Citation
Grauss, R. W. (2008, January 17). Regenerative medicine in cardiovascular disease: from tissue enginering to tissue regeneration. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/12556
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/12556
Note: To cite this publication please use the final published version (if
applicable).
SAMENVATTING, CONCLUSIES EN TOEKOMSTPERSPECTIEVEN
205206
SAMENVATTING
De algemene introductie in Hoofdstuk 1 van dit proefschrift geeft een overzicht van het nieuw verschenen veld van de regeneratieve geneeskunde en haar verschillende technologische gebieden. De hedendaagse aanpak van hartklepreparaties en -vervanging door mechanische en biologische protheses, evenals hun beperkingen, worden besproken.
Tevens worden het recente gebruik van (stam)cellen in de behandeling van ischemische hart- ziekten, samen met een verscheidenheid van potentiële celtypes besproken.
In Deel I van dit proefschrift werden verschillende methoden om complete acellulaire varkens- en rattenaortaklep-scaff olds, met als doel een biologische vervanging, te creëren welke de normale functie kan terugbrengen, onderhouden of verbeteren, aan onderzoek onderworpen.
Daarnaast werd het in vivo gedrag van deze kleppen bestudeerd in een rattenmodel. Deel II van dit proefschrift bestudeerde vervolgens het in vivo gedrag en de functionele verbetering na transplantatie van verschillende humane celtypes in een diermodel van het acute myocardin- farct. Bovendien werd de uitvoerbaarheid van het combineren van celtherapie met gentherapie in dit zelfde model bestudeerd. Ten slotte werden in Deel III verschillende methodes voor het phenotyperen van het muizenhart besproken en vergeleken.
D e el I
In Hoofdstuk 2 hebben we gekeken naar de histologische veranderingen in de samenstelling van de extracellulaire matrix (ECM), in de varkensklep, geïnduceerd door twee recent beschreven celextractie-methoden; een niet-ionair detergent Triton X-100 en een enzymatische trypsine- decellularisatie methode. (Immuno-)histochemie liet zien dat trypsine-behandeling resulteerde in een fragmentatie en distorsie van de elastine fi bers. Veranderingen in de collageen distributie werden geobserveerd in beide groepen. Een bijna complete uitwas van glycosaminoglycanen en chondroïtinesulfaat werd gezien bij beide methoden, met een kleinere glycosaminoglycanen- reductie in de trypsine-groep. Bovendien resulteerden beide behandelingen in een aanzienlijke uitwas van de adhesie-moleculen laminine en fi bronectine. Daarnaast werd de mogelijkheid van productie van ECM-componenten door in vitro bezaaide cellen bestudeerd. Gekweekte en gezaaide, Van Willebrand factor positieve endotheelcellen waren in staat om laminine, fi bronectine en chondroïtinesulfaat te produceren; bestanddelen welke verloren waren gegaan gedurende de decellularisatiebehandeling.
In Hoofdstuk 3 hebben we een 2-staps-detergent-enzymatische extractiemethode ontwikkeld, bestaand uit sodium dodecyl sulfaat (SDS) in combinatie met RNase and DNase, om complete acellulaire rattenaortaklep-conduits te produceren. Tegen onze verwachting in faalden eerder
207 beschreven methoden om de grotere varkensaortakleppen te decellulariseren in het verwijde-
ren van de cellen uit de kleinere en compactere rattenaortakleppen.
Onze nieuwe decellularisatieprocedure resulteerde in een compleet verlies van alle cellulaire structuren uit de complete klep-conduit, met alleen minimale histologische schade aan de ECM.
Daarnaast werden transplantatie-experimenten uitgevoerd in een heterotoop ratten aortaklep- implantatiemodel. Bij deze experimenten werden 4 verschillende groepen dieren geïncludeerd, bestaande uit cellulaire allogene (n = 4), acellulaire allogene (n = 4), cellulaire syngene (n = 3) en acellulaire syngene (n = 3) kleptransplantaties. Na 21 dagen waren alle uitgenomen cellulaire allograft klepbladen gedeformeerd en gezwollen, met ernstige schade aan de elastine en colla- geenfi bers, en een verlies van chondroïtine sulfaat. De morfologie en ECM samenstelling van de gedecellulariseerde allogene en syngene conduits daarentegen, leek bijna normaal. Interessant was dat in zowel de acellulaire allogene als syngene klepbladen ingroei van gladde-spiercel actine-positieve intimacellen afkomstig uit de anastomosale overgang plaatsvond, welke in staat waren om de ECM moleculen chondroïtinesulfaat en fi bronectine te produceren.
In Hoofdstuk 4 lag de nadruk op het karakteriseren van de immuunreactie tegen cellulaire en acellulaire aortaklepallografts, en het correleren van deze resultaten aan de structurele schade.
Rattenaortaklep-conduits werden gedecellulariseerd volgens een 2-staps-detergent-enzymati- sche extractiemethode, eerder beschreven in Hoofdstuk 3. Cellulaire allogene (n = 8), acellulaire allogene (n = 8) en syngene (n = 8) aortaklep-conduits werden daarna geplaatst in de aorta descendens gedurende 7 (n = 4) of 21 (n = 4) dagen. Immuno-histochemische analyse liet een forse infl ux van CD8+ T-lymfocyten en CD68+ macrofagen zien, begeleid door apoptose van de interstitiële cellen, 1 week na transplantatie van cellulaire allograftkleppen, gevolgd door een uitgebreide fragmentatie van de collageenmatrix na 3 weken. Daarentegen resulteerde decel- lularisatie in een afwezige cellulaire infi ltratie na 1 week met preservatie van de collageen matrix na 3 weken. Daarbij liet chemische analyse een stijging zien in de hoeveelheid gedenatureerd collageen na decellularisatie (7.8 ± 0.7 % vs. 12.0 ± 1.2 %, p < 0.05), wat niet toenam 3 weken na transplantatie (12.0 ± 1.8 %, p = ns), in tegenstelling tot de stijging van gedenatureerd collageen na cellulaire aortakleptransplantatie (12.3 ± 1.5 %, p < 0.05).
D e el I I
In Hoofdstuk 5 hebben we de haalbaarheid van het gebruik van humane mesenchymale stam- cellen (hMSC) uit patiënten met ischemische hartziekten (IHD) als celtherapie voor het acute myocardinfarct onderzocht in een immuun-gecomprimenteerd NOD/scid muismodel voor het acute myocardinfarct. hMSCs uit patiënten met IHD gelabeld met het green fl uorescent protein (GFP) (hMSC groep: n = 12) of alleen medium (Medium groep: n = 14), werden geïnjecteerd in
208 het geïnfarceerde myocard van deze muizen. Sham geopereerde dieren werden gebruikt als controlegroep (n = 10). Twee en veertien dagen na de operatie, werden cardiale anatomie en functie serieel onderzocht met behulp van een proefdier 9.4-T magnetic resonance imager (MRI). Op dag 2 liet gadolinium-DPTA delayed-enhancement MRI geen verschil in infarctgrootte zien tussen de hMSC and Medium groepen (33 ± 2 % versus 36 ± 2 %; p = ns), met een vergelijk- bare stijging van de linker-kamervolumina (LV), en vermindering van de ejectiefractie (EF) in beide infarctgroepen. Daarentegen was op dag 14 de EF signifi cant hoger in de hMSC groep dan in de medium groep (24 ± 3 % versus 16 ± 2 %; p < 0.05). Na twee weken liet immuno-histo- logische analyse een innestelingsratio van 4.1 ± 0.3 % van de gelabelde hMSCs zien. Deze cellen waren positief voor het humaan specifi eke endotheelcel-specifi eke eiwit vWF (16.9 ± 2.7 %) en de gladde spiercel (SMC) marker ASMA (78.3 ± 4.0 %), maar niet voor de hoog specifi eke gladde spiercel marker smMHC of de cardiomyocyt-specifi eke eiwitten α-sarcomeric actin, cardiac Tro- ponin I en myosin heavy chain. Daarbij was de totale bloedvat densiteit in het litteken en grens- gebieden signifi cant hoger in de hMSC groep (610 ± 78 / mm2 en 810 ± 68 / mm2 respectievelijk) dan in de Medium groep (347 ± 56 / mm2 en 565 ± 50 / mm2 respectievelijk; beide p < 0.05). Ten slotte lieten bepalingen van de wanddikte zien dat hMSC injectie resulteerde in een signifi cante reductie van het dunner worden van de infarctwand (Medium groep: 18,0 ± 2,1 × 10-2 mm, hMSC groep: 30,5.0 ± 2,9 × 10-2 mm; p < 0,05).
In Hoofdstuk 6 hypothetiseerden wij dat het geforceerd tot expressie brengen van de belangrijke cardiomyogene transcriptiefactor myocardine in hMSCs, hun potentiële therapeutische eff ect zou kunnen verbeteren. hMSC getransfecteerd met hetzij GFP en myocardine (hMSCmyoc, n = 10), hetzij GFP en een lege vector (hMSC, n = 10), werden geïnjecteerd in het acuut geïnfarceerde immuun-gecomprimenteerde NOD/scid muizenhart.
Medium (n = 12) geïnjecteerde en sham (n = 12) geopereerde dieren werden gebruikt als con- trolegroepen. Gedetailleerde metingen werden verricht op dag 2 en 14 door middel van een 9.4 T MRI, en op dag 15 met behulp van invasieve LV druk-volume metingen. Op dag 14 was de EF in beide met cellen behandelde groepen gepreserveerd vergeleken met de met medium behandelde groep; daarbij resulteerde hMSCmyoc injectie ook in lagere LV eind-systolische en eind-diastolische volumes (P < 0,05), wat niet werd geobserveerd na hMSC injectie alleen. Ver- der lieten druk-volume metingen signifi cant betere belastingonafhankelijke parameters zien van systolische en diastolische functie na hMSCmyoc injectie, vergeleken met hMSC behandeling alleen. Kwantitatieve bepaling op dag 15 demonstreerde tevens een signifi cant hogere innes- telingsratio in de hMSCsmyoc groep (5,8 ± 0,5 %) vergeleken met de hMSC groep (4,2 ± 0,3 %, p < 0,05). Bovendien brachten deze cellen een aantal cardiomyocyt specifi eke markers tot expressie, niet geobserveerd in de hMSC groep. Tenslotte was op dag 15 de totale bloedvatden- siteit in het littekengebied signifi cant hoger in de hMSC en hMSCmyoc groepen (11,8 ± 2,1 %, and 11,3 ± 1,3 %; p = ns), dan in de Medium groep (5,9 ± 0,9 %; p < 0,05).
209 In Hoofdstuk 7 onderzochten we de mogelijkheid of volwassen humane epicardiale cellen
(hEPDCs) een deel van hun embryonale programma opnieuw zouden kunnen herhalen wan- neer ze worden getransplanteerd in het ischemische myocard, om zo te kunnen dienen als een nieuw soort voorlopercel in de cardiale celtherapie. hEPDCs werden geïsoleerd uit humaan atriumweefsel en geïnjecteerd in een immuun-gecomprimenteerd NOD/scid muismodel voor het acute myocardinfarct. Analyse met 9.4T MRI liet zien dat de EF signifi cant hoger was na hEPDC injectie na 2 (n = 22) en 6 (n = 15) weken, in vergelijking met injectie van alleen medium (n = 24 en n = 18 respectievelijk). Bovendien waren eind-systolische en eind-diastolische volu- mina signifi cant kleiner in de EPDC-geïnjecteerde groep dan in de medium-geïnjecteerde groep op beide tijdspunten. Dit ging samen met een verhoogde overleving, een verhoogde vaatden- siteit en verhoogde wanddikte na 2 weken. Daarnaast hebben we ook een massale innesteling laten zien van geïnjecteerde hEPDCs na 2 weken, welke α-SMS actine, van Willebrand Factor, sarcoplasmatisch reticulum Ca2+-ATPase en SCN5a tot expressie brachten, maar geen strikte cardiomyocyt markers. Maar, ook al waren na 6 weken overleving en wanddikte nog steeds verhoogd, er konden slechts weinig hEPDCs worden teruggevonden.
D e el I I I
Ten slotte hebben we, in Hoofdstuk 8, een directe vergelijking uitgevoerd tussen twee verschil- lende methoden, die beide in staat zijn tot het cardiaal fenotyperen van muismodellen voor het acute myocardinfarct onder fysiologische gesloten-thorax omstandigheden. Namelijk, magne- tic resonance imaging (MRI) en druk-volume relaties door middel van de conductantie katheter (CK). Na permanente occlusie van de linker hartkransslagader, werden LV eind-diastolisch volume (EDV), eind-systolisch volume (ESV) en EF bepaald door middel van MRI (dag 14) en CK (dag 15). We vonden een gemiddelde tot sterke lineaire correlatie voor het EDV (CK = 0,62MRI+9,71 (R = 0,61)), ESV (CK = 0,62MRI+11,35 (R = 0,72)) en EF (CK = 0,80MRI-1,78 (R = 0,81)). Daarnaast von- den we na het analyseren van verschillende groepen (Sham geopereerde dieren en kleine of grote myocardinfarcten) dat volumina en EF stelselmatig lager uitvielen bij de CK dan bij de MRI, maar dat groepsverschillen evident waren voor beide technieken. Bovendien liet receiver-ope- rating characteristics (ROC) curve analyse een goede sensitiviteit en specifi citeit zien voor beide technieken, met superieure resultaten voor de MRI. Daarnaast werden de complementaire addi- tionele kenmerken van MRI en CK en hun waarde voor onderzoek naar hartfalen besproken.
210
CONCLUSIES
• Chemische decellularisatie door middel van Triton of trypsine resulteert in veranderingen in de ECM samenstelling, wat kan leiden tot problemen in klepfunctionaliteit en celgroei en migratie. Toekomstige studies moeten meer de nadruk leggen op de eff ecten van chemisch geïnduceerde celextractie op de ECM van de overgebleven scaff old, en op de potentiële in vitro of in vivo restoratie van verloren bestanddelen.
• Hoewel procedures om cellen van de hun omringende matrix los te maken onvermijdelijk gepaard gaan met een bepaalde mate van schade aan de ECM, waren de veranderingen die werden geobserveerd na de 2-staps-detergent-enzymatische extractiemethode, bestaande uit sodium dodecyl sulfaat in combinatie met RNase en DNase, veel kleiner dan de schade veroor- zaakt door de immuunreactie van de ontvanger.
• De 2-staps-detergent-enzymatische extractiemethode in aortaklep-allografts van de rat resulteert in een verzwakking van de cellulaire immuunreactie, gepaard gaande met een histo- logische, maar geen chemische preservatie van de collageen matrix.
• Mesenchymale stamcellen van patiënten met ischemische hartziekten kunnen zich nestel- len in het geïnfarceerde muizenmyocard en preserveren de LV functie 2 weken na een acuut myocardinfarct, mogelijk door het verbeteren van de littekendoorbloeding en reductie van de wandverdunning.
• Het geforceerd tot expressie brengen van de cardiomyogene transcriptiefactor myocardine in mesenchymale stamcellen van patiënten met ischemische hartziekten verbetert de LV func- tie en vermindert ook de LV remodeling. Dit eff ect vindt mogelijk plaats door een verbeterde innesteling en diff erentiatie in een cardiomyocyt-gelijkend fenotype.
• Volwassen humane EPDCs preserveren de cardiale functie en verminderen de ventriculaire remodeling na transplantatie in het ischemische muizenmyocard op de korte, maar ook op de lange termijn, en zijn veelbelovende kandidaten voor de klinische applicatie in het humane geïnfarceerde hart.
• Hoewel Magnetic resonance imaging (MRI) en druk-volume relaties door de conductantie katheter (CK) beide zeer waardevol zijn voor het evalueren van LV volumina en functie in mui- zen-myocardinfarct studies, blijft MRI aanbevolen voor longitudinale studies, voor accurate absolute volumetrische metingen en wanneer anatomische informatie essentieel is. Daarnaast heeft de CK de mogelijkheid om geavanceerde analyses te doen naar LV functie, mechanica en energetica.
TOEKOMSTPERSPECTIEVEN
211Tissu e engineering binnen de regeneratieve geneeskunde
De ideale kunstklep is een niet-obstructieve, niet-trombogene weefselvervanging welke de totale levenduur van de patiënt meegaat, in staat is tot remodeling en reparatie van cumula- tieve schade, en de potentie heeft om mee te groeien in een groeiende patiënt. Ook al heeft het concept van tissue engineering laten zien veelbelovend te zijn, er zijn nog vele problemen om opgelost te worden. De mechanismen van hartklepmorfogenese gedurende de embryonale ontwikkeling zijn op hoog niveau gereguleerd en complex, en beginnen nog maar net begrepen te worden. Ook al is er al veel kennis over de vasculaire wandcellen uit de grote vaten, weinig is nog bekend over endotheliale en interstitiële klepcellen, welke essentieel zijn in hartklep tissue engineering. Een interessant gegeven is dat het gebruik van stam- of voorlopercellen voor het bezaaien van tissue engineering-kleppen het probleem van het gebruik van een voor- geselecteerd celfenotype kan voorkomen. Toekomstige studies zouden daarom meer de nadruk moeten leggen op het gebruik van stamcellen in dit nieuwe gebied binnen de regeneratieve geneeskunde. Een ander punt van zorg is de functionele rol van weefsel en ECM elementen die verloren gaan na de celextractie-protocollen. Momenteel is het nog onbekend of deze ele- menten echt moeten worden vervangen in deze kleppen. Daaraan toegevoegd zouden meer ontwikkelde technieken, die cellen kunnen verwijderen van het biologische weefsel zonder schade aan te brengen in het overgebleven weefsel, moeten worden onderzocht. Verder, voor de productie van een mogelijk ‘off -the-shelf’ product, moeten wetenschappers zich meer gaan concentreren op het gebruik van allogene of zelfs xenogene weefsels of cellen, in combinatie met cellulaire of moleculair biologische modifi caties om een gastheerspecifi eke immuunreactie te voorkomen. Ten slotte, voordat hartkleppen geproduceerd met tissue engineering technie- ken klaar zijn voor de klinische arena, moeten ze sommige, zo niet alle, biologische kenmerken en functies van een normale klep kunnen imiteren. Daarnaast moeten ze zijn gevalideerd in toepasselijke in vitro en in vivo modellen.
Celtherapie binnen de cardiale regeneratieve geneeskunde
Ook al is het veld van de celtherapie momenteel onderwerp van intensief onderzoek, met vele doorbraken reeds bereikt, toch zijn er nog een hoop twistpunten. Het huidige proefschrift heeft een positief eff ect van een aantal nieuwe celtypes gedemonstreerd, maar, de vraag welke van alle op dit moment beschreven cellen nou het beste is voor cardiale regeneratie en vasculari- satie is nog steeds onbeantwoord. Belangrijk is tevens welke cellen kunnen worden gebruikt bij het acute MI en welke bij hartfalen of angina pectoris. Daaraan toegevoegd zou het aantal
212 cellen dat nodig is per volume eenheid beschadigd hartspierweefsel, evenals het optimale tijds- venster tussen schade en reparatie (bijv. gedurende MI vs. vroeg vs. laat), nog moeten worden ontrafeld. Daarnaast, om dit veld nog ingewikkelder te maken, hebben verschillende klinische studies allen verschillende toedieningstechnieken gebruikt.
Daarom zouden er vergelijkende studies moeten worden uitgevoerd om de verschillende voor- delen van intraveneuze, intracoronaire, transepicardiale en endocardiale injectiemethoden te bepalen. De beste implantatielocaties (bijv. het litteken, infarctgrensgebied of het gezonde myocard) moeten worden vergeleken in diermodellen.
Verder blijft het exacte mechanisme waarmee deze cellen hun therapeutische eff ecten uit- voeren controversieel. De initiële gedachte was dat stamcellen het zieke myocard konden regenereren door te diff erentiëren in functionele cardiomyocyten. Dit fenomeen lijkt op zijn best erg zeldzaam te zijn. Gentherapie in combinatie met celtherapie, zoals beschreven in dit proefschrift, zou hiervoor een veelbelovende oplossing kunnen zijn. Interessant genoeg heeft ons laboratorium recent laten zien dat het geforceerd tot expressie brengen van myocardine in hMSCs ook leidt tot de functionele expressie van cellulaire componenten die zijn betrokken bij de elektrische geleiding. Dit zou kunnen resulteren in een betere elektrische koppeling tussen gebieden met gezond myocard, leidend tot het effi ciënter contraheren van het beschadigde myocard.
Een andere vraag is wat het relatieve eff ect van celtransplantatie ten opzichte van andere tegen- woordig beschikbare medische en chirurgische behandelopties is. Men zou kunnen verdedigen dat het verbeteren van de persfusie door celtherapie al voldoende is om een suffi ciënte functie- verbetering te bewerkstelligen. Daaraan toegevoegd zou toekomstig onderzoek zich meer moeten richten op de vraag hoe lang de op cellen gebaseerde verbeteringen standhouden, en hoe celoverleving na injectie kan worden verbeterd. Inderdaad hebben recente studies ook gentherapie gebruikt om dit probleem te overkomen (AA Mangi, Nat Med 2003;9:1195-201).
Gezien het bovenstaande is een beter begrip van de moleculaire mechanismen (de complexe interactie tussen chemokines, adhesie-moleculen en extracellulaire matrix-factoren) en het migratie-gedrag van stamcellen onvermijdelijk voor de verdere evolutie van celtherapie bin- nen de hart- en vaatziekten.
Fenot yp eren van het muizenhart
Muismodellen voor hartziekten spelen een belangrijke rol binnen cardiovasculair onderzoek en hebben hun vertaalbaarheid richting de kliniek bewezen. Methoden om cardiale functie en volumina te bepalen zijn een uitdaging door de kleine maat en de snelle hartslag. In het huidige proefschrift worden maar twee gangbare methoden voor het cardiaal fenotyperen van het muizenhart beschreven, MRI en de conductantie katheter. Echter, nieuwe methoden zijn in
213 opkomst; recentelijk zijn ook 3D echocardiografi e (Dawson et al. Circulation, 2004) en Speckle-
tracking technologie (Popovic et al. AJP, 2006) in beeld gekomen. Interessant genoeg hebben verschillende auteurs reeds geëxperimenteerd met micro computed tomografi e (μCT) imaging (Nahrendorf et al., AJP 2007) en muis Positron emission tomografi e imaging (PET) (Chang et al., J Mol Cell Cardiol, 2007). Daarom is de verwachting dat in de nabije toekomst beeldvorming met verschillende modaliteiten een belangrijke rol gaat spelen bij het gebruik van muismodellen voor hart- en vaatziekten.
214
