University of Groningen
Compartmentalized cAMP Signaling in COPD
Zuo, Haoxiao
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2019
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Zuo, H. (2019). Compartmentalized cAMP Signaling in COPD: Focus on Phosphodiesterases and A-Kinase Anchoring Proteins. University of Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
10
Nederlandse Samenvatting
Yañez-Mó, M., Barreiro, O., Gonzalo, P., Batista, A., Megías, D., Genís, L., Sachs, N., Sala-Valdés, M., Alonso, M.A., Montoya, M.C., Sonnenberg, A., Arroyo, A.G., Sánchez-Madrid, F., 2008. MT1-MMP collagenolytic activity is regulated through association with tetraspanin CD151 in primary endothelial cells. Blood 112, 3217–3226.
Zeisberg, M., Neilson, E.G., 2009. Biomarkers for epithelial-mesenchymal transitions. J. Clin. Invest. 119, 1429–1437.
Zhang, F., Zhang, L., Qi, Y., Xu, H., 2016. Mitochondrial cAMP signaling. Cell. Mol. Life Sci. CMLS 73, 4577– 4590.
Zuo, H., Cattani-Cavalieri, I., Musheshe, N., Nikolaev, V.O., Schmidt, M., 2019a. Phosphodiesterases as therapeutic targets for respiratory diseases. Pharmacol. Ther.
Zuo, H., Cattani-Cavalieri, I., Valença, S.S., Musheshe, N., Schmidt, M., 2019b. Function of cyclic AMP scaffolds in obstructive lung disease: Focus on epithelial-to-mesenchymal transition and oxidative stress. Br. J. Pharmacol.
Zuo, H., Han, B., Poppinga, W.J., Ringnalda, L., Kistemaker, L.E.M., Halayko, A.J., Gosens, R., Nikolaev, V.O., Schmidt, M., 2018. Cigarette smoke up-regulates PDE3 and PDE4 to decrease cAMP in airway cells. Br. J. Pharmacol. 175, 2988–3006.
Introductie
Chronisch obstructief longlijden (COPD) is een veel voorkomende longziekte en een van de voornaamste doodsoorzaken wereldwijd. Kenmerken van COPD zijn o.a. een progressieve afname van longfunctie en luchtwegontsteking en -remodeling. Een belangrijke oorzaak van COPD is de blootstelling aan sigarettenrook.
De cyclische nucleotide cyclisch adenosinemonofosfaat, ofwel cAMP, is een secundaire boodschapper die betrokken is bij intracellulaire signaaltransductie en daardoor een belangrijke rol speelt bij verscheidene biochemische cellulaire processen. Sinds de start van onderzoek naar cyclische nucleotiden in de jaren ’50 van de vorige eeuw is aangetoond dat cAMP een cruciale rol speelt in o.a. de contractie en proliferatie van luchtweg gladde spiercellen, cel differentiatie, apoptose, migratie van kankercellen, afgifte van ontstekingsmediatoren, afzetting van extracellulair matrix en het onderhoudt van de endotheel- en epitheelbarrière. Stimulatie van G-proteïne gekoppelde receptoren, zoals de beta2-adrenoreceptor of specifieke prostaglandine receptoren, leidt tot de activatie van adenylyl cyclases (ACs) die de aanmaak van cAMP uit adenosinetrifosfaat katalyseren (Figuur 1).
Compartimentalisatie is een belangrijk onderdeel van cAMP signalering. Via cAMP compartimentalisatie worden extracellulaire signalen, via specifieke en afgebakende routes, verspreid binnen de cel. De diverse signaleringsroutes van cAMP zijn mogelijk doordat cAMP in staat is tot de activatie van meerdere effectormoleculen, waaronder proteïne kinase A (PKA), exchange proteins directly activated by cAMP (Epacs) en cyclische nucleotide-gemedieerde ionkanalen. De intracellulaire cAMP concentraties worden gecontroleerd door fosfodiësterases (PDEs), die cAMP hydrolyseren en daarmee haar mogelijkheid tot signaleren beëindigen. Daarnaast spelen de A-kinase anchoring proteins (AKAPs), die gelokaliseerd zijn op specifieke locaties in de cel, een cruciale rol in de instandhouding van cAMP compartimentalisatie door signaliseringscomplexen te vormen die lokale cAMP-gradiënten in stand houden.
In dit proefschrift wordt de rol van cAMP compartimentalisatie in COPD onderzocht, waarbij voornamelijk gefocust wordt op de betrokkenheid van PDEs en AKAPs na blootstelling aan sigarettenrook. De studies in dit proefschrift benadrukken de potentie van PDEs en AKAPs als therapeutische doelen in door sigarettenrook veroorzaakte COPD.
Visualisatie van cAMP-dynamiek in de luchtwegen
Biofysiologische methoden zoals op Förster resonance energy transfer (FRET)-gebaseerde biosensoren zijn ontwikkelend om real-time cAMP metingen te vereenvoudigen. Door middel van FRET kunnen fluctuaties van cAMP-niveaus in levende cellen gevisualiseerd worden. Tot op heden hebben slechts een handvol studies FRET toegepast in combinatie met structurele longcellen, waaronder humane
10
201
Nederlandse Samenvatting
Introductie
Chronisch obstructief longlijden (COPD) is een veel voorkomende longziekte en een van de voornaamste doodsoorzaken wereldwijd. Kenmerken van COPD zijn o.a. een progressieve afname van longfunctie en luchtwegontsteking en -remodeling. Een belangrijke oorzaak van COPD is de blootstelling aan sigarettenrook.
De cyclische nucleotide cyclisch adenosinemonofosfaat, ofwel cAMP, is een secundaire boodschapper die betrokken is bij intracellulaire signaaltransductie en daardoor een belangrijke rol speelt bij verscheidene biochemische cellulaire processen. Sinds de start van onderzoek naar cyclische nucleotiden in de jaren ’50 van de vorige eeuw is aangetoond dat cAMP een cruciale rol speelt in o.a. de contractie en proliferatie van luchtweg gladde spiercellen, cel differentiatie, apoptose, migratie van kankercellen, afgifte van ontstekingsmediatoren, afzetting van extracellulair matrix en het onderhoudt van de endotheel- en epitheelbarrière. Stimulatie van G-proteïne gekoppelde receptoren, zoals de beta2-adrenoreceptor of specifieke prostaglandine receptoren, leidt tot de activatie van adenylyl cyclases (ACs) die de aanmaak van cAMP uit adenosinetrifosfaat katalyseren (Figuur 1).
Compartimentalisatie is een belangrijk onderdeel van cAMP signalering. Via cAMP compartimentalisatie worden extracellulaire signalen, via specifieke en afgebakende routes, verspreid binnen de cel. De diverse signaleringsroutes van cAMP zijn mogelijk doordat cAMP in staat is tot de activatie van meerdere effectormoleculen, waaronder proteïne kinase A (PKA), exchange proteins directly activated by cAMP (Epacs) en cyclische nucleotide-gemedieerde ionkanalen. De intracellulaire cAMP concentraties worden gecontroleerd door fosfodiësterases (PDEs), die cAMP hydrolyseren en daarmee haar mogelijkheid tot signaleren beëindigen. Daarnaast spelen de A-kinase anchoring proteins (AKAPs), die gelokaliseerd zijn op specifieke locaties in de cel, een cruciale rol in de instandhouding van cAMP compartimentalisatie door signaliseringscomplexen te vormen die lokale cAMP-gradiënten in stand houden.
In dit proefschrift wordt de rol van cAMP compartimentalisatie in COPD onderzocht, waarbij voornamelijk gefocust wordt op de betrokkenheid van PDEs en AKAPs na blootstelling aan sigarettenrook. De studies in dit proefschrift benadrukken de potentie van PDEs en AKAPs als therapeutische doelen in door sigarettenrook veroorzaakte COPD.
Visualisatie van cAMP-dynamiek in de luchtwegen
Biofysiologische methoden zoals op Förster resonance energy transfer (FRET)-gebaseerde biosensoren zijn ontwikkelend om real-time cAMP metingen te vereenvoudigen. Door middel van FRET kunnen fluctuaties van cAMP-niveaus in levende cellen gevisualiseerd worden. Tot op heden hebben slechts een handvol studies FRET toegepast in combinatie met structurele longcellen, waaronder humane
202
Chapter 10
longepitheelcellen, gladde spiercellen en endotheelcellen. Real-time monitoring van cAMP-levels in longweefsel door middel van FRET was echter nog niet gemeld. Precisie-gesneden longplakjes (PCLS) zijn een erkend model om luchtreactiviteit en geneesmiddelentoxiciteit te bestuderen. In hoofdstuk 4 combineren we deze twee
technieken en tonen daarmee aan dat PCLS van transgene Epac1-camps
FRET-reporter muizen een unieke kans bieden om de luchtwegstructuur te onderzoeken. Daarnaast laten we met deze nieuwe benadering om cAMP te monitoren zien dat ex
vivo blootstelling aan sigarettenrookextract grotendeels de cellulaire cAMP-dynamiek en specifieke functionele reacties nabootst van longen van levende muizen die blootgesteld zijn aan sigarettenrook (hoofdstuk 4).
Figuur 1. Schematische weergave van de compartimentalisatie van cyclische nucleotide in de long. PDEs controleren de cAMP- en cGMP-signalering in de verschillende subcellulaire microdomeinen. Als gevolg worden de activiteiten van downstream-effectoren, zoals PKA, Epacs en PKG, beïnvloed. Afhankelijk van de stimulator of activator worden individuele PDEs op een specifieke tijd naar specifieke locaties in de cel gerekruteerd. A-kinase
anchoring proteins (AKAPs) zijn een groep scaffolding-eiwitten die het vermogen bezitten om via korte α-helical
structuren aan PKA te binden. Van een aantal PDEs en AKAPs is bekend dat ze sterk tot expressie komen in bijvoorbeeld mitochondria (AKAP1) of het plasmamembraan (AKAP5 en AKAP12). De moleculaire link tussen AKAPs en PDEs in specifieke compartimenten in de lung is echter nog niet ontrafeld. PDEs, fosfodiësterases; PKA, cAMP-afhankelijke proteïne kinase A; Epacs, exchange proteins directly activated by cAMP; PKG, cGMP-afhankelijke proteïne kinase G; AKAPs, A-kinase anchoring proteins; EP, E prostaglandine receptor; β2-AR, β2
-adrenoceptor; AC, adenylyl cyclase; pGC, particulate guanlytate cyclase; sGC, soluble guanylyl cyclase; NO,
stikstofmono-oxide; IP3R, inositol trisphosphate receptor; SERCA, sarco/endoplasmatisch reticulum Ca2+-ATPase.
De impact van sigarettenrook op de werking van fosfodiësterases
De superfamilie van PDEs bestaat uit 11 families met verschillen in substraatspecificiteit, moleculaire structuur en locatie binnen de cel. Hoofdstuk 3 vat
de regulatie van verschillende PDEs (PDE3, PDE4, PDE5, PDE7 en PDE8) en de rol van subtype specifieke remmers in COPD en astma samen (Figuur 1). In hoofdstuk 4 worden met behulp van in vivo en ex vivo modellen de effecten van sigarettenrook
op de regulatie van PDE3 en PDE4 specifiek in de luchtwegen beschreven. Blootstelling aan sigarettenrook leidt tot een verhoogde activiteit van PDE3 en verhoogde expressie en activiteit van verschillende PDE4 subtypen. Verder tonen we aan de PDE4 remming de door sigarettenrook verminderde ciliary beating frequency van luchtwegepitheelcellen en remming van PDE3 de verlaagde luchtwegrelaxatie herstellen in PCLS. Onze bevindingen laten dus zien dat hoewel zowel PDE3 als PDE4 betrokken zijn bij veranderingen in cAMP-dynamiek na blootstelling aan sigarettenrook, de fysiologische uitkomsten in de luchtweg erg verschillend zijn. Dit toont aan dat combinatietherapie van PDE3 en PDE4 inhibitors wellicht een betere therapie is voor ziekten zoals COPD dan subtype specifieke therapieën.
Figuur 2. Het effect van sigarettenrook op cAMP-compartimentalisatie in structurele luchtwegcellen. Blootstelling aan sigarettenrook induceert de expressie en activiteit van zowel PDE3 als PDE4, waardoor de real-time
cAMP-dynamiek wordt beïnvloed. Daarnaast stimuleert sigarettenrook de afgifte van TGF-β1, met de activatie van het
epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)-proces tot gevolg. A-kinase anchoring proteins (AKAPs), en in het
bijzonder Ezrin, AKAP95 en Yotiao, zijn in staat om TGF-β1- en sigarettenrook-geïnduceerde EMT te moduleren.
Chronische blootstelling aan sigarettenrook verandert zowel de PDE gen- als eiwitexpressie in nasale en bronchiale brushes en longweefsel.
10
203
Nederlandse Samenvatting
longepitheelcellen, gladde spiercellen en endotheelcellen. Real-time monitoring van cAMP-levels in longweefsel door middel van FRET was echter nog niet gemeld. Precisie-gesneden longplakjes (PCLS) zijn een erkend model om luchtreactiviteit en geneesmiddelentoxiciteit te bestuderen. In hoofdstuk 4 combineren we deze twee
technieken en tonen daarmee aan dat PCLS van transgene Epac1-camps
FRET-reporter muizen een unieke kans bieden om de luchtwegstructuur te onderzoeken. Daarnaast laten we met deze nieuwe benadering om cAMP te monitoren zien dat ex
vivo blootstelling aan sigarettenrookextract grotendeels de cellulaire cAMP-dynamiek en specifieke functionele reacties nabootst van longen van levende muizen die blootgesteld zijn aan sigarettenrook (hoofdstuk 4).
Figuur 1. Schematische weergave van de compartimentalisatie van cyclische nucleotide in de long. PDEs controleren de cAMP- en cGMP-signalering in de verschillende subcellulaire microdomeinen. Als gevolg worden de activiteiten van downstream-effectoren, zoals PKA, Epacs en PKG, beïnvloed. Afhankelijk van de stimulator of activator worden individuele PDEs op een specifieke tijd naar specifieke locaties in de cel gerekruteerd. A-kinase
anchoring proteins (AKAPs) zijn een groep scaffolding-eiwitten die het vermogen bezitten om via korte α-helical
structuren aan PKA te binden. Van een aantal PDEs en AKAPs is bekend dat ze sterk tot expressie komen in bijvoorbeeld mitochondria (AKAP1) of het plasmamembraan (AKAP5 en AKAP12). De moleculaire link tussen AKAPs en PDEs in specifieke compartimenten in de lung is echter nog niet ontrafeld. PDEs, fosfodiësterases; PKA, cAMP-afhankelijke proteïne kinase A; Epacs, exchange proteins directly activated by cAMP; PKG, cGMP-afhankelijke proteïne kinase G; AKAPs, A-kinase anchoring proteins; EP, E prostaglandine receptor; β2-AR, β2
-adrenoceptor; AC, adenylyl cyclase; pGC, particulate guanlytate cyclase; sGC, soluble guanylyl cyclase; NO,
stikstofmono-oxide; IP3R, inositol trisphosphate receptor; SERCA, sarco/endoplasmatisch reticulum Ca2+-ATPase.
De impact van sigarettenrook op de werking van fosfodiësterases
De superfamilie van PDEs bestaat uit 11 families met verschillen in substraatspecificiteit, moleculaire structuur en locatie binnen de cel. Hoofdstuk 3 vat
de regulatie van verschillende PDEs (PDE3, PDE4, PDE5, PDE7 en PDE8) en de rol van subtype specifieke remmers in COPD en astma samen (Figuur 1). In hoofdstuk 4 worden met behulp van in vivo en ex vivo modellen de effecten van sigarettenrook
op de regulatie van PDE3 en PDE4 specifiek in de luchtwegen beschreven. Blootstelling aan sigarettenrook leidt tot een verhoogde activiteit van PDE3 en verhoogde expressie en activiteit van verschillende PDE4 subtypen. Verder tonen we aan de PDE4 remming de door sigarettenrook verminderde ciliary beating frequency van luchtwegepitheelcellen en remming van PDE3 de verlaagde luchtwegrelaxatie herstellen in PCLS. Onze bevindingen laten dus zien dat hoewel zowel PDE3 als PDE4 betrokken zijn bij veranderingen in cAMP-dynamiek na blootstelling aan sigarettenrook, de fysiologische uitkomsten in de luchtweg erg verschillend zijn. Dit toont aan dat combinatietherapie van PDE3 en PDE4 inhibitors wellicht een betere therapie is voor ziekten zoals COPD dan subtype specifieke therapieën.
Figuur 2. Het effect van sigarettenrook op cAMP-compartimentalisatie in structurele luchtwegcellen. Blootstelling aan sigarettenrook induceert de expressie en activiteit van zowel PDE3 als PDE4, waardoor de real-time
cAMP-dynamiek wordt beïnvloed. Daarnaast stimuleert sigarettenrook de afgifte van TGF-β1, met de activatie van het
epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)-proces tot gevolg. A-kinase anchoring proteins (AKAPs), en in het
bijzonder Ezrin, AKAP95 en Yotiao, zijn in staat om TGF-β1- en sigarettenrook-geïnduceerde EMT te moduleren.
Chronische blootstelling aan sigarettenrook verandert zowel de PDE gen- als eiwitexpressie in nasale en bronchiale brushes en longweefsel.
204
Chapter 10
Hoofdstuk 5 en 8 richten zich op PDE8. PDE8 heeft een hogere affiniteit en lagere
Km voor cAMP dan andere PDE isovormen en is daardoor wellicht een goede target
om low-level intracellulaire cAMP signalering te beïnvloeden (hoofdstuk 5). PDE8
remming verhoogt selectief de cAMP-levels die gegenereerd worden door beta-2-adenoreceptor activatie, maar het heeft geen effect als de prostaglandine E2 of E4 worden geactiveerd. In hoofdstuk 8 rapporteren we de bevindingen dat de
genexpressie van PDE8A in basaal epitheel en PDE8A en PDE8A en PDE8B verlaagd zijn in bronchiaal epitheel na chronische blootstelling aan sigarettenrook. Dit alles toont aan dat PDE8 in COPD een interessant onderzoeksthema is.
Hoofdstuk 8 onderzoekt de veranderingen in PDEs na blootstelling aan
sigarettenrook in humane epitheelcellen verkregen uit nasale en bronchiale brushes en in volledig longweefsel (figuur 2). We tonen aan dat de genexpressie van de
verschillende PDE isovormen afhangt van rookstatus (nooit gerookt, huidige roker of ex-roker) en celtype. Onze data indiceert dat de PDE superfamilie een veelbelovende target is voor de ontwikkeling van specifieke en effectieve therapieën voor COPD.
De impact van AKAPs en PDEs op cAMP compartimentalisatie in
EMT
Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is een proces, waarbij gepolariseerde epitheelcellen meerdere biochemische veranderingen ondergaan en daardoor geleidelijk het fenotype van mesenchymale cellen verkrijgen en kan worden waargenomen tijdens COPD. In hoofdstuk 7 tonen we aan dat voorbehandeling met
de PDE3 remmer cilostamide en de PDE4 remmer rolipram TGF-β1-geïnduceerde verhoging van de mesenchymale marker collageen I significant verlagen. Dit indiceert dat cAMP stimulatie via PDE3 en PDE4 remming in staat is om TGF- β1-geïnduceerde EMT gedeeltelijk tegen te gaan.
AKAPs spelen een rol in cAMP compartimentalisatie door de regulatie van PKA. In
hoofdstuk 7 wordt ook de rol van AKAPs in TGF-β1- en sigarettenrook
geïnduceerde EMT onderzocht. Blootstelling aan sigarettenrook is in staat om TGF-β1-signalering te activeren wat EMT in werking kan stellen. De eerder genoemde verhoging van collageen 1 door TGF-β1 kan worden verminderd door het verstoren van AKAP-PKA interactie. Gen- en eiwitexpressie en knockdown-experimenten tonen aan dat verschillende AKAPs (Ezrin, Yotiao en AKAP95) betrokken zijn bij TGF- β1-geïnduceerde EMT. Dit wordt geassocieerd met de beta-2-adenoreceptor, maar niet met PDE3 en PDE4. Daarnaast is knockdown van de drie eerdergenoemde AKAP subtypen tegelijkertijd is in staat om TGF-β1-geïnduceerde celmigratie te voorkomen.
Toekomstperspectief
De studies uit dit proefschrift beschrijven hoe cAMP-compartimentalisatie, specifiek door PDEs en AKAPs, een belangrijke rol spelen in pathofysiologische processen van COPD. Via de modulatie van signaleringscascades in de cel beïnvloedt de alomtegenwoordige secundaire boodschapper cAMP een breed scala aan
fysiologische functies. Een beter begrip van cAMP-fluctuaties, zoals aanmaak en degradatie, en -functies binnen specifieke compartimenten van de cel zal een bijdrage kunnen leveren aan de screening en ontwikkeling van nieuwe effectieve therapeutische targets met minder bijwerkingen. Een bevinding die het belang van cAMP-modulatie in microdomeinen aantoont is de recentelijke vondst dat β2-AR/-AC6/-PDE8 hoofdzakelijk tot expressie komen in caveolae van het plasmamembraan van humane luchtweg gladde spiercellen.
De monitoring van intracellulaire cAMP-dynamiek wordt echter nog steeds bemoeilijkt door beperkingen van de bestaande biochemische methode. Voor cardiovasculair onderzoek zijn tot op heden verscheidene op FRET-gebaseerde biosensoren ontwikkeld die de real-time visualisatie van cAMP in specifieke microdomeinen vergemakkelijken, waaronder sensoren gericht op natrium-kaliumpomp ATPase, sarcoplasmatisch/endoplasmatisch reticulum calcium ATPase, AKAP79 en mitochondria. De ontwikkeling en het gebruik van soortgelijke microdomein-specifieke cAMP-biosensoren in de long kunnen een belangrijke bijdrage leveren aan ons begrip van cAMP-dynamiek in het longziekten.
Daarnaast is er vooralsnog geen cGMP FRET-biosensor gerapporteerd voor studies naar intracellulaire cGMP levels in structurele longcellen of longweefsel. Het ligt namelijk in de lijn der verwachting dat monitoring van microdomein-specifieke intracellulaire cAMP- en cGMP-levels, en vooral hun signaaloverdracht gemoduleerd door PDE2 en PDE3, meer inzicht zullen opleveren voor de ontwikkeling van nieuwe en specifiekere medicijnen gericht tegen cyclische nucleotiden.
Inzicht in gecompartimentaliseerde cAMP-signalering in de long helpt wellicht ook bij het ontrafelen van de specifieke stadia van het EMT-proces dat optreedt bij diverse longaandoeningen waaronder longfibrose. Recentelijke bevindingen suggereren dat de cAMP-levels die door verscheidene receptorsubtypen, PDEs, PKA, Epac en leden van de AKAP superfamilie gereguleerd worden, mogelijk specifieke aspecten van het EMT-proces beïnvloeden. Tot op heden zijn de farmaceutische behandelingsmethoden voor longfibrose erg beperkt. Toekomstige studies gericht op de specifieke rol van cAMP-compartimentalisatie kunnen hier wellicht verandering in brengen.
Conclusies
De belangrijkste conclusies die uit dit proefschrift getrokken kunnen worden zijn: De combinatie van real-time cAMP-monitoring door middel van FRET en de nabootsing van het longmicroklimaat met PCLS biedt een unieke kans om de complete luchtwegstructuur te bestuderen (hoofdstuk 4).
Blootstelling aan sigarettenrook veroorzaakt een verhoogde capaciteit voor PDE3- en PDE4- activiteiten in muizen-PCLS en gekweekte humane luchtweg gladde spiercellen en epitheelcellen. Dit is waarschijnlijk een afspiegeling van door de
10
205
Nederlandse Samenvatting
Hoofdstuk 5 en 8 richten zich op PDE8. PDE8 heeft een hogere affiniteit en lagere
Km voor cAMP dan andere PDE isovormen en is daardoor wellicht een goede target
om low-level intracellulaire cAMP signalering te beïnvloeden (hoofdstuk 5). PDE8
remming verhoogt selectief de cAMP-levels die gegenereerd worden door beta-2-adenoreceptor activatie, maar het heeft geen effect als de prostaglandine E2 of E4 worden geactiveerd. In hoofdstuk 8 rapporteren we de bevindingen dat de
genexpressie van PDE8A in basaal epitheel en PDE8A en PDE8A en PDE8B verlaagd zijn in bronchiaal epitheel na chronische blootstelling aan sigarettenrook. Dit alles toont aan dat PDE8 in COPD een interessant onderzoeksthema is.
Hoofdstuk 8 onderzoekt de veranderingen in PDEs na blootstelling aan
sigarettenrook in humane epitheelcellen verkregen uit nasale en bronchiale brushes en in volledig longweefsel (figuur 2). We tonen aan dat de genexpressie van de
verschillende PDE isovormen afhangt van rookstatus (nooit gerookt, huidige roker of ex-roker) en celtype. Onze data indiceert dat de PDE superfamilie een veelbelovende target is voor de ontwikkeling van specifieke en effectieve therapieën voor COPD.
De impact van AKAPs en PDEs op cAMP compartimentalisatie in
EMT
Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is een proces, waarbij gepolariseerde epitheelcellen meerdere biochemische veranderingen ondergaan en daardoor geleidelijk het fenotype van mesenchymale cellen verkrijgen en kan worden waargenomen tijdens COPD. In hoofdstuk 7 tonen we aan dat voorbehandeling met
de PDE3 remmer cilostamide en de PDE4 remmer rolipram TGF-β1-geïnduceerde verhoging van de mesenchymale marker collageen I significant verlagen. Dit indiceert dat cAMP stimulatie via PDE3 en PDE4 remming in staat is om TGF- β1-geïnduceerde EMT gedeeltelijk tegen te gaan.
AKAPs spelen een rol in cAMP compartimentalisatie door de regulatie van PKA. In
hoofdstuk 7 wordt ook de rol van AKAPs in TGF-β1- en sigarettenrook
geïnduceerde EMT onderzocht. Blootstelling aan sigarettenrook is in staat om TGF-β1-signalering te activeren wat EMT in werking kan stellen. De eerder genoemde verhoging van collageen 1 door TGF-β1 kan worden verminderd door het verstoren van AKAP-PKA interactie. Gen- en eiwitexpressie en knockdown-experimenten tonen aan dat verschillende AKAPs (Ezrin, Yotiao en AKAP95) betrokken zijn bij TGF- β1-geïnduceerde EMT. Dit wordt geassocieerd met de beta-2-adenoreceptor, maar niet met PDE3 en PDE4. Daarnaast is knockdown van de drie eerdergenoemde AKAP subtypen tegelijkertijd is in staat om TGF-β1-geïnduceerde celmigratie te voorkomen.
Toekomstperspectief
De studies uit dit proefschrift beschrijven hoe cAMP-compartimentalisatie, specifiek door PDEs en AKAPs, een belangrijke rol spelen in pathofysiologische processen van COPD. Via de modulatie van signaleringscascades in de cel beïnvloedt de alomtegenwoordige secundaire boodschapper cAMP een breed scala aan
fysiologische functies. Een beter begrip van cAMP-fluctuaties, zoals aanmaak en degradatie, en -functies binnen specifieke compartimenten van de cel zal een bijdrage kunnen leveren aan de screening en ontwikkeling van nieuwe effectieve therapeutische targets met minder bijwerkingen. Een bevinding die het belang van cAMP-modulatie in microdomeinen aantoont is de recentelijke vondst dat β2-AR/-AC6/-PDE8 hoofdzakelijk tot expressie komen in caveolae van het plasmamembraan van humane luchtweg gladde spiercellen.
De monitoring van intracellulaire cAMP-dynamiek wordt echter nog steeds bemoeilijkt door beperkingen van de bestaande biochemische methode. Voor cardiovasculair onderzoek zijn tot op heden verscheidene op FRET-gebaseerde biosensoren ontwikkeld die de real-time visualisatie van cAMP in specifieke microdomeinen vergemakkelijken, waaronder sensoren gericht op natrium-kaliumpomp ATPase, sarcoplasmatisch/endoplasmatisch reticulum calcium ATPase, AKAP79 en mitochondria. De ontwikkeling en het gebruik van soortgelijke microdomein-specifieke cAMP-biosensoren in de long kunnen een belangrijke bijdrage leveren aan ons begrip van cAMP-dynamiek in het longziekten.
Daarnaast is er vooralsnog geen cGMP FRET-biosensor gerapporteerd voor studies naar intracellulaire cGMP levels in structurele longcellen of longweefsel. Het ligt namelijk in de lijn der verwachting dat monitoring van microdomein-specifieke intracellulaire cAMP- en cGMP-levels, en vooral hun signaaloverdracht gemoduleerd door PDE2 en PDE3, meer inzicht zullen opleveren voor de ontwikkeling van nieuwe en specifiekere medicijnen gericht tegen cyclische nucleotiden.
Inzicht in gecompartimentaliseerde cAMP-signalering in de long helpt wellicht ook bij het ontrafelen van de specifieke stadia van het EMT-proces dat optreedt bij diverse longaandoeningen waaronder longfibrose. Recentelijke bevindingen suggereren dat de cAMP-levels die door verscheidene receptorsubtypen, PDEs, PKA, Epac en leden van de AKAP superfamilie gereguleerd worden, mogelijk specifieke aspecten van het EMT-proces beïnvloeden. Tot op heden zijn de farmaceutische behandelingsmethoden voor longfibrose erg beperkt. Toekomstige studies gericht op de specifieke rol van cAMP-compartimentalisatie kunnen hier wellicht verandering in brengen.
Conclusies
De belangrijkste conclusies die uit dit proefschrift getrokken kunnen worden zijn: De combinatie van real-time cAMP-monitoring door middel van FRET en de nabootsing van het longmicroklimaat met PCLS biedt een unieke kans om de complete luchtwegstructuur te bestuderen (hoofdstuk 4).
Blootstelling aan sigarettenrook veroorzaakt een verhoogde capaciteit voor PDE3- en PDE4- activiteiten in muizen-PCLS en gekweekte humane luchtweg gladde spiercellen en epitheelcellen. Dit is waarschijnlijk een afspiegeling van door de
206
Chapter 10
sigarettenrook-geïnduceerde veranderingen in intracellulaire cAMP-niveaus (hoofdstuk 4). Sigarettenrook beïnvloedt daarnaast het expressieprofiel van
verschillende PDEs, PDE4 mRNA- en eiwitniveaus en PDE4 en PDE3 activiteit worden geïnduceerd, terwijl de expressie van PDE3 onveranderd blijft (hoofdstuk 4).
Sigarettenrookextract beïnvloedt de PDE-activiteit op een cel-specifieke manier, cilostamide-gevoelige PDE3-activiteiten worden voornamelijk verhoogd in humane luchtweg gladde spiercellen, terwijl rolipram-gevoelige PDE4-activiteit is verhoogd in zowel humane luchtweg gladde spiercellen en epitheelcellen (hoofdstuk 4).
Behandeling met rolipram herstelt de verminderde ciliary beating frequency ex vivo in aan sigarettenrookextract-blootgestelde PCLS. De relaxatie van luchtwegen voorvernauwd met methacholine wordt juist significant verhoogd na behandeling met cilostamide.
AKAPs, in het bijzonder Ezrin, AKAP95 en Yotiao, zijn betrokken bij TGF- β1-geïnduceerde EMT. De gecombineerde remming van Ezrin, AKAP95 en Yotiao vermindert de TGF-β1-veroorzaakte celmigratie (hoofdstuk 7).
β2-AR is geassocieerd met Ezrin, AKAP95 en Yotiao. PDE3 en PDE4 zijn echter niet gelokaliseerd in hetzelfde cAMP-compartiment als Ezrin, AKAP95 en Yotiao (hoofdstuk 7).
Blootstelling aan sigarettenrook verandert de genexpressie van de PDE-subfamilies in 3 afzonderlijke cohortstudies bestaande uit epitheelcellen geïsoleerd uit nasale of bronchiale brushes of longweefsel (hoofdstuk 8). Van de PDE-subfamilieleden
vertoont alleen PDE4 in alle drie de cohorts een gewijzigde expressie (hoofdstuk 8).
PDE3A komt voornamelijk tot expressie in luchtweg gladde spiercellen, terwijl PDE4B en PDE4D in zowel luchtweg epitheelcellen als gladde spiercellen detecteerbaar zijn. Dit illustreert het verschil in verspreiding van PDE3 en PDE4 (hoofdstuk 8).
