaten tonen het belang van plectine voor behoud van de integriteit van het hart en impliceren dat plectine mutaties kunnen leiden tot cardiomyopathie bij mensen.

Hoofdstuk 8 bevat de tweede beschrijving van een recent ontdekte, dodelijke vorm van basale EBS genaamd letale acantholytische EB (LAEB). Twee kinderen van dezelfde consanguine ouders overleden binnen enkele dagen na de geboorte als gevolg van uitgebreide huiderosies (de opperhuid had losgelaten op >50% van het lichaamsoppervlak). Verder was er sprake van complete afwezigheid van lichaamsbeharing (= alopecie) en nagels (= anonychia), malformatie van de oorschelpen, en een sterk vergroot hart. De resultaten van desmoplakine (gen: DSP) DNA mutatie analyse bevestigen dat mutaties die leidden tot verlies van de staart van desmoplakine ten grondslag liggen aan deze ernstige aandoening (zie figuur 7). Het klinische beeld bij beide patiënten bevestigt tevens het karakteristieke fenotype van LAEB. De gevonden homozygote deletie van 5 baseparen (c.2874del5) in DSP is een nog niet eerder beschreven mutatie die hoogstwaarschijnlijk leidt tot het ontbreken van zowel de C-terminus (= staart), als het rod domein van desmoplakine. Blijkbaar is alleen de aanwezigheid van de N-terminus (=

kop) van desmoplakine voldoende voor embryonale ontwikkeling en intra-uteriene overleving, maar onvoldoende om de mechanische stress gedurende en na de geboorte te weerstaan. De desmoplakine C-terminus is essentieel voor de binding van keratines aan de desmosomale plaque. De DSP mutaties gevonden in de eerst beschreven LAEB patiënt leidden ook tot trunkatie van de C-terminus en dit resulteerde in verlies van keratine aanhechting aan verder normaal ogende desmosomen.

In de LAEB patiënten beschreven in dit proefschrift werd een overeenkomstige afwezigheid van keratinefilament aanhechting aan het desmosoom gezien, maar daarnaast ook afwezigheid van de desmosomale inner dense plaque (zie ook figuren 5 en 6). Deze data suggereren dat de desmosomale inner dense plaque gevormd wordt door het rod domein van desmoplakine. Bevindingen in de huid van muizen die het eiwit desmoplakine missen (een

zogenaamde ‘knockout’) ondersteunen deze hypothese. Een andere opvallende bevinding in de LAEB patiënt beschreven in dit proefschrift was het sterk vergrootte hart. Het aantal beschreven patiënten met LAEB is te gering om hier nu duidelijke uitspraken over te doen, maar mogelijk behoort cardiomyopathie ook tot de symptomen van LAEB, en behoort LAEB dus ook tot de groep van desmosomale cardiocutane syndromen.

Figuur 7. DSP mutaties gevonden in de eerst beschreven LAEB patiënt (EB114, Jonkman et al. 2005)¹² en de patiënt(en) beschreven in hoofdstuk 8 (EB232), met het effect van deze mutaties op eiwitniveau (onder).

Tot slot wordt in Hoofdstuk 9 een overzicht gegeven van de resultaten van bovengenoemde studies en volgt een algemene discussie over de implicaties van de resultaten met ideeën voor toekomstig onderzoek. Het onderzoek naar gen-, cel-, en eiwittherapie voor erfelijke huidziekten gaat met rasse schreden voorruit. Het achterhalen van de onderliggende genetische defecten van deze erfelijke huidziekten blijft daarvoor essentieel. In hoofdstuk 3 bleven nog 12 families/

patiënten over met blaarvorming met een basaal intraepidermaal splijtingsniveau waarbij geen mutatie gevonden werd in de genen coderend voor K5, K14, of plectine, ondanks uitgebreide DNA, RNA en eiwit analyses. Andere mogelijkheden die in de nabije toekomst onderzocht zullen worden zijn mutaties in het hemidesmosomale eiwit BP230 (zie ook figuur 2), dat tot dezelfde eiwitfamilie als plectine behoord, en ook dezelfde structuur heeft. BP230 is, net als plectine, in staat om keratines te binden aan zijn staart, en bovendien bestaat er een variant

p.Arg1934X c.6091delTT Exon nr: 1-5 6-10 11-14 15-18 19-22 23 24

niet in DSPII

dit proefschrift (EB232)

Homozygoot ROD A B C

N-terminus:

plakoglobine en plakophiline binding

C-terminus met

intermediate filament bindend domein Rod domein: dimerisatie

N N Z Y X W V ROD A B C

Z N

N Y X W V

c.2874del5

EB114

N N Z Y X W V

N N Z Y X W V ROD

N N Z Y X W V ROD

c.2874del5

p.Arg1934X c.6091delTT Jonkman et al. 2005

(EB114)

Compound heterozygoot EB232

(isoform) van BP230 die alleen in de huid voorkomt. Dit zou een kandidaat voor betrokkenheid bij basale EBS kunnen zijn. Verder zullen in families waarbij meerdere personen over meerdere generaties zijn aangedaan linkage analyses plaatsvinden, om te kijken waar in het genoom zich de onderliggende mutatie lijkt te bevinden. Een andere interessante (nu lopende) studie, die is voortgevloeid uit dit proefschrift, is de PLEC1 mutatieanalyse bij patiënten met de (meestal dominante) erfelijke hartzieke aritmogene-rechter-ventrikel-cardiomyopathie (ARVC). ARVC wordt gekenmerkt door specifieke ECG-afwijkingen en de zogenaamde ‘fibrofatty displacement’

(= vervanging door vet en bindweefsel) van hartcellen, zichtbaar in een hartbiopt. Dit kan leiden tot hartritmestoornissen, hartfalen en ‘sudden death’. Het woord ‘rechter’ in ARVC moet met een korreltje zout worden genomen, aangezien linkszijdige betrokkenheid vaak voorkomt en in sommige gevallen zelfs het enige deel van hart is dat aangedaan is (‘ALVC’). ARVC wordt beschouwd als een erfelijke desmosomale hartziekte, aangezien het grootste deel van de patiënten met ARVC mutaties hebben in genen die coderen voor desmosomale eiwitten.

Bevindingen van recente studies suggereren dat defecten in celsignaal pathways (al dan niet veroorzaakt door abnormale of gereduceerde/afwezige desmosomale eiwitten), en niet zozeer/

alleen defecte cel-cel binding, ten grondslag liggen aan ARVC. Mede gezien: 1. plectine zich ook in het desmosoom bevindt (zowel in huid als hart), 2. plectine-knockout muizen hartafwijkingen laten zien, en 3. de bevindingen bij de patiënt beschreven in hoofdstuk 7 met EBS, spierdystrofie en cardiomyopathie met ECG afwijkingen door plectine mutaties, is in samenwerking met de afdelingen cardiologie, genetica en pathologie van het Universitair Medisch Centrum Groningen een PLEC1 mutatie-screening opgezet voor een omvangrijke groep patiënten met ARVC, of ARVC-gelijkende hartziekte. De resultaten zullen uitwijzen of PLEC1 mutaties naast non-syndromale EBS, syndromale EBS met spierdystrofie (en cardiomyopathie) en EBS met pylorus atresie, ook non-syndromale cardiomyopathie veroorzaken. To be continued…!

References

1. Fine JD, Eady RA, Bauer EA, Bauer JW, Bruckner-Tuderman L, Heagerty A, et al. The classification of inherited epidermolysis bullosa (EB): Report of the Third International Consensus Meeting on Diagnosis and Classification of EB. J Am Acad Dermatol 2008;58(6):931-50.

2. Pasmooij AM, Pas HH, Jansen GH, Lemmink HH, Jonkman MF. Localized and generalized forms of blistering in junctional epidermolysis bullosa due to COL17A1 mutations in the Netherlands. Br J Dermatol 2007;156(5):861-70.

3. Pasmooij AMG. Genotyping of unusual phenotypes in epidermolysis bullosa. Vol PhD.

Groningen: Department of Dermatology, Rijksuniversiteit Groningen, 2006.

4. van den Akker PC, van Essen AJ, Kraak MM, Meijer R, Nijenhuis M, Meijer G, et al. Long- term follow-up of patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa in the Netherlands: Expansion of the mutation database and unusual phenotype-genotype correlations. J Dermatol Sci 2009.

5. Szeverenyi I, Cassidy AJ, Chung CW, Lee BT, Common JE, Ogg SC, et al. The Human Intermediate Filament Database: comprehensive information on a gene family involved in many human diseases. Hum Mutat 2008;29(3):351-60.

6. Koss-Harnes D, Hoyheim B, Anton-Lamprecht I, Gjesti A, Jorgensen RS, Jahnsen FL, et al.

A site-specific plectin mutation causes dominant epidermolysis bullosa simplex Ogna:

two identical de novo mutations. J Invest Dermatol 2002;118(1):87-93.

7. Gedde-Dahl T, Jr. Epidermolysis Bullosa. A clinical, genetic and epidemiological study. . Baltimore and London: The Johns Hopkins Press 1971.

8. Lalani SR, Thakuria JV, Cox GF, Wang X, Bi W, Bray MS, et al. 20p12.3 microdeletion predisposes to Wolff-Parkinson-White syndrome with variable neurocognitive deficits. J Med Genet 2009;46:168-75.

9. Green KJ, Gaudry CA. Are desmosomes more than tethers for intermediate filaments?

Nat Rev Mol Cell Biol 2000;1(3):208-16.

10. Franke WW, Borrmann CM, Grund C, Pieperhoff S. The area composita of adhering junctions connecting heart muscle cells of vertebrates. I. Molecular definition in intercalated disks of cardiomyocytes by immunoelectron microscopy of desmosomal proteins. Eur J Cell Biol 2006;85(2):69-82.

11. Bolling MC, Jonkman MF. Skin and heart: une liaison dangereuse. Exp Dermatol 2009;18(8):658-68.

12. Jonkman MF, Pasmooij AM, Pasmans SG, van den Berg MP, Ter Horst HJ, Timmer A, et al. Loss of desmoplakin tail causes lethal acantholytic epidermolysis bullosa. Am J Hum Genet 2005;77(4):653-60.