University of Groningen
Metallodrugs for therapy and imaging: investigation of their mechanism of action
Spreckelmeyer, Sarah
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2018
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Spreckelmeyer, S. (2018). Metallodrugs for therapy and imaging: investigation of their mechanism of action. University of Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
367
Samenvatting
368
In het onderzoek beschreven in dit proefschrift is de toepassing van metaalcomplexen voor therapeutische en beeldvormingsdoeleinden onderzocht. Dit onderzoek speelt zich af binnen het veld van de medische anorganische chemie. In de introductie wordt een overzicht gegeven van de toepassing van organische moleculen die een metaal of radiometaal bevatten, en welke voor therapeutische of diagnostische doeleinden bij met name kanker gebruikt kunnen worden. Het mechanisme van werking, het farmacokinetisch profiel en het biologische aangrijpingspunt van deze moleculen zijn nog niet volledig bekend. Daarom hebben wij in dit proefschrift de volgende doelen gesteld: i) het synthetiseren van nieuwe radiofarmaca voor kankertherapie of beeldvorming, en ii) het ontrafelen van de mechanismen van cellulaire opname en uitscheiding, en het vergelijken van de antikanker activiteit en de toxische effecten op organen van nieuwe goud bevattende metaalcomplexen met die van cisplatina. Om de giftigheid en transportmechanismen van de nieuwe cytotoxische goud-(III)-bevattende organometaalverbindingen te onderzoeken, is het ex vivo model van precies-gesneden weefselplakjes en humane celculturen in vitro gebruikt.
Het werk beschreven in Part A werd uitgevoerd aan de Universiteit van Brits-Colombia in Vancouver, BC, Canada, op de afdeling Medische Anorganische Chemie onder supervisie van Prof. Chris Orvig.
In hoofdstuk A1 presenteren wij de synthese van H4neunpa en
het hiervan afgeleide immuunconjugaat H4neunpa-trastuzumab (Figuur
1). We laten zien dat deze bij kamertemperatuur efficiënt van een radiolabel kunnen worden voorzien met 111In3+ binnen 15,
respectievelijk 30 minuten. 111In is een gamma emitter en kan daarom
gebruikt worden voor single-photon emissive computed tomography (SPECT). Het immuunconjugaat werd verder onderzocht in een in vivo model, waarin HER2/neu positieve muizen werden gebruikt die subcutaan SKOV-3 baarmoederkanker-xenografts droegen. Helaas lieten onze resultaten een onverwacht lage accumulatie van 111
369 gouden standaard 111In-CHX-DTPA-trastuzumab. Dit werd ondersteund
met Immuno-SPECT foto’s genomen na 1, 3 en 5 dagen na injectie. Daarom lijkt 111In-neunpa-trastuzumab niet geschikt voor toepassing in
de kliniek, hoewel in vitro experimenten (waarin de immunoreactiviteit, efficiëntie van radiolabeling, en stabiliteit in humaan serum werden beoordeeld) gelijkwaardige of superieure eigenschappen van deze chelaatvormer lieten zien, in vergelijking met de gouden standaard. Ten slotte bleek het labelen van H4neunpa met 177Lutetium, een
therapeutisch radiometaal, niet succesvol. De vergelijking van Lanthanide3+ (92pm CN=8) met Lutetium3+ (103pm CN=9)1 leidt tot de
hypothese dat Lutetium3+ te groot is voor H
4neunpa, of dat het
gewenste coördinatiegetal door sterische hinder niet gehaald wordt.
Figuur 1. Overzicht van radioconjugaten afgeleid van H4neunpa-p-Bn-NO2.
In hoofdstuk A2 staat het succesvolle labelen van H4
neunpa-p-Bn-NO2 met 225Actinium en 213Bismut beschreven. 225Actinium en
N N N OH O HO O N N HO OH O O NO2 H₄neunpa-p-Bn-NO₂ H₄neunpa-PSMA-L N N N OH O N HO O N OH HO O O HN NH S Glu-ureido-lys N N N OH O N HO O N OH HO O O HN H₄neunpa-p-Bn-trastuzumab NH S trastuzumab N N N OH O N HO O N OH HO O O HN H₄neunpa-metallacage-ligand NH S metallacage-ligand Chapter A1 Chapter A2 Chapter A2 111In3+ (SPECT) 225Ac3+ (Therapy) 213Bi3+ (Therapy) natSb3+ (Therapy) 177Lu3+ (Therapy) Chapter A1 Chapter A2 Chapter A2 Chapter A2 Chapter A1
370
213Bismut zijn alfa emitters die gebruikt kunnen worden voor targeted
alpha therapy (TAT). Bovendien kon H4neunpa-p-Bn-NO2 geconjugeerd
worden met een molecuul gericht op een prostaat-specifiek membraan antigen (PSMA), Glu-ureido-Lys (PSMA-L genaamd), wat resulteerde in H4neunpa-PSMA-L (Figuur 1). Helaas was de hoeveelheid 111In
radiolabel dat gekoppeld kon worden aan H4neunpa-PSMA-L erg laag.
Wel was de koppeling van een metaalkooi-ligand aan H4neunpa en
incorporatie van Lantanium3+ succesvol en gaf
fluorescentiespectroscopie met Lantanium3+ veelbelovende resultaten.
Zo zagen we verbeterde fluorescentie-eigenschappen door de incorporatie van Lantanium3+, hetgeen de toepassing in beeldvormende
technieken mogelijk maakt.
De resultaten in hoofdstukken A1 en A2 laten samen zien dat H4neunpa kan worden gezien als een excellente bifunctionele
chelaatvormer. Modificaties kunnen gemakkelijk uitgevoerd worden, afhankelijk van het doelmolecuul en het radiometaal van interesse. De synthese van H4neunpa is een 10-staps reactie met een totale
opbrengst van slechts 2.3% en is daarom moeilijk toe te passen voor klinisch gebruik. Daarom is een sneller protocol voor de synthese ontwikkeld, waarmee H4neunpa al gesynthetiseerd kan worden in 4
371 Figuur 2. Voorgestelde synthese route van H4neunpa.
In de toekomst zou neunpa-PSMA-L verbeterd kunnen worden door modificaties in de lengte van het molecuul dat de verbinding vormt tussen Glu-ureido-Lys en H4neunpa.
Omdat 89Zirconium4+ een veelbelovend radiometaal is voor
positron emissie tomografie (PET) beeldvorming, werden twee hydroxaamzuur dragende liganden gesynthetiseerd, zoals beschreven in hoofdstuk A3. De toxiciteit van deze liganden werd getest in verschillende kankercellijnen. De synthese van deze twee hydroxaamzuur-dragende liganden was succesvol en chemisch-fysische analyse bevestigde dit. Spijtig genoeg was het labelen met
89Zirconium niet succesvol, mogelijk door de met de density functional
theory (DFT) berekende starheid van hydroxaamzuur-armen. In de
toekomst zouden DFT-berekeningen gedaan moeten worden voordat een set verbindingen wordt gesynthetiseerd, zoals is gedaan voor de
NH2 N H NH2 NO2 Br K2CO3, DMF Na2CO3, CH3CN O O Br Pd/C 10% glacial CH3COOH LiOH THF/H2O 3:1 SCCl2 H2O, DCM N N N OH O HO O N N HO OH O O NCS N N N O O O O N N O O O O NO2 N N N OH O HO O N N HO OH O O NO2 LiOH THF/H2O 3:1 N N N O O O O N N O O O O NH2 N N N OH O HO O N N HO OH O O NH2 7 H4-neunpa-p-Bn-NO2 6 H4-neunpa-p-Bn-NCS 1 2 3 4 5 O O O NH NH HN N N O O O O NH N HN N N O O O O NO2 ACN
372
tweede generatie hydroxaamzuur dragende liganden beschreven in hoofdstuk A3.
In hoofdstuk A4 wordt het onderzoek beschreven dat als doel had een bifunctionele chelaatvormer H2dedpa met een thiol-reactieve
groep te synthetiseren. Dit maakt conjugatie met FXa (factor Xa, een component van de bloedstollingscascade) mogelijk, en daarmee de lokalisatie van bloedpropjes in patiënten. Onze resultaten laten zien dat de uitgevoerde synthese van een bifunctionele chelaatvormer H2dedpa
met een thiol-reactieve groep voor FXa conjugatie nog niet succesvol was.
Part B beschrijft een onderzoek aan de Rijksuniversiteit
Groningen onder begeleiding van Prof. Angela Casini en Prof. Geny Groothuis. De antikanker effecten op verschillende humane kankercellijnen, de toxiciteit in de nier en de mechanismen van ophoping in weefsel van verschillende nieuwe goud-(III)-cyclo-verbindingen werden vergeleken met die van cisplatina.
In deel B1 wordt de in de literatuur aanwezige kennis van transportmechanismen van cisplatina en andere metaalcomplexen beschreven. Er blijkt een aanzienlijk gebrek aan kennis te bestaan over de accumulatiemechanismen op moleculair niveau van cisplatina en de nieuwe generaties antikanker metaalcomplexen. Deze kennis is nodig om de balans tussen activiteits- en toxiciteitsprofielen van metaalverbindingen op te helderen en te begrijpen. Daarnaast is de verandering van expressie van geneesmiddeltransporters in doelcellen vaak betrokken bij resistentiemechanismen.
373 Figure 3. Geneesmiddeltransporters die mogelijk betrokken zijn bij ophoping van cisplatina.
374
In hoofdstuk B2 werd een set organometaal goud-(III)-verbindingen met liganden van het type bidentaat C^N gesynthetiseerd en gekarakteriseerd. Tevens werden hun antikanker eigenschappen bestudeerd in verschillende humane kankercellijnen en niet-kanker cellijnen. Deze studie laat de potentiële verbetering van de biologische eigenschappen (zoals giftigheid of PARP-1 inhibitie) van organometaal verbindingen met goud zien. Dit kan worden bewerkstelligd door hun coördinatieomgeving aan te passen. Door het chlorido-ligand te veranderen in een PTA-groep verbetert de wateroplosbaarheid, of door het in een glucosegroep te veranderen wordt de GLUT1-transporter getarget.
Figuur 4. De goud-(III)-organometaal complexen beschreven in dit proefschrift.
De meest actieve goud-(III)-verbinding [Au(pyb-H)(PTA)Cl]PF 6
(PTA=1,3,5-triazafosfa-adamantaan) werd gekozen om de toxiciteit en transportmechanismen verder te karakteriseren in een ex vivo model van precies-gesneden nierplakjes (PCKS) in hoofdstuk B3. We ontdekten dat deze nieuwe goud-(III)-verbinding (Figuur 4) meer toxische effecten liet zien in PCKS na 24 uur onder de gekozen experimentele condities ten opzichte van cisplatina. Beide verbindingen induceren een concentratie-afhankelijke vermindering van
N Au Cl N P N N PF6 N Au PPh2 O O O Cl PF6 [Au(py'-H)(PTA)Cl]PF ₆ Chapter B2 & B3 Compound 1 Chapter B4 Hoofdstuk B2 & B3 Hoofdstuk B4
375 de levensvatbaarheid in PCKS, welke correleerde met het goud-, respectievelijk platinagehalte. De goud-(III)-verbinding liet een lagere TC50-waarde zien dan cisplatina, te weten 4.3 ± 0.2 µM en 17 ± 2.0 µM
respectievelijk.
Tevens werd in hoofdstuk B4 het mechanisme van transport en cellulaire accumulatie van dit nieuwe experimentele metaalcomplex onderzocht in nierplakjes, en vergeleken met dat van cisplatina.
De betrokkenheid van de transporters OCT2/MATE en CTR1/ATP71/B in verschillende kankercellijnen werd onderzocht voor een andere C^N goud-(III)-verbinding, die we goud-(III)-compound 1 noemen. Deze stof bevat een fluorescente coumarinegroep welke de stof geschikt maakt voor fluorescentiemicroscopie. Door cimetidine te gebruiken als remmer voor OCT2/MATE, en CuCl2 als een competitieve
remmer van CTR1/ATP7A/B, werd de invloed van deze transporters op de accumulatie van goud-(III)-compound 1 onderzocht. Dit werd gedaan in A2780 cellen en in A2780cisR-cellen (welke resistent zijn tegen cisplatina) vergeleken met cisplatina. Uit de IC50 resultaten na 24 en 72
uur incubatie kan worden geconcludeerd dat goud-(III)-compound sterkere toxische effecten lijkt te hebben dan cisplatina. Tevens werd er met ICP-MS een grotere accumulatie van metaal gedetecteerd bij blootstelling aan goud-(III)-compound 1. Co-incubatie met CuCl2
verhoogde de toxiciteit van goud-(III)-compound 1 in zowel A2780 als A2780cisR cellen. Deze bevindingen worden ondersteund door een verhoging in de goud- en kopergehaltes in deze cellen. Dit leidt tot de hypothese dat niet alleen de ophoping van goud(III), maar ook dat van koper verantwoordelijk kan zijn voor de verhoogde toxiciteit. Daarnaast kan het betekenen dat CuCl2 de uitstroompompen die betrokken zijn bij
goud(III) ophoping remt. Een directe betrokkenheid van CTR1 of OCT2 bij de opname van het geneesmiddel kon niet aangetoond worden door remming door CuCl2 of cimetidine. Cisplatina liet soortgelijke
eigenschappen zien. Zowel co-incubatie van cisplatina en cimetidine, als cisplatina en CuCl2, leidde tot een verhoogde toxiciteit na 72 uur.
Desondanks werd er in beide cellijnen geen verhoogd platinagehalte gemeten met ICP-MS. Dit resultaat, samengenomen met het bewijs
376
voor een verhoogd kopergehalte in A2780 cellen, leiden tot de hypothese dat koperophoping de reden is voor verhoogde toxiciteit in deze cellijnen.
De onderzoeksdelen A en B zijn voorbeelden van multidisciplinaire samenwerking. Om met radiofarmaca aan de behoeften van de kliniek te voldoen en goede patiëntenzorg te leveren, is een expertisenetwerk van radiofarmaceuten, radiochemici en nucleair-geneeskundigen essentieel. Bovendien moet ook de fundamentele kennis van scheikundigen en biologen worden gebruikt. Naar mijn mening zijn er op dit moment zulke samenwerkingen, maar deze zouden geïntensiveerd en verruimd kunnen worden om de ontwikkeling van nieuwe en betere radiofarmaca te versnellen en verspilling van geld te voorkomen. Rekening houdend met de toepassingen van radiotracers in de kliniek, wordt de voorkeur gegeven aan macrocyclische chelaatvormers zoals DOTA of NOTA en niet aan acyclische chelaatvormers, omdat macrocyclische chelaatvormers een hogere stabiliteit vertonen in patiënten of betere opname in tumoren.
Op basis van de in vitro, ex vivo en in vivo transporterstudies kan gesteld worden dat specifieke remmers voor de geteste transporters noodzakelijk zijn om duidelijke conclusies te kunnen trekken uit de resultaten van transporter-remmingsexperimenten. Bij de vertaling van data uit dierstudies naar de humane situatie, moet er rekening worden gehouden met het feit dat er tussen diersoorten en de mens verschil in expressie en activiteit van geneesmiddeltransporters bestaat. Daarnaast moet men bij het evalueren van de accumulatie en de toxische effecten in kankercellen en andere organen voor ogen houden dat er verschillen bestaan in de expressie van transporters en enzymen tussen verschillende weefsel- en celtypen.
Er kan worden geconcludeerd dat het resultaat van het onderzoek beschreven in dit proefschrift perspectief biedt voor toepassing van metaalcomplexen voor therapeutische en beeldvorming in de toekomst.
