Rearrangements within the facioscapulohumeral muscular dystrophy
locus: mechanism, timing and consequences.
Lemmers, R.
Citation
Lemmers, R. (2005, June 15). Rearrangements within the facioscapulohumeral muscular
dystrophy locus: mechanism, timing and consequences. Retrieved from
https://hdl.handle.net/1887/2699
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in theInstitutional Repository of the University of Leiden Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/2699
Summary-Samenvatting
Bibl
iography
Summary
Summary
Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) is an autosomal dominant myopathy, commonly with age at onset in the second decade of life. FSHD is initially characterized by facialmuscle weakness and during progression,shoulder girdle muscles and upper arm muscles become involved.FSHD displays considerable inter- and intrafamilialvariability,with severity ranging from almostasymptomatic to patients thatare wheelchair-bound.W ith an incidence of 1:20,000 it is the third most common inherited neuromuscular disorder after Duchenne and myotonic dystrophy.
Already 10 years have passed since FSHD was linked to contractions of the polymorphic macrosatellite repeatD4Z4 on chromosome 4q35.W ithin each D4Z4 repeatunita putative gene DUX4was defined,of which,so far,no in vivo transcription has been demonstrated.In chapter 2 we have demonstrated a significant reduction of CpG-methylation in the D4Z4 repeat of FSHD-alleles in FSHD patients.Remarkably,a reduced D4Z4 methylation was also observed in phenotypic FSHD patients thatdid notcarry a contracted D4Z4 repeat.This disease associated D4Z4 hypomethylation is suggestive of a (local) chromatin alteration on 4q35 in FSHD patients. Although the disease mechanism is unknown,recentstudies have shown thatD4Z4 contractions may give rise to transcriptional gene deregulations of genes in cis and in trans. The work presented in this thesis is mainly focused on the mechanism and timing of mitotic D4Z4 contractions, the elucidation of complex D4Z4 genotypes, and other rearrangements in the subtelomeric FSHD region.
M olecular diagnosis of FSHD is performed by Southern blotting of EcoRI digested DNA followed by hybridization with probe p13E-11, which recognizes the region proximal to the D4Z4 repeat. The D4Z4 repeat may vary in number between 11–100 D4Z4 units on normal chromosomes. FSHD patients carry a D4Z4 repeat of 1–10 D4Z4 units. An almost identical D4Z4 repeatwas identified in the subtelomere of chromosome 10,butcontractions of this repeat have never been associated with FSHD. Consequently, probe p13E-11 recognizes four alleles, and discrimination between 4qter- and 10qter-derived repeats is accomplished by the use of restriction enzyme BlnI,which fragments the 10-derived D4Z4 repeats.
the 260 bp pLAM sequence and a 6.2 kb ȕ-satellite repeat both distal to D4Z4 and unique to 4qA alleles, but the role of these sequences in the disease mechanism is unknown.
In chapter 5 we have described compound heterozygosity for FSHD alleles (i.e. individuals, who carry two different FSHD alleles). In two different FSHD families we observed that this phenomenon possibly caused a more severe phenotype than a single FSHD allele, known as a phenotypic dosage effect. Parallel to this, three FSHD families were found in which, next to the pathogenic FSHD allele (4qA), an FSHD-sized D4Z4 repeat on a 4qB allele was identified in some individuals (Chapter 4). The combination of this allele with the FSHD allele did not reveal a more severe FSHD phenotype in the FSHD patients. Because the short 4qB allele was detected in five healthy family members, it was concluded that FSHD-sized 4qB alleles are not associated with FSHD (Chapter 4).
Southern blot analysis of D4Z4 repeats revealed the existence of 4;10 translocations of D4Z4 in approximately 20% of the individuals in different populations. As a consequence, some chromosome 10 alleles carry homogeneous 4-type D4Z4 repeats and some chromosome 4 alleles contain homogeneous 10-type D4Z4 repeats. In addition, hybrid repeat arrays have been encountered, consisting of mixtures of 4- and 10-derived D4Z4 units. Using the standard diagnostic tests, hybrid FSHD alleles can mistakenly be identified as non-pathogenic 10-type repeats (false negative). In contrast, hybrid repeats in combination with an FSHD-sized, non-pathogenic 10-type repeat can cause false positive FSHD testing (Figure 10). Fortunately, the identification of the restriction enzyme XapI, which specifically digests chromosome 4-derived D4Z4 repeat units, enables the recognition of hybrid alleles (Chapter 9). Therefore, triple DNA analysis with the restriction enzymes EcoRI, BlnI and XapI can elucidate all complex genotypes caused by 4;10 translocations and avoids errors in the molecular diagnosis of FSHD.
False negative FSHD testing can also be caused when the region encompassing probe p13E-11 is deleted in the FSHD allele (Chapter 6). These FSHD patients have a normal spectrum of the disease and these deletions have also been detected in controls. The use of distal probe 4qA enables the detection of these alleles. By determining the size of the p13E-11 deletions, part of the 4q35 region proximal to D4Z4 has been excluded from having a role in the FSHD pathogenesis.
Summary
New D4Z4 contractions occur almost equally frequently during meioses and embryogenesis. In chapter 7 we have shown that mitotic D4Z4 rearrangements occur by intrachromosomal gene conversions with or without crossover. Furthermore, these rearrangements most probably occur during the first few zygotic divisions after fertilization and result in somatic and germline mosaicism for FSHD (i.e. gonasomal mosacism). As a consequence, mosaic patients often have a less severe phenotype than non-mosaic patients. PFGE permits the detection of FSHD mosaicism because it typically shows more than four D4Z4 alleles. Because separation of all D4Z4 repeats is not accomplished using LGE, this method often fails to detect mosaic FSHD patients (Chapter 8).
Samenvatting
Samenvatting
Facioscapulohumerale spierdystrofie (FSHD) is een autosomaal dominante spierziekte, waarbij de klachten meestal ontstaan tussen het tiende en het twintigste levensjaar. FSHD komt in het begin vooral tot uiting in de aangezichtspieren (facies), en later in de spieren rond de schouderbladen (scapulo) en de bovenarmen (humeral). De ernst van de ziekte varieert, tussen verschillende FSHD families maar ook tussen familieleden met een identieke FSHD mutatie, van nauwelijks merkbaar tot rolstoelafhankelijkheid. M et een incidentie van 1 op 20.000 is FSHD,na Duchenne en myotone dystrofie,de derde meestvoorkomende erfelijke spierziekte. Reeds 10 jaar geleden werd de link gevonden tussen FSHD en de vermindering (contractie) van het aantal repeterende eenheden van de macrosateliet repeat D4Z4 op chromosoom 4q35. Binnen iedere D4Z4 repeateenheid werd een mogelijk gen gedefinieerd,DUX4. Totdusver kon echter geen in vivo expressie van DUX4 worden aangetoond.In hoofdstuk 2 werd de methylatie van D4Z4-DNA onderzocht, omdat deze epigenetische DNA verandering in verband wordt gebracht met de mogelijkheid om genen aan- of uit te schakelen. W e konden aantonen dat de D4Z4 DNA op FSHD chromosomen minder gemethyleerd zijn dan op normale chromosomen 4. Bovendien werd aangetoond dat de methylatie van D4Z4 nog minder is in FSHD patiënten waarbij de repeat niet verkort is. Deze observatie suggereert een belangrijke rol voor DNA demethylatie in hetontstaan van FSHD en mogelijk in hetaanzetten van enkele FSHD genen op chromosoom 4. Ofschoon het ontstaansmechanisme van FSHD nog onbekend is, werd aangetoond dat D4Z4 contracties mogelijk transcriptie veranderingen in cis en in trans veroorzaken. Hetonderzoek datbeschreven is in ditproefschriftis voornamelijk gerichtop het mechanisme en het tijdstip van de mitotische D4Z4 contractie, het ophelderen van complexe D4Z4 genotypen,en andere grote DNA veranderingen in hetsubtelomere FSHD locus.
DNA diagnostiek voor FSHD wordt gedaan met behulp van de zogenaamde ‘Southern blot techniek’ van EcoRI geknipt DNA geïsoleerd uit bloed. De FSHD allelen worden zichtbaar gemaakt door de blot te hybridiseren met probe p13E-11, dat het DNA proximaal van D4Z4 herkent.De D4Z4 repeatvarieerttussen de 11 en 100 eenheden op normale chromosomen 4.Bij FSHD patiënten heeft een van de chromosomen 4 een D4Z4 repeat van slechts 1 tot 10 D4Z4 eenheden. Een vrijwel identieke D4Z4 repeat bevind zich op chromosoom 10, maar een contractie van deze repeat veroorzaakt geen FSHD. Deze repeats, worden echter ook herkend door probe p13E-11 en daardoor verstoren ze de DNA diagnostiek. Om dit te voorkomen worden deze repeats gefragmenteerd metbehulp van hetrestrictie enzym BlnI.
hoofdstuk 3 werd een andere belangrijke duplicatie omschreven in het FSHD locus. Dit onderzoek werd geïnitieerd door de vondst van een telomere variatie (4qA en 4qB) tussen twee verschillende gecloneerde DNA fragmenten van chromosoom 4q. Een uitgebreide DNA analyse toonde aan dat beide varianten vrijwel even vaak voorkomen op normale chromosomen 4, maar FSHD allelen werden enkel gevonden met de 4qA variatie. Het belangrijkste verschil tussen beide varianten is een 260 bp pLAM sequentie en een ȕ-satelliet repeat van 6,2 kb, die beiden specifiek voor de 4qA variatie zijn. De rol van deze sequenties in het ziekte proces zijn echter nog onduidelijk.
In hoofdstuk 4 worden drie families omschreven waarbij een FSHD allel segregeert met een korte D4Z4 repeat op een 4qB chromosoom. De combinatie van dergelijke korte allelen leidt echter niet tot een ernstiger FSHD fenotype. Aangezien de korte 4qB-D4Z4 repeat ook werden waargenomen bij 5 gezonde familieleden kon geconcludeerd worden dat 4qB chromosomen niet geassocieerd zijn met FSHD (Hoofdstuk 4). In hoofdstuk 5 worden patienten beschreven met twee verschillende FSHD allelen. In twee families konden we aantonen dat twee FSHD allelen mogelijk tot een ernstiger fenotype leidt dan een enkel FSHD allel, een zogenaamd gen-dosis effect.
Eerder Southern blot onderzoek toonde 4;10 translocaties van de D4Z4 repeat aan in ongeveer 20% van de personen in verschillende populaties. Hierdoor dragen sommige chromosomen 10 een 4-type D4Z4 repeat en sommige chromosomen 4 een 10-type D4Z4 repeat. Verder werden ook hybride repeats waargenomen, deze zijn samengesteld uit 4- en 10-type D4Z4 eenheden. Wanneer gebruik word gemaakt van de gangbare DNA diagnostiek voor FSHD lijken sommige hybride FSHD repeats op niet pathogene 10 repeats (vals negatief). Bovendien kan de combinatie van een hybride allel met een niet-pathogeen kort 10-type repeat een vals positieve DNA test veroorzaken (Figuur 10). Om deze problemen met de DNA diagnostiek te voorkomen werd een nieuw restrictie enzym geïntroduceerd, XapI, wat specifiek D4Z4 eenheden van chromosoom 4 fragmenteert en wat de identificatie van hybride allelen mogelijk maakt (Hoofdstuk 9). Wanneer DNA voortaan geknipt wordt met EcoRI, BlnI en XapI kunnen alle ingewikkelde genotypen worden opgehelderd die veroorzaakt worden door 4;10 translocaties en dit voorkomt fouten in de DNA diagnostiek voor FSHD.
Samenvatting
repeats (10-350 kb). Met behulp van PFGE, probe p13E-11 en de restrictie enzymen EcoRI en BlnI konden translocaties van D4Z4 en p13E-11 deleties direct worden aangetoond door het vaststellen van het aantal 4- en 10-type D4Z4 repeats. De meeste diagnostische laboratoria maken echter gebruik van lineaire gel electroforese (LGE) voor de FSHD diagnostiek wat deze grote fragmenten niet van elkaar kan scheiden. Hierdoor kunnen p13E-11 deleties niet herkend worden en leidt de aanwezigheid van hybride allelen mogelijk tot een verkeerde moleculaire diagnose voor FSHD. Al deze problemen kunnen echter vermeden worden door gebruik te maken van de verbeterde methoden die beschreven staan in de hoofdstukken 6 en 9.
Nieuwe D4Z4 contracties vinden zowel plaats gedurende de meïose als de embryogenese (mitotisch). In hoofdstuk 7 wordt aangetoond dat mitotische verkortingen van de D4Z4 repeat plaatsvindt door een intrachromosomale genconversie mechanisme al dan niet geassocieerd met een crossover. Deze lengteverandering vindt over het algemeen plaats gedurende de eerste paar zygote celdelingen na de bevruchting en dit leidt tot zowel somatisch als kiembaan mozaisisme (gonasomal mozaisisme). Als gevolg hiervan zijn mozaïeke patiënten over het algemeen minder ernstig aangedaan dan patiënten die de het FSHD allelen doorgegeven krijgen van hun ouders. Met behulp van PFGE kunnen mitotische lengte veranderingen van D4Z4 makkelijk worden aangetoond omdat dan meer dan vier D4Z4 repeats zichtbaar worden. Aangezien LGE grote D4Z4 allelen niet kan scheiden, is deze methode ongeschikt om mozaisisme te detecteren in FSHD patiënten (Hoofdstuk 8).
