Afstudeerverslag
De ontwikkeling, optimalisatie en validatie
van een GC‐FID methode voor de analyse van
FAEE in meconium
Shirley Verschoor
Afstudeerverslag
De ontwikkeling, optimalisatie en validatie
van een GC‐FID methode voor de analyse van
FAEE in meconium
Versie: 1.3 Laatste Wijziging: 11 juni 2012 Groep: Forensisch Laboratorium Onderzoek richting Chemie Student: S.P. Verschoor Afstudeerplaats: Erasmus MC 's‐Gravendijkwal 230 Postbus 2040 3000 CA Rotterdam Mentor: Dr. Birgit Koch Begeleider: Ing. Bart van der Nagel Onderwijsinstelling: Avans Hogeschool Academie voor de Technologie van Gezondheid en Milieu Lovensdijkstraat 61‐63 4818 AJ Breda Tel. 076‐525 05 00 Opleiding: Forensisch Laboratorium Onderzoek Docentbegeleider: Jack van Schijndel Stageperiode: 30‐01‐2012 tot 30‐06‐2012Voorwoord
Het voor u liggende afstudeerverslag vormt het resultaat van mijn stageperiode en afstudeerproject bij het apotheeklaboratorium van Erasmus MC.
Mijn interesse voor het apotheeklaboratorium van het Erasmus MC is gewekt tijdens het derde studiejaar, waar ik stage liep bij de Forensisch Artsen Rotterdam Rijnmond (FARR). Tijdens deze stage ben ik mij steeds meer gaan interesseren en verdiepen in toxicologie. De monsters die door de forensisch artsen afgenomen werden voor toxicologisch onderzoek, werden doorgestuurd naar het laboratorium van het Erasmus MC om te analyseren. Na een paar uitvoerige gesprekken over het afstudeerproject heb ik besloten om mijn stage‐ en afstudeerperiode te volbrengen bij het Erasmus MC.
Het interessante aan dit onderwerp vind ik de matrix waarmee gewerkt wordt. Er is weinig bekend over de verschillende stoffen die aangetroffen kunnen worden in meconium. Het Erasmus MC is het eerste laboratorium in Nederland die deze bepaling nu kan doen. Het uitvoeren van dit afstudeerproject heb ik als een plezierige en leerzame tijd ervaren.
Voor de totstandkoming van dit afstudeerverslag wil ik mijn mentor Dr. Birgit Koch, begeleider Ing. Bart van der Nagel en kinderarts Drs. Barbara Sibbles hartelijk danken voor hun begeleiding. Zij hebben mij geholpen een juiste structuur aan te brengen in mijn afstudeerverslag en goede ideeën aangedragen, waardoor ik gestimuleerd werd op een hoger niveau naar mijn stage‐ en afstudeerperiode te kijken. Door hun enthousiasme en kennis raakte ik tijdens het schrijven van mijn afstudeerverslag net zo bevlogen als zij.
Verder wil ik Annemieke van Ede bedanken voor de gastvrijheid om op de afdeling van het Geboortecentrum Sophia mee te werken en voor het verzamelen van het meconium. Tot slot wil ik iedereen van de afdeling die mij ook maar op enige wijze heeft bijgestaan heel hartelijk bedanken. Shirley Verschoor Pernis, juni 2012
Samenvatting
De aanleiding voor dit onderzoek is tot stand gekomen, doordat er nog geen methode was ontwikkeld om maternaal chronisch alcoholgebruik tijdens de zwangerschap vast te stellen. Tijdens de zwangerschap werd voorheen bloed of urine van de moeder afgenomen om dit te controleren op alcoholgebruik. Dit is echter een momentopname. Kinderarts Drs. Barbara Sibbles kwam met de vraag om een methode te ontwikkelen om chronisch alcoholgebruik vast te stellen. Deze arts krijgt veel patiënten in haar praktijk die lijden aan FASD of FAS. Dit staat voor Foetaal Alcohol Spectrum Disorder en Foetaal Alcohol Syndroom. Het wordt veroorzaakt door alcoholgebruik van de moeder tijdens de zwangerschap. Er kunnen bij het kind lichamelijke effecten, geestelijke effecten, gedragsproblemen en leerstoornissen met mogelijke levenslange implicaties optreden. De aandoening kan variëren van licht tot zeer zwaar. Om chronisch alcoholgebruik aan te tonen wordt er gebruik gemaakt van het meconium van de neonaat. Dit wordt gevormd vanaf de twaalfde week tijdens de zwangerschap en is de eerste ontlasting van de neonaat na de geboorte. Het is een directe afspiegeling van het alcoholgebruik tijdens de zwangerschap. Dit kan dus goed gebruikt worden om chronisch alcoholgebruik vast te stellen.
Het doel was om deze methode te ontwikkelen, te optimaliseren en te valideren. De uitgangsmethode van het artikel “Population baseline of meconium fatty acid ethyl esters among infants of nondrinking women in Jerusalem and Toronto” (Chan et al) werd als basis gebruikt voor het onderzoek. Het was daarbij vooral belangrijk om een goede afkapwaarde vast te stellen. Dit was van belang om een positieve of negatieve uitslag terug te koppelen aan de behandelend artsen. Als de uitslagen zich boven een bepaalde afkapwaarde bevinden kan dit een verhoogde kans geven om FASD en FAS te ontwikkelen. Er werd onderzocht welke technieken gebruikt kunnen worden om dit vast te stellen. Tevens werd onderzocht welke voorbehandeling en extractie het best gebruikt kan worden bij een complexe matrix zoals meconium.
Alcohol wordt in het lichaam omgevormd naar vetzuurethylesters (FAEE). Als voorbehandeling wordt gebruik gemaakt van liquid/liquid extractie (LLE) en solid phase extractie (SPE). Het principe van LLE is gebaseerd op het gebruik van twee vloeistoffen of oplossingen waarvan de ene een apolaire, meestal organische fase is en de andere een meer polaire, meestal waterige fase is. Hierbij is het de bedoeling dat de meer apolaire componenten zich in de organische laag gaan bevinden en de meer polaire componenten in de waterige laag. Dit zorgt ervoor dat de FAEE zich in de apolaire laag gaat bevinden. Het zorgt er ook voor dat de meeste wateroplosbare verontreiniging zich in de polaire laag gaat bevinden. Als apolair oplosmiddel wordt gebruik gemaakt van hexaan. De waterige laag bevindt zich al in het meconium.
Sommige stoffen die bepaald moeten worden kunnen beter eerst gezuiverd worden uit matrices zoals meconium. Dit kan gedaan worden door gebruik te maken van SPE. Deze methode zorgt ervoor dat de monsters geconcentreerd en gezuiverd worden, zodat deze stoffen geanalyseerd kunnen worden zonder interferentie met andere stoffen. Hierdoor ontstaat er een betrouwbaardere meting. Het is een extractie methode die gebruik maakt van de fysische en chemische eigenschappen van opgeloste stoffen. Bij SPE wordt gebruik gemaakt van een stationaire en een mobiele fase. De vloeistof wordt dan door kolommetjes geleid. In de kolommetjes zitten korreltjes met adsorbens. Deze korreltjes kunnen polair of apolair zijn. Het analyt bepaald welk soort kolom wordt gebruikt bij
de extractie. Tijdens dit onderzoek wordt gebruik gemaakt van silica‐aminopropyl kolommen. Hierbij werd gebruik gemaakt van de normal phase. Dit houdt in dat de kolom polair is en het eluens apolair. Het houdt dus in dat de FAEE een grotere affiniteit heeft voor het eluens dat uit hexaan bestaat. Hierdoor zal de FAEE dus meespoelen en blijft de verontreiniging achter in de kolom. Het eluens met de FAEE zal worden opgevangen in een schone reageerbuis, zodat hier na indampen een verdere analyse op de GC mee uitgevoerd kan worden.
Om vluchtige stoffen zoals FAEE te meten wordt er gebruik gemaakt van een GC. Gaschromatografie is een scheidingsmethode die berust op het verschil in kookpunt. Het bestaat uit een mobiele fase die langs een stilstaande stationaire fase stroomt. De componenten van een mengsel worden meegenomen door de mobiele fase dat uit een draaggas bestaat. De stationaire fase bestaat uit een WAX kolom. Deze kolom is zeer geschikt om FAEE te scheiden. Dit komt doordat vetzuren uit lange apolaire C‐ketens bestaan met daaraan een kleine polaire zuurgroep. Doordat de kolom medium‐ polair is, zullen de FAEE goed van elkaar gescheiden worden. Een stof met een voorkeur voor de stationaire fase zal trager door het systeem lopen dan een stof met een voorkeur voor de mobiele fase. De stoffen worden één voor één langs een flame ionisation detector (FID) geleidt. Deze detector zet de signalen om en tekent deze uit op een chromatogram waaruit af te leiden is om welke stof het gaat. Tijdens het eerste gedeelte van de stage is vooral veel aandacht besteedt aan de optimalisatie van de methode. Dit werd met academische standaarden in hexaan gedaan. In het begin werd gestart met acht ethylesters. Dit waren ethyllaurate (E12:0), ethylmyristate (E14:0), ethylpalmitate (E16:0), ethylpalmitoleate(E16:1), ethylstearate (E18:0), ethyloleate (E18:1), ethyllinoleate (E18:2) en ethyllinolenate (E18:3). De retentietijden van de verschillende ethylesters werden bepaald en het programma van de GC werd zo ingesteld dat er een goede resolutie werd verkregen. De recovery van de E12:0 en de E14:0 bleef erg variëren. Om te controleren of de verschillen konden komen door de auto‐injector is de reproduceerbaarheid academisch onderzocht. Er is ook onderzocht of de verschillen veroorzaakt werden door een verlies tijdens het indampen. Dit was niet het geval. De verschillen konden dus alleen maar veroorzaakt worden door de SPE. Er werden twee soorten SPE – kolommen onderzocht. Dit waren silica‐aminopropyl kolommen van Waters en BondElut. De kolommen van BondElut gaven de hoogste recovery. Met deze kolommen werd dus verder gewerkt. Er zijn echter ook nog een aantal parameters van de GC onderzocht. Zo is er onderzocht of de gevoeligheid verhoogd kan worden door de splitverhouding te verlagen van 25 naar 12,5. Er is een drukpuls toegevoegd en de plungerspeed werd verlaagd. Deze wijzigingen hadden echter weinig effect. Vervolgens zijn de liner, naald en het septum vervangen. Hierdoor werd het systeem gelijk gevoeliger en kon er ook iets lager gemeten worden.
Na deze optimalisaties werd gestart met de opwerking in meconium. Tijdens deze opwerking kwam naar voren dat de recovery van E12:0 en E14:0 nog steeds erg wisselend was. Dat komt doordat deze ethylesters van nature ook in het menselijk lichaam voorkomen. Er werd besloten dat alleen verder werd gewerkt met de ethylesters uit het artikel. Dit waren E16:0, E18:0, E18:1 en E18:2. Hier werd een gedeeltelijke validatie op uitgevoerd. Er kon geen complete validatie uitgevoerd worden, doordat de aanlevering van meconium laag was. De lineariteit, carryover, LLOQ, reproduceerbaarheid en het matrixeffect werden gevalideerd.
De ijkllijnen van de ethylesters verlopen lineair. Er is geen sprake van een carryover effect. De LLOQ uit het artikel is niet voor alle ethylesters behaald. Voor de E18:0 en E18:2 wordt deze gesteld op 1µg/ml en is de LLOQ uit het artikel wel behaald. Bij de E16:0 en de E18:1 wordt deze op 2µg/ml gesteld. De reproduceerbaarheid is voor E18:0 niet behaald. Voor de overige ethylesters is deze wel behaald. Er treedt geen matrixeffect op. Door al deze bevindingen te combineren kan er geconcludeerd worden dat de methode die in het artikel gebruikt wordt doorgezet kan worden in het Erasmus MC. Alleen zijn er dan wel een paar kleine aanpassingen bij de LLOQ.
Er zal wel aanvullend onderzoek nodig zijn om ervoor te zorgen dat de houdbaarheid van de standaarden vergroot wordt. Deze zijn nu waarschijnlijk 14 dagen houdbaar in de vriezer bij ‐20°C. Door een houdbaarheid aan de QC’s en standaarden te geven zal de RSD van E18:0 verkleind worden en de reproduceerbaarheid vergroot worden. Hierdoor zal de betrouwbaarheid van de meetwaarden van de patiëntmonsters toenemen.
Summary
The reason for this research was established, because there is no method developed to determine chronic maternal alcohol consumption during pregnancy yet. Previously during the pregnancy, blood or urine was drawn from the mother to check on alcohol consumption. However, this is only a snapshot. Paediatrician Drs. Barbara Sibbles came up with the idea to develop a method to determine chronic alcohol consumption. She sees many patients in her practice who suffer from FAS or FASD. This stands for Fetal Alcohol Spectrum Disorder and Fetal Alcohol Syndrome respectively. It is caused by maternal consumption of alcohol during pregnancy. In the child physical effects, psychological effects, behavioural problems and learning disabilities can occur, with possible lifelong implications. The disorder can range from mild to very severe. In order to demonstrate chronic alcohol consumption, the meconium of the neonate can be used. This meconium is formed from the twelfth week during pregnancy and is the first stool of the newborn after birth. It is a direct reflection of alcohol consumption during pregnancy. This can be used to determine chronic maternal alcohol consumption during pregnancy.
The goal was to develop, optimize and validate this method. The output method of the article "Population baseline of meconium fatty acid ethyl esters among infants of nondrinking women in Jerusalem and Toronto" (Chan et al) was used as a basis for the research. It was particularly important to establish a proper cutoff value. It was important to report a positive or negative outcome to the treating physicians. If the results are above a certain cutoff value it can give an increased chance of developing FAS and FASD. It was investigated which techniques can be used to determine this. It was also examined what can be best used for treatment and extraction from a complex matrix, such as meconium. Alcohol in the body is transformed into fatty acid ethyl esters (FAEE). Liquid / liquid extraction (LLE) and solid phase extraction (SPE) were used as pretreatment. The principle of LLE is based on the use of two liquids, or solutions, one of which is a non‐polar, usually organic phase and the other is a more polar, usually aqueous phase. The scope of this technique is that the more non‐polar components are located in the organic layer and the more polar components in the aqueous layer. This ensures that the FAEE is located in the non‐polar layer. It also ensures that most water‐soluble contamination reside in the polar layer. Hexane is used as nonpolar solvent. The aqueous layer is already in the meconium.
Some substances must be purified first from matrices such as meconium. This can be done by making use of the SPE. This method ensures that the samples are more concentrated and purified, so that these substances can be analyzed without any interference of other substances. This results in a more reliable measurement. It is an extraction method that makes use of the physical and chemical properties of solutes. SPE uses a stationary and a mobile phase. The liquid is then guided through the columns. The columns contain granules with the adsorbent. These granules may be polar or non‐ polar. The analyte determines what type of column is used in the extraction. During this research silica‐aminopropyl columns are used. The normal phase is used. This means that the column is polar and the eluent non‐polar. It therefore means that the FAEE has a greater affinity for the mobile phase that consists of hexane. The FAEE will therefore stay in the mobile phase and be collected in the test tube, and the pollutions will stay behind on the column. The eluent of the FAEE will be
collected in a clean test tube and evaporated to dryness. The residue was reconstituted and injected into a gas chromatograph. For volatile substances such as FAEE a GC is used. Gas chromatography is a separation method that is based on the difference in boiling point. It consists of a mobile phase which flows along a stationary phase. The components of a mixture are included by the mobile phase consisting of a carrier gas. The stationary phase consists of a WAX column. This column is very suitable for separating FAEE, because fatty acids contain long non‐polar C chains with a small polar acid group. The column is medium polar, therefore the FAEE will separate from each other easily. A substance with a preference for the stationary phase will flow through the system slower than a substance with a preference for the mobile phase. The substances run one by one along a flame ionisation detector (FID). This detector converts the signals and creates a chromatogram which can distract what substance is found. During the first part of the internship much attention went to the optimization of the method. This was done with the academic standards in hexane. In the beginning is started with eight ethyl esters. These were ethyllaurate (E12: 0), ethylmyristate (E14: 0), ethylpalmitate (E16: 0), ethylpalmitoleate (E16: 1), ethylstearate (E18: 0), ethyloleate (E18: 1), ethyllinoleate (E18: 2) and ethyllinolenate (E18: 3). The retention times of the various ethyl esters were determined, and the program of the GC was set so that there was a good resolution. The recovery of the E12:0 and E14:0 remained very variable. To verify that the differences were caused by the auto‐injector, the reproducibility was examined academically. It was also examined whether the differences were caused by loss during the evaporation. This was not the case. The differences could therefore only be caused by the SPE. There were two types of SPE ‐ columns investigated. These were aminopropyl‐silica columns of Waters and BondElut. The columns of BondElut gave the highest recovery, and were therefore chosen for this investigation. However, also a number of parameters of the GC were examined. It was examined whether the sensitivity can be increased by the splitting ratio to decrease from 25 to 12,5. A pressure pulse is added, and the plungerspeed was reduced. These changes, however, had little effect. Subsequently, the liner, needle and the septum were replaced. This made the system more sensitive and there could be measured slightly lower.
After these optimizations the reprocessing in meconium was started. During this reprocessing it showed that the recovery of E12:0 and E14:0 was still very variable. That is because these ethyl esters also naturally occur in the human body. It was determined that the ethyl esters from the article would be used from now on. These were E16: 0, E18: 0, E18:1 and E18:2. A partial validation was performed on these ethyl esters. An overall validation could not be performed, because the delivery of meconium was low. The linearity, reproducibility, the LLOQ, carryover and the matrixeffect were validated.
The calibration curves of the ethyl esters are linear. There is no carryover effect. The LLOQ from the article is not achieved for all ethyl esters. For the E18: 0 and E18: 2, it is set at 1μg/ml and the LLOQ from the article is obtained. The LLOQ of E16:0 and E18:1 is set at 2μg/ml. The reproducibility for E18:0 is not achieved. For the remaining ethyl esters, this is achieved. There was no matrix effect. By combining all these findings it can be concluded that the method used by the article can be continued in the Erasmus MC. There are only a few minor modifications to the LLOQ.
Additional studies will be needed to ensure that the sustainability of the standards is enlarged. These are now probably preservable for 14 days at ‐20 ° c in the freezer. By giving the QC's and standards a preservability the RSD of E18:0 will be reduced and the reproducibility will be enlarged. As a result, the reliability of the measured values of the patient's sample will increase.
Inhoudsopgave
1. Inleiding ... 13 2. Theoretische achtergrond ... 14 2.1 Foetaal Alcohol Syndroom ... 14 2.1.1 Uiterlijke kenmerken FAS ... 14 2.2 Alcohol... 15 2.2.1 Omzettingsproducten van alcohol ... 16 2.2.2 Meconium ... 17 2.3 Extractiemethoden... 17 2.3.1 Liquid/Liquid Extractie... 17 2.3.2 Solid Phase Extractie ... 18 2.4 Detectiemethode ... 18 2.4.1 Gaschromatografie... 18 2.4.2 Kolom... 19 2.4.3 Detector... 20 3. Materiaal & methoden... 21 3.1 Chemicaliën ... 21 3.2 Instrumenten... 21 3.3 Stockoplossingen, standaarden en controles... 21 3.4 Liquid Liquid Extractie ... 21 3.5 Solid Phase Extractie ... 22 3.6 GC‐FID instellingen ... 22 3.7 Optimaliseren van de methoden... 22 3.8 Validatie... 23 4. Resultaten... 25 4.1 Uitkomsten academische reeksen ... 25 4.2 Validatie... 274.2.1 Lineariteit ... 27 4.2.2 LLOQ ... 29 4.2.3 Reproduceerbaarheid... 31 4.2.4 Matrixeffect... 35 5. Discussie/Conclusie ... 40 Aanbevelingen... 43 Literatuurlijst ... 44 Bijlagen ... 47 Bijlage I Artikel uitgangsmethode ... 48 Bijlage II Fluctuatie E12:0 & E14:0... 57 Bijlage III Lineariteit & carryover... 58 Bijlage IV LLOQ ... 61 Bijlage V Reproduceerbaarheid... 62 Bijlage VI Matrixeffect ... 63 Bijlage VII Patiëntmonsters ... 65 Bijlage VIII Verloop standaard Ethylpalmitate ... 66 Bijlage IX Verloop standaard Ethylstearate... 67 Bijlage X Verloop standaard Ethyloleate ... 68 Bijlage XI Verloop standaard Ethyllinoleate ... 69
Afkortingenlijst
ADH Alcoholdehydrogenase pagina 16
ALDH Aceetaldehydedehydrogenase pagina 16
FAEE Fatty Acid Ethyl Esters pagina 16‐19,21, 23, 28, 31, 34, 37, 41
FASD Fetal Alcohol Spectrum Disorder pagina 14
FAS Foetaal Alcohol Syndroom pagina 14 ‐ 16
FID Flame Ionisation Detector pagina 20, 39
GC Gaschromatograaf pagina 16 ‐ 19, 21, 22, 24, 39
IS Interne Standaard pagina 21, 26 ‐ 37, 42
LLE Liquid Liquid Extractie pagina 17, 21
LLOQ Lower Limit Of Quantitation pagina 21, 23, 25, 29, 32‐33, 35,39‐42
MEOS Microsomaal Ethanol Oxiderend Systeem pagina 16
QC Quality Control pagina 21, 23, 27‐31, 34, 36, 37,40‐43
RSD Relatieve Standaard Deviatie pagina 23, 24, 27 ‐ 37, 39 ‐ 42
SPE Solid Phase Extractie pagina 18, 21, 24, 25, 39, 40, 42 ‐ 43
WAX Weak Anion Exchanger pagina 19
1. Inleiding
De afdeling Medium Care Kindergeneeskunde krijgt regelmatig te maken met neonaten die bepaalde afwijkingen vertonen. Er wordt verondersteld dat dit kan komen door het alcoholgebruik van de moeder. Deze aandoening wordt het Fetal Alcohol Spectrum Disorder (FASD) genoemd. Tijdens de zwangerschap kan er bloed of urine van de moeder afgenomen worden om dit te controleren op alcoholgebruik. Dit is echter een momentopname. Het apotheeklaboratorium kreeg de vraag of er een andere methode ontwikkeld kon worden om chronisch alcoholgebruik tijdens de zwangerschap vast te stellen. Deze methode wordt tijdens de afstudeerstage ontwikkeld en gevalideerd.
Alcohol wordt na orale inname door het lichaam afgebroken in verschillende stoffen. Er vindt een non‐oxidatieve afbraak plaats door de vetzuurethylestersynthase die de alcohol omvormt in fatty acid ethyl esters (FAEE). Deze omzettingsproducten worden door de moeder via de foetale bloedsomloop overgedragen aan de foetus. Dit komt uiteindelijk in het meconium terecht. Het meconium is een goede biomarker om de FAEE te detecteren.
Allereerst zijn er verschillende academische standaardreeksen in hexaan gemaakt die dienden als referentie voor de werkelijke monsters. Deze reeksen werden geanalyseerd op de gaschromatograaf. De instellingen van de gaschromatograaf werden zo ingesteld dat er een goede resolutie ontstond van de ethylesters. Vervolgens werd academisch onderzocht wat de recovery zou zijn na de vaste fase extractie (SPE). Dit is met twee verschillende kolommen onderzocht. Daarna werden verschillende parameters van de gaschromatograaf onderzocht. Er werd onderzocht of het verlagen van de split, het toevoegen van een drukpuls en het verlagen van de plungerspeed van enige invloed was op de analyse. Zo ontstond een goede uitgangsmethode waar verder mee gewerkt kon worden. Vervolgens werd een extractiemethode opgezet om de FAEE te extraheren uit meconium. Er werd gebruik gemaakt van liquid/liquid extractie (LLE) en SPE. LLE zorgt ervoor dat de FAEE geëxtraheerd wordt uit de matrix. Vervolgens werd de SPE toegepast om het eindproduct zoveel mogelijk te zuiveren en alle in wateroplosbare verontreiniging te verwijderen. Nadat de methode was geoptimaliseerd, werd gestart met de gedeeltelijke validatie. De lineariteit, LLOQ, carryover, reproduceerbaarheid en het matrixeffect werden onderzocht. Vervolgens werden de werkelijke monsters gemeten. Deze uitslagen worden teruggekoppeld aan de behandelend artsen. Als de uitslagen zich boven een bepaalde afkapwaarde bevinden kan dit een verhoogde kans geven om FASD te ontwikkelen.
Dit afstudeerverslag is opgebouwd uit vijf hoofdstukken, de aanbevelingen, een literatuurlijst en bijlagen. In hoofdstuk twee wordt de specifieke theoretische achtergrond beschreven. Hier wordt informatie gegeven over alcohol en de schade die het kan toebrengen bij een ongeboren kind. In hoofdstuk drie worden de materialen en methoden weergegeven die zijn gebruikt tijdens het onderzoek. Hoofdstuk vier wordt gebruikt voor de resultaten. In hoofdstuk vijf wordt de discussie en conclusie gevoerd. Daarna volgen de aanbevelingen en de literatuurlijst. Dit verslag wordt afgesloten met verscheidene bijlagen. De afkortingen in het verslag worden dikgedrukt en staan genoteerd in de afkortingenlijst op pagina twaalf.
2. Theoretische achtergrond
Tijdens dit onderzoek is veel aandacht besteed aan de ontwikkeling, optimalisatie en validatie van een methode om de omzettingsproducten van alcohol te kunnen detecteren in meconium. Dit is van belang om aan te kunnen tonen dat moeders alcohol hebben gedronken tijdens de zwangerschap. Alcoholgebruik tijdens de zwangerschap kan veel defecten veroorzaken in de groei van de neonaat. In de volgende paragrafen wordt de uitleg weergegeven.
2.1 Foetaal Alcohol Syndroom
Foetaal Alcohol Spectrum Disorder (FASD) beschrijft de effecten die kunnen optreden bij alcoholgebruik tijdens een zwangerschap. Zo kunnen er lichamelijke effecten, geestelijke effecten, gedragsproblemen en leerstoornissen met mogelijke levenslange implicaties optreden. De aandoening kan variëren van licht tot zeer zwaar. Bij een lichte vorm van FASD kan het kind snel overprikkeld raken, een slecht geheugen hebben en zich vaak niet goed aanpassen aan een sociale omgeving. Als het kind een groeiachterstand heeft én afwijkende gezichtskenmerken én neurologische beschadigingen is er sprake van een zware vorm. Dit wordt Foetaal Alcohol Syndroom (FAS) genoemd. FAS is permanent en irreversibel. Het heeft invloed op alle gebieden van het leven van een patiënt en van diens familieleden 1‐3.
Als het kind vroeg gediagnosticeerd wordt met FASD of FAS kan er gelijk extra hulp ingeschakeld worden in de vorm van extra aandacht van leerkrachten of een plek in het speciaal onderwijs. Zo kunnen deze kinderen zich toch tot hun volledige potentieel ontwikkelen, waardoor de kans op latere problemen behoorlijk wordt verkleind. Verder is het belangrijk dat deze kinderen in een stabiele omgeving kunnen opgroeien. Het is belangrijk om voor zoveel mogelijk rust en regelmaat te zorgen 4.
2.1.1 Uiterlijke kenmerken FAS
FAS is een stoornis, die gekenmerkt wordt door abnormale gezichtskenmerken, groeiproblemen en problemen met het centrale zenuwstelsel. In figuur 1 & 2 zijn duidelijke uiterlijke kenmerken te zien. Kinderen met FAS kunnen de navolgende karakteristieken uiterlijke kenmerken vertonen: Kleine lichaamslengte bij geboorte en/of een smalle hoofdomtrek; Gezichtsafwijkingen, zoals smalle oogopeningen, het midden van het gezicht lijkt ietwat afgeplat met een platte neusbrug en ogen die iets te ver uit elkaar lijken te staan. Bovendien zie je bij kinderen met FAS vaak overhangende oogleden met een vouwtje in de binnenhoek. De neus is plat en staat omhoog. De bovenlip is smal zonder de kenmerkende ‘Cupido‐boog’ (philtrum). De oren staan vaak laag ingeplant en de kin is klein 1‐3,5.
Figuur 1: Typische uiterlijke kenmerken FAS 3 Figuur 2: Foto 4 & 5 duidelijk afwijkend philtrum en smalle bovenlip 3
2.2 Alcohol
Bijna iedere vrouw weet dat het niet goed is om alcohol tijdens de zwangerschap te gebruiken. Veel vrouwen denken echter dat er af en toe best een glas alcohol gedronken mag worden. Er is alleen geen veilige hoeveelheid van alcoholgebruik. Gedurende de gehele zwangerschap kan alcohol schade veroorzaken aan het ongeboren kind 6. In de prenatale levensperiode wordt een belangrijk deel van de cellen van organen gevormd. Deze cellen verplaatsen zich vervolgens naar hun definitieve plaats en daar ontwikkelen ze zich verder. Alcohol kan op elk van deze processen invloed uitoefenen 6.De placenta zorgt ervoor dat alle voedingsstoffen en zuurstof worden doorgegeven van moeder aan kind. Hierdoor kan de foetus groeien en bewegen. De aanleg van de placenta begint vanaf twee weken na de bevruchting en zal rond 12 weken zwangerschap klaar zijn. De bloedstroom in de placenta komt dan op gang. Alcohol is in staat om de placenta te doordringen en in de foetale bloedsomloop te komen. Door de inname kunnen ontwikkelingsstoornissen gevormd worden. Het tast de bloedstroom aan door de bloedvaten van de placenta te vernauwen. Hierdoor kan er hypoxie optreden en kan er foetale ondervoeding ontstaan. Alcohol passeert de placenta snel en dringt door de bloed‐hersen barrière van de foetus. De alcohol wordt door de foetus omgevormd tot ethylesters
6‐ 8
.
Alcohol kan de vorming van zenuwcellen beïnvloeden door te interfereren met groeifactoren. Hierdoor wordt de celdeling beïnvloedt en dit kan daardoor schade aanbrengen aan de vorming van het embryo of de foetus. Het kan ook invloed hebben op de celadhesie. Dit zorgt ervoor dat cellen zich tijdens de groei en ontwikkeling met elkaar verbinden om te kunnen overleven en te migreren. Alcohol kan ook invloed uitoefenen op de activiteit van neurotransmitters. Hierdoor zullen bepaalde signalen niet goed doorgegeven worden 6.
Alcoholgebruik tijdens het eerste trimester kan leiden tot misvorming van organen, hart, armen en ogen. Tijdens het tweede en derde trimester kan het ervoor zorgen dat de foetus achterblijft in de groei en dat zich neurologische defecten ontwikkelen. Doordat het centraal zenuwstelsel zich gedurende de gehele zwangerschap ontwikkelt, kan alcoholgebruik daardoor op elk moment schadelijk zijn. Geen alcoholgebruik tijdens de zwangerschap is de meest veilige optie. Het is aangetoond dat moeders die in een vroeg stadium van de zwangerschap meer dan zes eenheden alcohol per dag drinken een verhoogde kans hebben op een kind met een volledige uitdrukking van
FAS. Moeders die minder drinken (een tot twee eenheden alcohol) en dat vooral in het latere
stadium van de zwangerschap doen een verhoogde kans hebben op vroeggeboortes en een te laag geboortegewicht. Er zijn verschillende risicofactoren van belang bij de beoordeling van de effecten van blootstelling van alcohol op de ontwikkeling van de hersenen van de neonaat. Zo kan het drinkpatroon, het metabolisme van de moeder, de verschillen in genetische gevoeligheid en de timing van het alcoholgebruik tijdens de zwangerschap allemaal van invloed zijn op de uiteindelijke afwijkingen van de neonaat 6,9.
2.2.1 Omzettingsproducten van alcohol
De alcohol die in drank gebruikt wordt, wordt ethanol genoemd. Ethanol is een kleurloze, vluchtige vloeistof met een sterke, typerende geur. Het is een veelgebruikt oplosmiddel en bestaat uit twee C‐ atomen, vijf H‐atomen en een OH‐groep. De OH‐groep is kenmerkend voor een alcohol 10, 11.Ethanol wordt na orale inname door het lichaam afgebroken in verschillende stoffen. Na inname komt het via het spijsverteringskanaal in de maag terecht. Daar wordt tussen de 10 en 30% van het ethanol opgenomen in het bloed. Vervolgens gaat het ethanol naar de dunne darm waar bijna al het resterende ethanol (90‐98%) wordt opgenomen door het bloed. Hierna verspreidt het zich door heel het lichaam. Vervolgens wordt het ethanol afgebroken door de lever. Ethanol wordt door drie enzymatische processen afgebroken. Het grootste deel wordt afgebroken door Alcoholdehydrogenase (ADH) in aceetaldehyde. Deze stof wordt vervolgens door Aceetaldehydedehydrogenase (ALDH) omgezet in koolzuur en water. De tweede belangrijke afbraakroute verloopt via Microsomaal Ethanol Oxiderend Systeem (MEOS). Dit systeem is verantwoordelijk voor de metabole tolerantie en voor het ontstaan van toxische metabolieten in de lever. Tot slot is er nog een non‐oxidatieve afbraak door de vetzuurethylestersynthase in Fatty Acid Ethyl Ester (FAEE) 10, 11.
In het lichaam bevinden zich vetzuren die een functionele rol spelen in de opbouw van celmembranen en die tevens dienen als brandstof voor het lichaam. Zodra deze vetzuren in aanraking komen met ethanol wordt er een ester gevormd. Dit is te zien in figuur 3. Dit wordt via de foetale bloedsomloop overgedragen aan de foetus en kunnen uiteindelijk in het meconium gedetecteerd worden 12.
+
→
+
Laurinezuur Ethanol Ethyl laurate Water2.2.2 Meconium
De eerste ontlasting van een neonaat wordt meconium genoemd. Het is een donkergroene, plakkerige ontlasting. De ontlasting ontstaat doordat het kind vruchtwater inslikt waar zich afvalstoffen en lanugo (het fijne haar dat het babylichaam bedekt) in bevindt. De bovenste cellagen van de darm komen ook in het vruchtwater terecht. Het vruchtwater wordt gefilterd en wat overblijft, vormt uiteindelijk het meconium. Het vruchtwater wordt geabsorbeerd en opnieuw in de baarmoeder gebracht wanneer de foetus plast. Deze cyclus houdt het vruchtwater in een heldere, gezonde staat tijdens de negen maanden van de zwangerschap. De cyclus van de recycling van het vruchtwater duurt ongeveer drie uur. De donkergroene kleur wordt veroorzaakt doordat het spijsverteringsstelsel slijm, gal en bloed aanmaakt. De alcohol die de moeder drinkt wordt via de foetale bloedsomloop overgedragen aan de foetus. Dit komt uiteindelijk in het meconium terecht. Het meconium kan dus goed gebruikt worden om de FAEE die de moeder aangemaakt heeft te detecteren 13, 14.
2.3 Extractiemethoden
Meconium is een lastige matrix die veel verschillende stoffen bevat. Om deze stoffen er zoveel mogelijk uit te filteren zullen er verschillende stappen gedaan worden om de FAEE uit meconium te zuiveren. Daar wordt liquid/liquid extractie en solid phase extractie voor gebruikt.
2.3.1 Liquid/Liquid Extractie
Om een bepaling te doen bij meconium via de GC moet er eerst een extractie plaatsvinden. Het principe van LLE is gebaseerd op het gebruik van twee vloeistoffen of oplossingen waarvan de ene een apolaire, meestal organische fase is en de andere een meer polaire, meestal waterige fase is. Hierbij is het de bedoeling dat de meer apolaire componenten zich in de organische laag gaan bevinden en de meer polaire componenten in de waterige laag. Dit zorgt ervoor dat de FAEE zich in de apolaire laag gaat bevinden. Het zorgt er ook voor dat de meeste wateroplosbare verontreiniging zich in de polaire laag gaat bevinden 10, 15.
Tijdens dit onderzoek werd gebruik gemaakt van hexaan en aceton. Hexaan is erg apolair en aceton is minder apolair. Dit wordt bijeengevoegd in een reageerbuis. Deze reageerbuis wordt vervolgens geschud. Hierna zal zich een evenwicht instellen tussen de polaire en apolaire componenten. Dit proces wordt meerdere keren herhaald, zodat uiteindelijk alle apolaire componenten (FAEE) naar de organische laag migreren en de meer polaire componenten naar de waterige laag. Vervolgens wordt de reageerbuis gecentrifugeerd zodat zich twee lagen gaan vormen, doordat de vloeistoffen niet mengbaar zijn. De bovenste is hexaan, doordat hexaan een lagere dichtheid heeft dan aceton. De bovenste laag zal dus verwijderd en afgedampt worden, zodat de FAEEs achter zullen blijven. Om ervoor te zorgen dat er nog meer verontreiniging wordt verwijderd, zal er ook nog een solid phase extractie worden uitgevoerd. Dit wordt in de volgende paragraaf uitgelegd 16.
2.3.2 Solid Phase Extractie
Sommige stoffen die bepaald moeten worden kunnen beter eerst gezuiverd worden uit matrices zoals meconium. Dit kan gedaan worden door gebruik te maken van SPE. Deze methode zorgt ervoor dat de monsters geconcentreerd en gezuiverd worden, zodat deze stoffen geanalyseerd kunnen worden zonder interferentie met andere stoffen. Hierdoor ontstaat er een betrouwbaardere meting. Het is een extractie methode die gebruik maakt van de fysische en chemische eigenschappen van opgeloste stoffen 17.
Bij SPE wordt gebruik gemaakt van een stationaire en een mobiele fase.
De vloeistof wordt door kolommetjes geleid. In de kolommetjes zitten korreltjes met adsorbens. Een veelvoorkomende kolom die gebruikt wordt is de reversed phase C18 kolom. De kolom is dan apolair. De loopvloeistof is dan polair. De stof die gedetecteerd zal worden is ook apolair en zal dus een grotere affiniteit hebben voor de apolaire kolom. Door te spoelen met een polaire vloeistof wordt zo alle verontreiniging weggespoeld. Om de gebonden stof uit de kolom te elueren wordt gebruik gemaakt van een apolair oplosmiddel, waarvoor het analyt een grotere affiniteit heeft dan voor de stationaire fase17.
Tijdens dit onderzoek werd echter gebruik gemaakt van silica‐aminopropyl kolommen. Hierbij werd gebruik gemaakt van de normal phase. Dit houdt in dat de kolom polair is en het eluens apolair. Deze kolommen hebben een alifatische aminopropyl groep die gebonden is aan het silica oppervlak. Dit
wordt gebruikt om de FAEE te isoleren, doordat de functionele amine‐groep geneutraliseerd wordt door de hexaan en de FAEE zo geëlueerd wordt. Dit houdt dus in dat de FAEE een grotere affiniteit heeft voor het eluens dat uit hexaan bestaat. Hierdoor zal de FAEE dus meespoelen en blijft de verontreiniging achter in de kolom. Het eluens met de FAEE zal worden opgevangen in een schone reageerbuis, zodat hier na indampen een verdere analyse op de GC mee uitgevoerd kan worden 18‐19.
2.4 Detectiemethode
Vrijwel alle monsters die voor een analytisch‐chemische analyse aangeboden worden, zijn mengsels. Het is zelden het geval dat de interesse uitgaat naar het mengsel als zodanig. Daarvoor moeten de componenten van elkaar gescheiden worden, waarna er individueel gemeten kan worden. De methode die het meest geschikt is om vluchtige stoffen zoals FAEE te scheiden is gaschromatografie. In de volgende paragraaf wordt hier meer uitleg over gegeven.
2.4.1 Gaschromatografie
De gaschromatografie is specifiek voorbehouden aan vluchtige verbindingen of verbindingen die vluchtig te maken zijn door middel van temperatuursverhoging. Het is een scheidingsmethode die berust op het verschil in kookpunt. Het bestaat uit een mobiele fase die langs een stilstaande stationaire fase stroomt. De componenten van een mengsel worden meegenomen door de mobiele fase. Doordat de monstercomponenten bepaalde interacties ondergaan met de stationaire fase, worden ze vertraagd. Als de interactiekrachten, die afhankelijk zijn van de individuele component en de fase, verschillend zijn, is er een verschil in vertraging. Dit betekent dat de componenten in het mengsel die allen gelijk zijn gestart, op een verschillend tijdstip het systeem verlaten. In dat geval is het monster in zijn bestanddelen gescheiden 20‐21.
Een GC bestaat uit verschillende onderdelen. Het eerste onderdeel is de gascylinder. Deze zorgt voor de aanvoer van de gassen. Deze cylinder kan gassen aanvoeren zoals stikstof (N₂), waterstof (H) en helium (He). De flowcontroller zorgt ervoor dat de mobiele fase met een constante snelheid door het systeem stroomt. Het tweede onderdeel is het injectiesysteem. Hier wordt het monster ingebracht. Als het een vloeibaar monster betreft, wordt deze hier ook gelijk verdampt. Vervolgens wordt het mengsel door een kolom geleidt die zich in een oven bevindt. De oven zorgt ervoor dat er een gradiënt‐ of een isocratisch programma ingesteld kan worden. De scheiding van de componenten vindt plaats in de kolom, doordat de component een evenwicht instelt tussen de stationaire‐ en de mobiele fase. De kolom zorgt voor de stationaire fase. Een component met een voorkeur voor de stationaire fase zal trager door het systeem lopen dan een stof met een voorkeur voor de mobiele fase. Hierdoor worden de componenten van elkaar gescheiden. Na de scheiding moeten de componenten gedetecteerd worden. De detector reageert op de aanwezigheid van een component en geeft een elektrisch signaal. Dit signaal wordt geregistreerd door een recorder of datasysteem in de vorm van een piek. Een grafisch plaatje waarbij de signalen als functie van de tijd zijn weergegeven, wordt een chromatogram genoemd. Het tijdstip waarop een signaal verschijnt, is een maat voor de identiteit van een component. Hierop is een kwalitatieve analyse gebaseerd. De grootte van het signaal geeft informatie over de hoeveelheid van een component en speelt dus een rol bij een kwantitatieve analyse. In figuur 4 is de GC schematisch weergegeven 20‐21. Figuur 4: Schematische weergave gaschromatograaf 22
2.4.2 Kolom
De kolom die tijdens dit onderzoek werd gebruikt is een CP‐WAX 52 CB kolom (0.50µm x 0,25mm x 30m) van Varian. WAX staat voor weak anion exchanger. Het wisselt dus negatieve ladingen uit. Het is een chemisch gebonden kolom die medium polair is. Dit houdt in dat de moleculen van de fase met elkaar zijn verbonden (crosslinking) en ook met de wand van de kolom. Dit zorgt voor een langere levensduur van de kolom en het is erg inert. De kolom scheidt de oplosmiddelen op verschil in dipool. Het scheidt apolaire componenten snel, doordat ze een klein dipoolmoment hebben. Deze komen vrijwel onvertraagd van de kolom. Componenten met een hoog polair karakter hebben een langere retentietijd door een groter dipoolmoment. De filmdikte van de kolom is 0.50µm. Dit is een dunne filmdikte, waardoor er minder piekverbreding zal optreden. De diameter van de kolom is 0,25mm. Het is een narrow‐bore kolom, die de sensitiviteit verhoogt. De lengte van de kolom is 30 meter. Deze kolom is zeer geschikt om FAEE te scheiden. Dit komt doordat vetzuren uit lange apolaire C‐ketens bestaan met daaraan een kleine polaire zuurgroep. Doordat de kolom medium‐ polair is, zullen de FAEE goed van elkaar gescheiden worden 20, 23.2.4.3 Detector
De detector is het oog van het gaschromatografisch systeem. Detectoren maken daarbij gebruik van het feit dat als een component door de detector stroomt, er een verandering optreedt in de eigenschappen van het draaggas. De detector moet voldoen aan een aantal eisen. Het moet voor een universele of selectieve bepaling gebruikt kunnen worden. Afhankelijk van de applicatie moet een detector alle chemische componenten zien die uit de kolom komen, of juist niet alle maar slechts een bepaalde groep. Het moet een grote gevoeligheid bezitten. Dat wil zeggen dat een kleine verandering in concentratie in de meetcel leidt tot een grote verandering in het meetsignaal. De herhaalbaarheid moet ook groot zijn. Een detector moet eenzelfde signaal geven als er twee identieke componenten in dezelfde hoeveelheden de detector passeren, onafhankelijk van het tijdstip van de meting 24.
Tijdens dit onderzoek werd gebruik gemaakt van een FID. Een vlamionisatiedetector is een gevoelige detector die gebaseerd is op het elektrisch geleidend vermogen van een vlam. Deze detector reageert alleen op stoffen die verbrand kunnen worden en dat zijn bijna alle organische verbindingen. Op het moment dat er een organische component verbrandt, neemt het geleidend vermogen sterk toe, door de ontstane ionen en elektronen. Dit veranderend geleidend vermogen kan gemeten worden door twee elektroden. De stroomsterkte is maatgevend voor de hoeveelheid van de component en wordt door een computer geregistreerd 25.
3. Materiaal & methoden
Tijdens dit afstudeerproject zijn verschillende methoden gebruikt. In dit hoofdstuk worden de materialen en methoden die zijn gebruikt weergegeven.
3.1 Chemicaliën
Ethyl laurate (E12:0), Ethyl myristate (E14:0), Ethyl palmitate (E16:0), Ethyl palmitoleate (E16:1) Ethyl stearate (E18:0), Ethyl oleate (E18:1), Ethyl linoleate (E18:2), Ethyl linolenate (E18:3), Hexaan en Aceton zijn verkregen bij Sigma‐Aldrich (st. Louis, USA). Ethyl heptadecanoate (E17)(IS) is verkregen bij TCI Europe.
3.2 Instrumenten
De gaschromatograaf is van de Shimadzu GC‐2010 serie. De auto‐ injector die gebruikt wordt is een AOC‐20i van Shimadzu. Het besturingsprogramma is van GC Real Time Analysis. Er werd geïnjecteerd met een micro‐syringe van SGE Analytical Science met een volume van 10µl. De kolom die gebruikt wordt is een CP‐WAX 52 CB kolom met een lengte van 30 meter, een doorsnede van 0,25 millimeter en een deeltjesgrootte van 0,50 µm. De SPE kolommen die gebruikt werden zijn van Agilent Technologies, Bond Elut® NH2 met een volume van 1 milliliter/100 milligram. Het afdampblok wat gebruikt werd is van Liebisch. De centrifuge die gebruikt werd is van het merk Hettich Universal R. De pipetten die gebruikt werden zijn positive displacement pipetten van het merk Gilson. Deze pipetten worden twee maal per jaar gekalibreerd.3.3 Stockoplossingen, standaarden en controles
De bereidingen van de academische standaardreeksen staan vermeld in het tussentijdse verslag. De standaardreeksen voor het meconium werden verder bereidt uit de stockoplossingen van 500µg/ml. Dit werd voor elke ethylester bereidt. Dit resulteerde in zes stockoplossingen. Het oplosmiddel wat hiervoor gebruikt werd is hexaan. Hier lossen alle ethylesters goed in op. Van elke stockoplossing, behalve de IS werd een standaardreeks gemaakt van 1, 3, 6, 9 en 12µg/ml. De 1µg/ml werd gebruikt om de LLOQ te bepalen. 3 en 12µg/ml werden als standaarden gebruikt. Van de 6 en 9µg/ml werden 2 verschillende QC’s gemaakt. De stockoplossingen werden bewaard in de koelkast. Het meconium van verschillende neonaten werd gepouled en de standaarden en QC’s werden gespiked met 100µl van de desbetreffende sterkte FAEE. De blanco’s werden ook gepouled en daar werd alvast een IS aan toegevoegd. Deze werden vervolgens ingevroren bij ‐20˚ C. Bij de uitgangsmethode van het artikel werd gebruik gemaakt van een standaardreeks van 1, 2, 4, 6, 8, 10 en 20 µg/ml. Hier is de uiteindelijke validatie op gebaseerd.3.4 Liquid Liquid Extractie
Om de FAEE te extraheren uit het meconium werd er gebruik gemaakt van LLE. De reageerbuizen waren al gevuld met 500mg meconium en gespiked. De buizen werden gedurende 15 minuten ontdooid op kamertemperatuur. Vervolgens werd er 50µl van de IS aan de standaarden, QC’s en patiëntmonsters toegevoegd. Er werd achtereenvolgend aan elke reageerbuis 3,6 milliliter hexaan en 1,4 milliliter aceton toegevoegd met een positive displacement pipet. Dit werd eerst goed gemengd met de vortex. Vervolgens werden de oplossingen gedurende 20 minuten gecentrifugeerd op 4°C
met 3500 rpm. Er ontstaan dan 2 lagen. Aceton heeft een hogere dichtheid dan hexaan, dus dit is de onderste laag. De bovenste laag bevat hexaan. Het aceton zorgt ervoor dat de FAEE zich niet meer aan het meconium zal hechten. Alle lipofiele stoffen zullen zich gaan verplaatsen naar de apolaire fase. De apolaire fase is de laag die hexaan bevat. Deze laag bevat de FAEE en werd overgebracht in een schone reageerbuis. Dit werd ingedampt in het afdampblok. Vervolgens werd hier 1 milliliter hexaan aan toegevoegd, zodat er nog een SPE op uitgevoerd kon worden.
3.5 Solid Phase Extractie
De kolommen die gebruikt werden zijn normal phase silica‐aminopropyl kolommen. De kolommen hadden een capaciteit van 1 milliliter/ 100 milligram. De kolommen werden eerst geconditioneerd met 1 milliliter hexaan. Dit werd opgevangen in een reageerbuis en verwijderd. Daarna werd het monster op de kolom aangebracht en opgevangen in een schone reageerbuis. Vervolgens werd er twee maal gespoeld met 1 milliliter hexaan om ervoor te zorgen dat alle in water oplosbare verontreinigingen aan de kolom hechten. Deze 3 milliliter werd opgevangen en ingedampt in het afdampblok. Dit werd vervolgens opgelost in 150µl hexaan en geïnjecteerd in de GC.
3.6 GC‐FID instellingen
De uitgangsmethode om de GC in te stellen is gebaseerd op het artikel “Population baseline of meconium fatty acid ethyl esters among infants of nondrinking women in Jerusalem and Toronto” (Chan et al). In onderstaand schema zijn de instellingen te zien die zijn gebruikt. Tabel 1: Uitgangsmethode GC instellingen GC instellingen Draaggas Stikstof (N₂) Make‐up gas N₂/air 25,0ml/min Kolom CP‐WAX 52 CB kolom(0.50μm x 0,25mm x 30m) van Varian Detectie Flame Ionisation Detector (FID) op 300⁰C Voordruk 100 kPa Splitverhouding 25 Injectietemperatuur 260⁰C Injectievolume 2μL Injectie modus Split gedurende 0,75 minuten, daarna splitless Temperatuurprogramma 2 minuten op 50⁰C, 40⁰C per minuut ophogen naar 215⁰C, 15 minuten op 215⁰C, 30⁰C per minuut ophogen naar 250⁰C, 17,72 minuten op 250⁰C (event. temp.verlagen i.v.m. maximale isotherme temp. kolom) Totale tijd enkele run: 40 minuten
3.7 Optimaliseren van de methoden
Er is onderzocht of de uitgangsmethode met de GC‐FID instellingen uit het artikel nog aangepast moest worden. Dit is getest door verschillende parameters te veranderen om een zo goed mogelijke resolutie met een zo kort mogelijke retentietijd te verkrijgen. De uitkomsten hiervan zijn terug te lezen in het tussentijdse verslag.
3.8 Validatie
Het valideren van een methode houdt in dat er wordt onderzocht of de methode aan vooraf gestelde eisen voldoet en dus betrouwbaar is. Deze eisen zijn gebaseerd op een procedure die door het laboratorium van de Apotheek gemaakt is. Deze procedure is voor het grootste gedeelte weer gebaseerd op ‘Guideline for submitting samples and analytical data for methods validation’ van Food and Drug Administration. Als aan deze eisen wordt voldaan kan gezegd worden dat de methode juist ontwikkeld is en dat het resultaat dat verkregen wordt na een analyse betrouwbaar is. Dit resultaat is namelijk een benadering van de werkelijke waarde. De afwijking wordt aangegeven met validatie‐ parameters.
Doordat de piekhoogte van de E12:0 en E14:0 erg bleef fluctueren is besloten om deze ethylesters buiten beschouwing te laten voor de validatie. Deze ethylesters bevinden zich ook in verschillende concentraties in het blanco meconium. Dit is dus geen goede graadmeter om maternaal chronisch alcoholgebruik vast te stellen. Dit is terug te zien in bijlage II.
Vervolgens is er alleen verder gewerkt met E 16:0, E 18:0, E 18:1 en E 18:2. Deze ethylesters geven een recovery boven de 90%. Er is een gedeeltelijke validatie uitgevoerd, doordat er maar een beperkte hoeveelheid aan meconium leverbaar was. Tijdens de validatie is de lineariteit, carryover,
LLOQ, reproduceerbaarheid en het matrixeffect onderzocht.
Om de lineariteit te bepalen is er gebruik gemaakt van 2 standaarden. Dat zijn 3 en 12µg/ml. Hierdoor zal de ijklijn altijd lineair verlopen. De lineariteit was niet heel erg van belang. Het is een semi‐kwantitatieve methode waarbij alleen een afkapwaarde wordt vastgesteld. Tijdens het bepalen van de lineariteit bij de academische standaarden is al gebleken dat de ijklijn in ieder geval tot 50µg/ml lineair verloopt. Dit is een erg hoge standaard die niet teruggevonden zal worden bij patiëntenmateriaal. De lineariteit van de academische standaarden is terug te vinden in het tussentijdse verslag. Het was belangrijker om een afkapwaarde vast te stellen. Zodra de monsters zich boven de afkapwaarde bevinden wordt dit als positief geregistreerd.
Het carryover effect werd bepaald door 2 blanco’s na de hoogste standaard te injecteren. Deze blanco’s werden dan vergeleken met de blanco die aan het begin van de reeks voor de hoogste standaard werd geïnjecteerd. In bijlage III zijn de chromatogrammen van de lineariteit en het carryover effect te zien.
De LLOQ werd bepaald door te starten met 3 en 4µg/ml in vijfvoud. Deze sterktes zijn geschat aan de hand van de academische ijklijn. De RSD mag bij de LLOQ maximaal 20% zijn. De 3 en 4µg/ml weken veel minder af. Hierdoor werd de LLOQ verlaagd naar 1µg/ml. De chromatogrammen zijn terug te zien in bijlage IV.
Om de reproduceerbaarheid te testen werden QC I en QC II in duplo gemeten gedurende 6 dagen. De
QC’s werden elke dag opnieuw bereid en gemeten. De reproduceerbaarheid is de mate van
overeenstemming tussen resultaten die onder wisselende meetomstandigheden (verschillende dagen) zijn verkregen. De QC’s werden in duplo gemeten. Als de duplo’s minder dan 10% variëren worden de QC’s in enkelvoud gemeten tijdens elke reeks na de validatie. Variëren de duplo’s meer dan 10%, dan wordt dit tijdens een reeks in duplo gemeten. Dit is te zien op de chromatogrammen van bijlage V.
Het matrixeffect geeft aan of de matrix van invloed is geweest op het analytisch signaal wat verstoord kan worden door de aanwezigheid van andere stoffen. Bij het bepalen van eventuele matrixeffecten wordt de methode van Matuszewski 26 gebruikt. Dit houdt in dat beide QC’s in duplo worden opgewerkt. Dit werd gedaan door de academisch opgewerkte QC’s te injecteren. Deze werd gevolgd door de QC’s waarbij de FAEE pas na extractie en voor het indampen werd toegevoegd. Vervolgens werden de QC’s geïnjecteerd waar de FAEE al vanaf het begin werd toegevoegd. In bijlage VI zijn er een paar chromatogrammen te zien.
Na de gedeeltelijke validatie werden de monsters opgewerkt en geïnjecteerd. De chromatogrammen hiervan zijn terug te vinden in bijlage VII.
4. Resultaten
In dit hoofdstuk worden alle resultaten weergegeven. In het eerste gedeelte worden de resultaten uit de stageperiode kort besproken. Vervolgens wordt uitgebreid ingegaan op de resultaten van de validatie met meconium.
4.1 Uitkomsten academische reeksen
Tijdens het eerste gedeelte van de stage is vooral veel aandacht besteedt aan de optimalisatie van de methode. De retentietijden van de verschillende ethylesters werden bepaald en het programma van de GC werd zo ingesteld dat er een goede resolutie werd verkregen. De chromatogrammen hiervan zijn terug te vinden in het tussentijdse verslag. Tijdens de injecties in duplo is gebleken dat de recovery van de E 12:0 en de E 14:0 erg varieert. Dit kan komen doordat dit de meest vluchtige ethylesters zijn en dus ook sneller vervluchtigen. Om te controleren of de verschillen kunnen komen door de auto‐ injector is de reproduceerbaarheid getest. Er was weinig verschil in duplo’s te zien en de RSD bleef onder de 5%. Dit is te zien in tabel 2. De fluctuatie kon dus niet door de auto‐injector veroorzaakt worden. De verschillen konden dus alleen maar veroorzaakt worden door de voorbewerking. Om te onderzoeken of er veel verloren ging tijdens het indampen werden directe injecties zonder indampen vergeleken met injecties waarbij wel werd ingedampt. Hierbij lag de recovery tussen de 92% en de 113%. De E 12:0 had de laagste recovery. Daar gaat dus wel iets van verloren tijdens het indampen. Dit is echter een miniem verschil, dus dit kon ook uitgesloten worden. De uitkomsten hiervan zijn te zien in tabel 2. De fluctuatie kon dus alleen maar veroorzaakt worden de SPE. Om dit te onderzoeken werden directe injecties zonder indampen vergeleken met injecties waarbij wel was ingedampt en waar een SPE op was uitgevoerd. Er werden daarvoor kolommen gebruikt van Waters. Dit resulteerde voor bijna alle ethylesters in een recovery van ongeveer 95%. De E 12:0 had echter een recovery van 27% en de E 14:0 had een recovery van 75%. Dit was dus de oorzaak van de fluctuatie in de recovery van de ethylesters. Tabel 2: Overzicht uitkomsten academische reeksen Uitkomsten academische reeksen FAEE/component RSD Repro. 50µg/ml Rec. tussen directe en ingedampte injectie 50µg/ml Rec. tussen ingedampte SPE en directe injectie 50µg/ml E 12:0 3,7% 92,2% 27,3% E 14:0 4,4% 108,5% 75,5% E 16:0 4,3% 110,7% 96,8% E 16:1 3,2% 110,4% 93,4% E 18:0 4,1% 112,4% 101,7% E 18:1 3,6% 114,1% 99,1% E 18:2 3,8% 111,8% 98,8% E 18:3 3,7% 113,1% 96,1%Om te onderzoeken of dit aan de SPE kolom zou kunnen liggen zijn er ook nog kolommen besteld van BondElut. Hierbij werd onderzocht welke kolom het hoogste rendement zou opleveren. De uitkomsten zijn te zien in figuur 5. Daar is te zien dat de kolommen van BondElut het hoogste percentage aan rendement leveren.
Recovery van de respons 20µg/ml
0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0% 100,0% 120,0% E 12:0 E 14:0 E 16:0 E 16:1 E 17:0 I.S. E 18:0 E 18:1 E 18:2 E 18:3 FAEE R ec o ver y Waters BondElut Figuur 5: Recovery respons verschillende SPE kolommen
Tijdens dit onderzoek is gebruik gemaakt van een uitgangsmethode die staat beschreven in het artikel “Population baseline of meconium fatty acid ethyl esters among infants of nondrinking women in Jerusalem and Toronto”. Er zijn echter nog wel een aantal parameters onderzocht. Zo is er onderzocht of de gevoeligheid verhoogd kan worden door de splitverhouding te verlagen van 25 naar 12,5. Er is een drukpuls toegevoegd en de plungerspeed werd verlaagd. Deze wijzigingen hadden echter weinig effect. De liner, naald en het septum werden vervangen. Hierdoor werd het systeem gelijk gevoeliger en kon er ook iets lager gemeten worden. Er is ook onderzocht of de LLOQ uit het artikel behaald kon worden. In het artikel werd deze gesteld op 1 µg/ml. Uit dit onderzoek kwam naar voren dat de recovery van alle ethylesters, behalve E 12:0 en E 14:0 rond de 100% lag. De LLOQ uit het artikel kan bij een academisch opgewerkte standaard behaald worden. Dit houdt in dat het systeem gevoelig genoeg is om kleine hoeveelheden ethylesters te detecteren. Om te onderzoeken of er sprake is van carryover werd de standaard van 50 µg/ml twee maal geïnjecteerd. Na deze injecties werd alleen hexaan geïnjecteerd. Zo kon onderzocht worden of de ethylesters van de 50 µg/ml werden overgedragen door het injectiesysteem aan de blanco waar alleen hexaan in zat. Dit was niet het geval. De standaardreeks die uiteindelijk gebruikt wordt bij de “werkelijke” monsters zal van 1 tot en met 20 µg/ml gemeten worden. Hierdoor zal er in ieder geval geen sprake zijn van een carryover effect.
4.2 Validatie
Nadat de recovery van de E12:0 en de E14:0 in meconium erg wisselend was, is besloten dat deze ethylesters buiten beschouwing worden gelaten. Deze ethylesters komen namelijk van nature ook voor in het menselijk lichaam. Er is eerst nog onderzocht hoe hoog de recovery was tussen een direct academisch opgewerkte injectie en een injectie van meconium die gespiked en geëxtraheerd werd. De uitkomsten zijn te zien in tabel 3. Vervolgens kon er gestart worden met de validatie van de ethylesters uit het artikel “Population baseline of meconium fatty acid ethyl esters among infants of nondrinking women in Jerusalem and Toronto” (Chan et al). De ethylesters die hier gebruikt werden zijn: ethylpalmitate ( E 16:0), ethylstearate ( E 18:0), ethyloleate ( E18:1) en ethyllinoleate ( E 18:2). Tabel 3: Recovery tussen directe en gespikete meconium 40µg/ml FAEE 40µg/ml directe injectie FAEE 40µg/ml injectie meconium FAEE Height (counts) Height IS (counts) Respons Height (counts) Height IS
(counts) Respons Recovery
E 16:0 15782 3215 4,909 17298 3767 4,592 94%
E 18:0 9453 3215 2,940 10750 3767 2,854 97%
E 18:1 9520 3215 2,961 10840 3767 2,878 97%
E 18:2 7965 3215 2,477 8953 3767 2,377 96%
4.2.1 Lineariteit
De lineariteit werd bepaald door 2 standaarden. Standaard I bevat een sterkte van 3µg/ml en standaard II bevat een sterkte van 12µg/ml. Het is een semi‐kwantitatieve methode. Dit wordt dan gebruikt als screening op de aanwezigheid van ethylesters. Er werd gebruik gemaakt van de Interne Standaard methode. Deze methode heeft als voordeel dat de grootte van het injectiemonster niet bekend en constant hoeft te zijn. Dit wordt dan gecorrigeerd door de interne standaard.
Tabel 4: Lineariteit Ethylpalmitate
Conc. Height Height IS Conc. Deviation Recovery
(Theor.) (counts) (counts) (gemeten) (%) (%)
Blanco (zonder IS) 0 0‐monster (met IS) 0 134 794 0,346 std 1 3,301 735 986 3,301 6 106 std 1 duplo 3,301 691 970 3,22 1 101 std 2 13,205 2693 986 13,205 0 100 std 2 duplo 13,205 2580 955 13,128 ‐1 99 Tabel 5: Gestelde eisen lineariteit Ethylpalmitate
Waarde Eis Voldoet ?
Richtingscoëfficient 0,203553 Intercept 0,034186 Correlatiecoëfficient r 0,999742 0,995 JA Regressiecoëfficient (r2) 0,999485 0,99 JA F‐test 5819,424 10,128 JA Grubbs' uitbijtertest 1,493106 < 1,71 JA
