Post-incision events induced by UV : regulation of incision and the role of post-incision factors in mammalian NER
Overmeer, R.M.
Citation
Overmeer, R. M. (2010, September 29). Post-incision events induced by UV : regulation of incision and the role of post-incision factors in mammalian NER.
Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/15997
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/15997
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
Samenvatting voor de leek
146
Samenvatting voor de leek
Het begrip DNA is diep doorgedrongen in de hedendaagse reclame- en marketingwereld, mede door de suggestie dat er allerlei wonderlijke geneesmiddelen verscholen zouden zijn tussen de dubbele helix. Het is ook deze iconische dubbele helix die ten grondslag ligt aan de voornaamste functie van DNA; het accuraat dupliceren en overbrengen van informatie aan de dochtercellen. De dubbele helix kan omschreven worden als een spiraalvormige lad- der, waarbij de sporten overeenkomen met de baseparen. Er zijn vier verschillende basen elk met een eigen partner. Zo staat thymine (T) tegenover adenine (A) en guanine (G) tegenover cytosine (C). De volgorde van de basen codeert de informatie die nodig is voor het functi- oneren van de cel. Een enkele humane cel bevat 46 chromosomen die ieder tussen de 48 en 250 miljoen basen lang zijn. Deze complete verzameling van genetische informatie wordt het genoom genoemd.
Om DNA te dupliceren (DNA replicatie) moeten de twee strengen van de dubbele helix uit elkaar worden gehaald alvorens een nieuwe nucleotide (een base met een stukje helix eraan) tegenover de oude kan worden geplaatst. Op deze wijze worden nieuwe baseparen gevormd (met A tegenover T en C tegenover G), die stuk voor stuk bevestigd worden aan de vorige nucleotide voordat het volgende basepaar gevormd kan worden. Al met al worden twee identieke strengen DNA gevormd, één voor elke dochtercel. Het is dan ook niet moeilijk om in te beelden dat de integriteit van de helixen van essentieel belang is voor dit proces.
Immers, als een helix verbroken is stopt de DNA replicatie, raakt de basesequentie in het geding en gaat daardoor genetische informatie verloren. Op eenzelfde manier is de integriteit van de basen essentieel, want als een base niet meer een juist paar kan vormen, stopt de DNA replicatie of worden verkeerde base(n) geplaatst, welke eveneens tot verlies van informatie leidt.
Ons DNA raakt continu beschadigd door zowel milieufactoren, zoals tabaksrook, stra- ling en zonlicht (in de vorm van UV-bestraling), als zuurstofradicalen die vrijkomen bij het omzetten van voedsel in energie (metabolisme), waarbij zuurstofradicalen vrijkomen die ons DNA beschadigen. Om deze voortdurende aanval op ons DNA tegen te gaan en de integriteit van ons genoom bewaken, beschikken onze cellen enerzijds over een aantal herstelmecha- nismen en anderzijds over de mogelijkheid om de celcyclusprogressie (celdeling) te remmen.
Immers, mocht een cel met schade in het genoom verder gaan met celdeling, kan informatie verloren gaan of veranderen. Dergelijke veranderingen in het genoom kunnen leiden tot erfe- lijke ziekten of kanker.
De focus van dit onderzoek ligt op het voornaamste herstelmechanisme en de signaal- transductie na UV-bestraling. Om precies te zijn, richt dit proefschrift zich op deze gebeurte- nissen in niet-delende cellen. Dit onderscheid is belangrijk, gezien veel factoren die betrok- ken zijn bij DNA reparatie, ook betrokken zijn bij DNA replicatie. Onderzoek in delende cellen zou kunnen leiden tot interferentie van onze metingen aan DNA herstelmechanismen en/of signaaltransductie door DNA replicatie.
Het eerste hoofdstuk omschrijft het doel van dit proefschrift en geeft een korte introdusite van verschillende soorten schade en de daaraan gekopppelde herstelmechanismen. Boven- dien worden erfelijke ziekten die geassocieerd worden met defect nucleotide excisie herstel (NER) uitgelicht. Vervolgens wordt NER, gezien het feit dat dit het voornaamste herstelme- chanisme van UV-geïnduceerde DNA schade is, uitgebreid beschreven. In het kort repareert NER UV-geïnduceerde DNA schade door het verwijderen van een enkele streng van onge- veer 30 baseparen waarin de schade zich bevindt. Het resulterende enkelstrengse gat wordt vervolgens ingevuld op een manier dat veel weg heeft van gewone DNA replicatie. De her- kenning van DNA schade door NER gebeurt grofweg op twee verschillende manieren; trans- criptie gekoppeld herstel (TC-NER) en globaal genoom herstel (GG-NER). Dit laatste is het voornaamste thema van dit proefschrift. Het mechanisme van DNA schadeherkenning, even- als de opbouw van het GG-NER complex, wordt dan ook uitvoerig beschreven in hoofdstuk 2. Bovendien wordt de doorgifte van het incisiecomplex (‘pre-incisie complex’) naar het gat vullende synthesecomplex (‘post-incisie complex’), behandeld. Daarnaast wordt de regulatie van NER besproken. Tevens behandelt hoofdstuk 2 de dynamische aard van de bij NER be- trokken eiwitten en de signaaltransductiecascade die geïnduceerd wordt door UV-bestraling in niet-delende cellen. De perspectieven die door recente ontwikkelingen zijn ontstaan wor- den, voor zover die betrekking hebben op dit proefschrift, in hoofdstuk 3 besproken.
Het vierde hoofdstuk behandeld de regulatie van NER, een proces dat, ondanks het feit dat dit fenomeen al meer dan twintig jaar geleden voor het eerst beschreven is, tot voor kort onbegrepen is gebleven. Om deze regulatie te beschrijven hebben wij een nieuwe methode, gebaseerd op een serie (locale) UV-bestralingen, ontwikkeld. Hierbij laten we eerst com- plexen accumuleren bij een verzameling initiële DNA schades. Vervolgens induceren we een tweede set DNA schades door middel van een tweede bestraling. Hierdoor kunnen we (in de vorm van associatie met de tweede set schades) dissociatie van eiwitten vanaf de eerste set schades zichtbaar maken. Door deze proeven vervolgens te herhalen onder omstandigheden waarbij herstel niet afgemaakt kan worden, konden we de dissociatie van eiwitten vanaf in- complete herstelcomplexen beschrijven. De verkregen resultaten leiden tot de conclusie dat RPA, dat onmisbaar is voor de verwijdering van beschadigd DNA (DNA incisie) en tevens betrokken is bij de herstelsynthese, de spil is in de regulatie van DNA incisie. Immers, de accumulatie van RPA in post-incisie complexen voorkomt de associatie met pre-incisie com- plexen, welke vervolgens niet in staat zijn om tot DNA incisie over te gaan.
Zoals reeds genoemd moet het gat dat ontstaat door DNA incisie opgevuld worden op een manier die lijkt op normale DNA replicatie. Een essentieel onderdeel van deze herstel- synthese is het aantrekken en laden van een ringvormig platvorm (PCNA), dat ook wel als een schuivende klem omschreven wordt, door een zogenaamde klemlader. De schuivende klem kan dan als een mobiel platvorm functioneren voor DNA polymerase(s), (eiwitten die de DNA streng kunnen verlengen). Als het ware maakt PCNA de herstelsynthese mogelijk door DNA polymerase(s) te binden en correct te oriënteren. Hoofdstuk 5 beschrijft de rol van de klemlader, die betrokken is bij normale DNA replicatie (RFC), in NER. De resultaten
148
laten zien dat RFC niet nodig is voor de associatie van PCNA met herstelcomplexen, maar wel voor de associatie van DNA polymerase δ. Dit impliceert dat het aantrekken van PCNA onafhankelijk is van RFC en dat het laden van PCNA door RFC nodig is voor het aantrekken van DNA polymerase δ of dat RFC DNA polymerase δ direct aan kan trekken.
DNA-polymerase δ is niet het enige beschikbare polymerase. Er zijn meerdere DNA po- lymerases in de cel, elk met hun eigen activiteit en nauwkeurigheid. Naast de hoog nauwkeu- rige polymerases δ en ε, zijn er minder nauwkeurige DNA polymerases, zoals κ, η en ι, die betrokken zijn bij de translesiesynthese. Dit is een foutgevoelig proces dat in staat is voorbij beschadigde basen te repliceren, om te zorgen dat DNA replicatie kan worden voltooid. On- danks de grote kans op fouten is dit rendabel omdat onvolledige replicatie ernstigere gevol- gen met zich meebrengt dan een wijziging van één enkele base. De betrokkenheid van deze minder nauwkeurige polymerases in NER wordt beschreven in hoofdstuk 6. Vreemd genoeg lijkt het erop dat de herstelsynthese op twee verschillende manieren plaatsvindt, elk met hun eigen specifi eke samenstelling van DNA polymerases en klemladers.
Zoals gezegd is het belangrijk dat cellen hun celcyclusprogressie controleren in aanwe- zigheid van DNA schade. Zodoende kunnen zij zorgen dat de schade hersteld wordt alvorens de cel zich deelt. Zoals in hoofdstuk 2 besproken, wordt de signaaltransductie na beschadi- ging van DNA meestal niet geïnduceerd door herkenning van de schade zelf, maar door de herkenning van hersteltussenproducten. Hoofdstuk 7 beschrijft de activering van signaal- transductie in cellen die niet over functioneel NER beschikken. Opvallenderwijs knipt APE1, een eiwit dat normaliter betrokken is bij een afzonderlijk herstelmechanisme (base excisie herstel, afgekort tot BER), bij UV-geïnduceerde laesies. Echter, deze DNA incisie leidt tot een structuur dat niet kan worden gerepareerd door BER. Dit doordat BER een enkele be- schadigde base verwijdert terwijl UV-bestraling juist leidt tot dimerisatie van twee aan elkaar grenzende basen. Overigens kan dit alleen bij een willekeurige combinatie van C’s en/of T’s.
Hoewel dit tussenproduct niet gerepareerd kan worden, leidt het wel tot activering van het signaaltransductieproces en voorkomt het daarmee dat cellen in de de fase van de celcyclus waar DNA replicatie plaatsvindt (S fase) gaan.
Samenvattend; er was weinig bekend over de regulatie van NER geassocieerde incisie, de overdracht van pre- naar post-incisie complexen en de precieze eisen van herstelsynthese.
Naast het (gedeeltelijk) beantwoorden van enkele openstaande vragen, beschrijven we in dit proefschrift ook een nieuwe manier van het activeren van DNA schadesignaaltransductie in NER defi ciënte cellen.
