Functional analysis of genes involved in the regulation of development of reproductive organs in rice (Oryza sativa)
Chen, Y.
Citation
Chen, Y. (2011, December 20). Functional analysis of genes involved in the regulation of development of reproductive organs in rice (Oryza sativa). Retrieved from
https://hdl.handle.net/1887/18262
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/18262
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
Samenvatting
Samenvatting
139 Rijst (Oryza sativa) is na mais en tarwe het derde belangrijke voedselgewas en wordt dagelijks geconsumeerd door miljarden mensen in Azië waar eveneens de meeste rijst wordt geproduceerd.
De totale graanopbrengst is voor boeren de belangrijkste eigenschap in rijst die dan ook continu verbeterd wordt door veredelaars. De productiviteit van rijst is aanzienlijk verbeterd gedurende, maar ook na de zogeheten Groene Revolutie van de jaren zestig. Dit proces had niet alleen te maken met veredeling op zich maar ook met de verbetering van landbouwpraktijken en de toegenomen beschikbaarheid van kunstmest en pesticiden. Dit nog steeds gaande proces heeft geleid tot maximale oogsten van tien ton per hectare tijdens optimale condities, echter de gemiddelde productie van rijst in 2009 was 4,2 ton per hectare (FAO STAT 2009). Echter met de snelle economische ontwikkeling in de Twintigste Eeuw is onze levensstijl en bijbehorend voedselconsumptiepatroon aanzienlijk gewijzigd. Gaandeweg is er een vraag ontstaan naar rijst met betere kookkwaliteit en bijbehorende smaak, maar ook met vermeerderde voedingswaarde. De kookkwaliteit van rijst wordt voornamelijk bepaald door de grootte, kleur, vorm en de zetmeel- en eiwitinhoud van het endosperm. Hoewel de beschikbaarheid van water, kunstmest en het weer sterke effecten hebben op de bloemzetting, fertilisatie en de uiteindelijke kwaliteit van het rijstzaad, is het natuurlijk ook de genetische achtergrond die uiteindelijk mede de opbrengst en kwaliteit bepalen. In de afgelopen drie decennia is er veel onderzoek verricht aan de achtergrond van kwaliteit van rijst daarbij gebruikmakende van een aanpak bestaande uit biochemische, fysiologische en moleculaire componenten maar er ontbreekt nog steeds belangrijke kennis. De doelstelling van dit proefschrift was om nieuwe kennis te verwerven omtrent ontwikkeling van rijst daarbij gebruikmakende van twee verschillende strategieën. De eerste was gebaseerd op de yeast one-hybrid-techniek en dit heeft geleid tot de ontdekking van twee nieuwe transcriptiefactoren die betrokken zijn bij de regulatie van het voor kwaliteit belangrijke zaadopslageiwit GluB-1. De tweede strategie was gebaseerd op mutatiegenetica waarbij een collectie werd samengesteld en gefenotypeerd, van T-DNA- en transposoninsertiemutanten in genen die voornamelijk tot expressie komen tijdens bloem- en zaadontwikkeling. Deze aanpak heeft geresulteerd in de vondst van een mutant in het OsJAR1-gen, dat belangrijk bleek te zijn voor ondermeer bloemsluiting.
Hoofdstuk 1 geeft een samenvatting weer van de kennis dusverre omtrent de karakteristieken van kwaliteit in rijst alsmede van de effecten van genetische en omgevingsfactoren op deze.
Voorgaande studies hebben aangetoond dat kwaliteit en kwantiteit van zetmeel en zaadopslageiwitten in het endosperm de belangrijke factoren zijn die de kwaliteit van rijst bepalen.
Natuurlijk zijn daarom de genen die betrokken zijn bij de biosynthese van deze moleculen van groot belang en worden daarom door verschillende onderzoeksgroepen bestudeerd. De functies van de bijbehorende regulatiefactoren inclusief transcriptiefactornetwerken, waarvan de activiteit mede bepaald wordt door omgevingsfactoren, zijn eveneens onmisbaar voor een beter begrip van kwaliteit van rijst. Echter kennis hieromtrent is nog steeds een limiterende factor.
Glutelinen zijn de meest belangrijke zaadopslageiwtten in rijst en samen met het feit dat de promotorregio van gluteline (GluB-1) met de daarin zo belangrijke regulatie-elementen voor genexpressie redelijk goed beschreven is, maakt het dat dit gen een voor de hand liggende kandidaat was voor verder onderzoek. In Hoofdstuk 2 werd gebruik gemaakt van de yeast one-hybrid-techniek om naar nieuwe transcriptiefactoren te zoeken die betrokken zijn bij de regulatie van GluB-1. Als prooisequentie werd de promotor van het GluB-1-gen gebruikt en de cDNA-expressiebanken waarin gezocht werd, waren gemaakt met behulp van mRNA geïsoleerd van zaden en bloeiwijzen van rijst.
Samenvatting
140
Deze aanpak heeft geresulteerd in de vondst van twee nieuwe zinc-finger-eiwitten uit de CCCH- groep, genaamd OsGZF1 en OsGZF2, waarvan de interactie met de GluB-1-promotor werd bevestigd met behulp van in vitro gelretardatie-experimenten. Verdere experimenten met transgene planten voorzien van promotor-GUS-constructen afgeleid van OsGZF1- en OsGZF2 toonden aan dat beide genen voornamelijk tot expressie komen in een dunne laag weefsel om het scutellum van het zich ontwikkelende embryo, terwijl GluB-1 sterk tot expressie komt in het aleurone en subaleurone.
Deze waarnemingen werden voor OsGZF2 bevestigd met behulp van in situ hybridisatie. De regulatie door OsGZF1 en OsGZF2 van de GluB-1-promotor werd verder bestudeerd met behulp van transient expressie-experimenten in rijstprotoplasten. Hiermee werd aangetoond dat zowel OsGZF1 als OsGZF2 in staat is om de expressie van een GluB-1-promotorconstruct omlaag te brengen en dus waarschijnlijk een functie heeft als repressor. Dit resultaat werd bevestigd aan de hand van eiwitgels (SDS-PAGE) van zaden afkomstig van OsGZF1 RNAi-planten, waarop een toegenomen hoeveelheid te zien was van een glutelineprecursor.
Onderwerp van studie in Hoofdstuk 3 was een GH3-familie-eiwit, genaamd OsJAR1. Dit gen en twee bijbehorende mutanten (osjar1-2 en osjar1-3) werden gebruikt om het moleculaire mechanisme achter bloemopening en -sluiting te bestuderen in relatie tot signaaltransductie van het plantenhormoon jasmonzuur (JA). Kenmerkend voor deze mutanten was dat de bloemen dagenlang open bleven staan, terwijl bloemen van controleplanten al na 90 minuten gesloten waren. In tegenstelling tot de situatie bij controleplanten, kan bloemopening van de osjar1-mutanten niet geïnduceerd worden door uitwendige behandeling met JA of MeJA (methyljasmonaat). Voorts vindt remming door MeJA van wortelgroei evenmin plaats, dus zijn de weefsels van de osjar1-mutanten relatief ongevoelig voor JA en MeJA. Voorts bleek dat osjar1-3 meer gevoelig was voor infectie met de rijstblastschimmel en dat overexpressie van OsJAR1 de resistentie vermeerderde. Met behulp van biochemische technieken werd ontdekt dat het OsJAR1-gen in feite codeert voor een enzym dat in staat is om acht van de 20 aminozuren te conjugeren met JA. Verdere analyse van osjar1-2-planten liet zien dat niveau’s van het conjugatieproduct JA-Ile sterk verminderd waren. Dit experiment bevestigd dat OsJAR1 in feite een JA-Ile synthase is met belangrijke functies in de ontwikkeling van bloemen en zaden alsmede in resistentie tegen de rijstblastziekte en mogelijk ook tegen andere plantenziekten.
Er is aangetoond dat OsJAR1 in staat is om JA aan het aminozuur isoleucine (Ile) te koppelen resulterende in het plantenhormoon JA-Ile. Echter wat precies het verband is tussen JA-Ile en het fenotype van openblijvende bloemen in osjar1-planten is nog niet geheel duidelijk. De in Hoofdstuk 4 beschreven experimenten lieten zien dat tijdens de bloei van rijstplanten, de K+-inhoud van lodiculen van een osjar1-mutant twee keer zo hoog is als in de controle. De opzwelling en latere krimp en atrofie van de lodiculen zijn de sleutelprocessen die het openen en sluiten van bloemen van de rijstplant bepalen en die zijn dus blijkbaar anders gereguleerd in osjar1-planten. We beschouwen de verhoging van het niveau van K+ -ionenin lodiculen van osjar1-planten als een van de belangrijke redenen waarom de sluiting van bloemen faalt. De vraag die vervolgens beantwoord is, is welke genen op hun beurt hierbij betrokken kunnen zijn. Gebaseerd op expressieprofielen van bloemen, is er een selectie gemaakt van 12 verschillende K+-transportgenen voor nadere analyse. Met behulp van RT-PCR-experimenten is er bekeken welke van deze 12 genen een verschil in expressieniveau vertoont in bloemen van controle and osjar1-planten. Slechts een gen hiervan, te weten OsCHX14, liet een dergelijk expressiepatroon zien. Een dergelijk verschil kan relevant zijn omdat het een
Samenvatting
141 verklaring kan zijn van het waargenomen verschil in K+-niveau. Experimenten met transgene planten voorzien van een promotor-GUS-construct lieten zien dat expressie van OsCHX14 zich voornamelijk voordoet in de lodiculen tijdens de opening en sluiting van bloemen hetgeen een bepaalde rol suggereert in dit proces. OsCHX14 heeft 12 mogelijke transmembraandomeinen in de N-terminus en als bevestiging van deze waarneming blijkt een GFP-fusie-eiwit, tot expressie gebracht in rijstprotoplasten, dan ook gelokaliseerd op het cytoplasmamembraan te zijn.
Vervolgonderzoek met behulp van bakkersgist bevestigde dat OsCHX14 inderdaad in staat is om K+- ionen uit cellen te transporteren. Mede gebaseerd op deze en andere resultaten concluderen we dan ook dat OsCHX14 een van de sleutelfactoren is die verantwoordelijk is voor het verwijderen van K+- ionen uit de lodiculen tijdens de bloei van rijstbloemen die dan vervolgens resulteert in atrofie en bloemsluiting waarna de ontwikkeling van het eigenlijke zaad kan aanvangen.
Samenvattend, het werk beschreven in dit proefschrift heeft geleid tot de ontdekking van vier genen waarvan we nieuwe functies hebben aangetoond in de ontwikkeling van bloemen en zaden van rijst. Deze resultaten dragen bij aan een beter begrip van de functie van transcriptiefactoren in de expressie van zaadopslageiwitten en van de rol van plantenhormonen in het openen en sluiten van de bloemen van rijst. Deze resulaten zullen zich mogelijk vertalen in toepassingen gericht op verdere veredeling van rijst.
