Acute myeloïde leukemie (AML) is een heterogeen ziektebeeld waarbij in de WHO-classificatie een be- langrijke rol is weggelegd voor zowel morfologie, im- munofenotypering als detectie van chromosomale afwijkingen. Bij 40-50% van alle adulte ‘de novo’
AML-patiënten zijn met klassieke cytogenetische technieken abnormaliteiten afwezig en is nadere sub- typering van deze intermediaire risicogroep niet goed mogelijk. Dankzij het ontdekken van mutaties in het nucleofosminegen (NPM1) lijkt nadere classificatie mogelijk waardoor beter inzicht wordt verkregen in prognose en behandelstrategie. De praktische uit- voerbaarheid van realtime- kwantitatieve-PCR (RT- PCR) van de mutaties NPM1 A en B werd door ons getest aan de hand van een in de literatuur beschre- ven methode bij 49 in onze kliniek onderzochte vol- wassen AML- patiënten.
De mutaties NPM1-A en -B werden gevonden bij 12 volwassen patiënten met ‘de novo’ AML (24%), vaak bij een niet afwijkend karyotype (41%) en in combi- natie met mutaties in het fms-like tyrosinekinase-3- gen (‘internal tandem repeats’, FLT3-ITD- en D538- mutaties).
Toepassing van RT-PCR op RNA, geïsoleerd uit peri- feer bloed of beenmerg, leidt tot snelle en betrouwbare bepaling van de beide NPM-mutaties bij AML-patiën- ten. Dit is van belang voor diagnostiek en prognose met name bij AML-patiënten met een normaal karyo- type. Tevens behoort kwantificering van de NPM-mu- tatie, en daarmee bepaling van de tumorrestactiviteit, tot de mogelijkheden.
Trefwoorden: AML; Nucleofosmine; NPM; NPM1;
realtime-polymerasekettingreactie
Acute myeloïde leukemie (AML) is de meest voor- komende vorm van leukemie bij volwassenen waar- bij tenminste 20% van de totale kernhoudende cellen myeloïde blasten zijn. Onbehandeld kent AML een snel, vaak fataal, verloop zodat spoedige diagnos- tiek en behandeling van cruciaal belang zijn. Bij de in 1976 opgestelde FAB-classificatie (M0 t/m M7) werd AML ingedeeld op basis van de aantallen myelo- blasten, morfologische kenmerken van uitrijping, en de positiviteit van speciale celkleuringen (1). De FAB-classificatie blijkt echter niet altijd in staat kli- nisch beloop en overleving juist te voorspellen. Bij de nieuwe WHO-classificatie (2) is de indeling, naast immuunfeno typering, in belangrijke mate gebaseerd op de aanwezigheid van specifieke cytogenetische en moleculaire afwijkingen. Een groot aantal AML- patiënten kent specifieke cytogenetische afwijkingen zoals de translocaties inv (16), t (16;16), t (8;21), en t (15;17) die alle een goede prognose vertonen in te- genstelling tot bijvoorbeeld de translocaties t (9;22) en 11q23 die ongunstig zijn. Voor een overzicht, zie (3). Echter, met conventionele karyotypering zijn geen chromosomale abnormaliteiten detecteerbaar in 40-50% van alle gevallen (4). Mede dankzij de mi- croarray-analyse van grote groepen AML-patiënten (5, 6) is men er op basis van genexpressiepatronen in geslaagd het heterogene ziektebeeld AML verder uit te splitsen en nieuwe mutaties op te sporen die van invloed zijn op de prognose en behandeling. Zo kennen mutaties in bijvoorbeeld de transcriptiefactor CCAAT/enhancer-binding protein-α (CEBPA) (7, 8) een gunstig beloop. Andere, nieuwere markers zoals de interne tandemduplicatie (ITD) van het ‘fms-like tyrosinekinasegen’ (FLT3) (9), de partiële tandemdu- plicatie (PTD) van het ‘mixed lineage leukemiegen’
MLL (10), en toegenomen expressie van de transcrip- tiefactor EVI1 (11) en WT-1 (12) hebben daarentegen een slechtere prognose.
Recent zijn nieuwe mutaties ontdekt op exon-12 van het nucleofosminegen (NPM1) (4, 13-16). Deze NPM1- mutaties blijken de meest specifieke en meest voorko- mende genetische afwijkingen te vormen in volwassen en jonge AML-patiënten met een normaal karyotype (13, 17). De incidentie bij volwassenen bedraagt 35%
van de gevallen bij ‘de novo’ AML (4) terwijl deze bij 5-10% van de kinderen met AML aantoonbaar is (13).
Ned Tijdschr Klin Chem Labgeneesk 2009; 34: 150-156
Artikelen
Analyse en toepasbaarheid van de nucleofosminemutaties bij acute myeloïde leukemie
F.A.J.T.M van den BERGH1, Ö. BINGÖL1, J. SLOMP1, M.R. de GROOT2 en A. HEIJS-OUDE GROENEGER1
Afdelingen Laboratorium1 en Interne Geneeskunde2, Medisch Spectrum Twente, Enschede
Correspondentie: dr. F.A.J.T.M van den Bergh, Laboratorium Medisch Spectrum Twente, Postbus 50.000, 7500 KA Enschede E-mail: F.vandenbergh@ mst.nl
Afkortingen: MRD: minimal residual disease; RT-PCR: real- time-kwantitatieve-polymerasekettingreactie; NPM1: nucleo- fosmine-1; FAB: French-American-British Classification
Naast een normaal karyotype is NPM1 sterk geassoci- eerd met FLT3-ITD mutaties (15). Nucleofosmine is een in de celkern gelokaliseerd fosfoproteïne dat be- trokken is bij verschillende cellulaire processen zoals de duplicatie van centromeren, de biogenese van ri- bosomen en de regulatie van de tumorsuppressor p53.
Zij faciliteert het transport van pre-ribosomale eiwit- partikels naar het cytoplasma en heeft daardoor een belangrijke rol in de biogenese van ribosomen. NPM1- mutaties leiden tot veranderingen in het carboxytermi- nale einde van de nucleofosmine-eiwitketen waardoor het niet langer in de kern kan binden en cytoplasma- tisch gelokaliseerd wordt. Transport van ribosomale eiwitten over het kernmembraan wordt hierdoor niet langer gefaciliteerd (18-20). Circa 40 verschillende mutaties zijn inmiddels bekend (14, 21-23). Mutatie A, een TCTG-tetranucleotideduplicatie op positie 956 is verantwoordelijk voor 75% van alle NPM1- mutaties bij volwassenen. Mutatie B, een insertie van een CATG op positie 959, voor nog eens 15% van alle NPM1-mutaties. De aanwezigheid van NPM1-mutaties is geassocieerd met een betere respons op inductie- therapie en heeft mogelijk een gunstige invloed op de langetermijnsoverleving van FLT3-negatieve patiën- ten (15, 24). De aanwezigheid van de NPM1-mutatie heeft dus mogelijk grote invloed op de therapiekeuze voor deze groep AML-patiënten, en de ontwikkeling van gerichte vormen van therapie die rechtstreeks in- grijpen op door NPM-gereguleerde processen (14, 13, 25). Het bepalen van de tumorrestactiviteit (minimal residual disease, MRD) is een belangrijke parameter in de follow-up van de behandeling. Is de gevoelig- heid van detecteerbare restactiviteit m.b.v. microsco- pische morfologie 1-5% (5:10-2) en met flowcytometri- sche technieken ca. 0, 5% (5:10-3), zo valt op DNA- en RNA-niveau een gevoeligheid van 1:10-4 tot 1:10-6 te bereiken. Mutatiedetectie van genetische afwijkingen met behulp van kwantitatieve PCR is op dit moment mogelijk bij ongeveer 50% van alle AML-patiënten (3), waarbij het verloop van de ziekte tot op een niveau van 1 maligne cel op ca. 100.000 gezonde cellen ge- volgd kan worden. Kwantitatieve PCR van de NPM1- mutaties, die juist optreden bij AML-patiënten waarbij vaak geen andere cytogenetische afwijkingen detec- teerbaar zijn, kan het percentage patiënten met gene- tische afwijkingen in belangrijke mate verhogen en daarmee het inzicht in prognose en behandelstrategie.
Onlangs is door Gorello et al. (26) een snelle kwan- titatieve realtime-RT-PCR-assay ontwikkeld waarmee detectie van een aantal NPM1-mutaties gemakkelijk uitvoerbaar is. Omdat wij binnen HOVON-verband een uitgebreid pakket voeren voor de diagnostiek en monitoring van hematologische maligniteiten, hebben wij gekeken naar de praktische toepasbaarheid van deze assay op onze eigen patiëntenpopulatie.
Materialen en methoden Patiënten en celmateriaal
49 patiënten met de diagnose acute myeloïde leuke- mie (AML) met een gemiddelde leeftijd van 58 jaar (range 19-81 jaar) werden gediagnostiseerd volgens de WHO-criteria, gebaseerd op cytologisch onder-
zoek van bloed en beenmerg, immunofenotypering, cytogenetica en medische voorgeschiedenis. Tevens werd translocatieanalyse uitgevoerd op de transloca- ties BCR-ABL, AML1-ETO, PML-RAR, en CBFB- MYH11 na RNA-isolatie uit bloed en beenmerg vol- gens de geldende richtlijnen van het landelijk netwerk Moleculaire Diagnostiek bij Hematologische Maligni- teiten (www.modhem.nl). In 48 gevallen werd ook de FLT3-‘internal tandem duplication’ (FLT3-ITD) en de D538-puntmutatie bepaald. Uiterlijk binnen 1 uur na afname werd RNA geïsoleerd.
Celkweek
Gebruik werd gemaakt van de OC-AML3 cellijn (DSMZ cellijnbank, Duitsland) positief voor de NPM1 mutatie A, en de controlecellijn HL60 (DSMZ, idem).
De cellijn HL-60 werd opgekweekt volgens standaard- protocol in RPMI+ -medium bestaande uit RPMI1640 (zonder glutamine), 10% v/v FCS, 2% Pen/Strep, 1% v/v Ultraglutamine I en 0,4 µg Fungizone per ml medium.
De OC-AML3-cellijn werd opgekweekt in Alfa-MEM+- medium bestaande uit 20% v/v FCS, 2% v/v Pen/Strep, 1% v/v Ultraglutamine en 0,4 µg Fungizone per ml me- dium. Voor en na invriezen werd steeds gecontroleerd op mycoplasmacontaminatie d.m.v. DNA-analyse.
RNA afkomstig van perifeer bloed en beenmerg van AML-patiënten, gekweekte cellen van de positieve controle OC-AML3 (mutatie A) en negatieve controle HL-60 werden geïsoleerd met behulp van de QIAamp
®RNA Blood Mini Kit (Qiagen GmbH, Duitsland) volgens bijgeleverd protocol.
De kwaliteit van de RNA-isolatie uitgevoerd op bloed, beenmerg en isolaten van celkweken werd gecontro- leerd door middel van 1%-agarosegelelektroforese.
Hierbij werd gekeken naar de aanwezigheid en intact- heid van 18S en 28S ribosomale banden na aankleu- ring met ethidiumbromide.
Realtime-kwantitatieve-PCR
Bij de realtime-kwantitatieve-PCR is gebruik gemaakt van een gemeenschappelijke forward primer en probe voor zowel mutatie A als B en een mutatiespeciefieke reverse primer. Primers en probes (Applied Biosys- tems) staan beschreven in figuur 1: de forward pri- mer ligt in exon 11 (NPM-F), de probe (NPM- probe 5’-FAM-3’-MGB) ligt in het exon11/exon 12 gebied en de reverse primers (NPM mut A-R en NPM mut B-R) liggen in exon 12. De cDNA-synthese is uitgevoerd op 1 µg RNA. De realtime-kwantitatieve-PCR-reactiemix bestaat uit 12,5 µl TaqMan Universal Master Mix with uracil-N-glycosylase (UNG, Applied Biosystems), 300 nM primers, 200 nM probe en 5 µl cDNA (1/16 deel van de cDNA-reactie), in totaal 25 µl. De PCR wordt uitgevoerd en geanalyseerd op de ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System. PCR-condities zijn 2 min 50 ºC (UNG-enzymactivatie), 10 min 95 ºC (UNG- enzyminactivatie en AmpliTaq Polymerase-activatie), gevolgd door 45 cycli van 15 s 95 ºC en 1 min 60 ºC.
Er werd een fixed threshold gebruikt van 0,05. Na uit- voering van de reverse transcriptasereactie werd de kwaliteit en kwantiteit van het cDNA beoordeeld door RT-kwantificering van het porfobilinogeendeaminase (PBGD) gen dat werd meegenomen als referentiegen
volgens de richtlijnen van de MODHEM (Werkgroep Moleculair Biologische Diagnostiek van Hematologi- sche Maligniteiten, www.modhem.nl). Hier mee wordt tevens gecorrigeerd voor variaties in de efficiëntie van de cDNA-synthese en variaties in de cDNA-input die van invloed zijn op de hoeveelheid product na uitvoe- ring van de RT-PCR.
Sequencing
Het sequencen vond plaats d.m.v. conventionele PCR met behulp van Fast start Taq polymerase (5 U/µl). Per PCR van 50 µl is gebruik gemaakt van 5 µl cDNA, 20 µM forward primer, 20 µM reverse primer en 2 mM dNTP’s. Het PCR programma hierbij was: 2 minuten bij 95 °C, gevolgd door 40 cycli van 30 s bij 94 °C, 60 s bij 65 °C en vervolgens 60 s bij 72 °C; als laatste stap 10 min bij 72 °C. PCR- producten werden gescheiden en gevisualiseerd op 2%-agarosegel met ethidiumbro- mide. Hierna werden deze PCR-producten opgezuiverd met behulp van Exosap-IT (Amersham) en gekwanti- ficeerd door op 2% agarosegel te runnen. Vervolgens vindt ketenterminatie plaats. Per reactie van 20 µl werd gebruik gemaakt van 1,2 µl amplificaat en 20 µM pri- mer. Het programma voor de BigDye-reactie (BigDye Terminator Mix, Applied Biosystems) was: 25 cycli
van 10 s bij 96 °C, 5 s bij 50 °C en 90 s bij 60 °C. Hier- na werden de samples met behulp van ethanol gepre- cipiteerd en gescheiden m.b.v. capil laire elektroforese en fluorescentiedetectie op een ABI Prism 3100 Avant (Applied Biosystems).
Bepaling minimal-residual disease (MRD)
De hoeveelheid geamplificeerd produkt wordt d.m.v.
de TaqMan software berekend uit de kalibratiecurves.
Hierbij wordt de hoeveelheid restactiviteit berekend ten opzichte van de hoeveelheid uitgangsmateriaal waarbij gecorrigeerd wordt voor verschillen in PCR- efficiëntie en cDNA- inputvariaties via de Ct-waarden van het referentiegen PBGD. Gemeten wordt in duplo, waarbij de verschillen tussen de duplo Ct-waarden maximaal 2 Ct-cycli mogen zijn. Gebruik wordt ge- maakt van de ΔΔCt-methode waarbij ΔΔCt = ((Ctarget
t2 – CPBGD t2) – (Ct target t1 – CPBGD t1)) waarbij t1 en t2 de tijdstippen zijn van diagnose respectievelijk de follow-up. De hoeveelheid restactiviteit volgt uit de formule: % restactiviteit = 2 – ΔΔCt x 100%.
Alle overige niet genoemde translocatie- en mutatie- analyses zijn uitgevoerd conform de richtlijnen van het Moleculair Diagnostische Netwerk voor Hematologi- sche Maligniteiten (www.modhem.nl).
Statistische methoden
De associatie tussen het voorkomen van de FLT3- en de NPM1-mutaties werd bepaald met behulp van de fisher-exacttest.
Resultaten
Doordat de RNA-isolatie steeds werd uitgevoerd bin- nen 1 uur na afname van het onderzoeksmateriaal werden in alle gevallen intacte en discrete banden ge- vonden voor 18S- en 28S-ribosomaal-RNA bij agaro- segelelektroforese. De kwaliteit en opbrengst van het geamplificeerde cDNA werd beoordeeld aan de hand van het PBGD-referentiegen. Een gemiddelde Ct- waarde van 25,5 cycles werd verkregen bij analyse van 62,5 ng cDNA bij 49 verschillende patiënten samples onder gebruikmaking van 0,05 als vaste threshold waarde (figuur 1). Omdat afgebroken RNA tot lagere hoeveelheden uitgangsmateriaal en dus tot hogere C
t-waarden kan leiden, werd de individueel maximaal toelaatbare C t-waarde van het referentiegen op 27,5 cycles gesteld. Figuur 1AB toont de resultaten van het referentiegen, de mutaties NPM-A en NPM- B, en de positieve controle voor mutatie A (cellijn OC-AML3).
Voor mutatie B was geen commerciële cellijn verkrijg- baar. De standaardcurve werd verkregen door seriële verdunning van de positieve cellijn OC-AML3 (muta- tie A) in negatieve controlecellen (HL60). Tussen 10-2 en 10-6 wordt een lineair verband gevonden tussen de log concentratie en de Ct-waarde met een helling van -3,6 en een intercept van 18,2 C t -waarden (R = 0,992, figuur 2). Bij meting in drievoud is de reproduceer- baarheid uitgedrukt als variatiecoefficiënt bij de laag- ste verdunning (1:1) 0,3% oplopend tot 6,4% voor de hoogste verdunning (1: 106). Dit impliceert dat de ef- ficiency van de PCR-reactie ca. 1,9 bedraagt. Een ver- schil van 1 C t -waarde correspondeert dientengevolge met een verschil van ongeveer 50% in de geschatte Figuur 1. Realtime-kwantitatieve-polymerasekettingreactie
(RT-PCR) van beenmerg van patiënten met ‘de novo’ AML van nucleofosmine-exon 12 met (a) NPM1-mutatie A, (b) NPM1- mutatie B. Afkortingen: AD: aqua dest.; OC-AML3: controle- cellijn positief voor NPM1-mutatie A; HL60: controle cellijn negatief voor NPM1-mutaties. ∆Rn: Logaritmische weergave van de genormaliseerde fluorescentie.
A
B
1.000 E+1
1.000
1.000 6-1
1.000 6-2
1.000 6-3
1.000 6-4
1.000 6-5
1.000 E+1
1.000
1.000 6-1
1.000 6-2
1.000 6-3
1.000 6-4
1.000 6-5
∆Rn∆Rn
Amplification plot
Amplification plot Aantal cycli
Aantal cycli 0
0 5
5 10
10 15
15 20
20 25
25 30
30 35
35 40
40 45
45
concentratie van de gemeten doelwaarde (target-gen).
De hoge correlatiecoëfficiënt (R >0,99) resulteert in nauwkeurige schatting van de NPM1-mutatie A indien deze in lage concentratie aanwezig is. Ofschoon de curve lineair loopt tot 10-6 en de maximale gevoelig- heid bij duplometing 10-6 bedraagt, is het signaal bij deze lage concentratie (Ct-waarden 40 en hoger) min- der reproduceerbaar. De detectiegrens is daarom gezet op 10-5 d.w.z. dat voor mutatie A één gemuteerde cel op 100.000 wildtypecellen nog nauwkeurig te kwan- tificeren is. Bij 49 patiënten met AML getest op mu- tatie A en B werden bij 12 van hen NPM1-mutaties gevonden: 11 met NPM1-mutatie A (92%) en 1 met NPM1-mutatie B (8%). Bij 3 van de 12 patiënten vond detectie plaats in perifeer bloed, in de overige 9 op beenmerg. Bij één patiënt werd zowel bloed als been- merg geanalyseerd met Ct-waarden van resp. 16,71 en 15,77. Bij 46/49 patiënten werd volledige karyotype- ring uitgevoerd evenals analyse van de translocaties in de fusiegenen BCR-ABL, PML-RARα, CBFB-MYH11 en AML-ETO. Bij 9 van de 22 patiënten (41%) zon- der dergelijke chromosomale afwijkingen zijn NPM1- mutaties aantoonbaar. Bij de 24 patiënten met chro- mosomale afwijkingen bleken slechts in 2 gevallen (8%) NPM1-mutaties aantoonbaar. In 48 van de 49 patiënten werden ook twee type mutaties in het tyro- sinekinase-FLT3-gen, nl. de internal tandemduplicatie (FLT3-ITD) en de puntmutatie D835, geanalyseerd.
In de door ons onderzochte groep patiënten lijkt een significante associatie te bestaan met het voorkomen van FLT3- mutaties. Van de NPM1-positieve patiënten (n=12) vertonen zes patiënten (50%) tevens een FLT-3 mutatie, terwijl dit aantal in de NPM1-negatieve groep (n=36) slechts zeven bedraagt (19%, p=0,061).
De patiënt met de NPM1-mutatie B (nr. 23 uit tabel 2) heeft een AML-M2 met twee verschillende populaties blasten en is, ondanks de aanwezigheid van de prog- nostisch ongunstige mutatie FLT3-ITD, al bijna 5 jaar in remissie. Door middel van sequencing werd op de positieve cellijn OC-AML3 (mutatie A) en op 3 pati- enten met en zonder NPM-mutatie A en B mutatieana-
lyse uitgevoerd van een genfragment ter grootte van 276 bp met daarin het gebied waarin de beide mutaties zijn gesitueerd. Ten gevolge van de gemengde popula- tie positieve en negatieve cellen wordt steeds een dub- bel signaal verkregen. In het te verwachte mutatiege- bied komt de basevolgorde niettemin overeen met een TCTG- tetranucleotideduplicatie op positie 956 (mu- tatie A, figuur 3b) en insertie van de nucleotide CATG op positie 959 (mutatie B, figuur 3c). De basevolgorde van de wildtypepatiënt (niet-gemuteerd NPM-gen, fi- guur 3a) correspondeert volledig met die uit de litera- tuur (www.ncbi.nlm.gov.com, genbank NM002520).
Om te kijken of bepaling van de restactiviteit (MRD) mogelijk is bij het vervolgen van de behandeling, werd de hoeveelheid restactiviteit aan NPM-gemuteerde cellen gekwantificeerd. Van de 12 patiënten met een NPM-mutatie waren er zes van wie follow-up materi- aal aanwezig was (tabel 2). Hierbij werd het uitgangs- materiaal ten tijde van diagnose op 100% gesteld. Bij alle 6 patiënten is een sterke daling waarneembaar. Bij 4 van de 6 patiënten is enkele maanden na inzetten van de behandeling geen restactiviteit meer meetbaar. Er is een duidelijke relatie met de morfologische remis- sie (tabel 2). Patiënt nr. 47 met aanwezige restactiviteit is aan de gevolgen van AML overleden. De overige 5 patiënten zijn klinisch tot op heden nog in complete remissie.
Discussie
AML is een heterogene groep ziektebeelden waarvan een nadere indeling in subgroepen van cruciaal belang is voor de prognose, het ziektebeloop en de keuze van de therapie. Ongeveer 40% van alle ‘de novo’ AML- patiënten vertonen bij de klassieke karyotypering geen cytogenetische afwijkingen. Mede daardoor zijn zij moeilijk te classificeren met betrekking tot risico- inschatting en de keuze van therapie. Zij vallen in een intermediaire risicogroep. Volgens Gorello (26) blijken bij 60% van alle volwassenen AML-patiënten met normaal karyotype mutaties in exon 12 van het nucleofosmine (NPM1) gen voor te komen. De NPM1- mutatie blijkt samen te gaan met een betere respons op inductietherapie (15, 27). Door Gale et al. (27) en Verhaak et al. (15) werd tevens een reciproke relatie aangetoond tussen de aanwezigheid van de mutaties FLT3-ITD en NPM1 met betrekking tot het risico op relapse en de overlevingsduur. De FLT-ITD mutatie is geassocieerd met een slechte prognose. Voor de FLT3- D835-puntmutatie lijkt eenzelfde ongunstig effect te bestaan. Zowel de FLT-3 als NPM1-mutaties blijken significante, onafhankelijke risicomarkers te zijn met betrekking tot relapse en overlevingsduur (15,27).
Hierdoor valt onderscheid te maken in 3 prognosti- sche groepen: gunstig (FLT3-/NPM1+), intermediate (FLT3-/NPM1- of FLT3+NPM1+) en ongunstig (FLT3+/ NPM1-). Door bepaling van zowel de FLT3- als de NPM1-mutaties kan de huidige intermediaire risico- categorie dus worden opgesplitst in beter classificeer- bare risicogroepen.
Door Gorello et al. (26) werd een realtime-kwantita- tieve (RT)-PCR ontwikkeld voor de NPM1-mutaties A t/m H na isolatie uit DNA- respectievelijk RNA- materiaal van ‘de novo’ AML-patiënten.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
50 Standaardcurve
Ct-waarde
1,00E-06 1,00E-05 1,00E-04 1,00E-03 1,00E-02 1,00E-01 1,00E-00 Standaarden
Figuur 2. Verdunningsreeks van de positieve cellijn OC-AML3 (NPM1-mutatie A) in negatieve controlecellen HL60. Tussen 10-2 en 10-6 wordt een lineair verband gevonden met hellings- hoek -3,6, intercept 18,2 Ct-waarde en correlatiecoëfficiënt R = 0,992. De reproduceerbaarheid van de gemeten Ct-waarden is weergegeven als ± 2SD (balken). Bij Ct ≥ 40 (verdunnning 1:
106) wordt de meting onvoldoende reproduceerbaar.
In onze handen blijkt na isolatie van mRNA uit pe- rifeer bloed of beenmerg de RT-PCR op de NPM1- mutaties A en B zoals beschreven (26) snel en be- trouwbaar mogelijk. Wij beperkten ons tot de analyse van de mutaties A en B die samen ca. 90% van alle NPM1-mutaties vertegenwoordigen. De aanwezigheid van beide mutaties kon met behulp van sequencen be- vestigd worden, ofschoon door de gemengde popula- ties afwijkende en normale cellen de interpretatie van de basenvolgorde bemoeilijkt werd.
De door ons gevonden aantallen mutaties NPM1-A en NPM1-B stemmen goed overeen met de in de literatuur gerapporteerde percentages van voorkomen (15, 25).
Met 41% komt de mutatie met name voor in combinatie met een normaal karyotype. Het frequent voorkomen van deze mutaties bij normaal karyotype en zonder de aanwezigheid van andere cytogenetische afwijkingen, behoudens de FLT3-ITD mutatie, is primair van be- lang voor de prognose en dus voor de keuze van thera- pie. Het opvallende samengaan met de FLT3-mutatie, zoals beschreven in de literatuur (15, 27), is door ons minder significant bevonden (p = 0,061) wat mogelijk te wijten is aan het beperkte aantal onderzochte pa- tiënten: 50% van de 12 NPM1-positieve patiënten is ook positief voor een FLT3-mutatie terwijl dat aantal in de NPM1-negatieve groep slechts 19% bedraagt.
Omdat één gemuteerde cel betrouwbaar en reprodu- ceerbaar te detecteren is op minimaal 100.000 gezonde cellen, zou de kwantitatieve RT-PCR tevens een aan- grijpingspunt kunnen zijn voor bepaling van de MRD.
Bij 5/6 patiënten waarvan meerdere samples tijdens de behandelingsperiode beschikbaar waren, vinden wij na behandeling een drastische reductie in de aantallen maligne cellen, zowel in beenmerg als perifeer bloed.
Alle 5 patiënten zijn klinisch nog steeds in volledige remissie. Eén patiënt vertoonde een nieuwe oploop van het % MRD en is inmiddels aan de gevolgen van de AML overleden. De sequentiële meting van NPM1 in beenmerg kan worden gebruikt voor MRD-metin- gen. Het is echter niet bekend of bij AML, net als bij CML, het perifeer bloed een goede afstemming is van het beenmerg bij het ziekteverloop; vooralsnog moet daarom worden uitgegaan van beenmerg.
Een meer uitgebreide studie samen met verhoging van de detectiegevoeligheid tot 10-6 positieve cellen zal moeten uitwijzen wat het nut is van de NPM1- mutatieanalyse voor het monitoren van AML- patiënten waarbij geen andere chromosomale afwijkingen aan- toonbaar zijn. Het therapeutisch algoritme bij kwanti- ficering van de resterende t (9;22) -activiteit bij CML Figuur 3. Basevolgorde van cDNA-fragment ter grootte van
276 bp in het mutatiegebied zoals geamplificeerd met de for- ward primer in exon 11 en de reversed primer van het NPM1- genfragment zoals aangegeven in tabel 1. (A) ongemuteerde cellen (wildtype), (B) mutatie A (tetranucleotideduplicatie TCTG, onderstreept), (C) mutatie B (insertie van CATG, on- derstreept).
A
B
C
Tabel 1. Primers en probes zoals gebruikt voor de CDNA-assay en sequencing van de nucleofosmine-NPM1-mutaties A resp. B vol- gens Gorello et al. (26). De reverse primer, gebruikt voor de sequencing, is zelf gekozen om een groter amplicon te genereren (276 bp). Afkortingen: FAM: ‘fluorescent dye 6- carboxy-fluorescein’, MGB: ‘minor groove binder’.
Primer Sequentie Toepassing
NPM1-forward mutatie A en B 5’-GAAGAATTGCTTCCGGATGACT-3’ Sequencen, cDNA-assay
NPM1-reverse mutatie A 5’-CTTCCTCCACTGCCAGACAGA-3’ cDNA-assay
NPM1-reverse mutatie B 5’-TTCCTCCACTGCCATGCAG-3’ cDNA-assay
NPM1-probe 5’-FAM-ACCAAGAGGCTATTCAA-MGB-3’ cDNA-assay
NPM1-reverse 5’-AACCAAGCAAAGGGTGGAGTT -3’ Sequencen
is een goed voorbeeld van de potentie van een derge- lijke strategie (28).
Samenvattend: analyse van de nucleofosmine-1-muta- ties A en B is in de praktijk goed uitvoerbaar en lijkt een welkome aanvulling te vormen op de reeds be- staande AML-genotypering, zoals die in de HOVON- laboratoria gebezigd wordt. Nadere risicoclassificatie van met name die AML-patiënten die een normaal karyotype bezitten, wordt daardoor mogelijk.
Dankbetuiging
Het uitvoeren van de sequencing-reacties kon plaatsvinden dankzij de welwillende medewerking van het Streeklaborato- rium voor de Microbiologie voor Twente-Achterhoek (hoofd:
dr. R. Hendrix) te Enschede.
Referenties Bennett J
1. M, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR, Sultan C. Proposals for the classifica- tion of the acute leukaemias. French-American-British (FAB) co-operative group. Br J Haematol 1976; 33: 451-8.
Bennett J
2. M, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR, Sultan C. Proposed revised criteria for the classification of acute myeloïd leukemia. A report of the French-American-British Cooperative Group. Ann Intern Med 1985; 103: 620-5.
Jansen JH, van der Reijden BA. Moleculaire diagnostiek van 3.
myeloïde maligniteiten. Ned Tijdschr Hematol 2005; 2: 50-8.
Falini
4. B, Mecucci C, Tiacci E, Alcalay M, Rosati R, Pasqualucci L, La Starza R, Diverio D, Colombo E, et al.;
GIMEMA Acute Leukemia Working Party. Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a nor- mal karyotype. N Engl J Med 2005; 352: 254-66.
Tabel 2. Tumorrestactiviteit (MRD) tijdens diagnose, na inductietherapie en follow-up van patiënten met NPM1-mutatie-A-positieve AML. Het betreft de relatieve afname waarbij de concentratie NPM1- positieve cellen tijdens de diagnose op 100% is gesteld. De gevoeligheid waarbij betrouwbaar nog tumoractiviteit meetbaar is, is op 10-5 gesteld. Afkortingen: BM: beenmerg, PB: perifeer bloed, CR: complete remissie, PHSCT: perifere hematopoëtische stamceltransplantatie.
Pa- Datum Mate- Ct NPM- Ct ΔΔCt Follow-up- % restacti- Immuunfeno- Morfologie tiënt afname riaal mutatie PBGD periode viteit t.o.v. typering
(maanden) diagnose
2 05-12-2007 BM 17,28 24,64 0 0 100 25% afwijkende cellen AML-M6 uit MDS +25% erytroblasten
27-02-2008 BM 34,53 25,93 15,96 2 0,0016 CR CR
4 19-08-2005 PB 16,3 23,30 0 0 100 AML, 93 % blasten 94% blasten, AML-M1
14-09-2005 BM 33,9 27,30 13,6 1 0,0081 - geen goed BM
08-11-2005 BM 45 24,60 27,4 3 0 - CR
04-07-2006 BM 45 25,90 26,1 11 0 - CR
20-02-2007 BM 45 24,50 27,5 18 0 - CR, 1 jaar na PHSCT
12-02-2008 BM 45 26,10 25,9 30 0 - CR
18 20-02-2006 BM 16,75 24,31 0 0 100 AML, 75 % blasten 92 % blasten, AML-M1
27-02-2008 BM 30 23,80 13,76 1 0,0072 - 17% blasten,
matig celrijk BM
15-03-2006 BM 45 26,83 25,73 2 0 - CR
23-05-2007 BM 45 24,36 28,2 16 0 - CR
23 27-01-2004 BM 16,25 21,30 0 0 100 AML, 2 populaties 82% blasten, AML-M2 35% en 15%
16-09-2004 BM 45 22,53 27,51 8 0 - CR
27-01-2005 BM 45 22,60 27,44 12 0 - CR
19-05-2005 BM 45 21,51 28,53 14 0 - CR
08-09-2005 BM 45 23,23 26,81 18 0 - CR
06-04-2006 BM 45 23,18 26,86 25 0 - CR
30 13-06-2006 BM 18,59 25,86 0 0 100 AML, 80% blasten 68% blasten, AML-5b
20-07-2006 BM 34,25 26,52 15,00 1 0,0031 - CR
12-09-2006 BM 35,73 26,16 16,84 3 0,0009 - CR, wel matige
kwaliteit BM
23-11-2006 BM 45 25,22 27,05 5 0 2% regeneratieve 2% blasten
B-cellen
47 19-03-2007 BM 15,77 23,07 0 0 100 AML 72% blasten, AML-M1,
mogelijk uit MDS
11-04-2007 BM 25,75 28,15 4,9 1 3,3493 - Hypocellulair aspiraat
met 7% blasten
25-04-2007 BM 21,32 25,99 2,63 2 16,1544 4% blasten
Valk P
5. J, Verhaak RG, Beijen MA, Erpelinck CA, Barjesteh van Waalwijk van Doorn-Khosrovani S, Boer JM, et al.
Prognostically useful gene-expression profiles in acute myeloïd leukemia. N Engl J Med 2004; 350: 1617-28.
Bullinger
6. L, Döhner K, Bair E, Fröhling S, Schlenk RF, Tibshirani R, Döhner H, Pollack JR. Use of gene-expression profiling to identify prognostic subclasses in adult acute myeloïd leukemia. N Engl J Med 2004; 350: 1605-16.
Preudhomme
7. C, Sagot C, Boissel N, Cayuela JM, Tigaud I, de Botton S, Thomas X, et al.; ALFA Group. Favorable prognostic significance of CEBPA mutations in patients with ‘de novo’ acute myeloïd leukemia: a study from the Acute Leukemia French Association (ALFA). Blood 2002 15; 100: 2717-23.
Barjesteh van Waalwijk van Doorn-Khosrovani
8. S, Erpelinck
C, Meijer J, van Oosterhoud S, van Putten WL, Valk PJ, Berna Beverloo H, et al. Biallelic mutations in the CEBPA gene and low CEBPA expression levels as prognostic mark- ers in intermediate-risk AML. Hematol J 2003; 4: 31-40.
Nakao
9. M, Yokota S, Iwai T, Kaneko H, Horiike S, Kashi- ma K, Sonoda Y, Fujimoto T, Misawa S. Internal tandem duplication of the flt3 gene found in acute myeloïd leuke- mia. Leukemia 1996; 10: 1911-8.
Marcucci
10. G, Strout MP, Bloomfield CD, Caligiuri MA.
Detection of unique ALL1 (MLL) fusion transcripts in normal human bone marrow and blood: distinct origin of normal versus leukemic ALL1 fusion transcripts. Cancer Res 1998 15; 58: 790-3.
Barjesteh van Waalwijk van Doorn-Khosrovani
11. S, Erpelinck
C, van Putten WL, Valk PJ, van der Poel-van de Luytgaarde S, Hack R, Slater R, et al. High EVI1 expression predicts poor survival in acute myeloïd leukemia: a study of 319 ‘de novo’ AML patients. Blood 2003; 101: 837-45.
Inoue
12. K, Sugiyama H, Ogawa H, Nakagawa M, Yamagami T, Miwa H, Kita K, et al. WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood 1994; 84: 3071-9.
Cazzaniga
13. G, Dell’Oro MG, Mecucci C, Giarin E, Masetti R, Rossi V, Locatelli F, et al. Nucleophosmin mutations in childhood acute myelogenous leukemia with normal karyotype. Blood 2005; 106: 1419-22.
Boissel
14. N, Renneville A, Biggio V, Philippe N, Thomas X, Cayuela JM, Terre C, et al. Prevalence, clinical profile, and prognosis of NPM mutations in AML with normal karyo- type. Blood 2005; 106: 3618-20.
Verhaak R
15. G, Goudswaard CS, van Putten W, Bijl MA, Sanders MA, Hugens W, Uitterlinden AG, et al. Mutations in nucleophosmin (NPM1) in acute myeloïd leukemia (AML) : association with other gene abnormalities and previously established gene expression signatures and their favorable prognostic significance. Blood 2005; 106: 3747-54.
Falini
16. B, Nicoletti I, Bolli N, Martelli MP, Liso A, Gorello P, Mandelli F, et al. Translocations and mutations involv- ing the nucleophosmin (NPM1) gene in lymphomas and leukemias. Haematologica 2007; 92: 519-32.
Nakagawa
17. M, Kameoka Y, Suzuki R. Nucleophosmin in acute myelogenous leukemia. N Engl J Med 2005; 352:
1819-20.
Dumbar T
18. S, Gentry GA, Olson MO. Interaction of nucleo- lar phosphoprotein B23 with nucleic acids. Biochemistry 1989; 28: 9495-501.
Cordell J
19. L, Pulford KA, Bigerna B, Roncador G, Banham A, Colombo E, Pelicci PG, Mason DY, Falini B. Detection of normal and chimeric nucleophosmin in human cells.
Blood 1999; 93: 632-42.
Borer R
20. A, Lehner CF, Eppenberger HM, Nigg EA. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm.
Cell 1989; 56: 379-90.
Suzuki
21. T, Kiyoi H, Ozeki K, Tomita A, Yamaji S, Suzuki R, Kodera Y, et al. Clinical characteristics and prognostic implications of NPM1 mutations in acute myeloïd leuke- mia. Blood 2005; 106: 2854-61.
Döhner
22. K, Schlenk RF, Habdank M, Scholl C, Rücker FG, Corbacioglu A, Bullinger L, et al. Mutant nucleophosmin (NPM1) predicts favorable prognosis in younger adults with acute myeloïd leukemia and normal cytogenetics:
interaction with other gene mutations. Blood 2005; 106:
3740-6.
Schnittger
23. S, Schoch C, Kern W, Mecucci C, Tschulik C, Martelli MF, Haferlach T, et al. Nucleophosmin gene mu- tations are predictors of favorable prognosis in acute my- elogenous leukemia with a normal karyotype. Blood 2005;
106: 3733-9.
Schlenk RF, Döhner K, Krauter J, Fröhling s, Corbacioglu 24.
A, Bullinger L, Habdank M, et al. Mutations and treatment outcome in cytogenetically normal acute myeloïd leuke- mia. N Engl J Med 2008; 358: 1909-19.
Jansen JH. Nucleofosminemutaties komen zeer frequent 25.
voor bij acute myeloïde leukemie en correleren met een re- latief gunstige prognose. Ned Tijdschr Hematol 2005; 2:
235.
Gorello
26. P, Cazzaniga G, Alberti F, Dell’Oro MG, Gottardi E, Specchia G, Roti G, et al. Quantitative assessment of minimal residual disease in acute myeloïd leukemia car- rying nucleophosmin (NPM1) gene mutations. Leukemia 2006; 20: 1103-8.
Gale R
27. E, Green C, Allen C, Mead AJ, Burnett AK, Hills RK, Linch DC; Medical Research Council Adult Leukae- mia Working Party. The impact of FLT3 internal tandem duplication mutant level, number, size, and interaction with NPM1 mutations in a large cohort of young adult patients with acute myeloïd leukemia. Blood 2008; 111: 2776-84.
Baccarani M, Saglio G, Goldman J, Hochhaus A, Simons- 28.
son B, Appelbaum F, Apperley J, et al. Evolving concepts in the management of chronic myeloïd leukemia: recom- mendations from an expert panel on behalf of the Euro- pean LeukemiaNet. Blood 2006; 108: 1809-20.
Summary
Bergh FAJTM van den, Bingöl Ö, Slomp J, Groot MR de, Heijs-Oude Groeneger A. Analysis and feasibility of nucleo- phosmin mutations in acute myeloïd leukemia. Ned Tijdschr Klin Chem Labgeneesk 2009; 34: 150-156.
Acute myeloïd leukemia (AML) is a genetically heterogeneous disease with significant differences in clinical outcome due to a wide variety in genetic abnormalities. Classification accord- ing to the World Health Organisation (WHO) not only makes use of conventional morphological and cytochemical features but also of immunophenotyping, advanced cytogenetical- and molecular techniques. No chromosomal abnormalities are de- tectable by conventional karyotyping in 40 to 50 percent of AML patients. This poorly characterized subgroup is believed to have an intermediate risk. However, recently identified mu- tations enable further classification of this subgroup. Muta- tions in exon 12 of the nucleophosmin (NPM1) gene occur in about 40% of adult AML with normal karyotype. A sensitive and simple real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) is recently described and identifies several NPM1- mutations in blood and bone marrow of AML patients. The practical feasibility of this method was tested in 49 adults with AML. The high incidence of NPM1 mutations A and B (25%) could be confirmed, is often associated with normal karyotype (41%) and in combination with mutations in the fms-like ty- rosine kinase 3 gene (FLT3) (58%). It is concluded that the method described is easily adaptable and provides additional information with respect to diagnosis and prognosis, especially in AML adults with normal karyotype. Quantification of the NPM mutation also enables the possible detection of minimal residual disease.
Keywords: AML, nucleofosmine, NPM, NPM1, real-time poly- merase chainreaction
