Synthetic tools to illuminate matrix metalloproteinase and proteasome activities
Geurink, P.P.
Citation
Geurink, P. P. (2010, October 6). Synthetic tools to illuminate matrix metalloproteinase and proteasome activities. Retrieved from
https://hdl.handle.net/1887/16014
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/16014
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
Samenvatting
Moleculair gereedschap om de werking van matrix metalloproteinases en proteasomen te belichten
Het in dit proefschrift beschreven onderzoek richt zich op de ontwikkeling van moleculair gereedschap of “probes”, waarmee de aanwezigheid en/of de activiteit van enzymen in biologische monsters kan worden vastgesteld. In het bijzonder is aandacht besteed aan het bestuderen van metalloproteinases (MMPs en ADAMs) en proteasomen. Een probe bestaat doorgaans uit drie belangrijke onderdelen: een herkennings element om de probe specifiek één enzymfamilie te laten herkennen, een label voor de visualisatie/analyse van het gebonden enzym en een reactieve groep voor het covalent binden van het enzym. Zogenaamde “activiteitsgebaseerde probes”
bevatten een reactieve (electrofiele) groep die reageert met een nucleofiel in het actieve centrum van het enzym, waarbij een covalente binding ontstaat. Enzymen die voor hun katalytische werking onafhankelijk zijn van een nucleofiele groep kunnen niet met activiteitsgebaseerde probes worden bestudeerd, omdat er geen covalent gebonden constructie ontstaat. Voor dit type enzymen kunnen zongenaamde “affiniteits- gebaseerde probes” of “fotoreactieve probes” worden gebruikt. Deze probes bevatten een speciale groep die door middel van fotochemie een covalente binding kan bewerkstelligen, ook wel een fotofoor genoemd. Hoofdstuk 1 beschrijft de eigenschappen van de drie meest gebruikte fotoforen alsmede enkele voorbeelden van het gebruik ervan in chemisch-biologisch onderzoek.
Een potente klasse van MMP/ADAM remmers wordt gevormd door de peptide succiniyl hydroxamaten. Hoofdstuk 2 behandelt de synthese van een volledig beschermde succinyl hydroxamaat bevattende bouwsteen. Deze bouwsteen werd gebruikt voor de constructie van chiraal zuivere peptide hydroxamaten in een efficiënt, lineair vaste drager peptide synthese protocol. Hiermee werd onder anderen een biotine-gekoppelde, fotoreactieve probe (fotolabiele groep op de P2’ positie) gesynthetiseerd, welke gebruikt werd voor het covalent modificeren en visualiseren van ADAM-10. Daarnaast werd er een bibliotheek, bestaande uit 96 peptide hydroxamaat
172 Samenvatting
gebaseerde remmers, gemaakt waarbij de zijgroepen op de P2’ en de P3’ posities van de remmers zijn gevarieerd. Deze set van remmers werd vervolgens gebruikt voor het bestuderen van de voorkeur van MMP-9, MMP-12 en ADAM-17 voor de verschillende type remmers.
De efficiëntie van het lichtgeactiveerde koppelen van ADAM-10 met de fotoreactieve probe beschreven in Hoofdstuk 2 bleek zeer gering te zijn. Om die reden werd het verplaatsen van de fotolabiele groep naar de P1’ positie bestudeerd, zoals uiteengezet wordt in Hoofdstuk 3. Hiervoor werd eerst een bouwsteen gemaakt, analoog aan die beschreven in Hoofdstuk 2, maar voorzien van een 3-aryl-3- (trifluoromethyl)-3H-diazirine groep. Vervolgens werd deze bouwsteen gebruikt voor de synthese van een biotine-gekoppelde, fotoreactieve probe (fotolabiele groep op de P1’
positie). De hypothese dat het verplaatsen van de fotolabiele groep naar de P1’ positie een efficiëntere labeling zou bewerkstelligen bleek juist te zijn. De beschreven probe bleek superieur in het covalent modificeren van verschillende MMPs en ADAMs in vergelijking met de eerder beschreven probe (Hoodstuk 2). Een interessante uitkomst van deze studie is dat de efficiëntie van het fotogeactiveerde koppelen van een probe niet altijd evenredig samenhangt met zijn enzymremmende capaciteiten.
Het onderzoek beschreven in Hoofdstuk 4 omvat een studie naar het effect van het opnemen van fluor in proteasoom remmers op hun specificiteit voor de verschillende, katalytisch actieve subunits. Er is gebleken dat het vervangen van fenylalanine in een boorester bevattende, potente proteasoom remmer door gefluoreerde fenylalanine derivaten geen invloed had op de potentie en de selectiviteit van de remmer. Verder werd er een set van tripeptide epoxyketonen vervaardigd, waarbij één van beide of beide P2 en P3 posities werden voorzien van een gefluoreerd fenylalanine derivaat. Een interessante bevinding bij het analyseren van de enzymremmende capaciteiten van deze verbinding, was dat het invoeren van fluor, met name op de P2 positie, leidde tot een sterke daling van de affiniteit voor de ‘caspase- achtige’ (1) en ‘trypsine-achtige’ (2) subunits. Dit resulteerde uiteindelijke in een verhoogde selectiviteit voor de ‘chymotrypsine-achtige (5) subunit. Eén specifieke verbinding uit deze set kon worden aangemerkt als één van de meest 5 selectieve remmers die er vandaag de dag bekend zijn. Deze verbinding werd omgezet in een probe door middel van de ‘click’ reactie met een fluorescent bodipy-alkyn groep op het, in de verbinding aanwezige, N-terminale azide. Deze probe kon worden gebruikt voor het specifiek binden en visualiseren van de 5 subunit.
De ontwikkeling van selectieve remmers voor de trypsine-achtige site van het proteasoom (2) met goede celpenetrerende eigenschappen staat beschreven in Hoofdstuk 5. De selectiviteit voor 2 werd bereikt door het installeren van basische zijketen residuen in de P1 positie van tripeptide vinylsulfonen en epoxyketonen. Het invoeren van een 4-aminomethyleen fenylalanine analoog op deze positie in een vinylsulfon resulteerde in een proteasoom remmer met een hoge selectiviteit voor 2, zowel in celextracten als in levende cellen. Het koppelen van dit 4-aminomethyleen fenylalanine vinylsulfon aan de 2 sturende peptide sequentie (3-hydroxy-2- methylbenzoyl)-valine-serine zorgde voor een verdere verhoging van de selectiviteit voor
Samenvatting 173
2 en resulteerde zelfs in selectiviteit voor 2 ten opzichte van zijn immunoproteasoom pendant 2i.
Hoofdstuk 6 behandelt een studie naar de oriëntatie van verlengde peptide vinylsulfonen binnen in de katalytisch actieve holte van het proteasoom. In deze studie is het activiteitsgebaseerde modificeren van een enzym met behulp van een reactive, electrofiele groep gecombineerd met fotochemisch koppelen. Hiervoor werden in eerste instantie drie probes, bestaande uit een verlengd peptide vinylsulfon gekoppeld aan een N-terminale fotofoor (diazirine, arylazide en benzofenon), gemaakt. Van deze drie verbindingen bleek de arylazide variant als enige in staat om een koppeling tussen de actieve 5 subunit en een naburige 6 subunit te bewerkstelligen. Het gehele construct kon geïdentificeerd worden door middel van gel electroforese gevolgd door LC-MS/MS analyse.
Het ontwerp en de synthese van een nieuwe selectief splitsbare linker, gebaseerd op de levuline ester, is beschreven in Hoofdstuk 7. Een speciaal ontworpen ester van levulinezuur en 2,6-diisopropylphenol werd ingebouwd in een activiteitsgebaseerde probe, gebaseerd op de potente proteasoom remmer epoxomicin en voorzien van biotine. De optimale eigenschappen van deze splitsbare linker, in termen van stabiliteit en splitsbaarheid, werden gedemonstreerd aan de hand van het gebruik ervan voor het selectief immobiliseren van proteasoom actieve subunits uit een celextract. Een directe behandeling van de vaste drager met hydrazine leidde vervolgens tot de selectieve elutie van de aan deze probe gebonden eiwitten. Verder bleek de nieuwe splitsbare linker zeer goed te combineren met transformaties die veelvuldig toegepast worden in chemisch biologisch onderzoek, zoals ‘click’ chemie en de Staudinger-Bertozzi ligatie.
