Cover Page
The following handle holds various files of this Leiden University dissertation:
http://hdl.handle.net/1887/61829
Author: Hoeke, G.
Title: A fatty battle: towards identification of novel genetic targets to comBAT cardiometabolic diseases
Issue Date: 2018-05-03
Chapter
Summary Nederlandse samenvatting
List of publications Curriculum vitae
10
10
SUMMARY
Cardiovascular diseases (CVD), which are mainly caused by the development of atherosclerosis, are the leading cause of morbidity and mortality in Western Society.
Two main risk factors for the development of atherosclerosis are hyperlipidemia and inflammation, that cause accumulation of lipids and immune cells, respectively, in the arterial wall. While activation of brown adipose tissue (BAT) is a promising strategy to alleviate hyperlipidemia, reduction of inflammation is also thought to reduce atherosclerosis progression. In this thesis, we aimed to address two key objectives: 1) to identify genetic targets in mice and men that are involved in BAT activity and evaluate their effects on lipoprotein metabolism and atherosclerosis development, and 2) to identify genetic targets in mice that are involved in modulation of the immune system and evaluate their effects on atherosclerosis development. Chapter 1 serves as a general introduction in which hyperlipidemia and inflammation are introduced as the two main causes for atherosclerosis development. More specifically, firstly the physiology and role of BAT in lipoprotein metabolism and atherosclerosis development are explained.
Secondly, the contribution of pro- and anti-inflammatory cytokines as well as specific receptors on immune cells in propelling immune responses are explained in the context of atherosclerosis development.
Activated BAT takes up large amounts of triglyceride (TG)-derived fatty acids (FA) from the circulation in order to generate heat. However, the mechanism by which BAT takes up these TG-derived FA remained elusive. In chapter 2, we studied whether BAT takes up TG-derived FA after lipolysis from TG-rich lipoproteins (TRL), via uptake of whole TRL or via a combination of both. Glycerol tri[3H]oleate and [14C]cholesteryl oleate double- labeled TRL-mimicking particles of various sizes were injected into mice that were housed at 28°C (thermoneutrality; inactive BAT), 21°C (moderate BAT activity) or 7°C (high BAT activity). Subsequently, we determined the uptake of these radiolabels by several metabolic organs including BAT. We demonstrated that BAT takes up TG-derived FA mainly after lipoprotein lipase (LPL)-mediated lipolysis, rather than via whole particle uptake. This was the case for TRL-mimicking particles of all sizes and was independent of the activity level of BAT, although the total amount of TG-derived FA taken up by BAT was much larger when BAT was activated by an environmental temperature of 7°C.
We have also shown that, as a consequence of the above demonstrated increased uptake
of TG-derived FA by activated BAT, the formation and hepatic uptake of cholesterol- enriched TRL remnants is also accelerated. Via this mechanism, BAT activation alleviates hypercholesterolemia and atherosclerosis development in APOE*3-Leiden.CETP (E3L.
CETP) mice. Since statins increase the hepatic uptake of TRL remnants, we hypothesized in chapter 3 that statin treatment increases the lipid-lowering and anti-atherogenic effects of BAT activation by accelerating the clearance of TRL remnants generated by activated BAT. We tested this hypothesis by combining statin treatment with a β3-adrenergic receptor (β3-AR) agonist to activate BAT in hyperlipidemic E3L.CETP mice. Indeed, statin treatment on top of BAT activation further increased the hepatic uptake of cholesterol- enriched TRL remnants as compared to β3-AR agonism alone. As a consequence, concomitant treatment with the statin further increased the cholesterol-lowering and atheroprotective effects of BAT activation. From this, we concluded that combining statin treatment, which is the first choice in treatment of hypercholesterolemia, with BAT activation has therapeutic potential to reduce CVD further than can be reached by statin therapy alone.
In addition to increasing the hepatic uptake of cholesterol-enriched TRL remnants, BAT activation also increases the hepatic uptake of high-density lipoprotein (HDL)- cholesterol. BAT activation thus not only induces a flux of cholesterol to the liver via increasing the hepatic uptake of TRL remnants but also by enhancing the hepatic clearance of HDL-derived cholesterol. Since hepatic cholesterol is mainly used for the synthesis of bile acids (BAs) we studied the effect of BAT activation on hepatic cholesterol and BA metabolism in chapter 4. Prolonged BAT activation, by means of β3-AR agonism, reduced fecal BA excretion, increased BA levels in plasma, and induced hepatic cholesterol accumulation in E3L.CETP mice. Concomitant treatment with colesevelam, which is a BA sequestrant that blocks BA reabsorption from the gut, increased fecal BA excretion, normalized plasma BA levels, and reversed the hepatic cholesterol accumulation caused by β3-AR agonism. Moreover, plasma total cholesterol levels were further reduced by this combination compared to β3-AR agonism alone. We concluded that BAT activation combined with BA sequestration improves BA metabolism, prevents the accumulation of hepatic cholesterol, and further reduces plasma cholesterol as compared to BAT activation alone. Therefore, combining BAT activation with BA sequestration additively improves cholesterol metabolism and may further reduce atherosclerosis development.
The above-described studies increased our knowledge of the mechanistic effects of
10
BAT activation on lipid and lipoprotein metabolism in mice. However, the effect of BAT activation on human lipid and lipoprotein metabolism has not been extensively studied yet. Therefore, in chapter 5, we studied the effect of BAT activation, by means of short- term cooling, on the serum lipoprotein profile and HDL functionality in men. Before and after exposure to a personalized cooling protocol for 2 hours, serum samples were collected from young, lean men. Short-term cooling increased serum levels of free FA, TG, and cholesterol. This was accompanied by an increased concentration of large very- low-density lipoprotein (VLDL) particles upon cooling. In addition, cooling increased the concentration of small HDL particles as well as their cholesterol content. Small HDL particles are efficient acceptors of cholesterol via adenosine triphosphate-binding cassette A1 (ABCA1). Indeed, the increase in small HDL particles was accompanied by increased ABCA1-dependent cholesterol efflux in vitro. Short-term cooling thus increases the concentration of large VLDL particles and increases the generation of small HDL particles. In addition, short-term cooling increases HDL functionality, which may confer atheroprotective properties.
In chapter 6 we shifted our focus from the anti-atherogenic effects of BAT activation to the role of inflammation in atherosclerosis development. We reasoned that immune modulators that reduce the pro-inflammatory environment may protect from atherosclerosis development. As the human anti-inflammatory cytokine interleukin (IL)-37 may be such an immune modulator, we investigated the effect of hematopoietic expression of IL-37 on atherosclerosis development under low-grade inflammatory conditions. To this end, low-density lipoprotein receptor-deficient (Ldlr-/-) mice were lethally irradiated and transplanted with bone marrow from IL-37-transgenic or control wild-type mice and fed a Western-type diet. While hematopoietic IL-37 expression did not influence body weight, food intake and plasma cholesterol levels during the study, IL-37 expression did reduce the inflammatory state. Hematopoietic IL-37 expression did not influence the atherosclerotic lesion area and only marginally influenced plaque composition. Although the smooth muscle content within the lesion was decreased, macrophage and collagen content were not different. We therefore concluded that, under low-grade inflammatory conditions, hematopoietic IL-37 expression does not influence atherosclerosis development, at least in hyperlipidemic Ldlr-/- mice.
The production of pro- and anti-inflammatory cytokines by immune cells is determined by activation of immune receptors on their cell membrane. Reducing immune receptor
activation may therefore also reduce the pro-inflammatory environment. In chapter 7, we evaluated the role of the C-type lectin receptor (CLR) family in the pathogenesis of atherosclerosis. We studied whether hematopoietic deletion of the CLR Dectin-2 or the CLR adaptor molecule CARD9 reduces inflammation and atherosclerosis development.
To do so, Ldlr-/- mice were transplanted with bone marrow from control wild-type (WT), Dectin-2-/- or Card9-/- mice and fed a Western-type diet. Deletion of hematopoietic Dectin-2 did not influence the systemic inflammatory state or atherosclerosis development.
Although deletion of hematopoietic CARD9 also did not influence the inflammatory state, it unexpectedly increased the atherosclerotic lesion size. From these data we concluded that deletion of hematopoietic Dectin-2 does not influence atherosclerosis development, while deletion of hematopoietic CARD9 increases atherosclerotic lesion size, suggesting that the presence of CARD9 may have a protective role in atherosclerosis development.
CLRs are classically involved in the recognition of sugars and sugar-like structures present on fungi. In chapter 8, we hypothesized that under hyperglycemic conditions glycosylated protein (sugar-like) structures activate CLRs leading to immune cell activation and increased atherosclerosis development. Absence of CLRs during hyperglycemia may thus protect from atherosclerosis. We therefore next evaluated the effect of deletion of hematopoietic Dectin-2 or CARD9 on inflammation and atherosclerosis development under hyperglycemic conditions. Ldlr-/- mice were lethally irradiated and transplanted with bone marrow from control WT mice, Dectin-2-/- or Card9-/- mice. To induce hyperglycemia, insulin production by the pancreas was eliminated by injecting streptozotocin 6 weeks after BMT. Two weeks later, mice were fed a Western-type diet for 10 weeks. Under hyperglycemic conditions, deletion of hematopoietic Dectin-2 reduced the number of circulating pro-inflammatory Ly6Chi monocytes, while the pro-inflammatory cytokine production by LPS- and Pam3Cys-stimulated macrophages was increased. Deletion of hematopoietic Dectin-2 did not influence atherosclerosis development. While deletion of hematopoietic CARD9 did not influence the inflammatory state or lesion size, it tended to reduce the macrophage and collagen content in atherosclerotic lesions. From these data we concluded that under hyperglycemic conditions, deletion of hematopoietic Dectin-2 or CARD9 does not influence atherosclerosis development.
In chapter 9, we evaluated the results of this thesis and discussed the translational value of our research regarding the role of BAT and inflammation in the protection
10
against cardiometabolic diseases in humans. In addition, the future directions that are required to implement BAT activation and immune modulation in clinical practice to combat cardiometabolic diseases are discussed. Taken together, the studies described in this thesis increased our knowledge on the potential of BAT activation and immune modulation to combat CVD, and suggest that especially BAT activation is a promising strategy to further pursue.
10
NEDERLANDSE SAMENVATTING
Hart- en vaatziekten vormen de belangrijkste doodsoorzaak in de Westerse Wereld en worden voornamelijk veroorzaakt door slagaderverkalking, ook wel ‘atherosclerose’
genoemd. Slagaderverkalking leidt tot vernauwing van de slagader. Als de vernauwing zich in het hart bevindt kan dit leiden tot pijn op de borst. Als deze vernauwing scheurt dan kan er een stolsel ontstaan dat het bloedvat verstopt wat leidt tot een hartinfarct.
Ook kan door de hoge druk in de slagaders het stolsel losschieten en ergens anders een bloedvat verstoppen wat bijvoorbeeld tot een herseninfarct kan leiden. De twee belangrijkste oorzaken voor slagaderverkalking zijn ontsteking en hyperlipidemie.
Hyperlipidemie is gekenmerkt door een verhoogde concentratie van triglyceriden (TG) en cholesterol in (zeer-) lage-dichtheid lipoproteïnen ((V)LDL).
Hoofdstuk 1 van dit proefschrift dient als algemene introductie. Hierin worden de vetstofwisseling en slagaderverkalking geïntroduceerd, evenals de rol van geactiveerd bruin vet in de vetstofwisseling en in de bescherming tegen slagaderverkalking. Daarnaast worden de diverse typen ontstekingscellen en de rol van ontsteking in de ontwikkeling van slagaderverkalking uitgelegd. Suikers en vetten vormen belangrijke bouwstenen voor ons lichaam. De belangrijkste vetten in ons dieet zijn TG en cholesterol. TG is belangrijk als brandstof voor ons lichaam doordat het drie vetzuren per molecuul bevat die kunnen worden vrijgemaakt en gebruikt als energiebron door organen en weefsels.
Cholesterol wordt niet gebruikt als brandstof maar is belangrijk voor de aanmaak van nieuwe cellen, bepaalde hormonen, vitamine D en galzuren. Suikers zijn oplosbaar in ons bloed maar TG en cholesterol niet. Daarom worden vetten in het bloed vervoerd in microscopisch kleine vetbolletjes, zogenaamde ‘lipoproteïnen’, die TG en cholesterol naar de verschillende organen transporteren. De lipoproteïnen, chylomicronen en VLDL, die respectievelijk door de darm en lever worden gemaakt, bevatten in eerste instantie veel TG. Bekend is dat het enzym lipoproteïne lipase vetzuren kan vrijmaken uit het TG binnen deze deeltjes, welke vervolgens kunnen worden opgenomen door organen en weefsels. Skeletspieren en het hart gebruiken deze vetzuren voor het leveren van energie, en wit vetweefsel slaat vetzuren weer op in de vorm van TG. TG is ook een belangrijke brandstof voor bruin vetweefsel. Blootstelling aan kou is de belangrijkste natuurlijke activator van bruin vet en leidt tot de omzetting van vet dat in het bruin vet ligt opgeslagen tot warmte. Hierdoor slinkt de vetvoorraad in bruin vet. Om warmte te kunnen blijven produceren neemt bruin vet TG op uit het bloed. Dit heeft tot gevolg dat
activatie van bruin vet de concentratie TG in het bloed verlaagt, al was het nog onbekend hoe TG door bruin vet wordt opgenomen. Nadat organen TG hebben opgenomen uit de lipoproteïnen blijft een deeltje over dat relatief weinig TG bevat en veel cholesterol.
Deze cholesterol-verrijkte deeltjes noemen we lipoproteïnerestanten (het slechte cholesterol). Lipoproteïnerestanten worden normaliter door de lever opgenomen en daardoor uit het bloed verwijderd, maar wanneer dat onvoldoende gebeurt en de concentraties in het bloed te hoog worden kunnen ze de vaatwand binnendringen. In de vaatwand worden deze lipoproteïnerestanten opgenomen door ontstekingscellen, de belangrijkste stap in de ontwikkeling van slagaderverkalking. Gedurende de ontwikkeling van slagaderverkalking zorgt de ophoping van onder andere cholesterol en ontstekingscellen ervoor dat de vaatwand vernauwt, wat uiteindelijk kan leiden tot een infarct in het hart of in de hersenen met de dood tot mogelijk gevolg.
Hoge-dichtheid lipoproteïnen (HDL; het goede cholesterol) wordt aangemaakt in de lever en darmen en beschermt juist tegen slagaderverkalking. HDL kan cholesterol opnemen uit de ontstekingscellen in de vaatwand en het cholesterol naar de lever transporteren waar het wordt uitgescheiden, voornamelijk als galzuren in de ontlasting.
Slagaderverkalking kan zich dus ontwikkelen door zowel hoge bloedgehaltes van lipoproteïnerestanten die de vaatwand infiltreren en ontsteking bevorderen, als door onvoldoende verwijdering van cholesterol uit de vaatwand door HDL.
Zoals hierboven al beschreven speelt ontsteking ook een belangrijke rol bij de ontwikkeling van slagaderverkalking. Wanneer ontstekingscellen cholesterol in de vaatwand hebben opgenomen scheiden zij signaalmoleculen uit die de ontsteking verder bevorderen. Dit leidt ook tot infiltratie van nog meer ontstekingscellen in de vaatwand.
Ontstekingscellen kunnen echter ook signaalmoleculen uitscheiden die ontsteking remmen. Een voorbeeld van zo’n ontstekingsremmend signaalmolecuul is interleukine 37 (IL-37), wat wel in mensen maar niet in muizen aanwezig is. Een verhoogde aanmaak van ontstekingsremmende signaalmoleculen zoals IL-37 zou ontsteking kunnen verlagen en zo de ontwikkeling van slagaderverkalking kunnen remmen. Of een ontstekingscel ontstekingsremmende of ontstekingsbevorderende signaalmoleculen aanmaakt hangt af van de manier waarop de ontstekingscellen geactiveerd worden. Ontstekingscellen kunnen geactiveerd worden door binding van moleculen aan receptoren op hun celmembraan. Dit leidt in de meeste gevallen tot de productie van signaalmoleculen die ontsteking bevorderen. Een bekende groep ontstekingsbevorderende receptoren
10
op het membraan van ontstekingscellen zijn de C-type lectine receptoren (CLRs). Deze receptoren zijn voornamelijk verantwoordelijk voor het herkennen van suikerachtige structuren op schimmels. Het voorkomen van activatie van CLRs zou kunnen leiden tot een lagere aanmaak van ontstekingsbevorderende signaalmoleculen. Het verlagen van ontsteking zou vervolgens weer kunnen beschermen tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking.
Het onderzoek in dit proefschrift had twee doelen: 1) identificatie van genen in muizen en mensen die de activiteit van bruin vet beïnvloeden om vervolgens te onderzoeken wat de rol van deze genen is in de vetstofwisseling en de ontwikkeling van slagaderverkalking; 2) identificatie van genen in muizen die de mate van ontsteking beïnvloeden om vervolgens te onderzoeken of deze genen ook de ontwikkeling van slagaderverkalking beïnvloeden.
Zoals hierboven aangegeven neemt geactiveerd bruin vet dus grote hoeveelheden TG op uit het bloed, waarna de vetzuren uit TG gebruikt kunnen worden om warmte te produceren. Het was echter niet bekend op welke manier bruin vet TG opneemt: 1) door het vrijmaken van vetzuren uit TG buiten de cel, waarna bruine vetcellen deze vetzuren opnemen, 2) door opname van hele lipoproteïnen, of 3) door een combinatie van beide.
Om dit te bestuderen hebben wij in hoofdstuk 2 gebruik gemaakt van lipoproteïneachtige deeltjes van drie verschillende groottes, waarvan zowel de vetzuren van de TG als het cholesterol radioactief waren gemerkt. Deze deeltjes werden vervolgens ingespoten in muizen die blootgesteld waren aan een omgevingstemperatuur van 28°C (inactief bruin vet), 21°C (gemiddelde activiteit van bruin vet) of 7°C (zeer actief bruin vet). Hierna bepaalden we de opname van de radioactief gemerkte vetzuren en cholesterol door de verschillende organen, waaronder bruin vet. We konden op deze manier aantonen dat bruin vet voornamelijk vetzuren opneemt nadat deze uit TG zijn vrijgemaakt buiten de cel en niet via de opname van hele deeltjes. Deze selectieve wijze van vetzuuropname was gelijk voor deeltjes die qua grootte lijken op chylomicronen dan wel VLDL en door zowel inactief als zeer actief bruin vet, al was de hoeveelheid vetzuren die werd opgenomen door zeer actief bruin vet vele malen groter dan door inactief bruin vet.
Actief bruin vet neemt dus veel vetzuren op die afgesplitst zijn vanuit TG, die op hun beurt weer vrijgemaakt zijn uit lipoproteïnen. Hierdoor ontstaan restanten van lipoproteïnen die relatief veel cholesterol bevatten en door de lever worden opgenomen. Uit onze
studies bleek dat bruinvetactivatie via dit mechanisme niet alleen het TG-gehalte maar ook het cholesterolgehalte in het bloed verlaagt en tevens beschermt tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking in muizen. Behandeling met een statine, een cholesterolverlagend medicijn, versnelt de opname van lipoproteïnerestanten door de lever. Daarom testten we in hoofdstuk 3 de hypothese dat activatie van bruin vet in combinatie met statinebehandeling de cholesterolgehaltes in het bloed en de ontwikkeling van slagaderverkalking nog verder verlaagt, door gebruik te maken van E3L.CETP muizen. Inderdaad zorgde de combinatie van bruinvetactivatie en behandeling met een statine voor een verder verhoogde leveropname van lipoproteïnerestanten vergeleken met alleen bruinvetactivatie. Hierdoor verlaagde de combinatie van behandelingen inderdaad de cholesterolgehaltes in het bloed en beschermde nog beter tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking vergeleken met bruinvetactivatie alleen.
Op basis van deze resultaten concludeerden wij dat bruinvetactivatie een veelbelovende therapeutische toevoeging kan zijn aan de routinematige behandeling met statines om hart- en vaatziekten verder terug te dringen.
Geactiveerd bruin vet leidt dus tot een verhoogde opname van lipoproteïnerestanten door de lever. Cholesterol in de lever wordt voornamelijk gebruikt voor de aanmaak van galzuren die vervolgens worden uitgescheiden in de darmen en ons lichaam kunnen verlaten via de ontlasting. Een deel van deze galzuren wordt echter weer opgenomen door de darmen en aan de bloedbaan afgegeven voor hergebruik. Omdat het effect van bruinvetactivatie op het cholesterol- en galzuurmetabolisme nog grotendeels onbekend was, bestudeerden we deze relatie, wederom in E3L.CETP muizen, in hoofdstuk 4.
Bruinvetactivatie verlaagde de galzuuruitscheiding via de ontlasting, verhoogde de galzuurgehaltes in het bloed en veroorzaakte ophoping van cholesterol in de lever.
Vervolgens was onze hypothese dat we het galzuurmetabolisme konden verbeteren en de cholesterolophoping in de lever konden voorkómen door de galzuuruitscheiding via de ontlasting te verhogen. Om dit te bewerkstelligen gebruikten we een medicijn dat de heropname van galzuren door de darmen remt en zo de uitscheiding van galzuren via de ontlasting bevordert. We bestudeerden het effect van bruinvetactivatie in combinatie met deze remmer van de galzuurheropname op het galzuurmetabolisme en de cholesterolgehaltes in de lever. Deze combinatiebehandeling verhoogde de galzuuruitscheiding via de ontlasting en normaliseerde de galzuurgehaltes in het bloed vergeleken met alleen bruinvetactivatie en verbeterde op deze manier het galzuurmetabolisme. Bovendien beschermde deze combinatiebehandeling
10
tegen cholesterolophoping in de lever en verlaagde het de cholesterolgehaltes in het bloed beter dan bewerkstelligd kon worden met alleen bruinvetactivatie. We concludeerden uit deze gegevens dat het combineren van bruinvetactivatie met een remmer van galzuurheropname het galzuurmetabolisme verbetert, de lever tegen cholesterolophoping beschermt en cholesterolgehaltes in het bloed verder verlaagt vergeleken met alleen bruinvetactivatie. Daarbij postuleerden wij dat de combinatiebehandeling, door deze verdere verlaging van cholesterolgehaltes in het bloed, mogelijk ook kan zorgen voor een nog verdere remming van slagaderverkalking.
Door de hierboven beschreven studies hebben we veel inzicht verkregen over het effect van bruinvetactivatie op de vetstofwisseling in muizen. Het was echter nog onbekend wat het effect is van bruinvetactivatie op de vetstofwisseling van mensen. Daarom hebben we in hoofdstuk 5 bestudeerd wat het effect is van bruinvetactivatie, door middel van korte blootstelling aan kou, op de hoeveelheid en typen lipoproteïnen in het bloed. Ook bestudeerden we het effect van blootstelling aan kou op de mate waarin HDL cholesterol kan opnemen uit ontstekingscellen. Vóór en na blootstelling van jonge, slanke mannen aan een koelingsprotocol van 2 uur werden bloedmonsters afgenomen.
Korte blootstelling aan kou verhoogde de bloedgehaltes van TG en cholesterol. Dit ging samen met een verhoogde concentratie VLDL-deeltjes na blootstelling aan kou. Ook zorgde blootstelling aan kou voor een verhoogde concentratie kleine HDL-deeltjes die meer cholesterol bevatten. Eerder is beschreven dat deze kleine HDL-deeltjes efficiënt cholesterol kunnen opnemen uit ontstekingscellen. Inderdaad toonden we aan dat het HDL van mannen die waren blootgesteld aan kou efficiënter cholesterol op kon nemen vanuit ontstekingscellen dan HDL dat geïsoleerd was voor blootstelling aan kou.
Samengevat leidt korte blootstelling aan kou dus tot een verhoogde concentratie van grote VLDL deeltjes en kleine HDL deeltjes. Daarbij verhoogt korte blootstelling aan kou de functionaliteit van het HDL met betrekking tot opname van cholesterol, wat een beschermende werking kan hebben op de ontwikkeling van slagaderverkalking.
In hoofdstuk 6 focusten we ons op de rol van ontsteking in de ontwikkeling van slagaderverkalking. Het signaalmolecuul IL-37, dat aanwezig is in mensen en niet in muizen, werkt ontstekingsremmend. Een verhoogde hoeveelheid IL-37 in het lichaam zou dus mogelijk ontsteking kunnen verlagen en daardoor kunnen beschermen tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking. Daarom onderzochten we het effect van de aanwezigheid van IL-37 in ontstekingscellen op de ontwikkeling van slagaderverkalking
in muizen. Omdat ontstekingscellen geproduceerd worden vanuit cellen in het beenmerg, hebben we een beenmergtransplantatie uitgevoerd met beenmerg van muizen waar menselijk IL-37 aanwezig was of met beenmerg van controlemuizen waar IL-37 niet aanwezig was. Omdat IL-37 niet voorkomt in muizen kregen we op deze manier een groep muizen die IL-37 tot expressie bracht in hun ontstekingscellen en een controlegroep die IL-37 niet tot expressie bracht. Om slagaderverkalking te ontwikkelen kregen alle muizen een Westers dieet dat veel cholesterol bevat in vergelijking met standaard muizenvoer. De aanwezigheid van IL-37 in ontstekingscellen verlaagde inderdaad ontsteking in de muizen maar had geen effect op het lichaamsgewicht, de voedselinname en cholesterolgehaltes in het bloed. Ondanks de verlaagde ontsteking had de aanwezigheid van IL-37 in ontstekingscellen daarnaast ook geen effect op de ontwikkeling van slagaderverkalking. Hieruit concludeerden wij dat de aanwezigheid van IL-37 in ontstekingscelen niet beschermt tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking.
De aanmaak van signaalmoleculen die ontsteking bevorderen of juist remmen hangt af van de manier waarop ontstekingscellen geactiveerd worden. Binding van bepaalde structuren aan receptoren op de ontstekingscellen zoals zogenaamde ‘C-type lectin receptors’ (CLRs) zorgt voor activatie van deze cellen, wat vervolgens leidt tot de aanmaak van signaalmoleculen die de ontsteking bevorderen. In hoofdstuk 7 onderzochten we daarom of de afwezigheid in ontstekingscellen van de CLR Dectine-2 of van ‘caspase recruitment domain-containing protein 9’ (CARD9), de belangrijkste regulator van alle CLR-familieleden, beschermt tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking. Om dit te onderzoeken hebben we een beenmergtransplantatie uitgevoerd met beenmerg van muizen waarin ofwel géén Dectine-2 aanwezig was, ofwel géén CARD9 aanwezig was, of van controlemuizen waar Dectine-2 en CARD9 allebei wél aanwezig waren. Vervolgens kregen de muizen weer een Westers dieet om slagaderverkalking te induceren. De afwezigheid van Dectine-2 in ontstekingscellen had geen effect op zowel ontsteking als de ontwikkeling van slagaderverkalking. De afwezigheid van CARD9 in ontstekingscellen had ook geen effect op ontsteking, maar leidde verrassenderwijs tot de ontwikkeling van meer slagaderverkalking. Hieruit concludeerden we dat de afwezigheid van Dectine-2 in ontstekingscellen de ontwikkeling van slagaderverkalking niet beïnvloedt, terwijl afwezigheid van CARD9 in ontstekingscellen de ontwikkeling van slagaderverkalking bevordert, wat suggereert dat de aanwezigheid van CARD9 zou kunnen beschermen tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking.
10
CLRs zijn verantwoordelijk voor het herkennen van suikerachtige structuren op schimmels. Daarom bestudeerden we in hoofdstuk 8 nogmaals de rol van de CLR familie in de ontwikkeling van slagaderverkalking, ditmaal in een situatie met hoge suikergehaltes in het bloed, zoals voorkomt in mensen met suikerziekte ofwel diabetes. Onze hypothese was dat, in geval van diabetes, suikerachtige structuren in het bloed kunnen binden aan CLRs wat leidt tot activatie van ontstekingscellen. Daarom onderzochten we of de afwezigheid van Dectine-2 of CARD9 in ontstekingscellen beschermt tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking tijdens diabetes. Om dit te onderzoeken hebben we weer een beenmergtransplantatie uitgevoerd met beenmerg van muizen waarin ofwel géén Dectine-2 aanwezig was, ofwel géén CARD9 aanwezig was, of van controlemuizen waar Dectine-2 en CARD9 allebei wél aanwezig waren. Vervolgens zorgden we ervoor dat de muizen diabetes kregen, waarna ze een Westers dieet kregen om slagaderverkalking te kunnen ontwikkelen. De afwezigheid van Dectine-2 in ontstekingscellen verlaagde de hoeveelheid ontstekingscellen in het bloed maar deze ontstekingscellen maakten wel meer ontstekingsbevorderende signaalmoleculen. De afwezigheid van Dectine-2 in ontstekingscellen had geen effect op de ontwikkeling van slagaderverkalking. De afwezigheid van CARD9 in ontstekingscellen had geen effect op zowel ontsteking als op de ontwikkeling van slagaderverkalking. Daarom concludeerden we dat in diabetische muizen de afwezigheid van Dectine-2 of CARD9 in ontstekingscellen geen effect heeft op de ontwikkeling van slagaderverkalking.
De belangrijkste resultaten uit dit proefschrift zijn bediscussieerd in hoofdstuk 9.
Omdat resultaten die verkregen zijn uit proefdieren niet direct vertaald kunnen worden naar de mens, brengt onderzoek in proefdieren beperkingen met zich mee. Deze beperkingen werden besproken voor zowel het bruin vet-gerelateerde onderzoek als het ontstekings-gerelateerde onderzoek. Ook werd het toekomstperspectief besproken van bruinvetactivatie en ontstekingsverlagende strategieën in de strijd tegen hart- en vaatziekten. Samen hebben de studies die beschreven zijn in dit proefschrift onze kennis vergroot over zowel het effect van bruinvetactivatie op de vetstofwisseling en de ontwikkeling van slagaderverkalking, als de rol van ontsteking in de ontwikkeling van slagaderverkalking, wat aansluit op de onderzoeksdoelen uit dit proefschrift. Op basis van de resultaten beschreven in dit proefschrift lijkt vooral de activatie van bruin vet een veelbelovende strategie om hart- en vaatziekten verder terug te dringen.
10
LIST OF PUBLICATIONS
Schilperoort M, van Dam AD, Hoeke G, Shabalina IG, Okolo A, Hanyaloglu AC, Dib LH, Mol IM, Caengprasath N, Chan Y-W, Damak S, Reifel Miller A, Coskun T, Shimpukade B, Ulven T, Kooijman S, Rensen PCN, Christian M. The GPR120 agonist TUG-891 acutely increases lipid combustion in brown adipose tissue by stimulating mitochondrial fission and activating UCP1. EMBO Mol Med 2017; revision submitted.
Nahon KJ*, Hoeke G*, Bakker LEH, Jazet IM, Berbée JFP, Kersten S, Rensen PCN*, Boon MR*. Short-term cooling increases serum angiopoietin-like 4 levels in healthy lean men.
J Clin Lipidol 2017; in press. *contributed equally.
Hoeke G, Wang Y, van Dam AD, Mol IM, Gart E, Klop HG, van den Berg SM, Pieterman EH, Princen HMG, Groen AK, Rensen PCN, Berbée JFP*, Boon MR*. Atorvastatin accelerates clearance of lipoprotein remnants generated by activated brown fat to further reduce hypercholesterolemia and atherosclerosis. Atherosclerosis 2017; 267:116-126.
*contributed equally.
Hoeke G*, Khedoe PPSJ*, van Diepen JA, Pike-Overzet K, van de Ven B, Vazirpanah N, Mol I, Hiemstra PS, Staal FJT, Stienstra R, Netea MG, Dinarello CA, Rensen PCN, Berbée JFP. The effects of selective hematopoietic expression of human IL-37 on systemic inflammation and atherosclerosis in LDLr-deficient mice. Int J Mol Sci 2017; 18(8):1672. *contributed equally.
Berbée JFP, Mol IM, Milne GL, Pollock E, Hoeke G, Lütjohann D, Monaco C, Rensen PCN, van der Ploeg LHT, Shchepinov MS. Deuterium-reinforced polyunsaturated fatty acids protect against atherosclerosis by lowering lipid peroxidation and hypercholesterolemia.
Atherosclerosis 2017; 264:100-107.
Hoeke G*, Nahon KJ*, Bakker LEH, Norkauer SSC, Dinnes DLM, Kockx M, Lichtenstein L, Drettwan D, Reifel-Miller A, Coskun T, Pagel P, Romijn FPHTM, Cobbaert CM, Jazet IM, Martinez LO, Kritharides L, Berbée JFP, Boon MR*, Rensen PCN*. Short-term cooling increases serum triglycerides and small high-density lipoprotein levels in humans. J Clin Lipidol 2017; 11(4):920-928. *contributed equally.
Schilperoort M, Hoeke G, Kooijman S, Rensen PCN. Relevance of lipid metabolism for brown fat visualization and quantification. Curr Opin Lipidol 2016; 27(3):242-8.
Hoeke G, Kooijman S, Boon MR, Rensen PCN, Berbée JFP. Role of brown fat in lipoprotein metabolism and atherosclerosis. Circ Res 2016; 118(1):173-82.
Berbée JFP, Boon MR, Khedoe PP, Bartelt A, Schlein C, Worthmann A, Kooijman S, Hoeke G, Mol IM, John C, Jung C, Vazirpanah N, Bouwers LP, Gordts LP, Esko LD, Hiemstra PS, Havekes LM, Scheja L, Heeren J, Rensen PCN. Brown fat activation reduces hypercholesterolaemia and protects from atherosclerosis development. Nat Commun 2015; 6:6356.
Khedoe PP*, Hoeke G*, Kooijman S, Dijk W, Buijs JT, Kersten S, Havekes LM, Hiemstra PS, Berbée JFP, Boon MR*, Rensen PCN*. Brown adipose tissue takes up plasma triglycerides mostly after lipolysis. J Lipid Res 2015; 56(1):51-9. *contributed equally.
10
CURRICULUM VITAE
Geraldine Hoeke werd geboren op 14 juli 1990 te Soest. In 2008 behaalde zij haar VWO diploma aan het Griftland College te Soest. In datzelfde jaar startte zij met de studie Voeding en Gezondheid aan de Wageningen Universiteit, waar zij in 2012 het Bachelor of Science-diploma behaalde. Aansluitend startte zij haar Master Nutrition and Health met als specialisatie Molecular Nutrition aan de Wageningen Universiteit.
Tijdens haar Master raakte zij vooral geïnteresseerd in modulatie van de mitochondriële functie. Zo deed zij voor haar master thesis onderzoek naar het effect van deletie van mitofusin 1 dat betrokken is bij het fuseren van mitochondriën op de functie van mitochondriën in spiercellen. Dit onderzoek werd uitgevoerd onder supervisie van Dr.
Dorien van Dartel bij de afdeling ‘Human and Animal Physiology’ aan de Wageningen Universiteit. Hierna deed zij haar onderzoeksstage naar het effect van een vetrijk dieet op de mitochondriële β-oxidatie, onder supervisie van Dr. Jolita Ciapaite bij de afdeling Kindergeneeskunde aan het Universitair Medisch Centrum Groningen.
Nog voor het behalen van haar Master of Science-diploma startte Geerte in december 2013 met haar promotieonderzoek bij de sectie Endocrinologie binnen de afdeling Interne Geneeskunde van het Leids Universitair Medisch Centrum, onder supervisie van Prof. Patrick Rensen, Dr. Jimmy Berbée en Dr. Mariëtte Boon. Voor haar prestaties over haar werk won Geerte in 2016 een Travel Award voor de Atherosclerosis Thrombosis and Vascular Biology (ATVB) meeting in Nashville (Amerika) en in 2017 zowel een Young Investigator’s Award als een Poster Award tijdens de European Atherosclerosis Society (EAS) meeting in Praag (Tsjechië). Het promotieonderzoek waarvan de resultaten zijn beschreven in dit proefschrift werd afgerond in december 2017. Geerte zal na haar promotie haar droom najagen en zich richten op een carrière in het veldrijden.
10
DANKWOORD
Na 4 jaar is mijn proefschrift af. Dit was in mijn eentje echter niet gelukt, en daarom wil ik graag eindigen met een woord van dank aan iedereen die heeft bijgedragen.
Prof. Rensen, beste Patrick, de afgelopen 4 jaar heb jij me enorm veel geleerd en gestimuleerd door je enthousiasme, je humor en je blik: soms kritisch, soms door een roze bril. Ik heb veel bewondering voor de toewijding en de betrokkenheid die je toont voor het onderzoek en de mensen binnen jouw groep, waarin ik me ook enorm op mijn plek heb gevoeld. Dankjewel daarvoor. Dr. Berbée, beste Jimmy, we zaten praktisch naast elkaar en dus was jij mijn vraagbaak, degene met wie ik mijn blije en verdrietige momenten deelde. Ik wil je bedanken voor de precisie en het geduld waarmee je me zoveel hebt geleerd over het doen van onderzoek. Daarbij heb ik me door jouw rust en begrip altijd heel erg gesteund en begrepen gevoeld, zowel binnen het onderzoek als op persoonlijk vlak. Dr. Boon, beste Mariëtte, jij bent degene die mij heeft ingewerkt in het onderzoek en je gaf me al snel veel vertrouwen en vrijheid, maar stond ook altijd klaar als ik je hulp nodig had. Ik bewonder je geduld en ben je dankbaar voor alle keren dat je me met jouw positiviteit en enthousiasme weer op de rit hielp als ik het zelf even niet meer zag zitten.
Mijn directe collega’s wil ik bedanken voor de fijne samenwerking en de gezelligheid waardoor ik me enorm op mijn plek voelde. Yanan, I very much enjoyed working together with you. I will miss the countless conversations we had that were sometimes work-related, but were also often just girl-talk. De meiden van de oude ENDO-garde Andrea, Eline en Rosa, ze zeggen niet voor niets ‘teamwork makes dreamwork’. Ik had me geen betere hulp kunnen voorstellen tijdens alle experimenten. Ik heb mooie herinneringen aan onze tijd als collega’s! Kimberly, ik denk met veel plezier terug aan onze samenwerking en de twee manuscripten die daaruit voort zijn gekomen! Lisanne, bedankt voor je gezelligheid tijdens de EAS. Ondanks dat onze mening betreffende superlekkere smaakcombinaties wat uiteenloopt, vond ik het heel fijn dat we gelijk opliepen in het afronden van ons proefschrift en onze ervaringen konden delen. De meiden van de nieuwe ENDO-garde Ingrid, Iris, Laura, Lauren en Maaike, bedankt voor alle gezellige momenten in de kantoortuin, op het lab en de lunches! En dan hebben we natuurlijk nog de ENDO mannen. Sander, ik bedank je voor je hulp, je kritische blik en het introduceren van mijn bijnaam ‘Master G’, eentje die ik met trots gedragen heb. Jan,
Huub en Zhuang, bedankt voor alle gezelligheid bij de koffiepauzes. Enchen, I admire your positive energy and I know our colesevelam work is safe in your hands! Chris, Trea en Hetty, jullie zijn jullie gewicht in goud waard! Niet alleen op praktisch vlak, maar ook op mentaal vlak hebben jullie met humor en relativeringsvermogen mijn dag vaak weer goedgemaakt. Lianne, bedankt voor alle uren waarin je met mij hartjes hebt gesneden.
Ik had me geen fijnere partner kunnen wensen. Isabel, dankjewel voor de gezelligheid en al je hulp, je adviezen op onderzoeksgebied. De studenten die bij mij stage hebben gelopen - Lisanne, Bianca, José, Geert en Arthur - jullie waren stuk voor stuk harde werkers. Bedankt dat jullie mij ook elke dag wat leerden.
Ook wil ik mijn collega’s uit andere groepen en afdelingen bedanken voor hun bijdrages tijdens werkbesprekingen, experimenten en lab-uitjes. Padmini, bedankt voor al je hulp tijdens onze eerste studie. Ik bewonder je werklust en precisie. Collega’s van de Meijer groep Onno, Lisa, José, Lisa, Anne-Sophie, Jorge, Jinlan en van Humane Genetica, Ko, Vanessa, Amanda, Lianne, Mattijs, Sam, Saeed bedankt voor alle input op de werkbesprekingen! Ben en Fred, Silvia, Norma, Martine en alle andere mensen van het PDC, bedankt voor alle goede zorgen! Collega’s van TNO, bedankt voor de samenwerking.
Ook buiten werk hebben veel mensen indirect bijgedragen aan mijn promotieonderzoek.
Willemijn, jij hebt ervoor gezorgd dat mijn proefschrift meer is dan de wetenschappelijke inhoud. Door jouw prachtige ontwerp heeft mijn boekje een mooier jasje gekregen dan ik had durven dromen! Lisa, wat een geluk dat we vanuit Wageningen ook samen in Leiden terecht kwamen. Ik ben blij dat we de afgelopen 4 jaar onze vreugde en frustraties konden delen en kijk uit naar alle jaren dat we dat nog blijven doen en ik dank je voor alle gezellige momenten tijdens lunch, koffie, diner, of gewoon zomaar! De meiden van jaarclub Déjà vu, nog steeds vind ik het heel bijzonder dat wij al zoveel jaren onze Diës vieren. Bedankt voor alle gezelligheid, jullie interesse, de serieuze gesprekken en de onzinnige gesprekken. Evelien, wat begon met het schrijven van lange, versierde brieven heeft geresulteerd in een dierbare vriendschap. De manier waarop jij niet alleen heel hard werkt, maar ook je dromen achterna gaat en alles uit het leven haalt inspireert me! Suus, al sinds de middelbare school delen wij lief en leed en houden we elkaar op de hoogte van de laatste nieuwtjes. Dankjewel voor je luisterend oor, je relativeringsvermogen en de liters thee die we samen hebben gedronken!
