University of Groningen
Oncogenic variants guiding treatment in thoracic malignancies Meng, Pei
DOI:
10.33612/diss.160074057
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2021
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Meng, P. (2021). Oncogenic variants guiding treatment in thoracic malignancies. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.160074057
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
appeNDICeS
De ontwikkeling van gepersonaliseerde therapie heeft de behandeling van kankerpatiënten ingrijpend veranderd, met betere behandelresultaten en minder bijwerkingen. Deze ontwikkeling werd mogelijk gemaakt door implementatie van moleculaire analyses in de routine diagnostiek. Via deze analyses worden genen onderzocht om vervolgens patiënten te kunnen selecteren voor doelgerichte therapie, maar ook om behandelrespons te kunnen monitoren. In een research setting faciliteren deze methodes de identificatie van resistentiemechanismen. Het doel van het onderzoek beschreven in dit proefschrift was om diagnostische methoden te verbeteren, resistentiemechanismen te identificeren en de prognostische waarde van moleculaire biomarkers bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC) en oesophagus plaveiselcelcarcinoom (ESCC) te onderzoeken.
De behandeling van gemetastaseerde NSCLC-patiënten wordt bepaald door de aanwezigheid van activerende mutaties in oncogenen die de respons op specifieke kinaseremmers voorspellen. Vervolg behandellijnen worden vaak bepaald aan de hand van resistentie-geassocieerde genomische veranderingen die na behandeling naar voren komen. Genomische afwijkingen die de initiële en vervolg behandellijnen bepalen, omvatten puntmutaties (SNV), kleine inserties en deleties (InDel), mutaties die resulteren in afwijkende splicing, genfusies en amplificaties. Op dit moment zijn er meerdere onafhankelijke testen nodig om alle relevante afwijkingen in een klinische setting uit te voeren. De vaak kleine weefselbiopten maken het lastig om al deze testen op een goede manier uit te kunnen voeren.
In hoofdstuk 2 hebben we een alles-in-één transcriptoom-gebaseerde next generation sequencing (NGS) test ontworpen en onderzocht of we met deze test alle klinisch relevante variaties voor NSCLC efficiënt kunnen detecteren. We hebben de methode in eerste instantie getest op DNA geïsoleerd uit cellijnen en vervolgens op DNA geïsoleerd uit bevroren weefsel biopten, pleurale effusies en formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) biopten van NSCLC met bekende mutaties in EGFR, KRAS, ALK, PIK3CA, BRAF, AKT1, MET, NRAS of ROS1, of genfusies van ALK, ROS1, RET en NTRK1. Bij een ondergrens van ≥50.000 unieke reads en een DV200 RNA-kwaliteit van ≥30 werden alle verwachte varianten, d.w.z. 19 SNVs en InDels, drie MET exon 14 skipping mutaties en 13 fusiegenen gedetecteerd. Dit resulteerde in een testnauwkeurigheid van 100%. De betrouwbaarheid van de test neemt af als de kwaliteit van de samples afneemt, en in dergelijke gevallen is een zorgvuldige interpretatie van de gegevens essentieel.
In de afgelopen jaren is er veel onderzoek gedaan naar andere mogelijkheden voor het verkrijgen van tumor materiaal. Het meeste onderzoek is gedaan naar het opsporen van markers in het bloed. Dit is een minimaal invasieve benadering om het moleculaire profiel van tumoren te bepalen. Circulerend tumor (ct) DNA-moleculen lijken vooralsnog de meest veelbelovende bron voor het betrouwbaar meten van somatische mutaties. Andere op bloed-gebaseerde bronnen voor tumor-specifieke markers zijn circulerende tumorcellen (CTC's), exosomen/ microvesicels en bloedplaatjes. Bloedplaatjes bevatten RNA afkomstig van exosomen die onder andere afkomstig zijn van tumorcellen en als zodanig een weerspiegeling zouden kunnen zijn van het transcriptoomprofiel van tumorcellen. In hoofdstuk 3 hebben we onze transcriptoom-gebaseerde NGS-test toegepast op RNA geïsoleerd uit bloedplaatjes van patiënten met actieve ziekte en bekende oncogene-mutaties. Ondanks het genereren van voldoende unieke reads, hebben we geen van de verwachte varianten kunnen detecteren. Dit zou kunnen betekenen dat de hoeveelheid RNA afkomstig van de tumorcellen niet voldoende is om met deze test te kunnen worden aangetoond of dat de “scavanger”-functie van bloedplaatjes anders is dan eerder werd aangenomen. Als volgende stap hebben we de meer gevoelige digitale droplet-PCR (ddPCR) -test voor T790M, L858R en E19del in EGFR, codon 12 en 13 van KRAS en het ALK-EML4 / KIF5B-fusietranscript toegepast. In slechts drie van de 22 samples werden de te verwachte varianten
Appendices
A
gevonden. De drie gedetecteerde varianten waren allemaal KRAS-hotspotmutaties en deze werden met een zeer lage frequentie, variërend van 0,07% tot 0,55%, gevonden. Dit onderzoek gaf aan dat bloedplaatjes veel niet-gemuteerde KRAS-transcripten bevatten. In tegenstelling tot KRAS waren het aantal detecteerbare EGFR-transcripten extreem laag in bloedplaatjes en waren we niet in staat om mutante EGFR-transcripten te detecteren. Ten slotte hebben we ook geen van de verwachte acht ALK-fusietranscripten in bloedplaatjes-RNA gedetecteerd. Om de aanwezigheid van op bloed gebaseerde tumorcel-specifieke biomarkers verder vast te stellen, analyseerden we elf gematchte celvrije (cf) DNA-monsters geïsoleerd uit dezelfde bloedbuisjes. In deze monsters waren we in staat om circulerend tumor (ct) DNA te detecteren in acht van de elf plasmamonsters, met frequenties variërend tussen de 3% en 37%. Het niveau van tumorcel afkomstige RNA-transcripten in bloedplaatjes van NSCLC-patiënten is dus afwezig of te laag om betrouwbare detectie van klinisch relevante veranderingen in EGFR-, KRAS- en ALK-fusiegen-transcripten mogelijk te maken.
Een klein deel van de patiënten met een bekende activerende mutatie in BRAF reageert niet op de BRAF-specifieke remmers. Andere patiënten laten na een aanvankelijke goede respons uiteindelijk toch progressie zien. Dit kan worden verklaard door reeds aanwezige resistentievarianten of door evolutie van de tumorcellen tijdens de behandeling. Gecombineerde therapie met dabrafenib (BRAF-remmer) en trametinib (MEK-remmer) wordt routinematig gebruikt bij gevorderde NSCLC-patiënten met een BRAF p. (V600E) -mutatie. In hoofdstuk 4 bestudeerden we resistentiemechanismen bij, en de progressie-vrije overleving (PFS) van, 34 BRAF mutatie-positieve NSCLC-patiënten. Drie van de patiënten kregen systeem therapie vóór de gecombineerde behandeling met dabrafenib en trametinib, terwijl de andere patiënten in de eerste lijn met BRAF/MEK remmers werden behandeld. Het doel van deze studie was om te onderzoeken of de aanwezigheid van een gelijktijdige oncogene variant naast de BRAF p.(V600E) in de weefselbiopten die werden verkregen vóór de start van BRAF- en MEK-remmers correleerde met een kortere PFS. Details met betrekking tot de aanwezigheid van oncogene varianten werden verkregen uit klinisch diagnostische gegevens. Deze gegevens werden aangevuld door handmatige inspectie van volledige exome-sequentiegegevens met behulp van de “integrated genome viewer” (IGV). We hebben gelijktijdige andere oncogene mutaties waargenomen bij acht van de 36 patiënten. Bij vier patiënten werden gelijktijdige mutaties gevonden in genen die een rol spelen in de PI3K-signaleringsroute (PIK3CA en AKT1), bij één patiënt in de MAPK-route (BRAF G466V en KIT), bij twee patiënten in IDH1 en bij één patiënt in GNAS. De gelijktijdige aanwezigheid van al deze mutaties, dan wel de mutaties-specifiek in de PI3K- of MAPK-routes, correleerden niet met PFS. Eerste en tweede generatie EGFR-tyrosinekinaseremmers (TKI) worden gegeven op basis van de aanwezigheid van activerende EGFR-mutaties, zoals deleties in exon 19 en de L858R punt mutatie in exon 21. De derde generatie TKI osimertinib was oorspronkelijk alleen goedgekeurd voor patiënten met een verworven EGFR p. (T790M) resistentiemutatie na behandeling met een 1e of 2e generatie TKI. Meer recentelijk is osimertinib ook goedgekeurd voor eerstelijnsbehandeling van patiënten met activerende EGFR-mutaties. In hoofdstuk 5 rapporteerden we klinische kenmerken van twee EGFR-mutatie-positieve patiënten die een BRAF p. (V600E) ontwikkelden op tweedelijns osimertinib-behandeling. Richtlijnen voor behandelingsopties voor osimertinib behandelde patiënten met verworven BRAF p.(V600E) resistentiemutaties zijn nog niet vastgesteld. Behandeling van de eerste patiënt met een combinatie van dabrafenib en trametinib gelijktijdig met osimertinib gaf een tumorrespons met een PFS van 14 maanden. Behandeling van de tweede patiënt met dezelfde combinatie therapie resulteerde in een klinische respons binnen twee weken, hoewel er op basis van magnetische resonantie beeldvorming (MRI) progressie was van de hersenmetastasen na zes weken. Vergelijkbare resultaten op het gebied van overleving werden waargenomen bij andere gevallen die in de literatuur zijn gemeld.
De klinische relevantie van de toename van het aantal EGFR-kopieën per tumorcel in patiënten met EGFR-gemuteerd NSCLC bij eerstelijns TKI-behandeling is niet volledig opgehelderd. In
hoofdstuk 6 hebben we twee benaderingen onderzocht (interne referentie en normale
vergelijking) om een verhoogd aantal kopieën van het EGFR-gen te bepalen met behulp van bestaande, op amplicon gebaseerde, NGS-gegevens van de diagnostische test. Bij beide benaderingen was het percentage patiënten met een toename in het aantal EGFR kopieën hoger bij EGFR-gemuteerde patiënten ten opzichte van EGFR-wildtype-patiënten. Dit is in overeenstemming is met eerdere onderzoeken die toename van het EGFR kopie aantal hebben bepaald door fluorescente in situ hybridisatie (FISH). Een verhoogd aantal EGFR kopieën in weefsels verkregen voor start met 1e lijns TKI was geassocieerd met een slechtere algehele
overleving. De interne referentiebenadering bleek een betere voorspeller voor de algehele overleving te zijn dan de normale vergelijking (respectievelijk HR 3,58, log-rank P = 0,0004 en HR 2,76, log-rank P = 0,013). De hazard ratio's voor PFS waren niet verschillend voor beide benaderingen. Patiënten zonder toename van EGFR-kopie aantal die een EGFR p. (T790M) ontwikkelden na eerstelijns TKI, hadden de langste mediane totale overlevingstijd. We concludeerden dat een toename van het aantal EGFR kopieën, zoals bepaald door op amplicon gebaseerde NGS-gegevens, een slechtere overleving voorspeld bij EGFR-gemuteerde patiënten die werden behandeld met EGFR-TKI. Dit werd ook gevonden bij de patiënten die een T790M-mutatie ontwikkelden na behandeling met 1e of 2e generatie EGFR-TKI.
De klinische waarde van ctDNA bij dynamische monitoring van minimale restziekte en behandelrespons is reeds aangetoond bij NSCLC-patiënten [1,2]. Daarentegen zijn onderzoeken die zich richten op de klinische waarde van ctDNA bij ESCC-patiënten zeldzaam. In hoofdstuk 7 hebben we het potentieel van ctDNA als biomarker in ESCC bestudeerd. NGS-analyse werd uitgevoerd op DNA geïsoleerd uit tumorweefsel en pre- en postoperatieve cfDNA verkregen van 17 vroeg stadium ESCC-patiënten. Witte bloedcellen (WBC's) werden gebruikt om onderscheid te maken tussen persoonlijke varianten en somatische varianten. We identificeerden somatische varianten in pre-operatieve cfDNA samples bij acht van de 12 patiënten. In postoperatieve monsters werden de varianten gedetecteerd met een lagere variant allelfrequentie of waren niet detecteerbaar. Onze exploratieve studie toonde dus aan dat cfDNA mogelijk zou kunnen worden gebruikt als biomarker bij vroeg stadium ESCC-patiënten.
Appendices
appeNDICeS
My PhD life in Shantou and Groningen is like a box of chocolate, rich in flavor. This period has made indelible marks in my life, for it brought many changes in me. Overall I’ve enjoyed my life here, even though I’ve also been through homesickness and struggles for my research work. I’ve lost and obtained. Most of all, I have learned a lot. Looking back on the last four years, so many people have helped me and their kindness have brought me great joy here. I wish I had the words to express my gratitude for all of you and I am willing to offer other people my kindness as what you have shown to me.
I owe a great deal to my supervisor, Prof. Anke van den Berg. Before I came to Groningen as a PhD candidate, I had heard that you were a strict professor. After being here for one month, I realized that you are strict with research work but you are also a patient and kind person. With the help of you and Klaas, I presented a well-structured and clearly-planed project proposal and got the scholarship for my PhD program. I will always be grateful for giving me the opportunity to experience a different life in Groningen, for the hundreds of small talks after I send emails with questions to you, for all the helpful suggestions on my presentation, for the quick reply of all kinds of English drafts, for the endless encouragement you’ve given me when I was searching for a job. I would like to thank you for your criticisms as well, as they have made me a stronger person. I feel so lucky to have you as my supervisor. I learned the skill of critical thinking and pursuing my own academic interests. The experience of working with you is one of the greatest episodes of my life. I know I still have much to learn, much to accomplish, but I am ready for the coming challenges. Dear Prof. Harry Groen, thank you for being one of my supervisors as well. I was nervous during the regular Tuesday meetings at first, but your politeness and kindness made me feel much more relieved. Moreover, I really appreciate the opportunity of discussing research problems with you during the meeting. I’m also thankful for your guidance that reminds me to remember my research questions. You played a decisive role in the clinical fields for my projects. And thank you for your encouragement and the suggestions you have offered me when I feel stressful. I admire you as a true scientist and doctor with enthusiasm for research and in-depth knowledge. I will always be sincerely grateful for your consistent support and help during the last three years. Dear Dr. Klaas Kok, I would like to express my deepest appreciation for the help of revising my PhD proposal, and for the patient explanations of sequencing data. Whenever you helped clear the puzzles of my work, I felt refreshed and cheered up. I still remember that you told me the importance of critical thinking when I was preparing the first presentation in O&I group in the department of Genetics. Without you, I wouldn’t be able to become what I am now. I also would like to thank you for all the dinner parties at your house and for all the nice group photos taken by you, for all the introductions and recommendations about the Netherlands.
I owe Dr. Anthonie van der Wekken a great debt of thanks for the financial support and clinical data support. I really appreciate your clear suggestions on the two projects regarding the BRAF mutation. Without you, I would not have these two projects. Besides, I have enjoyed your constructive suggestions regarding designing meeting abstracts and posters. I admire you as a positive and self-motivated scholar. Please let me know when I should address you as Prof. van der Wekken.
My deepest appreciation also goes to Prof. Jiang Gu for introducing me to the field of molecular pathology and being my supervisor in China. I am grateful for your trust and guidance. I apologize that I couldn’t add you as one of my supervisors in the front page as there are limited number of supervisors can be listed. You will always be my supervisor in my heart.
Appendices
A
I would like to extend my sincere gratitude to Dr. Jeroen Hiltermann. You are always the first person to reply the emails for all manuscripts. I am impressed by your effective working methods and reliability. Thank you for your long-time scientific support.
I also would like to express my deepest appreciation to Prof. H.A.M. Kerstjens, Prof. M.R. Groves, Prof. B. Sorensen. Thank you so much for being the reading committee members of my thesis and for your positive evaluations.
Dear Dr. Lydia Visser, you are such a warm-hearted person, like the sun in our group. It seems like that you have magic to make people around you laugh. I want to be just like you, so I thought it over. Is it because that you always share interesting things, or you are humorous, or you are always smiling which make others smile with you unconsciously? The answer will be all of them. Besides your personal charisma, I also would like to thank you for your help in setting up primary cell culture and for the job recommendation letter.
I very much appreciate the support from the molecular diagnostics team of the department Pathology: prof. Wim Timens, prof. Ed Schuuring, Dr. Arja ter Elst, Dr. Léon C. van Kempen. Your invaluable insight into molecular diagnosis and wise suggestions have helped me a lot.
Special thanks also go to Martijn and Anna. Dear Martijn, thank you so much for all the NGS data analyses and all kind explanations. Dear Anna, I still remember the first time we met during the ISCOMS meeting. You came there to pick me up to the Department of Genetic. While walking, you told me in details how to get to the location. Thank you for showing me everything I may need to use in the Department of Genetics and for teaching me the experiment skills. I was impressed by your ability of planning experiments and organizing tables. You are a really nice teacher.
The best kind of people are the ones that come into your life and make you see the world where you can’t see by yourself. Dear Jiacong, you showed me how to be social person, a positive person, a sportive person. Thank you for arranging all things before I came to Groningen, for the help in research work, and for introducing new friends to me. Regardless of whether our paths will cross again, I will always wish you success and happiness.
Dr. Yiqun Geng, my dear mentor, friend and elder sister, thank you so much for leading me to the field of molecular pathology or circulating tumor DNA. Wish to meet you and your two cute sons soon in China.
Dear Yichen and Weiting, thank you so much for being my paranymphs. We work in the same office and share our feelings and all the happy and sad moments with each other. Yichen, I have so many wonderful traveling memories together with you. I admire you so much as you feel deeply, think deeply and live deeply. May you a smooth journey with your PhD program and your job. I believe you will be an excellent pathologist. Dear Weiting, you are such a funny and optimistic girl. Thank you for continuing the unfinished project of me. I wish your dream about getting rich will come true soon. I also would thank Wangzhao. You have a clear plan for your future life and I believe your life will go as you wish.
I would like to acknowledge the assistance from members of department of Pathology, hematology and pulmonary disease: Joost, Arjan, Lotteke, Mathilda, Myra, Johanna, Melanie, Geok Wee, Peijia, Xing, Rianne, Shengnan, Zhijun, Penny, Fenneke, Jessica, Zainab, Miguel, Jennie, Fengjuan, Minghui, Jiedong. All of you are very special to me. I have learned different things from you. Joost, I learned kindness and optimistic from you. It was nice to talk with you while walking to the meeting room in early days of my PhD. Dear Arjan, Mathilda, Myra, Johanna, Geok Wee, Peijia, it is nice to have the regular meetings with you on Friday mornings. Mathilda and Myra, thank you
for the kind reminders and help when I was working in O&O lab. Johanna, it was nice to have statistics course together with you. Your intelligence and learning attitude impressed me a lot. Geok Wee, I think you are an encyclopedia. Thank you for all the useful information you shared with us. Peijia, I admire you as you can always ask some smart questions during the meetings. Lotteke, thank you for driving us to the lab day destination and for sharing nice photos of Aletta. Fenneke, thank you for checking the clinical data for me and wish you good luck for your PhD. Xing and Penny, enjoy your (PhD) life in Groningen.
I had great pleasure of meeting and working with the entire O&I group in the department of Genetics: Rolf, Helga, Cleo, Birgit, Krista, Kim, Dineke, Ludolf, Rugter, Eddy, Fatemeh, Mohamed, Lennart, Jun, Joost. I was glad to have your valuable advices after my presentation. I really enjoyed all those parties with you. Ludolf, thank you so much for the help for library preparation. I also would like to thank Mathilde from iPSC CRISPR Facility for technical support of ddPCR. My thanks also goes to sequencing team of the Department of Genetics for sequencing assistance and others in the department of Genetics: Inge, Martijn, Mathieu, Rugter and Bart.
I’d like to acknowledge the assistance that I received from DNA and O&O lab members in the department of Pathology: Jasper, Debora, Bea, Annika, Weird, Moniqe, Nienke, Mirjam and others. Thank you for all the experiment support. Thanks also go to secretaries: Annet, Janine and Ellen. I’ve worked with some great people who are co-authors of my papers: prof. Min Su, Bart, Anke, Ali, Jantine, Menno, Frank, Shaobin, Qiongyi, Qian, Zuoqing, Wanchun, Jos, Rolof, John. Thank you for all your invaluable contributions to my papers. Dear Anke, thank you for teaching me primary culture. I enjoyed the time having lunches with you. Bart, thank you for checking clinical data and the introduction of cancer genome database. Thanks also should go to Kate for the English proofreading for my papers.
My special thanks to all my Chinese friends in Groningen or who were in Groningen: 黄妙珍，李 燕妮，齐灿灿和胡世贤夫妇，张振华，陈连民，李爽，楚晓菁，李婵，王道明，王敏，吴怡， 周芷微和刘凌夫妇，翟田田和邱思奇夫妇，马杰，梁元科，邱坤良和观志强夫妇，赵晓娟， 贾聪卓，雷雨，巫丹丹，江琼，李尚，李梅芳，章宇和卢雪玲夫妇，杜政熹和戚玉竹夫妇， 林宇晟，吴睿，王灿，彭晓红，李娜，吕丛超，王晶，李安，张家溪，薛俊岳，郭颖怡，王 熙敏，王嘉豪，胡雪楠。感谢你们工作之外的帮助和陪伴，愿大家未来可期，大有可为, 无 论在哪里都有朋友在身边，有饭可约。
To my parents (父母), no amount of words can ever be enough to express my gratitude for you, but I will try. 亲爱的爸妈，我知道任何言语上的感谢，对于你们这些年的牵挂和付出都过于 苍白。但是聊胜于无吧！感谢你们这些年对我所有决定的支持，感谢你们做我坚强的后盾和 退路。我知道你们对我的期待只有身体健康。别人关心的是我飞得高不高，你们只关心我飞 得累不累。女儿已经 30+了，可以独立面对生活了。我希望以后你们对我的牵挂少一点，而 我会更加牵挂你们的。亲爱的妹妹，我经常觉得，在很多方面，你更像是姐姐，也感谢你这 些年做我的坚强后盾，请再给我多点时间，让我成为你的后盾。另外我还要感谢我的伯伯、 伯妈，姨妈、姨父，堂哥、堂姐，表哥、表姐们的多年对我的关心和（红包）支持。 Appendices 176
