University of Groningen
The quest for function in systems with two dynamic covalent bonds
Marić, Ivana
DOI:
10.33612/diss.167788912
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2021
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Marić, I. (2021). The quest for function in systems with two dynamic covalent bonds: supramolecular self-assembly, self-replication and hydrogels for biomedical applications. University of Groningen.
https://doi.org/10.33612/diss.167788912
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Summary
This thesis focuses on building new functional systems that use two dynamic cova-lent bonds.
Chapter 1 provides a short introduction to dynamic combinatorial chemistry and post-assembly modifications as tools to build and diversify functional systems. To highlight the potential of these approaches, illustrative examples relevant to this thesis are discussed.
As new biomaterials aim to rival the extracellular matrix (ECM), in Chapter 2, we look into this natural fibrous network to gain insight into its complexity and understand the requirements we have to meet to make artificial ECM replicates. An overview of recent developments in materials for biomedical applications is given, involving natural and synthetic methods, focusing on materials that use adaptable linkages (dynamic covalent and non-covalent interactions).
Self-assembling, peptide-based fibers emerging from dynamic combinatorial libraries have been extensively studied in our group.This framework has led to a plethora of ex-citing behaviour and structures.In Chapter 3, for the first time, we report on 1,3-di-mercaptobenzene functionalized peptides, that, apart from the ability to participate in disulfide chemistry, can also engage in acyl-hydrazone formation and exchange. Since the outcome of peptide libraries depends on the experimental conditions, i.e., the system can be selectively directed to form non-assembled or assembled species, we could test acyl-hydrazone formation and exchange as well as perform structural stud-ies in both modes. The results show that both single macrocycles and self-assemblstud-ies can undergo complete or partial constitutional post-modification and subsequent ex-change of labile components. As these chemical systems utilize two covalent bonds and non-covalent interactions, we indeed observe reversibility in both molecular and supramolecular sense. However, this multilevel lability proved to be insufficiently syn-ergistic for a concrete, functional behaviour that goes beyond a simple exchange of constituents. To circumvent this challenge, we address some functions, such as self-replication, and propose others by limiting ourselves only to post-assembly modifica-tion as a mode of system diversificamodifica-tion.
In Chapter 4, we expand our toolbox of hydrazide-functionalized peptides and show that the aqueous dynamic combinatorial libraries of these molecules can undergo
self-269
Summary
assembly driven self-replication. In comparison to previously reported, structurally simi-lar building blocks (unmodified vs. hydrazide-modified C-terminus), we observe that minute changes in structure can direct the system from folding to replication, suggest-ing that these processes are related. In fact, the design criteria to direct buildsuggest-ing blocks towards foldamer formation are remarkably similar to those for directing them to repli-cate. What determines which process occurs is not necessarily the type of non-covalent interaction, but only whether they occur intra- or intermolecularly among identical building blocks. We investigated whether dynamic transformations from folded to self-replicating structures and vice versa can take place to gain insight into the connectivity between the two modes of assemblies. The outcomes of these experiments suggest that foldamers are transiently durable, while the self-replicating structure most likely repre-sents the lowest energy state of the system.
The post-assembly modification strategy, proposed in Chapter 3 as a tool to “build in” different functions into systems based on hydrazide-functionalized peptide building blocks, was explored in Chapter 5. Here, supramolecular, fibrous assemblies were reacted with particular di- and trialdehydes as cross-linking agents to yield hydrogels. The materi-als can be formed at a strikingly low critical gelation concentration (as low as 0.025 wt%), and gelation times are found to be in a span of 2 to 10 minutes, depending on the cross-linker, which is of importance for further applications. Cryo-EM and SEM measurements indicate fiber bundling and association. Rheology measurements revealed the frequency independence of both storage and loss moduli of all hydrogels regardless of the cross-linker used, while high amounts of stress induce gel fracture. Finally, we show that the hydrogels can be reversibly broken down through an exchange reaction with hydroxylamine as a chemical stimulus.
In Chapter 6, we aimed to establish the material developed in Chapter 5 as a modifiable platform for cell culturing. Cytotoxicity assays suggest that human bone marrow-de-rived mesenchymal stem cells (hBM-MSCs) can proliferate without diminished viabil-ity in the presence of the peptide-based material. Furthermore, cell adhesion-promoting sequences (RGD and LDV) were successfully incorporated into the fibrous scaffold. Such fibers were then subjected to hydrogelation to yield soft materials that present biologically relevant ligands. The in vitro visualization suggests extended morphologies of mesenchymal stem cells on the bioactive ligand-functionalized materials, as well as on the original unmodified substrate. The importance of the work presented in this chapter lies in the methodology for fabricating tailor-made, molecularly engineered soft materials through a modular approach. In the future, we aim to address other versatile
applications while developing new matrices combining different biologically relevant ligands for more rigorous control over cell fate.
Lastly, Chapter 7 puts the conducted research and findings into a broader context; what are the challenges behind and ahead of us, motivating why we should continue to be interested in these particular subjects, looking ahead at what is to be learned and gained by studying these topics.
271
Summary
Samenvatting
Translated by Kayleigh van Esterik
Dit proefschrift gaat over het maken van nieuwe functionele systemen die gebruik maken van twee dynamische covalente bindingen.
Hoofdstuk 1 geeft een korte inleiding over dynamische combinatoriële chemie en modificaties na assemblage als gereedschap om functionele systemen te bouwen en variëteit aan te brengen. Om het potentieel van deze aanpak te onderstrepen, worden er voorbeelden besproken die relevant zijn voor dit proefschrift.
Nieuwe biomaterialen hebben als doel om de extracellulaire matrix (ECM) na te bootsen. In Hoofdstuk 2 kijken we daarom in meer detail naar deze vezelnetwerken om inzicht te krijgen in hun complexiteit en de eisen waaraan ze moeten voldoen om als artificiële ECM te fungeren. Er wordt een overzicht gegeven van recente ontwikkelingen in materialen voor biomedische toepassingen, gebaseerd op zowel natuurlijke als synthetische methoden en gericht op materialen die reversibele bindingen kunnen aangaan (dynamische covalente en niet-covalente interacties).
Zelfassemblerende, peptide-gebaseerde vezels die ontstaan uit dynamische combinatoriële bibliotheken zijn uitgebreid onderzocht in onze onderzoeksgroep. Dit werk heeft geleid tot een veelvoud aan spannende gedragingen en structuren. In Hoofdstuk 3 rapporteren we voor het eerst dat peptiden die zijn gefunctionaliseerd met 1,3-dimercaptobenzeen, naast hun mogelijkheid tot disulfide chemie, ook in staat zijn om acyl-hydrazonen te vormen uit te wisselen. Omdat de uitkomst van de peptidenbibliotheken afhangt van de experimentele omstandigheden, d.w.z. het systeem kan selectief gestuurd worden naar niet-geassembleerde of geassembleerde structuren, konden we acyl-hydrazonvorming en -uitwisseling testen en studies doen in beide toestanden. De resultaten laten zien dat zowel de individuele macrocyclische verbindingen, alsook hun assemblages, geheel of gedeeltelijke post-modificatie kunnen ondergaan doordat de labiele onderdelen kunnen uitwisselen. Omdat deze chemische systemen twee soorten covalente bindingen en niet-covalante interacties benutten, zien we moleculaire en supramoleculaire reversibiliteit. Echter, dit gedrag was onvoldoende synergetisch voor concrete, functionele eigenschappen die verder gaan dan een simpele uitwisseling van onderdelen. Om wel tot de gewenste eigenschappen te komen hebben we ons gericht op een aantal functies,
zoals zelfreplicatie, en suggereren we andere functies die kunnen ontstaan na modificatie van de assemblages.
In Hoofdstuk 4 breiden we de gereedschapskist van hydrazide-gefunctionaliseerde peptides uit en laten we zien dat de waterige dynamische combinatoriële bibliotheken van deze moleculen zelfreplicatie kunnen ondergaan, aangedreven door zelfassemblage. In vergelijking met eerder gerapporteerde, structureel vergelijkbare bouwstenen (ongemodificeerd vs. hydrazide-gemodificeerde C-terminus), zien we dat kleine veranderingen in moleculaire structuur het systeem van vouwing (foldameervorming) naar replicatie kunnen sturen. Dit suggereert dat deze processen gerelateerd zijn. De designcriteria om bouwstenen foldameren te laten vormen zijn opmerkelijk vergelijkbaar met de criteria die tot replicatie leiden. Het is niet per se het type niet-covalente interactie dat bepaalt welk proces plaatsvindt, maar alleen of deze interacties
intra- of intermoleculair zijn. We hebben onderzocht of dynamische transformaties van
gevouwen naar zelfreplicerende structuren en vice versa plaatsvinden om inzicht te krijgen in de verbondenheid van deze twee vormen. De uitkomsten van deze experimenten suggereren dat foldameren slechts tijdelijk stabiel zijn, terwijl de zelfreplicerende structuur waarschijnlijk de laagste energietoestand van het systeem representeert. De strategie van modificatie na assemblage, voorgesteld in Hoofdstuk 3 als middel om verschillende functies “in te bouwen” in systemen gebaseerd op hydrazide-gefunctionaliseerde peptides, is verder onderzocht in Hoofdstuk 5. Door supramoleculaire vezelachtige assemblages te laten reageren met specifieke di- en trialdehydes als verknopers worden hydrogels gevormd. Deze materialen vormen bij een opvallend lage gelatieconcentratie (zo laag als 0.025 wt%) met een gelatietijd van 2 tot 10 minuten, afhankelijk van de verknoper, wat van belang is voor verdere toepassingen. Cryo-EM en SEM metingen laten vezelbundelingen en vezelassociatie zien. Reologiemetingen toonde aan dat zowel de opslag- als de verliesmoduli van alle hydrogels onafhankelijk zijn van de toegepaste frequentie, los van de gebruikte verknoper, terwijl grote kracht de gels laat breken. Als laatste laten we zien dat de hydrogels reversibel afgebroken kunnen worden door een uitwisselingsreactie met hydoxylamine.
Ons doel in Hoofdstuk 6 was om het ontwikkelde materiaal uit Hoofdstuk 5 toe te passen als een aanpasbaar platform (scaffold) voor celkweek. Cytotoxiciteitstests suggereren dat mesenchymale stamcellen van menselijk beenmerg (hBM-MSCs) zich kunnen vermenigvuldigen in aanwezigheid van het peptide-gebaseerde materiaal zonder dat hun levensvatbaarheid wordt aangetast. Daarnaast zijn sequenties die celhechting bevorderen
273
Summary
(RGD en LDV) succesvol geïncorporeerd in de vezelige scaffolds. Deze vezels werden vervolgens ingebouwd in gels, resulterend in zachte materialen die biologisch relevante liganden presenteren. In vitro visualisatie suggereert dat uitgebreide morfologieën van mesenchymale stamcellen vormen op zowel de materialen die zijn gefunctionaliseerd met biologisch actieve liganden, alsook op het originele ongemodificeerde substraat. Het belang van het werk gepresenteerd in dit hoofdstuk ligt in de methodologie voor het fabriceren van op maat gemaakte, moleculair gemanipuleerde zachte materialen via een modulaire aanpak. In de toekomst willen we ons richten op andere veelzijdige toepassingen naast het verder ontwikkelen van nieuwe matrices die verschillende biologisch relevante liganden combineren voor een betere controle over de ontwikkeling van cellen.
Tot slot worden de onderzoeksresultaten in Hoofdstuk 7 in een bredere context geplaatst; we gaan in op wat de uitdagingen zijn die achter en voor ons liggen, waarom we geïnteresseerd moeten blijven in deze specifieke onderwerpen en, vooruitkijkend, wat er te leren en te winnen valt door onderzoek te doen naar deze onderwerpen.
Rezime
Istraživanje predstavljeno u okviru ove disertacije fokusirano je na razvoj novih funkcionalnih sistema koji koriste dve dinamičke kovalentne veze.
Prvo poglavlje daje kratak uvod u dinamičku kombinatornu hemiju i modifikacije nakon molekulskog samouređivanja, kao strategije za izgradnju i diversifikaciju funkcionalnih sistema. Kako bi se istakao potencijal ovih pristupa, predstavljeni su neki od ilustrativnih primera relevantnih za ovu disertaciju.
Pošto novi biomaterijali imaju za cilj da se nadmeću sa vanćelijskim matriksom (ECM), u
drugom poglavlju analizirana je ova prirodna, vlaknasta mreža kako bismo stekli uvid u njenu složenost i razumeli zahteve koje moramo da ispunimo da bismo napravili veštačke replike vanćelijskog matriksa. Dat je pregled najnovijih dostignuća u oblasti materijala za biomedicinsku primenu, koji uključuju prirodne i sintetičke metode, sa fokusom na materijale koji koriste adaptibilne veze (dinamičke kovalentne i nekovalentne interakcije). Samouređujuća vlakna na bazi peptida, proizvodi dinamičkih kombinatornih biblioteka, opsežno su proučavana u našoj grupi. Ovaj istraživački pravac, doveo je do mnoštva uzbudljivih struktura i funkcija. U trećem poglavlju, po prvi put je prikazan 1,3-dimerkaptobenzen, funkcionalizovan peptidom, koji osim što može da učestvuje u disulfidnoj hemiji, takođe može da učestvuje u stvaranju i izmeni acil-hidrazona. Budući da ishod dinamičkih kombinatornih biblioteka peptida zavisi od eksperimentalnih uslova, tj. sistem može biti selektivno usmeren ka formiranju makrocikala koji se dalje samouređuju ili ne, testirano je stvaranje i izmena acil-hidrazona, i sprovedene su strukturne studije u oba ishoda. Rezultati pokazuju da pojedinačni makrocikli, kao i samouređujući, mogu podleći potpunoj ili delimičnoj konstitucionoj post-modifikaciji i naknadnoj izmeni labilnih komponenata. Kako ovi hemijski sistemi koriste dve dinamičke kovalentne veze i nekovalentne interakcije, zaista primećujemo reverzibilnost u molekulskom i supramolekulskom smislu. Međutim, ova labilnost na više nivoa, pokazala se nedovoljno sinergističkom za konkretno, funkcionalno ponašanje koje prevazilazi jednostavnu razmenu komponenti. Da bismo prevazišli ovaj izazov, istražene su neke od mogućih funkcija, kao što je samo-replikacija, a predložene su i druge, ograničene na modifikaciju nakon molekulskog samouređivanja, kao način diversifikacije sistema.
U četvrtom poglavlju proširen je repertoar hidrazid-funkcionalizovanih peptida i pokazano je da dinamičke kombinatorne biblioteke ovih molekula mogu da podlegnu
275
Summary
samo-replikaciji kao rezultat tendencije ka samouređivanjem. U poređenju sa strukturno sličnim molekulima prethodno opisanim u literaturi (nemodifikovani nasuprot hidrazidom modifikovani peptidi), primećeno je da male promene u strukturi mogu uticati na krajnji ishod sistema, tj. usmeriti ga od savijanja do replikacije, sugerišući da su ovi procesi povezani. U stvari, kriterijumi za dizajn molekula koji imaju tendenciju zauzimanja savijene, trodimenzionalne strukture izuzetno su slični onima koji rezultuju replikacijom. Ono što određuje koji će se proces desiti nije nužno vrsta nekovalentnih interakcija između identičnih gradivnih jedinica, već samo to da li su one intra- ili
intermolekulskog tipa. Istražili smo da li je moguće postići dinamičku transformaciju
iz savijene, trodimenzionalne u samo-replikovanu strukturu, i obrnuto, da bi se stekao uvid u odnos između dva načina uređenja. Rezultati ovih eksperimenata sugerišu da su savijene strukture privremeno postojane, dok struktura koja sama katalizuje svoju formaciju najverovatnije predstavlja najniže energetsko stanje sistema.
Strategija modifikacije nakon samouređivanja, predložena u trećem poglavlju kao metod za „ugrađivanje“ različitih funkcija u sisteme zasnovane na peptidima funkcionalizovanim hidrazidom, istražena je u petom poglavlju. Ovde su supramolekulske, vlaknaste strukture reagovane sa određenim di- i trialdehidima, kao agensima za umrežavanje, kako bi se postigla formacija hidrogelova. Materijali se mogu formirati na izuzetno niskoj kritičnoj koncentraciji geliranja (čak 0,025 mas.%), a utvrđeno je da je vreme geliranja u rasponu od 2 do 10 minuta, u zavisnosti od agensa korišćenog za umrežavanje, što je od važnosti za dalju primenu. Krio-elektronska mikroskopija i skenirajuća elektronska mikroskopija ukazuju na ugrupnjavanje i povezivanje vlakana. Reološka merenja pokazuju da su moduli elastičnosti i viskoznosti svih gelova nezavisni od primenjene frekvencije, bez obzira koji je agens za umrežavanje korišćen, dok velike količine stresa izazivaju pucanje gela. Na kraju, pokazano je da se hidrogelovi mogu reverzibilno razgraditi reakcijom izmene sa hidroksilaminom, kao hemijskim stimulusom.
U šestom poglavlju istraživan je materijal razvijen u petom poglavlju, kao platforma za rast ćelija, koja može biti modifikovana po potrebi. Analize citotoksičnosti sugerišu da se mezenhimske matične ćelije iz ljudske koštane srži neometano razmnožavaju u prisustvu materijala na bazi peptida. U sledećem koraku, sekvence peptida koje promovišu adheziju ćelija (RGD i LDV) uspešno su ugrađene u vlaknastu osnovu. Takva vlakna su zatim podvrgnuta hidrogelaciji da bi se dobili mekani materijali koji sadrže biološki relevantne ligande. In vitro vizualizacija sugeriše izdužene morfologije mezenhimskih matičnih ćelija na materijalima funkcionalizovanim bioaktivnim ligandom, kao i na originalnom nemodifikovanom supstratu. Važnost rada predstavljenog u ovom poglavlju
leži u metodologiji za izradu mekanih materijala „po meri“, molekularno dizajniranih kroz modularni pristup. U budućnosti imamo za cilj da ispitamo i druge raznovrsne primene, dok razvijamo nove materijale, kombinujući različite biološki relevantne ligande za rigorozniju kontrolu nad ćelijskom sudbinom.
Na kraju, poglavlje sedam stavlja sprovedeno istraživanje i rezultate u širi kontekst; koji su izazovi iza i ispred nas, motivišući zašto bismo i dalje trebali da budemo zainteresovani za ove konkretne teme, gledajući unapred šta ćemo naučiti i steći proučavanjem ovih tema.
277
