University of Groningen
Structural and biochemical characterization of the human neutral amino acid transporter
ASCT2
Garaeva, Alisa
DOI:10.33612/diss.133658065
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2020
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Garaeva, A. (2020). Structural and biochemical characterization of the human neutral amino acid transporter ASCT2. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.133658065
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Addendum
NEDERLANDSE SAMENVATTING
Uitwisseling van moleculen tussen een cel en de omgeving gebeurt vaak met behulp van membraaneiwitten. Deze membraaneiwitten veranderen van conformatie tijdens het binden, verplaatsen, en loslaten van een substraat. Om ervoor te zorgen dat een substraat, de lading, wordt getransporteerd, laat een transporteiwit zijn substraat bindende plek beurtelings aan de verschillende kanten van het membraan zien. Aan de ene kant kan de lading binden, aan de andere kant kan de lading losgelaten worden. Verschillende families van transporters maken gebruik van verschillende structuren en mechanismen zodat de substraat bindende plek afwisselend toegankelijk is aan de verschillende kanten van het membraan. Een mogelijk mechanisme is een lift-achtige beweging binnen het eiwit. Het substraat bindt aan de substraat bindende plek, het eiwit ondergaat een lift-achtige beweging waardoor het substraat aan de andere kant van de membraan komt en daar losgelaten wordt, vergelijkbaar met een persoon die de lift naar een andere verdieping neemt. Eiwitten die gebruik maken van dit lift-type transport hebben dezelfde structurele organisatie; twee functionele domeinen, namelijk een “scaffold” en het transport domein. Het “scaffold” domein blijft min of meer stabiel in het membraan en het transport domein bindt het substraat en beweegt naar de andere kant van het membraan waardoor het substraat verplaatst wordt.
ASCT2 is een membraaneiwit dat gebruik maakt van het lift-type transport om neutrale aminozuren uit te wisselen, en zorgt daardoor voor de juiste concentratie van deze aminozuren binnen en buiten de cel. Dit eiwit is betrokken bij verschillende fysiologische processen en dat is beschreven in hoofdstuk 1. In verschillende types kanker blijkt ASCT2 tot over-expressie te komen, er is gesuggereerd dat ASCT2 een belangrijke rol speelt in de groei van kankercellen door veel glutamine te importeren. Daarom lijkt de inhibitie van ASCT2 een veel belovende strategie tegen kanker; verschillende ASCT2 remmers in de vorm van kleine moleculen zijn ontworpen en gesynthetiseerd in de hoop glutamine import te minimaliseren. Behalve dat ASCT2 een belangrijk transporteiwit is, dient het ook als een herkenningplaats, receptor, voor verschillende retro-virussen, waarvan sommige weer geassocieerd zijn met multiple sclerosis en het ontstaan van schizophrenia [1,2].
In hoofdstuk 2 worden evolutionair verschillende eiwit families besproken die allemaal volgens het lift-type zouden werken. Eén daarvan is de SLC1 familie van glutamaat transporters, die in mensen 7 leden heeft; neurotransmitter transporters EAAT1-5 en neutrale aminozuur uitwissellaars ASCT1-2. De eerste transporter waarvoor een lift-type is beschreven, is GltPh dat is geı̈soleerd uit een archaeon, en een homoloog is van de humane transporters voor de neurotransmitter glutamaat. Later
bleek ook met structuren van humane glutamaat transporters dat waarschijnlijk de hele familie gebruik maakt van het lift-type.
ASCT2 heeft significante sequentie gelijkenis met andere leden van de SLC1 familie die energie van een kation gradiënt gebruiken om substraat in de cel te accumuleren. Omdat er geen structuur van ASCT2 bekend was, wist men niet hoe het transportmechanisme van ASCT2 precies werkte. Een structuur zou ook veel kunnen helpen bij het ontwerpen van ASCT2-remmers en potentiële kanker medicijnen. In hoofdstuk 3 beschrijven we de eerste structuur van menselijk ASCT2, opgelost met behulp van cryo-EM. Het humane ASCT2 eiwit was geproduceerd in de gist Pichia pastoris, en vervolgens gezuiverd met het detergens n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) in de aanwezigheid van cholesteryl-hemisuccinaat en het substraat glutamine. Dit gezuiverde ASCT2 kon gereconstitueerd worden in proteo-liposomen. In deze membraanblaasjes katalyseert het eiwit Na+ -afhankelijke en electro-neutrale uitwisseling van interne aminozuren met extern radioactief gelabeld glutamine. Net zoals de andere leden van de SLC1 familie is ASCT2 een homo-trimeer. Elke protomeer bestaat uit een “scaffold” en een transport domein. Daarnaast heeft het “scaffold” domein ook nog een extracellulair structureel element die uitsteekt zoals een antenne. De drie antennes van de drie protomeren vormen waarschijnlijk samen de plek waar een virus kan binden. De oriëntatie van het “scaffold” en het functionele domein ten opzichte van elkaar laat zien dat ASCT2 in een naar binnen gerichte conformatie zit. Dit is anders dan structuur van de prokaryotische homoloog GltPh. In ASCT2 zit het transport domein relatief los van het “scaffold” domein aan de binnenkant van de cel, daardoor brengt het een structureel element (hairpin 2, HP2) dichtbij de intracellulaire kant van het membraan. Dit structurele element dient als een extracellulair deurtje voor de bindings-plek in glutamaat transporters binnen de SLC1 familie. Onze structuur van ASCT2 suggereert dat hetzelfde structuurelement ook kan dienen als deurtje waardoor de substraat bindende plek aan de binnenkant van de cel bereikt kan worden.
In hoofdstuk 4 laten we zien dat het is gelukt om ASCT2 vast te zetten in een conformatie waarin de substraat bindende plaats toegankelijk aan de binnenkant van de cel, en inderdaad kun je hier zien dat HP2 als een deurtje functioneert. Daarom suggereren wij dat SLC1 transporters werken volgens het één-deur lift mechanisme. Bovendien zagen we ook verschillende niet-eiwit dichtheden in onze structuur. Dit zouden phospholipiden of cholesterol kunnen zijn. Deze lipiden zouden zich rondom het “scaffold” domein bevinden, en tussen het “scaffold” en transport domein. Eén van deze extra dichtheden bevindt zich naast de substraat bindende plek. Het vertoont de karakteristieke vormen van een phospholipide molecuul. Door de positie waar het zich bevindt, wordt verhinderd dat het HP2 deurtje dicht kan gaan, waardoor de transporter in
een open conformatie is. Deze, en eventueel andere dichtheden zijn potentiele allosterische binders die kunnen helpen bij het ontwerpen van eiwit-remmers.
Alle structuren die van ASCT2 in detergens zijn opgelost, zijn in een naar binnen gerichte conformatie. Dit suggereert dat dit de energetisch meest gunstige conformatie van het eiwit in detergens is. Om het eiwit juist in een naar buiten-gerichte conformatie te bestuderen hebben andere wetenschappers geprobeerd stukjes van antilichamen te gebruiken om deze conformatie vast te zetten [3]. In hoofdstuk 5 hebben we ASCT2 gereconstitueerd in lipide-nanodiscs, en hebben de structuur opgelost, zowel in de aanwezigheid en zonder het substraat glutamine. In de aanwezigheid van de lipiden nam ASCT2 de structuren van buiten-afgesloten en naar buiten open aan. Dit laat nog een keer zien hoe belangrijk lipiden zijn voor de conformatie van membraan-eiwitten. Voor de rest waren de condities namelijk vergelijkbaar. Ook in deze twee structuren zagen we dichtheden die we niet hebben benoemd, zeer waarschijnlijk ook van lipiden. We zien de lipiden op andere plekken dan in de naar binnen gerichte conformatie. Een van de lipiden zien we nu op een plek waar ook de bestaande allosterische remmer, UCPH101, bindt in het EAAT eiwit [4]. Deze lipide-plek zou ook gebruikt kunnen worden voor het specifiek ontwerpen van van allostersiche remmers. Deze structuur van ASCT2 in de buiten-afgesloten toestand heeft de hoogste resolutie (3.26 A) tot nu toe gepubliceerd en het lijkt alsof er posities voor Na+ ionen in de substraat bindende plek zijn.
In hoofdstuk 6 kijken we naar de ontwikkeling van een anti-kanker medicijn met ASCT2 als doel. Dit was een samenwerking met de Icahn School of Medicine at Mount Shai (USA), Binghamton University (USA) en het Institut Pasteur (France). Het ging om een geı̈ntegreerde combinatie van verschillende computationele methoden (homologie modelleren, moleculaire docking en MD simulaties), functionele studies (elektrofysiologie en experimenten in proteo-liposomen), en structurele biologie (cryo-EM). Op deze manier zijn verschillende remmers voor ASCT2 ontworpen en gekarakteriseerd.
In de toekomst kunnen nieuwe biochemische en structurele studies over ASCT2 bijdragen aan het begrijpen hoe dit eiwit precies werkt en dat kan dan weer waardevolle informatie opleveren voor de zoektocht naar effectieve anti-kanker medicijnen.
1. Rolland, A. et al. Correlation between disease severity and in vitro cytokine production mediated by MSRV (Multiple Sclerosis associated RetroViral element) envelope protein in patients with multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 160, 195–203 (2005).
2. Yao, Y. et al. Elevated levels of human endogenous retrovirus-W transcripts in blood cells from patients with first episode schizophrenia. Genes, Brain Behav. 7, 103–112 (2008).
3. Yu, X. et al. Cryo-EM structures of the human glutamine transporter SLC1A5 (ASCT2) in the outward-facing conformation. Elife 8, 1–17 (2019).
4. Canul-Tec, J. C. et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature 544, 446–451 (2017).
LIST OF PUBLICATIONS
1. Garibsingh RA*, Ndaru E*, Garaeva AA*, Bonomi M, Slotboom DJ, Paulino
C, Grewer C, Schlessinger A. Structural basis for stereospecific inhibition of ASCT2 from rational design. bioRxiv, 2020. *these authors contributed equally.
2. Garaeva AA, Slotboom DJ. Elevator-type mechanisms of membrane transport. Biochem Soc Trans. 2020; pii: BST20200290.
3. Garaeva AA, Guskov A, Slotboom DJ, Paulino C. A one-gate elevator mechanism for the human neutral amino acid transporter ASCT2. Nat
Commun. 2019;10(1):1-8.
4. Garaeva AA, Oostergetel GT, Gati C, Guskov A, Paulino C, Slotboom DJ. Cryo-EM structure of the human neutral amino acid transporter ASCT2.
Nat Struct Mol Biol. 2018;25(6):515-521.
5. Jaehme M, Singh R, Garaeva AA, Duurkens RH, Slotboom DJ. PnuT uses a facilitated diffusion mechanism for thiamine uptake. J Gen Physiol. 2018 Jan 2;150(1):41-50.
6. Kovaleva IE, Garaeva AA, Chumakov PM, Evstafieva AG. Intermedin/adrenomedullin 2 is a stress-inducible gene controlled by activating transcription factor 4. Gene. 2016 Sep 15;590(1):177-85. 7. Garaeva AA, Kovaleva IE, Chumakov PM, Evstafieva AG. Mitochondrial
dysfunction induces SESN2 gene expression through Activating Transcription Factor 4. Cell Cycle. 2016;15(1):64-71.
8. Evstafieva AG, Garaeva AA, Khutornenko AA, Klepikova AV, Logacheva MD, Penin AA, Novakovsky GE, Kovaleva IE, Chumakov PM. A sustained deficiency of mitochondrial respiratory complex III induces an apoptotic cell death through the p53-mediated inhibition of pro-survival activities of the activating transcription factor 4. Cell Death Dis. 2014 Nov 6;5:e1511.
ACHIEVEMENTS
1. EMBO (European Molecular Biology Organisation) Short-Term Fellowship (2019) to carry out research in the lab of Prof. Markus Seeger (Institute of Medical Microbiology, University of Zurich, Switzerland). The topic of the research project is “Synthetic nanobodies for functional and structural characterization of glutamate transporters”.
2. SSBN (Stichting Stimulering Biochemie Nederland) travel grant to attend 72nd Annual SGP (Society of General Physiologists) Symposium
Molecular physiology of the cell membrane: an integrative perspective from experiment and computation (2018).
ACKNOWLEDGMENTS
Dear committee members, Prof. B. Poolman, Prof. I. Hänelt, Prof. A.J.M. Driessen and Prof. G. Maglia, thank you for your time and energy that you spent on reading my PhD thesis.
Dear Dirk Slotboom, I cannot wish to have a better supervisor. When I grow up, I want to be like you: clever, patient, understanding, ambitious, optimistic, supportive, wise, politically correct and a professor (maybe; I have not decided yet). Thank you for risking and accepting me as your PhD student, I feel that under your supervision and in the environment of your group I have evolved and developed greatly. I thank you for being a very good teacher, who can explain everything in a simple, clear and patient way; for being available 24/7; for enduring reading, correcting and improving all my writings and adding skipped articles; for careful discussion of my experiments and their results; for talking over my presentations before and after the meetings; for suggesting me to go on conferences and present at some of them. A special big thank you for organizing joined lab retreats with the groups from Frankfurt and Zürich! The very first of these meetings that happened in Groningen in summer 2016 helped me to discover that talking to people is not that scary as I had thought. I believe that these meetings are impactful much beyond just sharing experiences and discussing scientific problems. These meetings can help someone to decide what to do next in their life, like it happened in my case. On a personal level, I always enjoy criticizing with you hot sunny weather and waiting for the rain; discussing the “Nutcracker” ballet; agreeing that Moscow is the most beautiful city in the world (right?). I thank you for all the supportive talks with me and Vakil, for the recommendations how to behave in certain situations and for being just a very nice person.
Dear Cristina Paulino, you are a very smart, motivating, creative, leading and inspiring supervisor. I am proud to be a part of your group, directly learn from you many aspects of our science: from theory and technical parts – through the data analysis and trouble shootings – to the manuscripts writing and figures polishing. In addition to all your science-related qualities, you are a very thoughtful and a VERY communicative person, which I love! I never met anyone in my life who can talk about any subject, discuss any topic, argue on any side of a conversation. You are my example to follow.
Dear Albert Guskov, I am infinitely grateful to you for helping me to find this PhD position. You were the one who organized for me the interviews
with Bert, Arnold and Dirk, and you were the one who initiated ASCT2 research project. Your belief in Russian scientists and your trust in them are priceless and teach me not to judge people by the first impression they make. Thank you for all the conversations that we have had and for the psychological support of me and Vakil that helped us to stay positive and motivated. I am extremely lucky to be a member of the main Eurovision fun club and to share with you, Marina, Leo and Teo the happy night of the Netherlands’ victory in 2019. Looking forward for seeing you on TV screens as the visitors of the 2021 final in Rotterdam, and, who knows, as performers at some point. Marina, the cupcakes made following your recipe are my most favorite dessert!
Dear Bert Poolman, I thank you for all the questions that you asked me during the group meetings, all the comments regarding this thesis book and uniting Christmas dinners that you organized.
Dear Jacopo, I am so happy that you postponed your acting career and, instead of playing in “The Young Pope”, chose a PhD in Groningen. I have decided that we should become best friends the first day I saw you at the Monday group meeting (although it took other 3 months to implement this plan). I really hope that you will find the job of your dream somewhere in Switzerland, preferably near Zürich because I cannot imagine any party or a meeting for “just one” Aperol without you! And yes, I like you first for your brain, and then for your beauty!
Dear Gianluca, I think I would still not be talking to people if it were not for you. Thanks for becoming my very first international friend! I think I now know so many details about Italy (never microwave risotto; where Trinco village is on the map) that one day I can write a tourist guidebook of that country. I truly enjoyed our coffees, “how to measure transport rates” discussions, watching students re-passing biochemistry exam, observing how fascinated you are when talking about fishes and aquariums, watching Jupiter, Saturn and the NEOWISE comet through your telescope. Please, stay the same versatile person as you are and exploit the world with your scooter!
Dear Vanessa, I am convinced that you are a reincarnated cat! You are very strong and stylish, and your strict following of the color season system makes you to look even more stunning. I believe you can become a powerful old Russian lady living in Saint Petersburg!
Dear Emanuela, thanks for your company, Lambrusco Wednesdays, your mum home-made limoncello, singing Ed Sheeran songs and dancing,
“how “the proper” Latin language should sound” discussions and for being a very good friend.
Dear Valeria, the head of the wet lab of Paulino group, I am very lucky to meet you and to learn how the best professional gin tonics are made. You are the one who inspired me for the painting sessions during the quarantine and discovered for me the Alcohol Ink technique, which lead to the cover of this thesis book. Thanks for sharing this short time with me and I hope to learn more about Zürich from you.
Dear friends and (ex-)members of the Molecular Systems Biology group Tamara, Diego, Mattia and Luc. Thank you for being a part of Vakil’s and my life, you are very interesting and funny people with strong personalities. Tamara, thank you for all the concerts and events that we visited together; for picnics and coffees. It impresses me how much energy and motivation you have to interact with people and how open you are for new experiences and new friends. Diego, I am very happy for you, your job and life in den Haag. We (including our cat Grusha) miss you very much; you are a positive and a talkative person. Bueno. Mattia, you are really a treasure of the group. Thank you for your honesty and reliability; for babysitting our cat (you know that you are her favorite sitter, right?). But special thank you for your company for Vakil, for discussing with him all the nerdy stuff, politics, listening for his complains (less job for me to do) and for just being a very good friend. Luc, thank you for joining Vakil in the discussions during the coffee breaks, being a nice office mate and for supporting him during his PhD defense.
Dear office mates, Aike, Michelle, Inda, Yasmine, thank you for sharing the common space with me, for the grape and cookies only for “133 office people”. Aike, I am still jealous of your dreads and maybe one day I will do something similar with my hair. I enjoyed discussing with you what we had/are going to have for dinner; listening what people gossip about in the corridor by the coffee machine (you can not help doing it if the office is next to the coffee machine!). Also, thank you for translating my summary in Dutch!
Dear Chancie, Foteini, Jan, Marc, Lisa, Gert, Michiel, Adi, Franz, Solene, Laura, Miyer, Pauline, Joury, Mark, Jose, Ella, Alex, Artem, Bauke, Masha, Pavlo, Eleonora, Evi, Hendrik, Li Yue, Luca, Marco, Minh, Wojtek, Gea, Ineke, Renate, Sandra, Tim, Rianne, thank you for your help, for all the discussions (scientific and not very scientific), all lunches and small talks in the lab or in the corridor that we had. Chancie, you are very nice, intelligent and supportive person. Thank you for all the
scientific discussions and for discovering for me some bars in Groningen. Foteini, I am convinced that you are a soul of the group; you are a funny, super communicable and interacting person, and a friend for many cats including Grusha (that’s actually a big achievement!). Jan, thank you for all the help with the Talos and data processing, nothing would have work without you! Adi, that was fun to organize the group outing with you, I learnt many organizational aspects following your example. Masha, thank you for all the days and nights that you spent at our place looking for Grusha, including the weeks after the fire. Gea, thank you for producing with me 0.5 kg of yeast cells at the very beginning – that was enough for my PhD. Ineke, thank you for sharing with me the lipid preparation task and for your help with orders.
Also thanks to all the (ex-)members of the Membrane Enzymology, the Structural Biology and the Molecular Systems Biology groups, you all are diverse and interesting people and from each of you I learnt something.
Dear alumni of the Membrane Enzymology, Stephan, Joris, Weronika, Valentina, Joana, Lotteke, you all are fascinating people, and that was a pleasure to work with you and share the same office with some of you. You are my examples of how to find your path in life and in the career and how not to be scared to follow your dream in the same country or on the other side of the globe. Let’s keep in touch!
My dear non-biologist Russian friends, Andrey Dorokhov and Dasha Sidorova, Anatoly and Marina Gladky, Dolgor, Angelica Kriger, thanks a lot for your company and all discussions that we had! Every meeting with you was an incredible pleasure and motivated me for new actions.
My dear biologist Russian friends, Nikolai Kondratev, Irina Garanina, Olga Shadrina, Roman Beloshistov, Anna Zotova, thank you for the emotional support during my school, university and PhD times. You are real example of friends that can be in touch while living in different countries. Nikolai, I want to thank you for all traditional weekend skype calls that you had with Vakil that helped him and me to stay sane persons. And thanks for the amazing book marks, I cannot read any book without them anymore. Enjoy your New Zeeland hobbit life, one day we will visit you! Irina and Olga, daughter and mother, my dear university dorm room mates. I wish you to remember how smart and talented you are and fight for getting your PhD degrees. Irina, I believe you will build an amazing house! Roman, my dear lab colleague in Moscow, thanks for all the beers and potatoes from the microwave that we had, for the episodes of a series about Moscow metro, for growing tomatoes and for being a very good and
supportive friend. Enjoy Heidelberg, your C2 level of German language, and I am looking forward to seeing you soon at least as a group leader and then as a PI. Zot, you are a very talented neurologist whom I would even trust. Thanks for all the fun and cheerfulness that you always bring to my life starting from high school times. I hope the hospital where you are working has finally bought enough gloves so that you don’t need to use yellow rubber cleaning gloves for you medical purposes anymore.
Дорогие сибирские родственники, Людмила, Андрей и Лиза, я очень рада вашему появлению в моей жизни. Вы активные, креативные, справедливые и жизнерадостные люди. Спасибо за все ваши усилия, чтобы показать мне красоту Сибири и сделать каждый из наших приездов приятным времяпрепровождением, полным приключений. Дорогая бабуля Давани (Ася), казанские родственники, спасибо вам за гостеприимство и проведенные у вас летние каникулы. Татарский мир очень большой и необычный, и все это особенно забавно обсуждать с другими татарами. Мои хорошие родители, мама и папа, спасибо за то, что воспитали меня, помогли выбрать мой жизненный путь и направить меня в биологию. Спасибо за вашу любовь, поддержку, советы и за то, что вы самые лучшие. Я вами очень горжусь и люблю! Братик Ильдарчик, ты очень классный и милый, и чистюля. Приезжай к нам в гости играть с Грушей, развлекать и фоткать нас. Дорогие тетя Света, Андрей и Вова, спасибо, что развлекаете и присматриваете за мамой. Удачи вам с постройкой дома и с кальвадосом!
My dear Vakil, you are the most talented person in the world! You are very honest, polite and extraordinary smart; you are funny, patient and reasonable. I am incredibly lucky to share my life with you. Thank you for all the sleepless nights when you were helping me with math and python homework at the University in Moscow; for the romantic mails that you sent me by post during summer holidays; for teaching me the English language and rehearsing my presentations; for explaining how to behave in a certain environment. You are always near me and I really cannot imagine my life without you. But specifically thank you for your persistence that made me to fall in love with you and that lead me to my current PhD position and this thesis. Я тебя очень люблю.
