University of Groningen Development of novel anticancer agents for protein targets Estrada Ortiz, Natalia

Development of novel anticancer agents for protein targets

Estrada Ortiz, Natalia

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from

it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date:

2017

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

Estrada Ortiz, N. (2017). Development of novel anticancer agents for protein targets. University of

Groningen.

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

CHAPTER

9

S

UMMARY AND

D

ISCUSSION

6

9

S

UMMARY AND DISCUSSION

The research described in this these was aimed to discover and evaluate new anticancer drugs. Two different approaches were undertaken. In the first part, the design and evaluation of new p53-MDM2/X inhibitors based on previously described compounds are presented (Part A), in an attempt to increase their potency and explore different regions on the p53-MDM2/X interphase. In the second part, another class of compounds, metal complexes (Part B), were synthetized aiming to interact with several protein targets and act as anticancer agents. Several series of metal complexes were studied to determine their potential cytotoxic activity against cancer cell lines and to unravel their possible mechanism of action compared to known metal containing drugs such as cisplatin and auranofin. Furthermore, evaluation of their toxicity was performed in healthy tissue using rat Precision Cut Tissue Slices (PCTS) to unravel uptake, pathways involved in the toxicity and possible selectivity of the compounds towards cancer cells.

P

A

In this section, we described the design of novel p53/MDM2 inhibitors. The discovery of p53/MDM2 inhibitors is still a hot topic in cancer research.1–3 This targeted strategy aims to be selective for cancer cells with overexpression of MDM2. Since the disclosure of Nutlin-3,4 _{many scaffolds have been}

synthesized and evaluated, including indo-imidazole, imidazoline, benzodiazepinedione, spirooxindole, among others.5,6 _{Several compounds presently undergo early clinical evaluations.}7–10 _{However, the}

discovery of new p53/MDM2/MDMX scaffolds is still of high interest due to low single agent activity currently seen in clinical trials and insufficient PKPD properties.

Chapter 3 presented in a systematic review the current state of the art of different classes of inhibitors of p53/MDM2 and their associated co-crystal structures, with a special focus on the binding mode of the compounds including the importance of the highly conserved water molecules have for the design of new inhibitors.

An important discussion point is the lack of dual action compounds targeting MDM2 and MDMX to assure fully restored p53. So far the few compounds that address the duality are not as potent as inhibitors of MDMX.10 _{However, peptidic inhibitors possess dual inhibitory activity towards MDM2 and}

MDMX. Recently, several stapled peptides have been described6,10 _{with great affinity towards MDM2}

and MDMX. ALRN-6924 (Aileron Therapeutics) is currently undergoing phase I and II clinical trials in patients suffering of solid tumors, lymphoma and myeloid leukemias.11

Important common features present in p53/MDM2 inhibitors are:

- 3-point pharmacophore model formed by the side chains of p53 Phe19-Trp23-Leu26, which competitive inhibitors have to mimic.

- MDM2 binders have a T-shaped topology where the ends of the T comprise the three moieties addressing the pharmacophore points.

- The central scaffold is mostly a heterocyclic ring, annulated rings or in some cases acyclic linear.

- P53_{Trp23 contributes most to the interaction energy in the binding of P53 and MDM2 and thus}

groups, indoles, oxindoles or 2-oxo benzimidazoles). A considerable increase in binding affinity can be reached by the suitable introduction of a hydrophobic halogen at the bottom of the Trp23 binding pocket.

ĚĚŝƚŝŽŶĂů ŝŶƚĞƌĂĐƚŝŽŶƐ ƚŽ ƌĞĐĞƉƚŽƌ ĂŵŝŶŽ ĂĐŝĚƐ ŝŶǀŽůǀĞ Ă ŚLJĚƌŽŐĞŶ ďŽŶĚŝŶŐ Žƌ ʋ- ʋ ŝŶƚĞƌĂĐƚŝŽŶ ƚŽ His96, hydrogen bonding to Ser17, halogen bonding or hydrogen bonding to backbone or sidechain Glu72, respectively, and dipolar interaction with His73. In this regard, the presence of crystal water molecules is of importance which act as potential stabilization points though hydrogen bonding In chapter 3, we discovered that in general the MDM2 crystal structures show a high degree of crystallographic water presence and that a water on top of the indole ring of p53_{Trp23 seems to be}

highly conserved in many structures. Later studies led to unravel 2 new positions where conserved waters are present (data not published). The water molecule on top of the indole ring of p53Trp23 was found to be present in about 60% of 66 evaluated co-crystal structures. Additionally, waters close to

MDM2_{Lys55, and in the area covered by} MDM2_{Val93 and} MDM2_{His96 seems to be common in 45 and 41%}

of the co-crystals, respectively (figure 1). These findings show potential spots to consider as target for the design of MDM2 inhibitors because it could be important to include possible hydrogen bond formation with the mentioned waters as a strategy to stabilize the binding of the inhibitors and increase the potency of new series of compounds targeting p53/MDM2 interactions.

Figure 1. Regions of conserved crystallographic waters in ligand-MDM2 structures. Cyan: water clusters; light pink: MDM2 residues interacting with the water clusters and hot pink: p53 key amino acids Phe19, Trp23 and Leu26.

Chapter 4 focusses on the development of artificial macrocycles as potent p53-MDM2 inhibitors, aiming to target the hydrophobic area formed by Tyr67, Gln72, His73 Val93 and Lys94, not widely explored with different classes of inhibitors. By the introduction of this hydrophobic handle, we expected to observe an increment of the affinity to the receptor as well as improvement in cellular permeation. The novelty of this series of compounds besides the different interaction area, is the method for synthesis with the use of Ugi multicomponent reaction followed by a ring closing metathesis (RCM) as an alternative to access diverse ring sizes and conformations. This approach furnished a series of compounds with affinity to the target in the low μM range (figure 2). One

6

9

7-fold compared to the racemic compound.

Figure 2. Macrocycles with higher affinity towards MDM2/X.

Furthermore, chapter 5 describes the design and synthesis of 2,3'-Bis(1'H-indole) heterocycles, which offered an easy and effective way to prepare new p53/MDM2/MDMX inhibitors. This series of derivatives possess a phenyl annulated ring that makes additional hydrophobic interactions with the

mdm2_{Val93, mimicking} p53_{Leu22 and helping to stabilize the binding and increase the potency of}

previously described indole derivatives.12 _{The best derivative from this family achieved a Ki of 1.8 and}

0.2 μM for MDM2 and MDMX, respectively (Figure 3). The obtained results open new synthetic opportunities to develop derivatives offering three points of diversity along with linkers of different lengths that can help to establish a structure activity relationship and producing more compounds with higher affinity and more drug-like properties.

Figure 3. 2,3'-Bis(1'H-indole) derivative with the higher affinity towards MDM2

A few families of MDM2 inhibitors13–15 _{(figure 4) were screened in cell based assays (data not}

published), leading to moderate cytotoxic activity (IC50 40-100 μM) assessed with a small panel of

cancer cell lines. Furthermore, we encountered solubility problems of the macrocyclic derivatives in aqueous media. Therefore, more investigation is ongoing to optimize the chemical synthesis strategy to obtain compounds with better solubility, PKPD properties, more diversity and hopefully higher affinity to the receptor. Our group is currently working in two different synthetic approaches to develop of macrocycles (Figure 5):

N NH O O Cl N H Cl CO2H N H N O O N H Cl CO2H F F F Cl N NH O O O N H Cl CO2H Cl Cl 1. (d.r 1:1) K_i= 0.098μM 2 Ki= 0.082μM 3 K_{i Rac}= 0.139μM K_{i A}= 0.093μM Ki B= 0.7μM N H Cl N O OH Cl F 4 Ki MDM2= 1.8μM Ki MDMX= 0.2μM

1. Assembly of macrocycles, using as linkers isocyano carboxylic acids and the subsequent ring closure by Ugi reaction with a primary amine and oxo component.16 To obtain p53/MDM2 inhibitors the oxo component should be our anchor indole used in the synthesis of macrocycles and 2,3'-bis(1'H-indole) heterocycles described in this thesis.

2. Using an artificial amino acid linker formed as a reaction between diamines and anhydrides, which undergo Ugi cyclization reaction with oxo component (anchor indole) and isocyanide.

Figure 4. Different scaffolds screened in cell based assays. 5. Tetrazoles14

; 6͘ɴ-lactams13

; 7. Macrocycles (chapter 4); 8. 2,3'-Bis(1'H-indole) Heterocycles 15 (chapter5)

Figure 5. Examples of different synthetic routes to access artificial macrocycles as p53/MDM2 inhibitors

Due to the importance of p53-MDM2/X protein-protein interaction, several research groups and companies have been working on the development of effective inhibitors. Recently, new compounds entered clinical trials, however the preliminary results showed limited PKPD properties and severe side effects in some cases leading to gastrointestinal and hematological toxicity.17,18 _{Therefore there is still}

room for the development of more active and selective compounds, with improved metabolic profile and dual targeting function of MDM2 and MDMX.

P

B

In this section, the study of the toxicity of different families of gold compounds in cancer cells (in vitro) and in healthy tissues (ex vivo) is described. Metals and metal containing compounds have been used for therapeutic purposes since 5000 years.19 _{Nowadays, the medical applications of metal-based}

compounds are well known in various areas, including as anticancer agents, as diagnostics and for diabetes treatment, among others. Currently platinum(II) complexes are widely used in the clinic and

NN N N H N R1 R2 N H CO2H Cl N N H O O R1 X n m N H CO2H Cl N H Cl N O X O N H R CO2H 5 6 7 N X R 2 N H CO2H Cl R1 9 Cl H2N N H CO2Et CHO Cl HO NC O N HN O O Cl N H CO2Et Cl B H N CO2Et CHO N H CO2Et NH NC H N S O OH O H2N NH N S O O Cl Cl O A N HN O O Cl N H CO2H Cl N H CO2H NH NH N S O O Cl O

6

9

compound cisplatin is highly toxic displaying a large range of side effects, most prominently nephrotoxicity and ototoxicity.21,22 Therefore, different chemical strategies have been developed over the last years, to achieve new alternatives and elucidate new potential targets for improved anticancer therapeutics. In this context, gold-based complexes are interesting due to their different redox chemistry (Au(I) and Au(III) as possible oxidation states) and ligand exchange reactions, which offer different mechanisms of activity compared to cisplatin.23–25

In chapter 6 the toxicity of a series of bifunctional Au(I)-based compounds was studied using precision cut liver and kidney slices26,27 _{to understand tissue specific toxicity and elucidate a possible mechanism}

of action. The described derivatives were designed to act as chimeric compounds combining the cytotoxicity of gold ions and the proton pump inhibition properties of lansoprazole as ligand. In a previous study from Casini and coworkers, the cytotoxic activity of these compounds was evaluated in a small panel of cancer cells, including cell lines sensitive and resistant to cisplatin, and a non-cancerous cell line.28 _{These series of compounds showed to be more cytotoxic to the cancer cell lines}

(ca. 5 fold) than in the non-cancerous cell line, suggesting potential selective pharmacological effects.28

In our study, we selected representative compounds (Figure 6) of this series and assessed them for their effects on PCTS ex vivo after 24 h incubation in comparison to lansoprazole. The complexes displayed toxicity in the μM range in kidney and liver slices, with complex 11 as the least toxic derivative in healthy tissue with a TC50 values of ca. 27 and 25 μM in kidney and liver respectively, and

a TC50 PCKS/IC50 ratio of 1.8 and 1.7 for kidney and liver slices, respectively (where the IC50 for A2780

and A2780R cells was taken from Serratice et al.28_{) indicating lack of cancer cell specificity. However,}

for compound 10 the TC50 PCKS/IC50 cells ratio was 20 for kidney slices and 8.9 for liver slices,

indicating possible selective toxicity towards cancer cells compared to healthy tissue. Furthermore, a slightly higher toxicity is observed in the liver slices compared to kidney slices for compounds that bear a phosphine ligand, 10 and 12, as demonstrated by both the ATP and histomorphology data. Additionally, after analysing the results of RNA expression profiles of pathways activated under hypoxia (HIF1a),29 _{oxidative stress (Nrf2)}30 _{and DNA damage (p53)}31 _{we observed that the clearest}

impact was on the Nrf2 pathway, indicating oxidative stress as a possible mechanism of toxicity. This is in line with the known redox chemistry of Au(I) complexes which often induce intracellular redox damage. More studies are necessary to confirm oxidative stress as the toxicity mechanism, including inhibition studies of enzymes involved in the maintenance of the intracellular redox homeostasis, such as those involved in the thioredoxin and glutathione systems.

Figure 6. Lansoprazole derivatives evaluated in this study.

N OCH2CF3 S N H N 10 Au Ph3P [BF4] O N OCH2CF3 S N N 11 Au O P N N N N OCH2CF3 S N N 12 Au Ph3P [BF4] O Au PPh3

As previously mentioned, cytotoxic chemotherapeutic metallodrugs, such as cisplatin, show adverse drug reactions including nephrotoxicity.32 Unfortunately, there is still lack of knowledge about its mechanism of accumulation in cells and tissues. Several studies have been carried out to elucidate the mechanisms of uptake and efflux of cisplatin on different cancer cell lines and various in vitro assays with kidney cells or isolated tubules were used. Nonetheless, those mechanisms are not yet fully understood.33 Thus, in chapter 7, we studied the toxicity and accumulation mechanisms of cisplatin using the PCKS technique in comparison to a previously reported cytotoxic cyclometallated Au(III) complex (13, Figure 7) with improved stability in aqueous environment compared with similar complexes. 34 _{We evaluated the involvement of OCT and MATE transporters in cisplatin and Au(III)}

complex to compare the uptake and accumulation in rat kidney slices in absence and presence of the “unselective” OCTs and MATEs inhibitor cimetidine and its effect on cisplatin and Au(III)complex 13 toxicity in healthy rat PCKS. The viability of the PCKS after treatment was determined using ATP concentration and histomorphology analysis. Moreover, accumulation of platinum and gold in PCKS was assessed using ICP-MS. As expected, a concentration dependent decrease in viability of PCKS, which correlated with the increase in slice content of platinum or gold, was observed after exposure to the metal complexes. However, no effect of cimetidine on the toxicity or accumulation of both compounds was found. Based on these results we conclude that OCTs and MATEs do not play a prominent role in cisplatin or Au(III) complex uptake and accumulation. Further studies to explore the role of different transporters are needed. Noteworthy, all pre-clinical in vivo/ex vivo techniques, including this PCTS model, bear the same problem of interspecies differences, rat kidneys express OCT1, OCT2 and MATE1, whereas human kidneys express additionally MATE2-K and OCT 2 but no OCT1.35 Several attempts to use mRNA expression of KIM1 and villin as cell specific biomarkers to assess kidney toxicity were as yet unsuccessful. The use of PCTS for uptake and accumulation studies of metallodrugs offers good opportunities for future application on human tissue to obtain human-specific data. However, the use of more human-specific inhibitors, other than cimetidine, should be preferable to exclude overlapping inhibitory effects of different transporters.

Figure 7. Au complexes evaluated in chapter 7 and 8.

Chapter 8 focusses on the synthesis and evaluation of the biological activity of Au(I)-N-heterocyclic carbene complexes as anticancer agents in vitro and ex vivo using PCKS. The antiproliferative effects of the Au(I) complexes were tested in four cancer cell lines, namely a p53 wild-type and a p53 null variant of HCT 116 (colorectal carcinoma), MCF-7 (breast adenocarcinoma) and A375 (malignant melanoma). The selection of the p53 wild type and null variants cell lines was based on the known mechanism of cisplatin toxicity of induction of rapid dependent apoptosis and, as a secondary effect, p53-independent cell cycle arrest.36,37

The MCF-7 cell line was chosen because of its resistance to cisplatin treatment compared to other breast cancer cell lines.38 _{Thus, these cell lines offered the opportunity}

N Au Cl N P N N PF6 13 Au N N 14

6

9

The last cell line used in our study was chosen due to the scarce information available on metal complexes studied on melanoma derived cell lines. Our results suggest that the toxicity mechanism of the Au(I) complexes is independent of p53 activity and they exert higher toxicity in the MCF-7 cell line. Most of the compounds ƐŚŽǁĞĚƐƵƉĞƌŝŽƌĂĐƚŝǀŝƚLJ͕ŝŶƚŚĞŶDŽƌůŽǁʅDƌĂŶŐĞ͕ĐŽŵƉĂƌĞĚǁŝƚŚĐŝƐƉůĂƚŝŶ and auranofin in three of the four cell lines, A375 being the exception. However, compound 14 (Figure 7) was markedly more active in HCT116 p53 null and MCF-7 cell lines or as active as cisplatin in HCT116 p53 wild-type cell line but much less toxic in the A375 cell line.

Due to their potent cytotoxic effects in cancer cells, Au(I) complexes were tested for their possible toxicity using PCKS. Most of the derivatives displayed high toxicity on the PCKS, with TC50s in the low

μM range. Remarkably, complex 14 showed no toxicity up to 50 μM as evaluated by ATP content and histomorphology. The selectivity of complex 14 for cancer cells compared to healthy tissues is still promising and prompt us to develop new derivatives of this compound with enhanced anticancer properties and selectivity against cancer cells.

In addition to the work presented in the previous chapters of this thesis, we reported for the first time Ru(II) complexes conjugated to cyc(RGDfK) peptide39 as a way to target the specifically integrin ƌĞĐĞƉƚŽƌɲǀɴϯ͕ŝŵƉŽƌƚĂŶƚĨŽƌƚƵŵŽƌŐƌŽǁƚŚĂŶĚŵĞƚĂƐƚĂƐŝƐĨŽƌŵĂƚŝŽŶ.40

The binding affinities of the bioconjugates ĨŽƌ ƚŚĞ ɲǀɴϯ ŝŶƚĞŐƌŝŶ ƌĞĐĞƉƚŽƌ were in the nM range and showed high selectivity to ɲǀɴϯ compared to ƚŚĞɲϱɴϭƌĞĐĞƉƚŽƌ͘However, the cytotoxicity of all the reported bioconjugates was low in cancer cells with different integrin receptors expression levels (SKOV-3 and A549).41 Further studies are needed to develop targeted metallodrugs with intrinsically higher cytotoxic potency.

F

INAL REMARKS

Overall, in this thesis two different approaches were explored to design potential anticancer drugs, targeting a specific protein-protein interaction with high oncological relevance and the design of metal complexes with a broad spectrum of activities. In both cases, there are still open questions regarding the compound specificity, stability, transport, metabolic transformations and capability of reaching the specific cellular target.

Further studies are needed to give answer to such questions, including more extensive cell based studies to test the efficacy of the compounds as anticancer agents, and the use of different models to get more information regarding the specific mechanisms of action. The use of PCTS could be one of the most suitable options to evaluate different parameters to understand the mechanisms of action to a larger extent. Additionally, using this technique would allow us to have information regarding the toxicity in healthy tissue, useful to improve the design of the compounds to decrease the possibility of unfavourable side effects before administration in vivo. In addition, the application of the PCTS model favours the reduction and refinement of the use of experimental animals, due to the large variety of tests and experiments that are possible to perform in just one animal instead of sacrificing a large number of them. Furthermore, with this technique, it is possible to obtain human specific data, when PCTS are prepared from human organ tissue. This will provide translational data and will result in a better safety of the drugs that are tested in phase 1 clinical studies.

6

9

N

EDERLANDSE SAMENVATTING

Het onderzoek beschreven in dit proefschrift is gericht op het ontdekken van nieuwe anti-kanker geneesmiddelen. Twee verschillende benaderingen zijn hierbij toegepast. In het eerste deel wordt de ontwikkeling en evaluatie beschreven van nieuwe p53-MDM2/X remmers, op basis van eerder ontdekte remmers (Deel A), met als doel meer potente stoffen te ontwikkelen en het effect van binding aan de verschillende regio’s in de p53-MDM2/X interface beter te kunnen begrijpen. In het tweede deel wordt de synthese van een andere klasse van verbindingen, metaalcomplexen (Deel B), beschreven, die zijn gericht op interactie met verschillende eiwit targets, met als doel om als anti-kanker geneesmiddel te fungeren. Enkele reeksen van metaalcomplexen werden onderzocht om hun potentiële cytotoxiciteit voor kankercellijnen vast te stellen en om het mogelijke werkingsmechanisme te ontrafelen in vergelijking met bekende metaal-bevattende medicijnen, zoals cisplatina en auranofine. Bovendien werd de toxiciteit van deze metaalcomplexen onderzocht in gezond weefsel, gebruik makend van ‘Precision Cut Tissue Slices’ (PCTS) om de opname, de mechanismen betrokken bij de toxiciteit en de mogelijke selectiviteit van de verbindingen voor kanker cellen te bestuderen.

D

A

In dit deel beschrijven we de ontwikkeling van nieuwe p53-MDM2 en p53-MDMX remmers als geneesmiddel tegen kanker. De ontdekking van p53-MDM2/X interactie is nog steeds een hot topic in het kanker onderzoek.1–3 _{Remmers van deze interactie veroorzaken het vrijkomen van p53 en}

bevorderen zo de apoptose in kankercellen. Het is de bedoeling dat deze nieuwe remmers selectief zijn voor kankercellen die MDM2/X tot overexpressie brengen. Sinds de ontdekking van Nutlin-34 als p53-MDM2 remmer, zijn meerdere structuren gesynthetiseerd en geëvalueerd, waaronder indo-imidazool, imidazoline, benzodiazepinedion en spiroindool verbindingen.5,6 _{Verschillende van deze}

verbindingen worden op dit moment onderzocht in klinische studies.7–10 _{De ontdekking van nieuwe}

p53-MDM2/X remmers is echter nog steeds van groot belang vanwege de lage activiteit en ontoereikende PKPD eigenschappen die tijdens de huidige klinische onderzoeken van deze verbindingen worden waargenomen.

Hoofdstuk 3 presenteert in een systematisch overzicht de huidige ‘state of the art’ van verschillende klassen p53-MDM2/X remmers en hun co-kristalstructuren, met een bijzondere focus op het mechanisme van de binding van de remmers, en met name de invloed die de geconserveerde watermoleculen hebben voor het ontwerpen van nieuwe remmers.

Een belangrijke discussiepunt is het ontbreken van de zogenaamde ‘dual action’ van de remmers, namelijk binding aan zowel MDM2 als MDMX om het volledige vrijkomen van p53 te verzekeren. Tot nu toe blijken de verbindingen die deze ‘dual action’ bezitten geen erg potente inhibitors van MDMX te zijn.10 Er zijn echter peptide remmers bekend die actieve remming veroorzaken van zowel MDM2 als MDMX. Recentelijk zijn enkele ‘stapled’ peptiden (peptiden waarvan de 3D structuur middels een linker wordt vastgezet) beschreven met grote affiniteit voor MDM2 en MDMX. ALRN-6924 (Aileron Therapeutics) is zo’n stapled peptide en is momenteel in fase I en II klinische studies voor patiënten die lijden aan solide tumoren, lymfomen en myeloïde leukemie.11

- Als competitieve remmers bootsen ze het 3-punts farmacofoor model na dat wordt gevormd door de zijketens van Phe19, Trp23 en Leu26 van p53.

- MDM2 binders hebben een T-vormige topologie waar de einden van de T de drie delen omvatten die overeen komen met de farmacofoor punten.

- De centrale structuur is meestal een heterocyclische of geannuleerde cyclische structuur of een acyclisch lineaire structuur.

- Het aminozuur P53

Trp23 draagt het meest bij aan de interactie energie in de binding van p53 en MDM2 en zodoende is het belangrijk dat dit deel goed nagebootst wordt wat betreft hydrofobiciteit en vorm (bijv. fenyl groepen, indolen, oxindolen of 2-oxo benzimidazolen). Een aanzienlijke toename in bindingsaffiniteit kan bewerkstelligd worden door het introduceren van een geschikt hydrofoob halogeen onder in de Trp23 bindingspocket.

ĂŶǀƵůůĞŶĚĞ ŝŶƚĞƌĂĐƚŝĞƐ ŵĞƚ ĂŵŝŶŽnjƵƌĞŶ ŝŶDDϮ ďĞƐƚĂĂŶ Ƶŝƚ ĞĞŶ ǁĂƚĞƌƐƚŽĨďƌƵŐ ŽĨʋ- ʋ ŝŶƚĞƌĂctie met His96, een waterstofbrug met Ser17, een halogeenbinding of waterstofbrug met Glu72 en een dipool interactie met His73. In dit verband is de aanwezigheid van kristalwatermoleculen van belang die fungeren als mogelijke stabilisatiepunten door vorming van een waterstofbrug. In hoofdstuk 3 hebben we ontdekt dat in het algemeen de MDM2 kristalstructuren een hoge graad van aanwezig kristalwater laten zien en dat een water boven de indoolring van p53_{Trp23 behouden blijft bij binding}

van de inhibitoren van de MDM2-p53 interactie aan MDM2.. Vervolgstudies hebben geleid tot het ontrafelen van twee nieuwe locaties waar geconserveerde watermoleculen aanwezig zijn. Het watermolecuul boven de indoolring van p53Trp23 bleek aanwezig te zijn in ongeveer 60% van de 66 geëvalueerde co-kristalstructuren. Verder lijkt het erop dat watermoleculen in de buurt van

MDM2_{Lys55 en in het gebied begrensd door} MDM2_{Val93 and} MDM2_{His96 voorkomen in respectievelijk 45%}

en 41% van de co-kristallen (figuur 1). Deze bevindingen laten zien welke plaatsen in het eiwit MDM2 mogelijk beschouwd kunnen worden als target voor remmers. Het kan namelijk van belang zijn om de mogelijke vorming van waterstofbruggen te betrekken bij de strategie om de binding van remmers te stabiliseren en de remmingspotentie van de nieuwe reeks verbindingen gericht op p53/MDM2 interacties te vergroten.

6

9

Figuur 1. Regio’s van geconserveerde kristalwatermoleculen in inhibitor-MDM2 structuren. Cyaan: clusters van watermoleculen; licht roze: MDM2 residuen die interactie hebben met de waterclusters; donker roze: de belangrijke p53 aminozuren Phe19, Trp23 en Leu26.

Hoofdstuk 4 legt de focus op de ontwikkeling van macrocyclische verbindingen als potente p53-MDM2 remmers, die gericht zijn op het hydrofobe gebied, gevormd door Tyr67, Gln72, His73, Val93 en Lys94, welke over het algemeen geen bindingsplaats is van de remmers van de andere klassen van inhibitoren. Door gebruik te maken van dit hydrofobe handvat verwachten we een verbetering van de affiniteit te zien van de remmer voor het MDM2 eiwit, alsmede een verbetering in permeabiliteit van de celmembraan. Het vernieuwende aan deze series van verbindingen, naast het afwijkende gebied van interactie, is de methode van synthese, die gebruik maakt van de Ugi reactie, gevolgd door een ringsluiting metathese (RCM), hetgeen de vorming van verschillende formaten en conformaties van de ringstructuren mogelijk maakt. Deze aanpak heeft geresulteerd in een reeks van verbindingen met affiniteit voor de target in de lagere μM range (figuur 2). Eén van de macrocycles (verbinding 3 in figuur 2) kon worden opgezuiverd en gescheiden in zijn enantiomeren, hetgeen resulteerde in een 7-voudig toename in affiniteit vergeleken met het racemische mengsel.

Figuur 2. Macrocyclische verbindingen met hogere affiniteit voor MDM2/X

Hoofdstuk 5 beschrijft de ontwikkeling en synthese van 2,3'-Bis(1'H-indole) heterocycles, die een eenvoudige en effectieve basis vormen voor de synthese van nieuwe p53/MDM2/X remmers. De derivaten in deze serie bevatten een geannuleerde fenylring, die een additionele hydrofobe interactie met de mdm2Val93 aangaat en die p53Leu22 nabootst en helpt bij het stabiliseren van de binding alsmede de potentie verhoogt van eerder beschreven indool derivaten.12 Het beste derivaat van deze familie bereikte een Ki van 1.8 en 0.2 μM voor respectievelijk MDM2 en MDMX (figuur 3). De verkregen resultaten bieden nieuwe kansen voor de synthese en ontwikkeling van nieuwe derivaten die drie punten van mogelijke variatie in het molecuul bieden, alsmede linkers van verschillende lengtes, welke kunnen bijdragen aan het vaststellen van een structuur-activiteitrelatie en aan het produceren van meer verbindingen met hogere affiniteit en betere ‘drug-like’ eigenschappen.

N NH O O Cl N H Cl CO2H N H N O O N H Cl CO2H F F F Cl N NH O O O N H Cl CO2H Cl Cl 1. (d.r 1:1) Ki= 0.098μM 2 K_i= 0.082μM Ki Rac= 0.139μM3 Ki A= 0.093μM K_{i B}= 0.7μM

Figuur 3. 2,3'-Bis(1'H-indool) derivaat met een hogere affiniteit voor MDM2

Een paar families van MDM2 remmers13-15 (figuur 4) zijn gescreend in celkweken en vertoonden middelmatige cytotoxische activiteit (IC50 40-100 μM) op basis van onderzoek in een kleine groep

kanker cellijnen. Verder bleken deze macrocyclische derivaten slecht oplosbaar te zijn in waterig medium. Daarom wordt er nu verder onderzocht hoe de strategie van chemische synthese geoptimaliseerd kan worden om verbindingen te krijgen met verbeterde oplosbaarheid, PKPD eigenschappen, meer diversiteit en hopelijk hogere affiniteit voor de receptor. Onze onderzoeksgroep is momenteel bezig met twee verschillende synthetische benaderingen om macrocycles te ontwikkelen (Figuur 5):

1. Synthese van macrocyles gebruik makend van linkers zoals isocyano-carbonzuren en de daarop volgende ringsluiting middels de Ugi reactie met een primair amine en een oxo component.16 _{Voor het verkrijgen van p53/MDM2 remmers moet de oxo component het}

indool-ankerpunt zijn in de synthese van macrocycles en 2,3'-bis(1'H-indool) heterocycles zoals beschreven in dit proefschrift.

2. Het gebruik maken van een kunstmatige aminozuur-linker, die wordt gesynthetiseerd in een reactie tussen diamines en anhydrides, welke een Ugi cyclisatie ondergaan met de oxo component (indool) en isocyanide.

Figuur 4. Verschillende structuren welke gescreend zijn in celkweken. 5. Tetrazolen14

; 6. ɴ-lactams13

; 7. Macrocycles (hoofdstuk 4); 8. 2,3'-Bis(1'H-indole) Heterocycles 15

(hoofdstuk 5) N H Cl N O OH Cl F 4 Ki MDM2= 1.8μM Ki MDMX= 0.2μM NN N N H N R1 R2 N H CO2H Cl N N H O O R1 X n m N H CO2H Cl N H Cl N O X O N H R CO2H 5 6 7 N X R 2 N H CO2H Cl R1 9

6

9

Figuur 5. Voorbeelden van verschillende syntheseroutes voor kunstmatige macrocycles als p53/MDM2 remmers Vanwege het belang van de p53-MDM2/X eiwit-eiwit interactie werken verscheidene onderzoeksgroepen en bedrijven aan de ontwikkeling van effectieve remmers. Recentelijk zijn nieuwe verbindingen getest in klinische onderzoeken, maar helaas laten de eerste resultaten slechts beperkte PKPD eigenschappen en ernstige bijwerkingen zien, die in sommige gevallen leiden tot gastro-intestinale en hematologische toxiciteit.17,18 _{Er is daarom dus nog steeds ruimte voor}

ontwikkeling van actievere en selectievere verbindingen, met een verbeterd metabool profiel en het gelijktijdig targeten (dual action) van de functie van MDM2 en MDMX.

D

B

In dit deel wordt de studie van de toxiciteit van verschillende families van goud verbindingen in kankercellen (in vitro) en in gezonde weefsels (ex vivo) beschreven. Metalen en metaal-bevattende verbindingen worden al 5000 jaar gebruikt voor therapeutische doeleinden.19 Tegenwoordig zijn meerdere medische toepassingen van metaal-bevattende verbindingen bekend, onder anderen als een middel tegen kanker en voor het diagnosticeren en behandelen van diabetes. In de kliniek worden momenteel platinum (II) complexen veel gebruikt en deze staan in de lijst van essentiële geneesmiddelen van de wereldgezondheidsorganisatie.20 De meest toegepaste verbinding, cisplatina, is echter zeer giftig en toont een groot aantal bijwerkingen, voornamelijk nefrotoxiciteit en ototoxiciteit.21,22 _{Daarom zijn er in de afgelopen jaren verschillende chemische strategieën ontwikkeld}

om tot nieuwe alternatieven te komen en om nieuwe potentiële targets te ontdekken voor verbeterde geneesmiddelen tegen kanker. In deze context zijn op goud gebaseerde complexen interessant vanwege hun verschillende redox chemie (met Au(I) en Au(III) als mogelijke oxidatiestatus) en ligand uitwisselingsreacties, die werkingsmechanismen hebben die verschillen van die van cisplatina.23–25

In hoofdstuk 6 is de toxiciteit in gezond weefsel van een reeks bifunctionele Au(I)-verbindingen bestudeerd door gebruik te maken van precies-gesneden lever- en nierplakjes26,27 om de weefsel-specifieke toxiciteit te begrijpen en om een mogelijk werkingsmechanisme te ontrafelen. De beschreven stoffen werden ontworpen om te fungeren als chimere verbindingen die de cytotoxiciteit van goud ionen combineert met de protonpomp-remmende eigenschappen van lansoprazol. In een eerdere studie van Casini en collega's werd de cytotoxische activiteit van deze verbindingen

Cl H2N N H CO2Et CHO Cl HO NC O N HN O O Cl N H CO2Et Cl B H N CO2Et CHO N H CO2Et NH NC H N S O OH O H2N NH N S O O Cl Cl O A N HN O O Cl N H CO2H Cl N H CO2H NH NH N S O O Cl O

bestudeerd in een klein panel van kankercellen, waaronder cellijnen die gevoelig zijn voor cisplatina, cellijnen die resistent zijn tegen cisplatina en een niet-kankercellijn.28 Deze reeksen verbindingen bleken meer cytotoxisch te zijn voor de kankercellijnen (ongeveer 5 keer) dan voor de niet-kankercellijn, wat potentiëel selectieve farmacologische effecten suggereert.28

In onze studie hebben we enkele representatieve verbindingen (Figuur 6) van deze serie beoordeeld op hun effecten op precies-gesneden weefsel plakjes (PCTS) ex vivo na 24 uur incubatie in vergelijking met lansoprazol. De verbindingen toonden toxiciteit in het μM concentratiegebied op de nier-en leverplakjes met complex 11 als de minst toxische derivaat in gezond weefsel met een TC50 waarde

van ca. 27 en 25 μM voor de nierplakjes (PCKS) en leverplakjes (PCLS) respectievelijk. Er werd een TC50

(PCKS)/IC50(kankercel) ratio van 1.8 en 1.7 voor de nierplakjes en leverplakjes respectievelijk berekend,

waarin de IC50 voor de A2780 en A2780R cellen uit Serratice et al.28 werd genomen. Dit geeft aan dat

de specficiteit voor kankercellen gering is. Echter, voor complex 10 bedroeg de TC50 (PCKS)/IC50

(kankercel) ratio 20 in nierplakjes en 8.9 in leverplakjes, wat mogelijk een selectieve toxiciteit voor kankercellen vergeleken met gezonde weefsel aangeeft. Bovendien werd middels het ATP gehalte en histomorfologische data een iets hogere toxiciteit waargenomen in de leverpreparaten in vergelijking met nierpreparaten voor de verbindingen 10 en 12, die een fosfineligand hebben. Daarnaast hebben we, na het analyseren van de resultaten van RNA-expressieprofielen van pathways geactiveerd door hypoxie (HIF1a), 29 _{oxidatieve stress (Nrf2)} 30 _{en DNA-schade (p53)} 31 _{geconstateerd dat de}

Nrf2-pathway het meest wordt beïnvloed, wat aangeeft dat oxidatieve stress mogelijk het mechanisme van toxiciteit is. Dit komt overeen met de bekende redoxchemie van Au (I) complexen die vaak intracellulaire redox schade veroorzaken. Meer studies zijn noodzakelijk om oxidatieve stress te bevestigen als het toxiciteitsmechanisme, inclusief remmingsstudies van enzymen die betrokken zijn bij het behoud van de intracellulaire redoxhomeostase, zoals enzymen die betrokken zijn bij de thioredoxine- en glutathione-huishouding.

Figuur 6. De lanzoprazole derivaten die in dit proefschrift zijn bestudeerd.

Zoals eerder vermeld, vertonen cytotoxische chemotherapeutische metallodrugs, zoals cisplatina, bijwerkingen, met name nefrotoxiciteit.32 _{Helaas is er nog gebrek aan kennis over het mechanisme van}

opname en accumulatie in cellen en weefsels. In het verleden zijn verscheidene studies uitgevoerd om de mechanismen van opname en eliminatie van cisplatina in verschillende kankercellijnen te verduidelijken, waarbij diverse in vitro analyses met niercellen of geïsoleerde niertubuli werden gebruikt. Deze mechanismen worden helaas nog steeds niet volledig begrepen.33

Daarom hebben we in hoofdstuk 7 de mechanismen van toxiciteit en accumulatie van cisplatina bestudeerd met behulp van de PCKS-techniek en vergeleken met een eerder vermeld cytotoxisch

N OCH2CF3 S N H N 10 Au Ph3P [BF4] O N OCH2CF3 S N N 11 Au O P N N N N OCH2CF3 S N N 12 Au Ph3P [BF4] O Au PPh3

6

9

heeft ten opzichte van vergelijkbare complexen.34 We hebben de betrokkenheid van OCT- en MATE-transporters in cisplatina- en Au (III) -complex opname bestudeerd door de opname en accumulatie in PCKS van ratten in afwezigheid en aanwezigheid van de OCT en MATE inhibitor cimetidine te vergelijken en het effect ervan op de toxiciteit van cisplatina en Au (III ) complex 13 te bestuderen. De levensvatbaarheid van de PCKS na de behandeling werd bepaald met behulp van ATP concentratie en histomorfologie. Bovendien werd accumulatie van platina en goud in PCKS gemeten met behulp van ICP-MS. Zoals verwacht werd na de blootstelling aan de metaalcomplexen een concentratieafhankelijke afname in levensvatbaarheid van PCKS waargenomen, die correleerde met de stijging van de hoeveelheid platina of goud in het weefsel. Er werd echter geen effect gevonden van cimetidine op de toxiciteit of accumulatie van beide verbindingen. Op basis van deze resultaten concluderen we dat OCT's en MATE's geen prominente rol spelen bij de opname en accumulatie cisplatin of Au (III) complex. Er zijn nieuwe studies nodig om de eventuele rol van transporters te onderzoeken. Het is duidelijk is dat alle preklinische in vivo/ex vivo technieken, inclusief dit PCTS-model, te maken hebben met specifieke verschillen tussen soorten, zoals de expressie van OCT1, OCT2 en MATE1 in de nieren van ratten, terwijl MATE2-K en OCT2, maar niet OCT1,35 _{tot expressie}

komen in menselijke nieren. De pogingen om de mRNA-expressie van KIM1 en villin als cel-specifieke biomarkers te gebruiken om niertoxiciteit te beoordelen waren nog niet succesvol. Het gebruik van PCTS voor opname- en accumulatie studies van metallodrugs biedt goede kansen voor toekomstige toepassing op menselijk weefsel om menselijke specifieke gegevens te verkrijgen. Het gebruik van meerdere specifieke remmers naast cimetidine is nodig om overlappende remmende effecten van verschillende transporters uit te sluiten.

Figuur 7. De Au complexen die in dit proefschrift zijn bestudeerd.

Hoofdstuk 8 richt zich op de synthese en evaluatie van de biologische activiteit van Au (I) -N-heterocyclische carbene complexen als middel tegen kanker in vitro en ex-vivo met behulp van PCKS. De antiproliferatieve effecten van de Au (I) complexen werden getest in vier kankercellijnen, namelijk een p53 wildtype en een p53 nulvariant van HCT 116 (colorectaal carcinoom), MCF-7 (borst adenocarcinoom) en A375 (maligne melanoma cellen). De selectie van de p53 wild type en nulvariant cellijnen was gebaseerd op het bekende mechanisme van cisplatina toxiciteit van inductie van snelle p53-afhankelijke apoptose en, als een secundair effect, p53-onafhankelijke remming van de celcyclus.36,37 De MCF-7 cellijn werd gekozen vanwege zijn resistentie tegen cisplatina behandeling in vergelijking met andere borstkankercellijnen.38 Zo bieden deze cellijnen de mogelijkheid om het toxiciteitsmechanisme van cisplatina te vergelijken met de Au (I) complexen en de betrokkenheid van p53 te onderzoeken. De laatste cellijn die in onze studie werd gebruikt, werd gekozen vanwege de schaarse informatie die beschikbaar is over het effect van metaal complexen op melanoom-afgeleide

N Au Cl N P N N PF6 13 Au N N 14

cellijnen. Onze resultaten suggereren dat het toxiciteitsmechanisme van de Au (I) complexen onafhankelijk is van p53-activiteit en dat ze een hogere toxiciteit in de MCF-7 cellijn uitoefenen. De ŵĞĞƐƚĞǀĞƌďŝŶĚŝŶŐĞŶǀĞƌƚŽŽŶĚĞŶƐƵƉĞƌŝĞƵƌĞĂĐƚŝǀŝƚĞŝƚ͕ŝŶŚĞƚ ŶD ŽĨůĂĂŐ ʅDďĞƌĞŝŬ͕ ǀĞƌŐĞůĞŬĞŶ ŵĞƚ cisplatina en auranofine in drie van de vier cellijnen, met uitzondering van de A375 cellijn. Verbinding 14 (Figuur 7) was echter sterker actief in HCT116 p53 nul- en MCF-7 cellijnen en even actief als cisplatina in HCT116 p53 wildtype cellijn maar veel minder giftig in de A375 cellijn.

Door hun sterke cytotoxische effecten in kankercellen werden de Au (I) complexen getest op hun mogelijke toxiciteit met behulp van PCKS. De meeste derivaten vertoonden hoge toxiciteit op de PCKS, met TC50ΖƐŝŶŚĞƚůĂŐĞʅDďĞƌĞŝŬ͘KƉŵĞƌŬĞůŝũŬǁĂƐĚĂƚĐŽŵƉůĞdž14 geen toxiciteit vertoonde tot een

ĐŽŶĐĞŶƚƌĂƚŝĞǀĂŶϱϬʅD͘ĞƐĞůĞĐƚŝǀŝƚĞŝƚǀĂŶĐŽŵƉůĞdž14 voor kankercellen in vergelijking met gezonde weefsels is nog steeds veelbelovend en stimuleert ons om nieuwe derivaten van deze verbinding te ontwikkelen met verbeterde anti-kanker eigenschappen en selectiviteit tegen kankercellen.

Naast het werk dat in de hoofdstukken van dit proefschrift is gepresenteerd, hebben we voor het eerst Ru(II) complexen geconjugeerd aan cyclisch (RGDfK) peptide39 _{als een manier om specifiek te}

targeten naar de ŝŶƚĞŐƌŝŶĞƌĞĐĞƉƚŽƌɲǀɴϯ͕ĚŝĞďĞůĂŶŐƌŝũŬŝƐǀŽŽƌƚƵŵŽƌŐƌŽĞŝĞŶŵĞƚĂƐƚĂƐĞ-vorming.40 ĞďŝŶĚŝŶŐƐĂĨĨŝŶŝƚĞŝƚĞŶǀĂŶĚĞďŝŽĐŽŶũƵŐĂƚĞŶǀŽŽƌĚĞɲǀɴϯŝŶƚĞŐƌŝŶĞƌĞĐĞƉƚŽƌǁĂƌĞŶŝŶŚĞƚŶD-bereik ĞŶǀĞƌƚŽŽŶĚĞŚŽŐĞƐĞůĐƚŝǀŝƚĞŝƚǀŽŽƌɲǀɴϯǀĞƌŐĞůĞŬĞŶŵĞƚĚĞĂϱɴϭ-receptor. De cytotoxiciteit van alle gerapporteerde bioconjugaten was echter laag in kankercellen met verschillende niveaus van integrine receptor expressie (SKOV-3 en A549).41 _{Additionele studies zijn nodig om metallodrugs te ontwikkelen}

die specifieke targeting combineren met intrinsiek hogere cytotoxiciteit.

S

Samenvattend, er werden in dit proefschrift twee verschillende benaderingen onderzocht om potentiële geneesmiddelen tegen kanker te ontwerpen, enerzijds gericht op een specifieke eiwit-eiwit interactie met hoge oncologische relevantie en anderzijds gericht op het ontwerp van metaalcomplexen met een breed spectrum aan anti-kankeractiviteiten. In beide gevallen zijn er nog open vragen over de specificiteit, stabiliteit, transport en metabole omzettingen van de ontwikkelde verbindingen en hun vermogen om het specifieke doel te bereiken.

Verdere studies zijn nodig om antwoorden op dergelijke vragen te geven, inclusief uitgebreidere studies in cellijnen om de werkzaamheid van de verbindingen te testen als middel tegen kanker en het gebruik van verschillende modellen om meer informatie te krijgen over de specifieke werkingsmechanismen. Het gebruik van PCTS kan een van de meest geschikte opties zijn om verschillende parameters te evalueren en om de mechanismen beter te begrijpen. Met behulp van deze techniek kunnen we ook informatie verkrijgen over de toxiciteit in gezond weefsel, wat nuttig is om het ontwerp van de verbindingen te verbeteren en om de mogelijkheid van ongunstige bijwerkingen te bestuderen voordat ze in vivo worden toegediend. Daarnaast bevordert het gebruik van PCTS de reductie en verfijning van proefdiergebruik tijdens preklinisch onderzoek doordat een grote verscheidenheid aan tests en experimenten met weefsel uit één dier mogelijk is. Hierdoor is het niet nodig om een groot aantal dieren op te offeren. Bovendien is het met deze techniek mogelijk om mens-specifieke gegevens te verkrijgen wanneer PCTS worden gemaakt uit menselijk orgaanweefsel.

6

9

geneesmiddelen die worden getest in fase 1 klinische studies.

REFERENCES

(1) Popowicz, G. M.; Dömling, A.; Holak, T. A. The Structure-Based Design of

Mdm2/Mdmx–p53 Inhibitors Gets Serious.

Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50 (12), 2680–

2688.

(2) Khoo, K. H.; Verma, C. S.; Lane, D. P. Drugging the P53 Pathway: Understanding the Route to Clinical Efficacy. Nat. Rev. Drug

Discov. 2014, 13 (3), 217–236.

(3) Burgess, A.; Chia, K. M.; Haupt, S.; Thomas, D.; Haupt, Y.; Lim, E. Clinical Overview of MDM2/X-Targeted Therapies. Front. Oncol. 2016, 6.

(4) Vassilev, L. T.; Vu, B. T.; Graves, B.; Carvajal, D.; Podlaski, F.; Filipovic, Z.; Kong, N.; Kammlott, U.; Lukacs, C.; Klein, C.; Fotouhi, N.; Liu, E. A. In Vivo Activation of the P53 Pathway by Small-Molecule Antagonists of MDM2. Science 2004, 303 (5659), 844–848. (5) Khoury, K.; Holak, T. A.; Dömling, A.

P53/MDM2 Antagonists: Towards Nongenotoxic Anticancer Treatments. In

Protein-Protein Interactions in Drug Discovery; Dömling, A., Ed.; Wiley-VCH

Verlag GmbH & Co. KGaA, 2013; pp 129– 163.

(6) Neochoritis, C.; Estrada-Ortiz, N.; Khoury, K.; Dömling, A. Chapter Twelve - P53– MDM2 and MDMX Antagonists. In Annual

Reports in Medicinal Chemistry; Desai, M.

C., Ed.; Elsevier, 2014; Vol. 49, pp 167–187. (7) Zak, K.; Pecak, A.; Rys, B.; Wladyka, B.;

Dömling, A.; Weber, L.; Holak, T. A.; Dubin, G. Mdm2 and MdmX Inhibitors for the Treatment of Cancer: A Patent Review (2011 – Present). Expert Opin. Ther. Pat. 2013, 23 (4), 425–448.

(8) Wang, S.; Zhao, Y.; Bernard, D.; Aguilar, A.; Kumar, S. Targeting the MDM2-P53 Protein-Protein Interaction for New Cancer Therapeutics. In Protein-Protein

Interactions; Wendt, M. D., Ed.; Topics in

Medicinal Chemistry; Springer Berlin Heidelberg, 2012; pp 57–79. (9) Zhao, Y.; Bernard, D.; Wang, S. Small

Molecule Inhibitors of MDM2-P53 and MDMX-P53 Interactions as New Cancer Therapeutics. BioDiscovery 2013, No. 8, 4. (10) Estrada-Ortiz, N.; Neochoritis, C. G.;

Dömling, A. How To Design a Successful

P53-MDM2/X Interaction Inhibitor: A Thorough Overview Based on Crystal Structures. ChemMedChem 2016, 11 (8), 757–772.

(11) Clinicaltrials.Gov Identifier for ALRN-6924: NCT02264613 and NCT02909972. (12) Popowicz, G. M.; Czarna, A.; Wolf, S.; Wang,

K.; Wang, W.; Dömling, A.; Holak, T. A. Structures of Low Molecular Weight Inhibitors Bound to MDMX and MDM2 Reveal New Approaches for P53-MDMX/MDM2 Antagonist Drug Discovery.

Cell Cycle 2010, 9 (6), 1104–1111.

(13) Shaabani, S.; Neochoritis, C. G.; Twarda-Clapa, A.; Musielak, B.; Holak, T. A.; Dömling, A. Scaffold Hopping via ANCHOR.QUERY: ɴ-Lactams as Potent P53-MDM2 Antagonists. MedChemComm 2017. (14) Surmiak, E.; Neochoritis, C. G.; Musielak, B.; Twarda-Clapa, A.; Kurpiewska, K.; Dubin, G.; Camacho, C.; Holak, T. A.; Dömling, A. Rational Design and Synthesis of 1,5-Disubstituted Tetrazoles as Potent Inhibitors of the MDM2-P53 Interaction.

Eur. J. Med. Chem. 2017, 126, 384–407.

(15) Neochoritis, C. G.; Wang, K.; Estrada-Ortiz, N.; Herdtweck, E.; Kubica, K.; Twarda, A.; Zak, K. M.; Holak, T. A.; Dömling, A. 2,3͛-Bis(1͛H-Indole) Heterocycles: New P53/MDM2/MDMX Antagonists. Bioorg.

Med. Chem. Lett. 2015, 25 (24), 5661–5666.

(16) Liao, G. P.; Abdelraheem, E. M. M.; Neochoritis, C. G.; Kurpiewska, K.; Kalinowska-dųƵƑĐŝŬ͕:͖͘DĐ'ŽǁĂŶ͕͖͘͘ Dömling, A. Versatile Multicomponent Reaction Macrocycle Synthesis Using ɲ-Isocyano-ʘ-Carboxylic Acids. Org. Lett. 2015, 17 (20), 4980–4983.

(17) Ray-ŽƋƵĂƌĚ͕/͖͘ůĂLJ͕:͘-Y.; Italiano, A.; Le ĞƐŶĞ͕͖͘WĞŶĞů͕E͖͘Śŝ͕:͖͘,Ğŝů͕&͖͘ZƵĞŐĞƌ͕ R.; Graves, B.; Ding, M.; Geho, D.; Middleton, S. A.; Vassilev, L. T.; Nichols, G. L.; Bui, B. N. Effect of the MDM2 Antagonist RG7112 on the P53 Pathway in Patients with MDM2-Amplified, Well-Differentiated or Dedifferentiated Liposarcoma: An Exploratory Proof-of-Mechanism Study.

Lancet Oncol. 2012, 13 (11), 1133–1140.

(18) Andreeff, M.; Kelly, K. R.; Yee, K. W.; Assouline, S. E.; Strair, R.; Popplewell, L.;

Bowen, D.; Martinelli, G.; Drummond, M. W.; Vyas, P.; Kirschbaum, M. H.; Iyer, S. P.; Ruvolo, V. R.; Nogueras-Gonzalez, G. M.; Huang, X.; Chen, G.; Graves, B.; Blotner, S.; ƌŝĚŐĞ͕W͖͘:ƵŬŽĨƐŬLJ͕>͖͘DŝĚĚůĞƚŽŶ͕^͖͘ ZĞĐŬŶĞƌ͕D͖͘ZƵĞŐĞƌ͕Z͖͘Śŝ͕:͖͘EŝĐŚŽůƐ͕'͖͘ Kojima, K. Results of the Phase 1 Trial of RG7112, a Small-Molecule MDM2 Antagonist in Leukemia. Clin. Cancer Res. 2015.

(19) KƌǀŝŐ͕͖͘ďƌĂŵƐ͕D͘:͘DĞĚŝĐŝŶĂů/ŶŽƌŐĂŶŝĐ ŚĞŵŝƐƚƌLJ͗ര/ŶƚƌŽĚƵĐƚŝŽŶ͘Chem. Rev. 1999,

99 (9), 2201–2204.

(20) WHO Model List of Essential Medicines. 2015.

(21) Dasari, S.; Tchounwou, P. B. Cisplatin in Cancer Therapy: Molecular Mechanisms of Action. Eur. J. Pharmacol. 2014, 0, 364–378. (22) ƌƵŶŽ͕W͘D͖͘>ŝƵ͕z͖͘WĂƌŬ͕'͘z͖͘DƵƌĂŝ͕:͖͘

<ŽĐŚ͕͖͘͘ŝƐĞŶ͕d͘:͖͘WƌŝƚĐŚĂƌĚ͕:͘Z͖͘ Pommier, Y.; LipparĚ͕^͘:͖͘,ĞŵĂŶŶ͕D͘d͘ Subset of Platinum-Containing

Chemotherapeutic Agents Kills Cells by Inducing Ribosome Biogenesis Stress. Nat.

Med. 2017, 23 (4), 461–471.

(23) Gaynor, D.; Griffith, D. M. The Prevalence of Metal-Based Drugs as Therapeutic or Diagnostic Agents: Beyond Platinum. Dalton

Trans. 2012, 41 (43), 13239–13257.

(24) Bertrand, B.; Casini, A. A Golden Future in Medicinal Inorganic Chemistry: The Promise of Anticancer Gold Organometallic Compounds. Dalton Trans. 2014, 43 (11), 4209–4219.

(25) Nardon, C.; Boscutti, G.; Fregona, D. Beyond Platinums: Gold Complexes as Anticancer Agents. Anticancer Res. 2014, 34 (1), 487– 492.

(26) de Graaf, I. A. M.; Groothuis, G. M.; Olinga, P. Precision-Cut Tissue Slices as a Tool to Predict Metabolism of Novel Drugs. Expert

Opin. Drug Metab. Toxicol. 2007, 3 (6), 879–

898.

(27) ĚĞ'ƌĂĂĨ͕/͘͘D͖͘KůŝŶŐĂ͕W͖͘ĚĞ:ĂŐĞƌ͕D͘,͖͘ Merema, M. T.; de Kanter, R.; van de Kerkhof, E. G.; Groothuis, G. M. M. Preparation and Incubation of Precision-Cut Liver and Intestinal Slices for Application in Drug Metabolism and Toxicity Studies. Nat.

Protoc. 2010, 5 (9), 1540–1551.

(28) ^ĞƌƌĂƚŝĐĞ͕D͖͘ĞƌƚƌĂŶĚ͕͖͘:ĂŶƐƐĞŶ͕͘&͘:͖͘ Hemelt, E.; Zucca, A.; Cocco, F.; Cinellu, M. A.; Casini, A. Gold(I) Compounds with Lansoprazole-Type Ligands: Synthesis, Characterization and Anticancer Properties in Vitro. MedChemComm 2014, 5 (9), 1418– 1422.

(29) Semenza, G. L. Hypoxia-Inducible Factor 1 (HIF-1) Pathway. Sci STKE 2007, 2007 (407), cm8-cm8.

(30) Ma, Q. Role of Nrf2 in Oxidative Stress and Toxicity. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2013, 53, 401–426.

(31) Lane, D. P. P53, Guardian of the Genome.

Nature 1992, 358 (6381), 15–16.

(32) Hall, M. D.; Okabe, M.; Shen, D.-W.; Liang, X.-:͖͘'ŽƚƚĞƐŵĂŶ͕D͘D͘ The Role of Cellular Accumulation in Determining Sensitivity to Platinum-Based Chemotherapy. Annu. Rev.

Pharmacol. Toxicol. 2008, 48, 495–535.

(33) Spreckelmeyer, S.; Orvig, C.; Casini, A. Cellular Transport Mechanisms of Cytotoxic Metallodrugs: An Overview beyond Cisplatin. Molecules 2014, 19 (10), 15584– 15610.

(34) Bertrand, B.; Spreckelmeyer, S.; Bodio, E.; Cocco, F.; Picquet, M.; Richard, P.; Gendre, P. L.; Orvig, C.; Cinellu, M. A.; Casini, A. Exploring the Potential of Gold(III) Cyclometallated Compounds as Cytotoxic Agents: Variations on the C^N Theme.

Dalton Trans. 2015, 44 (26), 11911–11918.

(35) Motohashi, H.; Inui, K. Organic Cation Transporter OCTs (SLC22) and MATEs (SLC47) in the Human Kidney. AAPS J. 2013,

15 (2), 581–588.

(36) Zamble, D. ͖͘:ĂĐŬƐ͕d͖͘>ŝƉƉĂƌĚ͕^͘:͘Wϱϯ-Dependent and -Independent Responses to Cisplatin in Mouse Testicular

Teratocarcinoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 1998, 95 (11), 6163–6168.

(37) di Pietro, A.; Koster, R.; Boersma-van Eck, t͖͘Ăŵ͕t͖͘͘DƵůĚĞƌ͕E͘,͖͘'ŝĞƚĞŵĂ͕:͘ ͖͘ĚĞsƌŝĞƐ͕͘'͖͘͘ĚĞ:ŽŶŐ͕^͘WƌŽ- and Anti-Apoptotic Effects of P53 in Cisplatin-Treated Human Testicular Cancer Are Cell Context-Dependent. Cell Cycle 2012, 11 (24), 4552–4562.

(38) Yde, C. W.; Issinger, O.-G. Enhancing Cisplatin Sensitivity in MCF-7 Human Breast Cancer Cells by down-Regulation of Bcl-2 and Cyclin D1. Int. J. Oncol. 2006, 29 (6), 1397–1404.

(39) Hahn, E. M.; Estrada-Kƌƚŝnj͕E͖͘,ĂŶ͕:͖͘ Ferreira, s͘&͖͘͘<ĂƉƉ͕d͘'͖͘ŽƌƌĞŝĂ͕:͘͘ G.; Casini, A.; Kühn, F. E. Functionalization of Ruthenium(II) Terpyridine Complexes with Cyclic RGD Peptides To Target Integrin Receptors in Cancer Cells. Eur. J. Inorg.

Chem. 2017, 2017 (12), 1667–1672.

(40) yŝŽŶŐ͕:͖͘ĂůĐŝŽŐůƵ͕,͖͘͘ĂŶĞŶ͕͘,͘:͘ Integrin Signaling in Control of Tumor Growth and Progression. Int. J. Biochem.

6

9

(41) 'ŽŽĚŵĂŶ͕^͘>͖͘'ƌŽƚĞ͕,͘:͖͘tŝůŵ͕͘ Matched Rabbit Monoclonal Antibodies against Ȱv-Series Integrins Reveal a Novel Ȱvɴ3-LIBS Epitope, and Permit Routine

Staining of Archival Paraffin Samples of Human Tumors. Biol. Open 2012, 1 (4), 329– 340.