University of Groningen
Towards in vivo application of oxygen-releasing microspheres for enhancing bone
regeneration
Buizer, Arina
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2018
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Buizer, A. (2018). Towards in vivo application of oxygen-releasing microspheres for enhancing bone regeneration. Rijksuniversiteit Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Samenvatting
139 De stappen die genomen zijn om de toepassing van zuurstof afgevende microbolletjes voor het verbeteren van de regeneratie van bot te vertalen van laboratoriumtafel naar
in vivo toepassing worden in dit proefschrift beschreven.
Op dit moment is de gouden standaard voor het repareren van botdefecten het gebruik van autoloog bot. De belangrijkste nadelen van het gebruik van autoloog bot zijn het vóórkomen van morbiditeit ter plaatse van de oogstlocatie van het bot, het feit dat er een extra ingreep nodig is (met de bijkomende kosten) voor het oogsten van een bottransplantaat en de beperkte beschikbaarheid van autologe bottransplantaten. Daarom worden de mogelijkheden voor het regenereren van botweefsel steeds meer onderzocht. Met name wordt veel onderzoek gedaan naar botregeneratie middels een scaffold die ingezaaid wordt met cellen die het vermogen hebben botweefsel te vormen. Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC) hebben het vermogen bot te vormen, ze zijn gemakkelijk te verkrijgen en ze hebben trofische effecten. hMSCs zijn door deze eigenschappen een gewild celtype om op scaffolds voor botregeneratie te zaaien. De vascularisatie van scaffolds die ingezaaid zijn met cellen blijft nog een belangrijk punt. Op het moment dat een scaffold in het lichaam geïmplanteerd wordt, worden de cellen die op de scaffold gezaaid zijn blootgesteld aan langdurige ischemische omstandigheden, omdat ze vaak geïmplanteerd worden op loci met verstoorde vascularisatie en omdat er in een scaffold geen vascularisatie aanwezig is. Vooral de cellen die zich in het centrum van de scaffold bevinden krijgen niet voldoende zuurstof om te overleven, waardoor de kwaliteit van de botregeneratie maar matig is. Wanneer hMSCs worden blootgesteld aan ischemie, gaan ze angiogene groeifactoren (AGF) produceren. Die AGF stimuleren de ingroei van bloedvaten. Door de opbouw van een vasculair netwerk in een scaffold ingezaaid met cellen wordt een duurzame zuurstofvoorziening opgezet. Door de aanwezigheid van zo’n duurzame zuurstofvoorziening kunnen hogere aantallen cellen die op een scaffold gezaaid zijn overleven, en zo kan een optimale botregeneratie bereikt kunnen worden. Er zijn microbolletjes die geleidelijk aan zuurstof afgeven ontwikkeld, ten eerste om de overleving van hMSCs in de eerste weken na implantatie in het lichaam te verhogen. Ten tweede, door maar een klein beetje zuurstof af te geven wordt de productie van AGF door hMSCs gestimuleerd, waarmee het opbouwen van een duurzame zuurstofvoorziening op de langere termijn wordt ondersteund. De zuurstof afgevende microbolletjes worden gemaakt met poly (trimethylene carbonate) (PTMC) als matrixmateriaal en calcium peroxide partikels (CaO2) als zuurstofdonor. CaO2 reageert met water volgens onderstaande chemische reacties, resulterend in de productie van zuurstof.
CaO2 + 2 H2O → Ca(OH)2 + H2O2 2 H2O2 → O2 + 2 H2O
140
PTMC wordt afgebroken middels een oppervlakte erosie-proces, wat inhoudt dat de CaO2 partikels die door de PTMC matrix verspreid zijn geleidelijk aan aan water blootgesteld worden. Op deze manier is een systeem dat geleidelijk aan zuurstof afgeeft gecreëerd.
De doelen van dit proefschrift zijn:
• Onderzoeken welke methode het meest geschikt is voor het zaaien van cellen op biomaterialen met hoge en met lage porositeit;
• Onderzoeken bij welk zuurstofpercentage hMSCs zich het beste prolifereren en tegelijkertijd AGF produceren;
• Het ontwikkelen van een methode om PTMC-CaO2 microbolletjes te produceren en
te onderzoeken hoe het zuurstof afgifteprofiel van deze microbolletjes is;
• Kijken of de zuurstof afgevende microbolletjes biocompatibel zijn in vitro en in vivo; • Onderzoeken of de toepassing van zuurstof afgevende microbolletjes de overleving
van ischemisch weefsel verbetert in vivo.
In Hoofdstuk 2 wordt een statische en een vacuümmethode voor het zaaien van hMSC op een scaffold met lage en een scaffold met hoge porositeit vergeleken. Drie verschillende celzaaidichtheden worden vergeleken voor het gebruik op een scaffold met hoge porositeit. De levensvatbaarheid van de cellen, de celproliferatie en de celzaaihomogeniteit zijn de eindpunten in deze studie. hMSCs werden geïsoleerd uit het beenmerg dat vrijkwam bij het opraspen van de femurschacht bij het plaatsen van een totale heuparthroplastiek. De cellen die op deze manier verkregen zijn, zijn gebruikt bij alle hMSC-experimenten die in dit proefschrift beschreven zijn. De cellen zijn gekarakteriseerd volgens de richtlijnen die opgesteld zijn door de International Society for Cellular Therapy (ISCT) en het celprofiel voldeed aan de ISCT richtlijnen. Ongeacht welke celzaaimethode gebruikt werd, zowel in scaffolds met hoge als met lage porositeit, was er een hogere celadherentie aan de buitenkant van de scaffold dan aan de binnenkant. Bij scaffolds met een lage porositeit resulteerde de vacuüm celzaaimethode in de meest homogene celzaaiing en het hogere aantallen adherente cellen aan de scaffold dan de statische celzaaimethode. Op de scaffolds met hoge porositeit resulteerde juist de statische celzaaimethode in de meest homogene celzaaiing en het hogere aantallen adherente cellen aan de scaffold dan de vacuüm celzaaimethode. Het toepassen van vacuüm op de cellen resulteerde niet in een verminderde hMSC proliferatie. De absolute aantallen cellen op de scaffolds nam af
Samenvatting
141 in de tijd na het zaaien op beide types scaffolds en met beide celzaaimethodes. Beide celzaaimethodes hadden een zaaiefficiëntie van rond de 90%. Op scaffolds met een lage porositeit gaf de hoogste celzaaidichtheid ook het hoogste aantal adherente cellen aan de scaffold.
In Hoofdstuk 3 wordt het zuurstofbereik waarin hMSCs prolifereren, metabool actief zijn en er tegelijkertijd transcriptie van AGF plaatsvindt, onderzocht. De proliferatie van hMSC was het hoogste bij 1% zuurstof. Bij 21% zuurstof, wat in feite voor uit beenmerg afkomstige hMSCs een hyperoxische situatie is, lieten de cellen de hoogste gecorrigeerde metabole activiteit zien. Bij omstandigheden met hypoxie was de gecorrigeerde metabole activiteit het hoogste bij 2% zuurstof. De transcriptie van AGF onder hypoxische omstandigheden is gerelateerd aan de transcriptie van AGF wanneer hMSCs blootgesteld worden aan 21% zuurstof. Aangezien HIF-1α-transcriptie standaard gebeurt, werd al verwacht dat de transcriptie van HIF-1α onder hypoxische condities niet significant verschilde van de transcriptie onder normoxische condities. De transcriptie van VEGF en ANG-1 daarentegen was significant hoger bij 2% O2 dan bij 21% zuurstof. Daarom concluderen we dat het zuurstofbereik waarin uit beenmerg afkomstige hMSCs een hoge celproliferatie vertonen, metabool actief zijn en een hoge transcriptie van AGF vertonen, 1-2% O2 is.
In Hoofdstuk 4 wordt een methode om zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes
te maken beschreven. Daarnaast wordt het zuurstofafgifteprofiel van de aldus geproduceerde microbolletjes beschreven en wordt het effect van de aanwezigheid van de microbolletjes op de metabole activiteit van hMSCs die gekweekt worden onder omstandigheden met hypoxie onderzocht. Aangezien de microbolletjes zuurstof gaan afgeven op het moment dat zij in contact komen met water moet contact met water tijdens het productieproces vermeden worden. Daarom is een olie-in-olie oplosmiddel verdampingsmethode gebruikt, en polydisperse microbolletjes met een maximale diameter van 200 μm werden hiermee geproduceerd. In vitro, in simulated body fluid met daarin cholesterol esterase, gaven de PTMC-CaO2 mircobolletjes zuurstof af gedurende ongeveer 20 dagen. De aanwezigheid van PTMC-CaO2 microbolletjes leidde tot hogere adherentie van hMSCs aan de microbolletjes dan aan celkweekplastic, wat suggereert dat de bolletjes niet cytotoxisch zijn. hMSCs hebben een hogere metabole activiteit wanneer zij onder hypoxische omstandigheden gekweekt worden in de aanwezigheid van zuurstof afgevende microbolletjes dan in de aanwezigheid van niet- zuurstof afgevende bolletjes na 7 dagen kweken. Dit suggereert dat de zuurstofafgifte vanuit de microbolletjes de hMSC-overleving verhoogt na langdurige blootstelling aan hypoxische omstandigheden.
142
De biocompatibiliteit van de zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes is
onderzocht middels in vitro and in vivo tests, die gebaseerd zijn op ISO standard 10993-5. Deze worden beschreven in Hoofdstuk 5. Bij de in vitro tests, waarbij L929
muizenfibroblasten gekweekt werden met een PTMC-CaO2 microbolletjesextract
in verschillende concentraties, werd cytotoxiciteit van hoge concentraties van het extract aangetoond. Lagere concentraties van het extract daarentegen, die meer in de buurt komen van de verwachte in vivo concentraties, leidden niet tot verhoogde celdood. Dit werd bevestigd in de in vivo tests. Wanneer de PTMC-CaO2 microbolletjes geïmplanteerd werden in subcutane pockets in muizen, werden geen nadelige effecten geobserveerd. Concluderend: de zuurstof afgevende microbolletjes zijn biocompatibel.
Als bewijs van het principe werden de zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes geïmplanteerd onder een met op toeval gebaseerde restvaatvoorziening, maar verder gedevasculariseerde huidflap in muizen (verder ‘gedevasculariseerde huidflap’ genoemd). De resultaten worden beschreven in Hoofdstuk 6. Histologische analyse van de huidflappen toonde aan dat de hoeveelheid necrose van het huidweefsel toenam vanaf de craniale basis van de flap richting het caudale einde van de flap. Dit impliceert dat er sprake is van een ischemische gradiënt in de huidflap, waarbij de craniale basis van de huidflap goed gevasculariseerd en niet ischemisch is, en het caudale uiteinde van de flap het slechtst gevasculariseerd en daarmee het meest ischemisch is. Huidflappen waaronder niet-zuurstof afgevende PTMC microbolletjes geïmplanteerd zijn, lieten significant meer necrose zien dan huidflappen waaronder zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes geïmplanteerd zijn op 3, 7 en 10 dagen na implantatie. Deze bevindingen suggereren dat de afgifte van zuurstof door de
PTMC-CaO2 microbolletjes celdood kan voorkomen bij cellen die aan ischemische
omstandigheden blootgesteld worden, waardoor de overleving van ischemisch weefsel verbeterd kan worden.
De uitkomsten van dit onderzoeksproject worden bediscussieerd en suggesties voor toekomstig onderzoek worden gegeven in Hoofdstuk 7, de algemene discussie. De zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes die onderzocht zijn in dit proefschrift zijn getest in een toepassing in huidweefsel in muizen. Het zou interessant zijn ook toepassingen in andere weefsels te onderzoeken, zoals botweefsel of hartspierweefsel. In slecht gevasculariseerd weefsel ondervinden cellen niet alleen een tekort aan zuurstof, maar ook aan andere nutriënten, zoals glucose, aminozuren en vitamines. Het suppleren van meer nutriënten dan glucose alleen aan cellen die aan ischemie blootgesteld worden zou de celoverleving ook verder kunnen verhogen. Dit is verder onderzoek waard. In dit onderzoeksproject zijn microbolletjes ontwikkeld die
Samenvatting
143 gedurende drie weken zuurstof afgeven. Wellicht is nog een langduriger zuurstofafgifte te bereiken door het matrixmateriaal aan te passen.
Concluderend: zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes, die in vitro gedurende ongeveer 20 dagen zuurstof afgaven, zijn geproduceerd. Bij in vivo tests bleken de microbolletjes biocompatibel te zijn en ze verminderden huidnecrose significant wanneer ze geïmplanteerd werden onder een gedevasculariseerde huidflap in muizen gedurende 10 dagen. Dit suggereert dat de zuurstof afgevende
PTMC-CaO2 microbolletjes de celoverleving in ischemische weefsels faciliteren en
