University of Groningen
PET methodology in rat models of Parkinson’s disease
Schildt, Anna
DOI:
10.33612/diss.125440245
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2020
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Schildt, A. (2020). PET methodology in rat models of Parkinson’s disease. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.125440245
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Chapter 9
Inleiding
De ziekte van Parkinson is de op een na meest voorkomende neurodegeneratieve ziekte wereldwijd en, met een steeds ouder wordende bevolking, een aanzienlijke belasting voor patiënten, zorgverleners en de samenleving. De ziekte wordt gekenmerkt door de pathologische vorming van alfa-synucleïne-eiwitaggregaten en de degeneratie van dopaminerge neuronen in de substantia nigra pars compacta. Klinische symptomen van de ziekte van Parkinson zijn de motorische symptomen bradykinesie, starheid en tremor, evenals een aantal niet-motorische symptomen, waaronder constipatie, depressie en dementie. Zowel klinische studies met patiënten met de ziekte van Parkinson als studies in diermodellen, zoals vissen, knaagdieren of niet-menselijke primaten, zijn een belangrijk onderdeel geweest van het onderzoek naar de moleculaire en fysiologische mechanismen achter de ziekte. Een breed scala aan methoden wordt toegepast in deze klinische en preklinische studies, waaronder positron emissie tomografie (PET). PET is een krachtige techniek die de evaluatie van fysiologische processen in vivo mogelijk maakt, zowel bij mensen als bij dieren, op voorwaarde dat een geschikt radioligand voor het beoogde doelwit beschikbaar is. Voordat PET met een nieuw radioligand kan worden toegepast in onderzoek of de reguliere patiëntenzorg, moet de optimale kwantitatieve analyse van elk PET-radioligand worden bepaald. Terwijl mensen en kleine proefdieren, zoals knaagdieren, het grootste deel van hun genetische code delen, zorgen verschillen in eiwitexpressie en -binding of metabolisme er voor dat een evaluatie van een radioligand in elke soort noodzakelijk is.
Evaluatie van de PET-methodologie
De focus van het eerste deel van dit proefschrift was de evaluatie van twee radioliganden voor cholinerge doelwitten in ratten. Eerst werd het radioligand 1- [11C]-methylpiperidine-4-ylpropionaat ([11C]-PMP) geëvalueerd. [11C]-PMP is een
acetylcholinederivaat dat wordt gehydrolyseerd door acetylcholinesterase (AChE) in de synaptische spleet van cholinerge neuronen. Na hydrolyse zit de metaboliet van [11C]-PMP onomkeerbaar gevangen in de hersenen van mensen en andere
Nederlandse Samenvatting
213
9
primaten. Er werd echter ook aangetoond dat de metaboliet niet irreversibel gebonden is in de hersenen van ratten. Deze schijnbare omkeerbaarheid van de binding van [11C]-PMP in ratten zou kunnen leiden tot onjuiste resultaten als de
kwantificering ervan wordt uitgevoerd met methoden die bedoeld zijn voor irreversibel bindende radioliganden. Daarom werd een verkennend onderzoek naar de geschiktheid van farmacokinetische modellen of semi-kwantitatieve uitkomstmaten voor [11C]-PMP kwantificatie uitgevoerd (Hoofdstuk 2). We hebben
dynamische [11C]-PMP PET-scans van 90 minuten in combinatie met arteriële
bloedafname en metabolietanalyse uitgevoerd. Farmacokinetische modellen op basis van een metaboliet-gecorrigeerde plasma inputfunctie of een referentie-weefsel als inputfunctie zijn toegepast voor data analyse en daarnaast zijn als semi-kwantitatieve uitkomstmaten de gestandaardiseerde opnamewaarde (SUV) en de gestandaardiseerde opnamewaarde ratio (SUVR) berekend. De uitkomstmaten werden vergeleken met waarden van AChE-activiteit uit de literatuur om hun biologische validiteit te beoordelen. De studie bevestigde de schijnbare omkeerbaarheid van [11C]-PMP binding in ratten en we vonden dat het
irreversibele compartimentmodel met twee weefselcompartimenten (2TCM) niet in staat was om de data goed te beschrijven. Er konden namelijk geen betrouwbare schattingen van de snelheidsconstante k3, die de AChE-hydrolysesnelheid weergeeft, worden gemaakt, vanwege het verlies van de [11C]-PMP metaboliet uit
het hersenweefsel. Niettemin bleek uit visuele beoordeling dat Patlak grafische analyse de gegevens voor een acquisitielengte van 20 minuten goed te kunnen beschrijven. Hoewel de metabole snelheid (Ki) verkregen uit Patlak grafische
analyse theoretisch niet de gewenste uitkomstparameter is, was Ki goed
gecorreleerd met AChE-activiteit uit de literatuur. Voor een langere acquisitielengte van 60 minuten zou [11C]-PMP kunnen worden gekwantificeerd met behulp van het
effectieve distributievolume (EDV) dat rekening houdt met het verlies van metaboliet uit de hersenen en de mogelijke uitwisseling van de metaboliet tussen weefsel en plasma. Hoewel het EDV de gegevens van slechts vier hersengebieden goed kon beschrijven, correleerden die hersengebieden goed met AChE-activiteit. Hoewel de Patlak grafische analyse met het cerebellum als referentieweefsel de data niet goed kon beschrijven, correleerde de effectieve distributievolume ratio (EDVR) verkregen met het cerebellum als referentieweefsel goed met
AChE-activiteit. Net zoals geldt voor de EDV, zou de EDVR van slechts vier hersengebieden door het model kunnen worden gekwantificeerd. De semi-kwantitatieve metingen correleerden goed met AChE-activiteit. Er werden echter slechts matige correlaties van SUV met Ki of EDV gevonden, terwijl SUVR een
goede correlatie vertoonde met beide uitkomstmaten verkregen met plasma-input. Al met al laat de studie zien dat [11C]-PMP kan worden gebruikt voor de
kwantificering van AChE-activiteit met behulp van surrogaatmaten verkregen uit Patlak grafische analyse met metaboliet-gecorrigeerd plasma inputfunctie of de grafische analyse die rekening houdt met de uitstroom van metabolieten. Hoewel de evaluatie van [11C]-PMP bij ratten veelbelovende resultaten liet zien, zijn
aanvullende beoordeling van het cerebellum als referentiegebied en de invloed van veranderingen in de cerebrale doorbloeding op de opname van radioligand noodzakelijk voordat radioligand kan worden gebruikt in ziektemodellen in ratten. Een ander radioligand voor het cholinerge systeem is [18
F]-fluorethoxybenzovesamicol ([18F]-FEOBV), een ligand van de
acetylcholine-transporter (VAChT). In hoofdstuk 3 werd de kwantificering van [18F]-FEOBV
geëvalueerd in controle dieren en in ratten met gedeeltelijke verzadiging van VAChT door voorbehandeling met 10 µg/kg FEOBV. Net als bij de evaluatie van [11C]-PMP, werden dynamische [18F]-FEOBV PET-scans van 90 minuten in
combinatie met arteriële bloedafname uitgevoerd. Zowel farmacokinetische modellering als semi-kwantitatieve metingen werden toegepast om de gegevens te kwantificeren. Kwantificering met compartimentmodellen toonde aan dat het irreversibele 2TCM de snelheidsconstanten en de influxsnelheid Ki betrouwbaarder kon schatten dan het reversibele 2TCM. Logan en Patlak grafische analyse toonden een goede fit van de gegevens en een vergelijkbare variantie van het distributievolume VT en Ki. De influxsnelheid Ki van de irreversibele modellen was
echter vergelijkbaar voor 60- en 90-min acquisitie, terwijl VT voor 90 min
acquisitielengte hoger was dan voor 60 min. Voor 60 min acquisitielengte was Logan grafische analyse minder gevoelig voor gedeeltelijke verzadiging van VAChT dan de irreversibele modellen. De gedeeltelijke VAChT-verzadiging had geen effect op het optimale kinetische model met metaboliet-gecorrigeerde plasma input voor kwantificering van [18F]-FEOBV. We vonden echter een afname van Ki in
Nederlandse Samenvatting
215
9
referentieweefsel voor [18F]-FEOBV bestaat. De grafische analyse van Patlak met
het cerebellum als referentieweefsel kon inderdaad de data niet goed beschrijven. Bovendien werden slechte correlaties gevonden tussen de resultaten van het irreversibele 2TCM en de semi-kwantitatieve SUVR. Evenzo vertoonde SUV een slechte correlatie met Ki berekend met het irreversibele 2TCM wanneer VAChT
gedeeltelijk verzadigd was en een lage gevoeligheid om onderscheid te maken tussen de controle en partiële verzadiging van VAChT. Daarom moet SUV alleen worden gebruikt voor de kwantificering van [18F]-FEOBV als bloedafname niet
mogelijk is of als het te meten biologische effect groot is. Naast het vinden van de optimale kwantificatiemethode hebben we ook de test-hertest betrouwbaarheid van [18F]-FEOBV in controle dieren onderzocht. SUV werd gebruikt voor kwantificering
van [18F]-FEOBV omdat er geen bloedmonsters konden worden genomen
vanwege herhaalde PET-scans. We vonden een goede intraclass correlatiecoëfficiënt en test-hertest betrouwbaarheid met behulp van de SUV als de uitkomstparameter. Er moeten echter nog aanvullende test-hertest onderzoeken met arteriële bloedafname en kinetische modellering worden uitgevoerd.
De resultaten beschreven in hoofdstuk 3 toonden aan dat [18F]-FEOBV een
veelbelovend radioligand is voor de beoordeling van VAChT. Daarom hebben we het radioligand verder geëvalueerd door de mogelijkheid een verhoogde cholinerge activiteit af te beelden te onderzoeken. Dopaminerge en cholinerge neurotransmissie beïnvloeden elkaar in de hersenen en er is aangetoond dat dopamine D2-receptorantagonisten de afgifte van acetylcholine verhoogde. In de
studie beschreven in hoofdstuk 4 hebben we voorbehandeling met twee D2
-receptorantagonisten, raclopride (1 mg/kg) en haloperidol (10 mg/kg), gebruikt om de afgifte van acetylcholine te stimuleren. Vervolgens werden dynamische [18
F]-FEOBV PET-scans van 90 minuten met arteriële bloedafname uitgevoerd voor optimale kwantificering van cholinerge activiteit. Patlak grafische analyse met behulp van metaboliet-gecorrigeerde plasma-invoer werd gebruikt om de influxsnelheid Ki te verkrijgen als een maat voor cholinerge activiteit. We vonden
dat de influx in het striatum na behandeling met raclopride was toegenomen. Hoewel het effect niet statistisch significant was, was de effectgrootte groot (aangepaste p=0,1, Cohen's d=1,1). Het cerebellum vertoonde een lagere influxsnelheid na behandeling met raclopride in vergelijking met controleratten. Dit
zou kunnen suggereren dat off-target binding van raclopride of een interactie met andere neurotransmitters leidde tot de afname van de influxsnelheid als gevolg van de hoge dosis raclopride die werd gebruikt. Ratten behandeld met haloperidol vertoonden een verlaagd metabolisme van [18F]-FEOBV in vergelijking met
controleratten, maar er werd geen effect op de metaboliet-gecorrigeerde plasma-invoer gevonden. Alle hersengebieden behalve het striatum vertoonden een statistisch significant verlaagde influxsnelheid in met haloperidol behandelde ratten in vergelijking met de controle ratten. Naast D2-receptoren bindt haloperidol aan
verschillende andere receptoren, zoals adrenerge en serotonerge receptoren. Hoewel de hoge dosis haloperidol kan resulteren in binding aan andere receptoren, is de binding van haloperidol aan σ-receptoren de meest waarschijnlijke reden voor de effecten van haloperidol op [18F]-FEOBV opname.
Hoewel de bindingsaffiniteit van [18F]-FEOBV voor VAChT 10 keer groter is dan
voor σ-receptoren bij ratten, kwam de distributie van de verminderde binding na behandeling met haloperidol gedeeltelijk overeen met de expressie van σ-receptoren. Dit suggereert dat de binding van [18F]-FEOBV aan σ-receptoren bij
ratten verder moet worden geëvalueerd.
Toepassing van PET-methodologie
Het doel van de evaluatie van de kwantificatie van nieuwe radioliganden in ratten was het bevestigen van hun geschiktheid voor toepassing in PET-beeldvorming in dierziektemodellen. Voor progressieve neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Parkinson, kan veel informatie worden verkregen uit longitudinale studies. In het tweede deel van dit proefschrift is PET-beeldvorming toegepast bij het onderzoek naar pathologische processen gerelateerd aan de ziekte van Parkinson. Er wordt gesuggereerd dat in de hersenen van patiënten met de ziekte van Parkinson een hypercholinerge toestand optreedt, waarschijnlijk vanwege de degeneratie van dopaminerge neuronen, de daaropvolgende vermindering van beschikbare dopamine en de eerder genoemde interactie tussen dopaminerge en cholinerge neurotransmissie. Hoofdstuk 5 beschrijft een studie naar het effect van dopaminerge degeneratie op cholinerge neurotransmissie in een rattenmodel van
Nederlandse Samenvatting
217
9
de ziekte van Parkinson. Unilaterale intrastriatale injectie van 6-hydroxydopamine (6-OHDA) werd gebruikt om in ratten de degeneratie van dopaminerge neuronen, zoals waargenomen bij de ziekte van Parkinson, te modelleren. De controlegroep ontving intrastriatale injectie van vehikel. Daarnaast werd een subgroep van 6-OHDA en vehikel behandelde ratten gedurende vier weken onderworpen aan gedwongen lichaamsbeweging. Lichaamsbeweging lijkt neuroprotectief te zijn bij de ziekte van Parkinson door oxidatieve stress, hersenontsteking en dopaminerge denervatie te verminderen, hoewel de exacte mechanismen onbekend zijn. Daarom wilden we onderzoeken of de verhoogde cholinerge activiteit in het Parkinson-model werd verminderd door lichaamsbeweging. De motorfunctie van elke rat werd geëvalueerd met behulp van de cilindertest. Daarnaast werd PET-beeldvorming met behulp van [18F]-FEOBV uitgevoerd om cholinerge activiteit te
bepalen. Tien dagen na intrastriatale 6-OHDA of vehikelinjectie werd PET-imaging uitgevoerd zonder arteriële bloedafname en daarom werd de SUV gebruikt voor kwantificering van [18F]-FEOBV opname. Op dag 31 werd de
metaboliet-gecorrigeerde plasma-input bepaald met behulp van arteriële bloedafname en toegepast in het irreversibele 2TCM om de influxsnelheid Ki te verkrijgen. We
vonden geen effect van lichaamsbeweging of 6-OHDA-injectie op de motorfunctie in de cilindertest op dag 2, 8 of 29 na de behandeling met 6-OHDA of vehikel. Bovendien had 6-OHDA of lichaamsbeweging geen effect op de SUV of Ki van
[18F]-FEOBV. De vergelijking van de ipsi- en contralaterale hemisfeer van
verschillende hersengebieden toonde statistisch significante verschillen in SUV en Ki. Hoewel deze verschillen veroorzaakt zouden kunnen zijn door de unilaterale
injectie van 6-OHDA of vehikel, waren de effectgroottes klein. Daarom is het noodzakelijk om verder onderzoek uit te voeren met behulp van immuunhistochemie van markers van cholinerge neuronen om de PET-bevindingen te bevestigen. Bovendien moet de mate van dopaminerge denervatie van het striatum en substantia nigra in onze studie nog worden geëvalueerd. Hoewel op toxinen gebaseerde modellen van de ziekte van Parkinson zoals het 6-OHDA-model nuttig zijn bij het evalueren van bepaalde aspecten van de ziekte, kunnen ze geen informatie verschaffen over de effecten van genetische mutaties op de ziekte van Parkinson. De meest voorkomende genetische mutaties bij familiale en idiopathische ziekte van Parkinson zijn gevonden in het leucine-rijke
repeat kinase 2 (LRRK2) gen, dat betrokken is bij ontstekingsprocessen, zoals het primen van microglia. Geprimede microglia zijn gevoeliger voor triggers van ontsteking en vertonen een heftigere ontstekingsreactie. In Hoofdstuk 6 hebben we de hypothese onderzocht dat microglia van ratten die de menselijke LRRK2 p.G019S-mutatie dragen gevoeliger zouden zijn voor triggers en dus een heftigere hersenontstekingsreactie op een perifere ontstekingsstimulus zouden vertonen in vergelijking met niet-transgene nestgenoten. Bovendien verwachtten we dat de verhoogde ontstekingsactiviteit zou leiden tot verlies van dopaminerge neuronen. Daarom werden LRRK2 p.G2019S-ratten en niet-transgene nestgenoten in de buikholte geïnjecteerd met lipopolysaccharide (LPS, 3 mg/kg) als ontstekingsstimulus, of met zoutoplossing (controle ratten). Gedurende een periode van 10 maanden werden ontstekingen in de hersenen en dopaminerge integriteit beoordeeld met behulp van PET-beeldvorming met respectievelijk [11
C]-PBR28, [11C]-DTBZ en [18F]-DOPA. Bovendien werden gedragstesten voor
motorische functie en reukzin en postmortale immuunhistochemie van markers van hersenontsteking (CD68) en dopaminerge neuronen (tyrosine hydroxylase, TH) uitgevoerd. De verschillen die werden gevonden in gedragstesten hadden voornamelijk betrekking op veroudering van de ratten. Niet-transgene en LRRK2 p.G2019S transgene ratten behandeld met LPS vertoonden na verloop van tijd verhoogde [11C]-PBR28 binding in de cortex en ventrale hersengebieden,
waaronder hersenstam, amygdala en hypothalamus. Deze toename was echter alleen statistisch significant voor LRRK2 p.G2019S transgene ratten in vergelijking met controle ratten 10 maanden na LPS injectie. Postmortale analyse op 12 maanden na LPS-behandeling vertoonde geen statistisch significante toename van CD68-positieve cellen in het striatum of substantia nigra. Er werd geen dopaminerge degeneratie gedetecteerd met behulp van PET-beeldvorming of met immuunhistochemie bij ratten die werden behandeld met LPS die gerelateerd konden zijn aan de aanwezigheid van ontsteking in het striatum en substantia nigra. Door de ontsteking in de cortex en ventrale hersengebieden kunnen echter andere neurotransmittersystemen zijn aangetast. Samengevat toonde deze studie aan dat een perifere inflammatoire trigger een progressieve toename van ontstekingsreacties in de hersenen bij LRRK2 p.G2019S-ratten kan veroorzaken,
Nederlandse Samenvatting
219
9
hoewel deze ontstekingsreacties de dopaminerge integriteit in deze studie niet beïnvloedde.
De bevindingen van dit proefschrift benadrukken het belang van het evalueren van nieuwe radioliganden in elke diersoort vóór hun gebruik. De verschillen tussen mensen en ratten, waaronder in bloed-hersenbarrière permeabiliteit zoals gezien voor [11C]-PMP of de bindingsaffiniteit van [18F]-FEOBV voor VAChT- en
σ-receptoren, kan de selectie van het kinetische model sterk beïnvloeden en bijgevolg de uitkomstmaten van de studie beïnvloeden. Bovendien toont het aan dat PET-beoordeling van dierziektemodellen in longitudinale studies kan worden beïnvloed door radioliganden die bloedmonsters nodig hebben voor hun optimale kwantificering. Rekening houdend met deze beperking, vonden we geen hypercholinerge staat in het 6-OHDA rattenmodel, hoewel aanvullende bevestiging van de mate van dopaminerge degeneratie nog moet worden uitgevoerd. Injectie van 6-OHDA leidt tot snelle degeneratie van dopaminerge neuronen in vergelijking met ziekteprogressie gedurende meerdere decennia bij de mens. Deze discrepantie zou de uitkomst in onze studie kunnen hebben beïnvloed. Bij het evalueren van het effect van een perifere ontstekingstrigger op ontstekingsprocessen en het dopaminerge systeem in de hersenen vonden we geen dopaminerge degeneratie in LRRK2 p.G2019S transgene ratten. Daarentegen werd een toename van hersenontsteking gevonden in de cortex en ventrale hersengebieden en dit had andere neurotransmittersystemen kunnen beïnvloeden. Onderzoek naar de ontwikkeling van de ziekte van Parkinson is zeldzaam omdat de ziekte meestal pas wordt gediagnosticeerd na het optreden van motorische symptomen wanneer er al een aanzienlijke dopaminerge degeneratie is opgetreden. Diermodellen dragen enorm bij aan onze kennis van de ziekte van Parkinson en andere ziekten. Niettemin, zoals dit proefschrift aantoont, moeten de bevindingen uit dierstudies zorgvuldig worden vertaald naar de mens.
