Kuijl, C.P.
Citation
Kuijl, C. P. (2008, October 15). Regulation of endosomal and phagosomal transport.
Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/13146
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/13146
Samenvatting en discussie
Intracellulaire pathogene bacteriën zijn mede-geëvolueerd met de mens. Met de kaping en door manipulatie van de normale functies van gastheer cellen, zijn deze bacte- riën in staat om een niche te creëren waar ze kunnen overleven en groeien. De endocyti- sche route wordt gebruikt en gewijzigd door bacteriën zoals Salmonella typhimurium (Salmonella) en Mycobacterium tuberculosis en is het onderwerp van dit proefschrift. We kunnen kennis verwerven over de normale functie van de endocytische route, door te onderzoeken hoe pathogene bacteriën deze route manipuleren.
We hebben Salmonella als model systeem genomen, omdat het de endocytische route doorreist op een wijze die vergelijkbaar, maar niet identieke is aan de normale endocytose. Salmonella bevat een type III secretie-systeem dat eiwitten injecteert in de gastheer cel die er voor zorgen dat Sal- monella de gastheer binnen komt via de en- docytische route. Deze geïnjecteerd eiwitten wijziging de endocytische route zodanig dat Salmonella kan overleven in de gastheer cel.
Normaal gesproken begint de endocytische route met pH-neutrale vesicles (early endo- somen) die verzuren tijdens de maturatie (late endosomen en ten slotte lysosomen).
Deze verzuring leidt tot activatie van lumi- nale proteasen die behoren tot de cathepsine familie en zorgen voor de af braak van de inhoud van de lysosomen. Om te overleven in de cel, voorkomt Salmonella actief de maturatie van het vesicel waarin het verblijft (het fagosoom). Salmonella voorkomt fusie van het fagosoom met lysosomen die geac- tiveerd cathepsins bevatten. In hoofdstuk 2 beschrijven we hoe het Rab7 Interacting Lysosomal Protein (RILP) het vervoer van fagosomen en de fusie van fagosomen met lysosomen stimuleert, wat resulteert in een vijandige omgeving waarin Salmonella niet kan groeien.
Salmonella kan dienen als een bron van
extracellulair antigeen voor MHC klasse II moleculen, omdat MHC klasse II moleculen worden beladen met antigenen in gespeciali- seerde lysosomen, zogenaamde MHC klasse II Compartimenten (MIICs). Het MIIC kan multi-vesiculair of multi-lamellair zijn met MHC klasse II moleculen op zowel de bui- tenste membraan als de binnenste membra- nen. In hoofdstuk 3 wordt de interactie tus- sen twee moleculen van het afweersysteem in het MIIC zeer gedetailleerd beschreven.
Één molecuul is HLA-DR, het MHC klasse II molecuul dat (vreemde) antigenen pre- senteert aan CD4 positieve T-cellen van het immuunsysteem om de productie van specifieke antilichamen op te wekken. Het andere is HLA-DM die de uitwisseling van het zelf-peptide CLIP met een potentieel an- tigeen peptiden afkomstig van een externe bron (bijvoorbeeld Salmonella) faciliteerd.
Zowel HLA-DR en HLA-DM zijn aanwezig op de buiten membraan van een Salmonella bevattende fagosomen. We tonen aan dat HLA-DM gemediëerde peptide uitwisseling plaats vindt op de vesicels in de MIICs maar niet op de buiten membraan van dit compar- timent. Aangezien er weinig tot geen interne vesicels zijn in het fagosoom, vindt belading van MHC klasse II moleculen nauwelijks plaats. Dit kan een mechanisme zijn van salmonella om zich te onttrekken aan het immuunsysteem.
De celbiologie heeft de endocytische route goed bestudeerd. Zowel het MIIC als het Salmonella fagosoom zijn positief voor de small GTPase Rab7. Rab7 kan RILP rekruteren voor het initiëren van transport en fusie (hoofdstuk 2). Hoe transport en fusie worden gereguleerd in detail is onbekend en is het onderzoeks onderwerp in hoofdstuk 4. Small GTPases gaan heen en weer tussen een membraan gebonden actieve vorm (GTP geladen) en een mem- braan ongebonden vorm (GDP gebonden).
De hydrolyse van GTP tot het GDP kan dus functioneren als een moleculaire schakelaar om het transport en de fusie van de Rab7 Nederlandse samenvatting
positieve compartiment te beëindigen. GT- Pase Activerende Proteïnen (GAP) kunnen de GTPase activiteit stimuleren van van de small GTPases en mogelijkerwijs het trans- port en de fusie reguleren. RILP verlaagt de intrinsieke GTPase activiteit van Rab7 en verhindert bovendien de binding van de geïdentificeerde Rab7GAP (TBC1D15) aan Rab7. Dit suggereert dat het transport en de fusie niet worden gereguleerd door de GAP. We tonen aan dat Rab7 gemediëerde motor rekrutering afhankelijk is van RILP, maar het transport alleen aanvangt wan- neer zowel ORP1L als RILP aanwezig zijn.
ORP1L is een cholesterol-bindend eiwit en bindt evenals RILP aan GTP-Rab7. Choles- terol binding door het cholesterol bindend domein van ORP1L houdt het eiwit in een conformatie dat transport mogelijk maakt.
Bij verwijderding van dit domein vindt geen dynein gemediëerd transport plaats. Wan- neer de vesicles een laag cholesterol gehalte hebben, of wanneer het cholesterol bindend domein is verwijderd, stelt het ORP1L molecuul een domein bloot dat het eiwit VAP-A rekruteert. Dit VAP-A voorkomt binding van de dynein motor aan het Rab7- RILP-ORP1L complex. De Niemann-Pick ziekte (veroorzaakt door mutaties in het gen NPC1) veroorzaakt cholesterol ophoping in de lysosomen en wordt gekenmerkt door een opeenhoping van deze vesicles in het gebied nabij de celkern. Wanneer ORP1L zonder cholesterol bindend domein tot expressie wordt gebracht in cellen die het NPC1 gen ontbreken (normaliter resulterend in het Niemann-Pick fenotype), dan zijn vesicles overladen met cholesterol, maar verspreid.
Dynein gemediëerd transport van laat endo- somen en lysosomen is dus afhankelijk van de cholesterol concentratie in deze vesicles.
Veel technisch uitdagende en krachtige technieken worden in dit proefschrift be- schreven om onderzoek te doen naar een verscheidenheid van biologische vragen. Één van deze technieken is de siRNA techniek om specifiek eiwitten uit een cel te verwij-
deren. Wanneer grote siRNA bibliotheken worden gebruikt en/of de wetenschappelijke vraag niet concreet genoeg is, zal een over- weldigend aantal ‘hits’ zal worden gevon- den. Het onderzoeken van al deze ‘hits’ op biologische relevatie zal veel tijd en mid- delen kosten. Echter, deze techniek kan zeer krachtig zijn en kan snel leiden tot resultaten wanneer gebruik wordt gemaakt van kleine gespecialiseerde bibliotheken in combinatie met een specifieke wetenschappelijke vraag.
In hoofdstuk 6 worden bijvoorbeeld alleen het effect van de kinases op de groei van Salmonella bestudeerd. De ‘hits’ van deze studie verklaren echter niet de waargeno- men effecten. “Hardcore” celbiologie en/of biochemie beschreven in alle hoofdstukken blijft dan ook een essentiële activiteit om de specifieke biologische functies van deze genen te beschrijven.
Hoofdstukken 2 en 3 beschrijven het effect van Salmonella op de bekende endocytische routes in de gastheercel, in hoofdstuk 6 worden nieuwe host eiwitten beschreven waarvan de activiteit word gereguleerd door Salmonella en Tuberculose. Salmonella en Tuberculose manipuleren vele processen in de gastheercel waaronder transport.
Aangezien het transport onder meer gere- guleerd wordt door kinases, onderzochten we of kinase remmers effect hebben op de overleving van Salmonella en Tuberculose in de gastheercel. De Proteïne Kinase A (PKA) remmer H-89 is van grote invloed op Salmonella en Tuberculose groei in de gastheercel, toediening van de H-89 blok- keerde groei van Salmonella en Tuberculose.
Andere PKA remmers en verwijdering van PKA (met behulp van small interfering RNA, siRNA) resulteerde niet in geblok- keerde groei. Dit wijst er op dat niet PKA maar een ander kinase geremd wordt door H-89. Vervolgens hebben we elk kinase één voor één verwijderd met behulp van siRNA om te testen of het betrokken is bij Salmo- nella groei in de gastheercel. Op deze wijze hebben we tien kinasen geïdentificeerd die
betrokken zijn bij Salmonella groei. Tevens hebben we het in vivo remmend effect van H-89 (en afgeleide stoffen) op de groei van Salmonella en Tuberculose vergeleken met het in vitro remmend effect op de kinase- activiteit van de geïdentificeerde kinasen.
Alleen bij het Proteïne Kinase B (PKB) komt het in vitro profiel overeen met het in vivo profiel, wat aangeeft dat niet PKA maar PKB het relevante kinase is dat door H-89 wordt geremd in het geval van intracellulaire remming van Salmonella en Tuberculose groei. Bij infectie activeert Salmonella PKB en regelt op deze wijze actine dynamiek via activatie van PAK4 en transport/fusie via de small GTPase Rab14. Dit alles wordt gedaan om fusie met lysosomen te voorkomen. Het activeren van PAK4 of Rab14 onafhankelijk van PKB kan derhalve (ten dele) het bac- teriedodende effect van de PKB remming teniet doen.
Een verrassende vondst is dat kinases PKB en PAK4 niet alleen geactiveerd worden bij salmonella infectie, maar ook in verscheidene soorten kanker. Het is daarom ook aantrekkelijk om te speculeren dat de genen geactiveerd door pathogenen zoals Salmonella en Tuberculose ongeveer gelijk zijn aan de genen die geactiveerd zijn in kanker. De activatie van deze genen ver- hoogt niet alleen de overlevings kans van de cel, maar ook de overlevings kans van het pathogeen in de cel. In het verleden ontdekte antibiotica worden nu ingezet als anti kanker medicijnen. Het zou zomaar kunnen zijn dat de nieuwe huidig anti kanker medicijnen kunnen worden ingezet als nieuwe antibio- tica tegen pathogenen die resistent zijn tegen de huidige antibiotica.
Nederlandse samenvatting
