Functional protein networks unifying limb girdle muscular dystrophy
Morrée, A. de
Citation
Morrée, A. de. (2011, January 12). Functional protein networks unifying limb girdle muscular dystrophy. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/16329
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/16329
Note: To cite this publication please use the final published version (if
applicable).
Spier Dystrofie gebaseerd op functionele netwerken tussen eiwitmoleculen
Spierverzwakkingsziekten (spierdystrofiën) vormen een grote groep zeer diverse ziektebeelden, die zich kenmerkt door een structureel verlies aan spierkracht.
Deze ziekten hebben vaak een progressief karakter: de symptomen worden erger naarmate de patiënt ouder wordt. Dit betekent dat de spieren steeds zwakker worden, wat de levenskwaliteit van de patiënten aanzienlijk vermindert.
Het ziektebeeld van Limb Girdle Spier Dystrofie
Limb Girdle Spier Dystrofie (LGMD) is een zeer zeldzame aandoening die gemiddeld bij 1 op de miljoen mensen voorkomt (zie hoofdstuk 1 voor een uitgebreide introductie). LGMD wordt pas zichtbaar op latere leeftijd, meestal rond het 25ste levensjaar. De spiergroepen van de heup- en schoudergordel (de Limb Girdle) verliezen hierbij geleidelijk hun spierkracht. Later volgen ook andere spiergroepen.
Een typisch patroon (bijvoorbeeld bij LGMD2B) is dat patiënten eerst niet meer op hun tenen kunnen lopen, vervolgens niet meer op hun hurken kunnen zitten en weer later veelal moeite krijgen met opstaan en traplopen. Uiteindelijk belanden de meeste patiënten in een rolstoel. Hoewel de ziekte niet dodelijk hoeft te zijn, drukt deze wel een zeer duidelijk stempel op het leven van de patiënt. Genezing is helaas niet mogelijk.
Een problematisch aspect van LGMD is dat diagnose vaak moeilijk te stellen is.
LGMD is namelijk een genetische ziekte. Dit betekent dat mutaties in het DNA van de patiënt de oorzaak zijn. Alleen door het identificeren van deze mutaties kan de diagnose van genetische ziekten met 100% zekerheid worden vastgesteld. Het probleem van LGMD-diagnose is echter dat LGMD kan worden veroorzaakt door mutaties in tenminste 21 verschillende gedeeltes van het DNA (genen). Controle van al deze gedeeltes op mutaties is erg duur en tijdrovend. Zodoende weten veel
patiënten niet zeker of ze aan LGMD lijden. Dit is niet alleen belangrijk voor de (h) erkenning van de ziekte, maar ook voor de behandeling. Verkeerde medicatie kan namelijk een averechts effect hebben.
De centrale vraag die open staat, is: hoe kan het dat zoveel verschillende genetische mutaties hetzelfde ziektebeeld kunnen veroorzaken? Betreft het hier wel één en dezelfde ziekte? Of worden er misschien minieme verschillen over het hoofd gezien? Deze vragen zijn essentieel voor de zoektocht naar een behandelmethode of medicijn. Bovendien kan de vraag gesteld woorden of één medicijn wel voldoende zal zijn, of dat elk van de 21 varianten straks een specifieke medicatie nodig heeft.
Richting één moleculair mechanisme voor LGMD
Volgens het centrale model van de moleculaire biologie bewaart de cel erfelijke (genetische) informatie in de vorm van DNA. De cel zal de DNA-code lezen en deze via RNA-moleculen naar eiwitmoleculen vertalen. De cel gebruikt die eiwitmoleculen vervolgens om in leven te blijven en zijn taken in het lichaam uit te voeren.
Ieder eiwitmolecuul wordt gecodeerd door een specifiek stukje DNA: het gen. Het is reeds bekend welke eiwitmoleculen gecodeerd worden door de 21 verschillende genen die LGMD kunnen veroorzaken. Dit maakt de zaak er echter niet gemakkelijker op. De 21 eiwitten blijken totaal verschillend te zijn van vorm, van functie en van locatie binnen de cel. Wat de zaak nog lastiger maakt, is dat deze eiwitten niet alleen door de spier aangemaakt worden, maar ook door andere weefsels. Dit is verrassend, omdat de ziekte vooral de spierkracht aantast.
Zodoende staat de fundamentele vraag hoe DNA-mutaties in 21 verschillende genen tot eenzelfde LGMD-ziektebeeld kunnen leiden, nog altijd open (hoofdstuk 1).
In dit proefschrift is een moleculair mechanisme onderzocht dat mogelijk ten grondslag ligt aan LGMD. Dit onderzoek is begonnen met de variant LGMD2B.
Het bestaande model voor LGMD2B, veroorzaakt door Dysferlinemutaties LGMD2B wordt veroorzaakt door mutaties in het stuk DNA dat codeert voor het eiwit Dysferline. Het eiwit Dysferline komt veel voor in de spier, maar is ook gevonden in immuuncellen, bloedvaten, de nieren en de hersenen. In de spier is Dysferline een essentieel onderdeel van het spiermembraanherstelsysteem.
Doordat de spiervezels voortdurend bloot staan aan grote fysieke krachten, treedt er continu minuscule schade op aan het spiermembraan (de spiercelwand). Bij lichamelijke inspanning, zoals sporten, ontstaan microscopisch kleine scheurtjes Nederlandse samenvatting
in het spiermembraan. Dit is niet schadelijk, want de spier beschikt over een zeer efficiënt systeem waarmee de scheurtjes direct weer worden gedicht. Dit is te vergelijken met een lekke fietsband die zichzelf weer plakt. Dysferline is hierbij noodzakelijk. Dysferline brengt kleine membraanpakketjes (blaasjes) naar de membraanscheurtjes toe om het lek te dichten. Als er geen goed werkend Dysferline-eiwit aanwezig is in de cel, zal er geen of minder herstel optreden. De schade in de spieren zal dan ophopen.
Het was uit eerder beschreven onderzoek niet duidelijk hoe Dysferline dit spiermembraanherstel precies realiseert. Het was evenmin bekend of het hierbij samenwerkt met andere eiwitten. Daarnaast was niet duidelijk of membraanreparatie de belangrijkste of misschien wel de enige functie van Dysferline is. Dit laatste is echter niet waarschijnlijk, omdat een gebrekkige spiermembraanreparatie bijvoorbeeld niet kan verklaren waarom de ziekte pas op latere leeftijd zichtbaar wordt. De schade zou in dit geval immers al van kinds af aan moeten optreden.
Het verkrijgen van moleculair gereedschap: een voorbeeld
Wij besloten de functie(s) van Dysferline te onderzoeken door te bestuderen aan welke andere eiwitten het zich bindt (hoofdstuk 2). Om dat te kunnen doen, hadden we specifiek gereedschap nodig waarmee we het Dysferline-eiwitmolecuul konden aantonen en vastpakken. Dit gereedschap hebben we verkregen door gebruik te maken van de trucjes van het natuurlijke afweersysteem. Het dierlijk lichaam is namelijk heel goed in staat om moleculen van ziekteverwekkers, zoals virussen en bacteriën, te herkennen en onschadelijk te maken. Dit doet het met behulp van speciale immuuncellen die antistoffen (antilichamen) maken die gericht zijn tegen moleculen die normaal gesproken niet in het lichaam voorkomen.
Die antilichamen binden zich aan de ziekteverwekker en dienen vervolgens als
‘vlaggetje’ (specifieke herkenning) voor afbraak door het immuunsysteem.
Deze biologische oplossing is een zeer geschikte manier om specifieke antistoffen tegen Dysferline te verkrijgen. Door een dier (in dit geval een lama) in te spuiten met Dysferline-eiwitmoleculen, komt er een immuunreactie tegen dit eiwit op gang, en worden er door het lichaam antistoffen aangemaakt die specifiek Dysferline-eiwit zullen herkennen. Dit is hetzelfde proces als vaccinatie.
Door deze antistof producerende cellen uit het bloed te isoleren, kunnen de specifieke herkenningsmoleculen tegen Dysferline worden verkregen. Op deze manier hebben wij de antilichamen voor ons onderzoek uit de lama geïsoleerd (in een eerder onderzoek dat vooraf ging aan dit proefschrift).
Stap 1: Wat zijn de functies van Dysferline?
De Dysferline-antilichamen hebben we gebruikt om het Dysferline-eiwit te isoleren uit spierweefsel. Daarna hebben we onderzocht welke eiwitten zich aan Dysferline binden. Dit bleken er meer dan 100 te zijn, terwijl er voorheen slechts negen bekend waren. Door middel van computeranalyses (bioinformatica) hebben we vervolgens gekeken naar veelvoorkomende functies in deze totale groep eiwitten. Hieruit bleek dat Dysferline zich bindt aan veel eiwitten die betrokken zijn bij het transport van membraanblaasjes. Dit past bij het idee dat Dysferline membraanpakketjes aflevert bij membraanschadepunten. Interessant is echter dat Dysferline zich ook bindt aan eiwitten die betrokken zijn bij aanhechting van de cel, bij energiehuishouding (in mitochondriën, de energiefabrieken van de cel) en bij eiwitvouwing. Dit duidt erop dat Dysferline zelf ook een rol speelt in deze processen. We hebben kunnen aantonen dat onze methode zeven van de negen reeds beschreven bindingspartners bevestigt. Met een andere methode hebben we bovendien twee nieuwe interacties kunnen valideren. Uiteindelijke konden we concluderen dat Dysferline betrokken is bij membraanonderhoud en dat dit eiwit tijd- en locatieafhankelijk werkt.
Vervolgens hebben we onderzocht hoe Dysferline samenwerkt met twee van de eiwitten waar het zich aan bindt, te weten Calpaine 3 en AHNAK (hoofdstuk 3). Calpaine 3 is een eiwit met enzymatische functie (een enzym): het knipt andere eiwitten in tweeën. AHNAK (Hebreeuws voor “reus”) is een reusachtig eiwit met onduidelijke functie(s). Wij hebben kunnen aantonen dat Calpaine 3 zich aan AHNAK kan binden en het kan knippen. Calpaine 3 knipt AHNAK op vier specifieke plaatsen. Het in stukken geknipte AHNAK kan zich vervolgens niet meer aan Dysferline binden. Dit suggereert dat Calpaine 3 de binding tussen AHNAK en Dysferline – en hiermee wellicht ook de functie van Dysferline – reguleert.
Stap 2: LGMD2A en het hoe en waarom van het zelfmoordenzym Calpaine 3
Een mutatie in het DNA-gedeelte (gen) dat codeert voor Calpaine 3-eiwit kan aanleiding geven tot een soortgelijk ziektebeeld als een mutatie in het gen dat codeert voor Dysferline. Dit ziektebeeld staat bekend als LGMD2A. In spierweefsel van LGMD2A-patiënten zagen we dat wanneer Calpaine 3 niet meer gemaakt wordt, AHNAK zich ophoopt in de spier.
Hoewel reeds uit eerder beschreven onderzoek duidelijk was dat Calpaine 3 een enzym is, was niet duidelijk hoe mutaties in dit enzym leiden tot een progressieve spierverzwakkingsziekte waarbij de spier langzaam wordt afgebroken. Wel was bekend dat Calpaine 3 als inactief enzym gemaakt wordt door de cel. Het enzym activeert zichzelf door autolyse: een proces waarbij het enkele stukken Nederlandse samenvatting
eiwit uit zichzelf knipt. Wanneer en hoe dit gebeurt was echter nog onduidelijk.
Nadat Calpaine 3 geactiveerd is, kan het andere eiwitten knippen (zogenaamde substraten). Daarbij zal echter ook de autolyse verder doorzetten, waardoor het enzym zichzelf uiteindelijk inactiveert. Geschat wordt dat Calpaine 3 zichzelf activeert en inactiveert in minder dan tien minuten. Het pleegt als het ware zelfmoord. Er was maar weinig bekend over wat Calpaine 3 bewerkstelligt in die zeer korte periode van activiteit.
Wij besloten daarom te onderzoeken welke eiwitten door Calpaine 3 worden geknipt om zo te achterhalen wat het betekent voor de cel als dit enzym wel of niet werkt (hoofdstuk 4). Allereerst hebben we een herkenningsequentie voor Calpaine 3 geïdentificeerd. Calpaine 3 herkent en knipt eiwitten door middel van deze sequentie. Deze sequentie wordt bovendien gedeeld door alle bekende substraten van dit enzym. Aan de hand van deze herkenningssequentie hebben we tevens alle substraten van Calpaine 3 kunnen voorspellen. Met behulp van computeranalyses konden we vervolgens een beeld schetsen van de functies die deze substraten delen. Een dergelijke analyse geeft een idee van wat het voor de cel betekent als Calpaine 3 actief is. Calpaine 3 bleek namelijk vooral structuureiwitten in de cel te knippen. Dit betekent dat wanneer Calpaine 3 actief wordt, het de structuur van de cel zal veranderen.
Daarnaast ontdekten we dat Calpaine 3 zelf meermaals zijn eigen herkenningssequentie bevat. Dit verklaart de autolyse van Calpaine 3. Het enzym heeft dankzij deze sequenties een ingebouwd systeem om zichzelf in én uit te schakelen. Wij denken nu dat Calpaine 3 in inactieve vorm klaar ligt in de cel. Zodra het geactiveerd wordt, zal het structuureiwitten knippen en zo de architectuur van de cel veranderen. Maar doordat het zichzelf automatisch inactiveert zal deze structuurverandering locaal blijven. Calpaine 3 zorgt zodoende voor snelle, locale veranderingen in de structuur van de spiercel.
Stap 3: AHNAK en het verhaal van klein Duimpje en de reus
Zoals hierboven vermeld is AHNAK een reusachtig eiwit (700 kDa) waaraan nog geen eenduidige functie is toegekend. Door het werk van andere wetenschappers wisten we dat AHNAK zich bevindt op de zogenaamde enlargosoomblaasjes, die mogelijk een rol spelen bij celmembraanvergroting en -herstel. Daarnaast lijkt AHNAK nog een meer structurele rol te spelen, die wij verder onderzocht hebben in hoofdstuk 5 en 6. AHNAK is namelijk relevant voor het actuele onderzoek omdat het zich bindt aan Dysferline en omdat deze interactie gereguleerd wordt door Calpaine 3. Er was echter nog weinig bekend over AHNAK-regulatie in spiercellen.
Uit ons onderzoek (zie hoofdstuk 5) kwam naar voren dat AHNAK lid is van een grotere familie van drie eiwitten: AHNAK, AHNAK2 en Periaxin. Van AHNAK
en van Periaxin worden twee varianten gemaakt door de cel: één reusachtig en één heel klein eiwit. We zagen dat het reusachtige AHNAK-eiwit zich ophoopt in de cel daar waar cellen elkaar raken. Het kleine AHNAK-eiwit kan zich binden aan de grote variant en wordt op dezelfde plaatsen gevonden. In tegenstelling tot het grote AHNAK kan het kleine AHNAK zich echter ook verplaatsen naar de celkern.
Daar is het kleine AHNAK betrokken bij RNA-aanpassingen (RNA splicing), die invloed hebben op de aanmaak van AHNAK-eiwitten. De cel kan door middel van RNA aanpassingen kiezen of het de AHNAK-reus of het kleintje produceert. Kleine AHNAK zorgt via een positieve terugkoppeling naar de RNA-moleculen voor een verhoogde productie van kleine AHNAK-eiwitmoleculen, ten koste van de reus.
Het reusachtige AHNAK-eiwit daarentegen, lijkt zoals verwacht een meer structurele rol te spelen. Het reageert namelijk zeer snel op chemische blokkades van de zogenaamde integrine receptoren. Dit zijn de moleculaire ankers waarmee een cel zich vasthoudt (hoofdstuk 6).
Stap 4: Parallellen voorbij het spierweefsel, Dysferline in het immuunsysteem
Tot slot is het onderzoek gericht geweest op de functie van Dysferline in immuuncellen. Voor de meeste LGMD veroorzakende genen geldt dat deze niet uitsluitend door spiercellen gebruikt worden. Toch treffen de ziekteverschijnselen vooral de spieren. Van Dysferline was reeds bekend dat het ook in immuuncellen voorkomt. Dit is interessant, omdat de variant LGMD2B gekenmerkt wordt door een overmatige ontstekingsreactie (immuunreactie) in de spieren. Een onderzoek naar de functie van Dysferline in immuuncellen, leverde enkele parallellen met spiercellen op (zie hiervoor hoofdstuk 7).
Net als in spiercellen is Dysferline in immuuncellen betrokken bij membraanherstel. Het is echter niet waarschijnlijk dat immuuncellen veelvuldig blootstaan aan membraanschade, zoals dat bij spiercellen het geval is. Een andere parallel is dat Dysferline zich ook in immuuncellen bindt aan eiwitten die betrokken zijn bij celaanhechting. Door Dysferline-eiwitproductie in gekweekte immuuncellen te remmen, hebben we kunnen nagaan in hoeverre Dysferline belangrijk is voor deze celaanhechting. Het bleek dat immuuncellen minder goed hechten wanneer Dysferline afwezig is. Deze cellen zonder Dysferline worden tevens gekenmerkt door een verstoorde productie van aanhechtingseiwitten.
Dit laatste zagen we ook terug in immuuncellen van LGMD-patiënten. Na een chemische blokkade van de aanhechtingsankers van de cel (eerder beschreven in hoofdstuk 6) wordt Dysferline heel snel door de cel opgenomen, tezamen met de aanhechtingsmoleculen. Deze waarnemingen kunnen de verstoorde ontstekingsreactie in LGMD2B-patiënten verklaren en onderstrepen dat Dysferline Nederlandse samenvatting
meer doet dan alleen spiermembraanherstel.
Terug naar de patiënt
Zowel spiercellen als immuuncellen zijn in hun functie afhankelijk van effectief en efficiënt onderhoud van de membraanstructuren aan contactpunten met andere cellen. Gebaseerd op onze waarnemingen hebben wij voorgesteld dat Dysferline, Calpaine 3 en AHNAK zeer belangrijk zijn voor het onderhoud van dergelijke contactpunten (hoofdstuk 8). Verlies in functie van een van de drie eiwitten resulteert in verstoring van dat onderhoud. Dit duidt erop dat LGMD mogelijk het resultaat is van gebrekkig functionerende onderhoudssystemen in de cellen in het spierweefsel.
Uit dit model kan worden afgeleid dat LGMD-patiënten geen problemen hebben met de aanmaak van spiervezels, maar met het onderhoud ervan. Aangezien de spieren voortdurend bloot staan aan krachten van buitenaf, is dergelijk onderhoud continu noodzakelijk. Het in dit proefschrift voorgestelde model biedt zo een verklaring voor het gegeven dat LGMD zich pas op latere leeftijd manifesteert.
