Activity-based profiling of glycoconjugate processing enzymes
Witte, M.D.
Citation
Witte, M. D. (2009, December 22). Activity-based profiling of glycoconjugate processing enzymes. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/14551
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/14551
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
Samenvatting
Activiteits-gebaseerd profileren van glycoconjugaat afbrekende enzymen
Het onderzoek naar biologische processen richt zich steeds meer op het analyseren van de betrokken moleculen en de bijbehorende reacties. In dit onderzoeksveld, ook wel chemische biologie genoemd, ontwikkelt men moleculair gereedschap (activiteitsgebaseerde probes) om een specifiek enzym te labelen en zo de rol van het enzym te bestuderen. Op activiteit gebaseerde probes bestaan uit drie delen: een reactieve groep, een “linker” en een label. De reactieve groep, ook wel “warhead” genoemd, reageert met een nucleofiel in het actieve centrum van een enzym, waarbij een covalente binding ontstaat. Om goede binding van de reactieve groep aan het enzym te bewerkstelligen wordt een “linker” ingebouwd. Deze beperkt mogelijke sterische hindering tussen het label en het actieve centrum van het enzym. Tevens kan de “linker” gebruikt worden om specificiteit te generen voor een bepaald enzym. Het label, vaak een fluorofoor, maakt de visualisatie/analyse van het covalente adduct mogelijk. In sommige gevallen kan de linker en/of label binding aan het enzym verhinderen. Een alternatieve methode om deze enzymen toch te kunnen labelen, is de zogenaamde twee-staps labeling. In plaats van een linker/label wordt een bioorthogonaal ligatie functionaliteit, zoals een azide, ingebouwd in de activiteitsgebaseerde probe. Binding aan het enzym wordt niet verstoord door de relatief kleine azido-groep en na binding kan het ligatie-handvat worden gebruikt om alsnog een label aan te brengen.
136 Samenvatting
Het onderzoek beschreven in dit proefschrift is gericht op het ontwikkelen van moleculair gereedschap dat gebruikt kan worden om enzymen die betrokken zijn bij de afbraak van glycoconjugaten te bestuderen. Er is een grote varieteit aan glycoconjugaten, maar over het algemeen bestaan ze uit een suikerstructuur welke via een N- of een O-glycosidische band is gebonden aan een eiwit, lipide of een ander suiker. Deze conjugaten spelen een rol in belangrijke biologische processen, zoals voedselopslag en cel-cel herkenning. De synthese en afbraak ervan is daarom goed gereguleerd en een verstoring van de balans veroorzaakt vaak ziektes. In Hoofdstuk 1 wordt allereerst het principe van activiteitsgebaseerde probes behandeld. Vervolgens worden de enzymen die betrokken zijn bij de opbouw en afbraak van glycoconjugaten beschreven en wordt een overzicht van de covalente remmers en activiteitsgebaseerde probes van deze enzymen gegeven.
Het enzym peptide N-glycanase (PNGase) is verantwoordelijk voor het loskoppelen van N-glycanen van glycoproteinen. De synthese en karakterisatie van een fluorescente probe voor dit enzym wordt beschreven in Hoofdstuk 2. Een in de literatuur beschreven covalente remmer van PNGase, Z-VAD-Fmk, werd voorzien van BODIPY-TMR. Deze fluorofoor maakte in-gel detectie van gelabeld eiwit mogelijk met behulp van een fluorescentie scanner. Labeling van PNGase met de ontstane probe was afhankelijk van concentratie van de probe en de activiteit van het enzym. De fluorescente probe werd gebruikt in competitie-experimenten om de activiteit van mogelijke nieuwe covalente remmers te onderzoeken.
In Hoofdstuk 3 wordt met behulp van een aantal gefunctionaliseerde chitobioses het belang van de reactieve groep op de potentie van PNGase-remmers beschreven. Aangezien het actieve centrum van PNGase overeenkomsten heeft met het actieve centrum van cysteine proteases werd chitobiose gefunctionaliseerd met verschillende reactieve groepen die voorkomen bij cysteine protease remmers. Het bleek dat de reactieve groep zeer belangrijk is voor de activiteit van de remmer. Chitobiose-derivaten voorzien met een goede vertrekkende groep (Cl, OMs) als “warhead” bleken potenter dan remmers met een slechtere vertrekkende groep (F, DMBA). Tevens bleek de stereochemie een grote rol te spelen in epoxide/aziridine bevattende inhibitoren, waarbij de S,S configuratie het meest potent was.
GlcNAcylering van eiwitten is een veel voorkomende post-translationele modificatie in het cytosol. Eiwitten in het cytosol worden afgebroken door het proteasoom maar het is niet duidelijk of dit voor geglycosyleerde eiwitten ook opgaat. De mogelijke afbraak van geglycosyleerde eiwitten wordt in Hoofdstuk 4 met behulp van geGlcNAcyleerde proteasoom probes bestudeerd. Twee verschillende soorten probes werden gesynthetiseerd.
Bij de eerste set probes werd de N-terminus van het peptide voorzien van een azidoacetyl.
In de tweede set werd de azide aangebracht op de suiker, door de acetyl van het glucosamine-residue te vervangen voor een azidoacetyl. Uit competitie-experimenten bleek dat het proteasoom geremd werd door beide geglycosyleerde probes. Om aan te tonen dat het glucosamine-residue niet was gehydrolyseerd door glycosidases, werd de azide in de probes na labeling gemodificeerd met biotine. Aangezien beide soorten probes hetzelfde
Samenvatting 137
labelingspatroon vertoonden, is deglycosylering van de probe geen vereiste voor binding aan het proteasome. Er mag daarom geconcludeerd worden dat het proteasome geGlcNAcyleerde eiwitten kan afbreken. De relevantie van de gevormde glycopeptides dient echter verder te worden onderzocht.
De natuurstof cyclophellitol was de basis voor het ontwerpen van zowel een twee-staps probe (KY170) als een directe probe (MDW933) voor exo β-glucosidases (Hoofdstuk 5).
Door het primaire alcohol van cyclophellitol te vervangen voor een azide-groep werd KY170 verkregen. Uit een assay met een fluorogeen substraat bleek dat de twee-staps probe een goede inhibitor is van β-glucosidase uit amandelen (de potentie voor dit enzym is ongeveer 10 keer verminderd door de introductie van de azide) alsmede recombinant glucocerebrosidase (IC50 100 nM) was. Vervolgens werd de twee-staps probe getoetst in labelingsexperimenten. Met gezuiverde enzymen kon het gevormde covalente probe-enzym adduct worden aangetoond door ligatie van de azide met een fluorofoor. Echter, een significante hoeveelheid niet-specifieke labeling werd waargenomen tijdens de ligatie van de fluorofoor in complexe monsters, zoals cellysaten of levende cellen. Om de problematische tweede stap te voorkomen werd de directe probe MDW933 gesynthetiseerd. De BODIPY fluorofoor werd geconjugeerd aan de azide van KY170 door middel van de koper- gekatalyseerde “click”-reactie. De directe probe bleek niet alleen een potentere remmer van glucocerebrosidae (IC50 2 nM), maar labelde bovendien GBA-1 selectief in cel-lysaten en levende cellen.
Glucocerebrosidase hydrolyseert de glycosidische band tussen glucose en ceramide.
Mutaties die leiden tot vouwingsproblemen van glucocerebrosidases zorgen voor een deficiëntie ervan, wat uiteindelijk leidt tot ophoping van het substraat glucosyl-ceramide.
Het gevolg is een stappelingsziekte die de ziekte van Gaucher wordt genoemd. Drie therapieën zijn bekend voor de ziekte van Gaucher, enzym-replacement therapie, substraat- reductie therapie en de chaperone therapie. Bij de enzym-therapie wordt recombinant enzym intraveneus bij een patient ingebracht. Een tweede methode is het herstellen van de balans tussen afbraak en synthese van glucosylceramide door het enzym dat de synthese katalyseert te remmen. Bij de laatste methode wordt de vouwing van het gemuteerde enzym hersteld door een chaperone, meestal een non-covalente remmer, toe te voegen. Hoofdstuk 6 beschrijft hoe MDW933 gebruikt werd om Gauchers’ ziekte te onderzoeken en in het bijzonder om de chaperone therapie te valideren. Uit de resultaten met MDW933 bleek dat chaperones zorgen voor een toename aan hoeveelheid eiwit in cellen met de mutatie Asn370Ser. De toename van activiteit was hiermee niet evenredig, wat er op kan duiden dat een deel van het enzym geremd wordt door de chaperones.
