Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation

Cover Page

The handle http://hdl.handle.net/1887/62061 holds various files of this Leiden University dissertation

Author: Soethoudt, Marjolein

Title: Chemical tools to study the cannabinoid receptor type 2

Date: 2018-04-26

63. Ostenfeld, T.; Price, J.; Albanese, M.; Bullman, J.; Guillard, F.; Meyer, I.; Leeson, R.; Costantin, C.;

Ziviani, L.; Nocini, P. F.; Milleri, S., A Randomized, Controlled Study to Investigate the Analgesic Efficacy of Single Doses of the Cannabinoid Receptor-2 Agonist GW842166, Ibuprofen or Placebo in Patients With Acute Pain Following Third Molar Tooth Extraction. Clin J Pain 2011, 27, (8), 668-676.

64. Nevalainen, T., Recent Development of CB2 Selective and Peripheral CB1/CB2 Cannabinoid Receptor Ligands. Curr Med Chem 2014, 21, (2), 187-203.

65. Pharmaceuticals, G., Glenmark’s Molecule for Neuropathic Pain, Osteoarthritis - GRC 10693, Successfully Completes Phase I Trials. 2009.

66. Odan, M.; Ishizuka, N.; Hiramatsu, Y.; Inagaki, M.; Hashizume, H.; Fujii, Y.; Mitsumori, S.; Morioka, Y.;

Soga, M.; Deguchi, M.; Yasui, K.; Arimura, A., Discovery of S-777469: An orally available CB2 agonist as an antipruritic agent. Bioorganic Med Chem Lett 2012, 22, (8), 2803-2806.

67. Rogers, N., Cannabinoid receptor with an 'identity crisis' gets a second look. Nat Med 2015, 21, (9), 966-967.

68. Kenakin, T.; Miller, L. J., Seven Transmembrane Receptors as Shapeshifting Proteins: The Impact of Allosteric Modulation and Functional Selectivity on New Drug Discovery. Pharmacol Rev 2010, 62, (2), 265-304.

69. Violin, J. D.; Crombie, A. L.; Soergel, D. G.; Lark, M. W., Biased ligands at G protein-coupled receptors:

promise and progress (vol 35, pg 308, 2014). Trends Pharmacol Sci 2014, 35, (9), 489-489.

70. Chen, X.; Sassano, M. F.; Zheng, L. Y.; Setola, V.; Chen, M.; Bai, X.; Frye, S. V.; Wetsel, W. C.; Roth, B. L.;

Jin, J., Structure-Functional Selectivity Relationship Studies of beta-Arrestin-Biased Dopamine D-2 Receptor Agonists. J Med Chem 2012, 55, (16), 7141-7153.

71. Herenbrink, C. K.; Sykes, D. A.; Donthamsetti, P.; Canals, M.; Coudrat, T.; Shonberg, J.; Scammells, P. J.;

Capuano, B.; Sexton, P. M.; Charlton, S. J.; Javitch, J. A.; Christopoulos, A.; Lane, J. R., The role of kinetic context in apparent biased agonism at GPCRs. Nat Commun 2016, 7, 10842.

72. Martella, A.; Sijben, H.; Rufer, A.; Fingerle, J.; Grether, U.; Ullmer, C.; Hartung, T.; A, I. J.; van der Stelt, M.; Heitman, L., A novel selective inverse agonist of the CB2 receptor as a radiolabeled tool compound for kinetic binding studies. Mol Pharmacol 2017, 92 (4). 389-400.

73. Nederpelt, I.; Bleeker, D.; Tuijt, B.; AP, I. J.; Heitman, L. H., Kinetic binding and activation profiles of endogenous tachykinins targeting the NK1 receptor. Biochem Pharmacol 2016, 118, 88-95.

74. Nederpelt, I.; Kuzikov, M.; de Witte, W. E. A.; Schnider, P.; Tuijt, B.; Gul, S.; IJzerman, A. P.; de Lange, E. C. M.; Heitman, L. H., From receptor binding kinetics to signal transduction; a missing link in predicting in vivo drug-action. Sci Rep-Uk 2017, 7, (1), 14169.

Nederlandse Samenvatting

204

Nederlandse Samenvatting

Medicijnonderzoek omvat het hele proces vanaf de ontdekking van een therapeutisch relevant eiwit tot de officiële registratie van een effectief en veilig geneesmiddel in de maatschappij. Dit proces kan meer dan een decennium duren en meer dan een miljard euro kosten. Geneesmiddelenonderzoek kan worden opgedeeld in de ontdekkingsfase (‘drug discovery’) en ontwikkelingsfase (‘drug development’). De ontdekkingsfase kan vervolgens worden opgedeeld in verschillende fasen, waarin eerst een therapeutisch relevant eiwit wordt geïdentificeerd (‘target identification’), waarvan vervolgens moet worden gevalideerd dat modulatie van dit eiwit daadwerkelijk een gewenste invloed heeft op de remming of behandeling van een bepaalde ziekte (‘target validation’). Vervolgens moet er voor dit eiwit stoffen worden ontdekt (‘hit discovery’) en geoptimaliseerd op het gebied van selectiviteit, effectiviteit en veiligheid (‘hit-to-lead optimization’). In de ontwikkelingsfase wordt een veelbelovende stof, een ‘lead compound’ of ‘geneesmiddel kandidaat’, in dieren getest en als laatste ook in mensen. In deze fase is het onder andere belangrijk dat het wordt aangetoond dat de lead compound daadwerkelijk een dosis-afhankelijke, moleculaire interactie aangaat met het eiwit waar het voor is ontwikkeld (‘target engagement’). Vooral in deze laatste fase van medicijnonderzoek zijn er veel geneesmiddel kandidaten die afvallen omdat ze geen effectiviteit, of juist heel veel vervelende bijwerkingen laten zien, wat vervolgens leidt tot hele hoge kosten.

Een eiwit waarvoor veel geneesmiddel kandidaten in late stadia van het medicijnonderzoek zijn afgekeurd is de cannabinoid receptor type 2 (CB2 receptor, CB2R). Dit eiwit is samen met de cannabinoid receptor type 1 (CB1 receptor, CB1R) een bekend aangrijpingspunt (‘eiwit target’) van tetrahydrocannabinol (THC). THC is een van de meest voorkomende stoffen in de cannabis plant en is het meest bekend voor de psycho-actieve effecten die het teweeg brengt. De cannabis plant kan gezien worden als een van de oudst bekende medicijnen ter wereld voor veel verschillende condities. Omdat de CB2R vooral voorkomt in immuun cellen is het een mogelijk veelbelovend eiwit voor therapeutische behandeling van verschillende ziektes waarin ontstekingen en afbraak van neuronen een belangrijke rol spelen, zoals multiple sclerosis. De CB1R komt vooral voor in het centraal zenuwstelsel en is daarom vooral verantwoordelijk voor de psycho-actieve bijwerkingen die geassocieerd worden met cannabis gebruik, zoals ‘high’ worden en een verhoogd risico op psychoses.

Medicijnonderzoek heeft zich daarom vooral gericht op het ontwikkelen van CB2R- selectieve moleculen, omdat verwacht wordt dat deze stoffen geen vervelende, CB1R- gemedieerde bijwerkingen zullen hebben. Daarnaast wordt er ook veel onderzoek gedaan naar andere eiwit targets van THC, omdat het is ontdekt dat niet alle effecten van THC verdwijnen in genetisch gemodificeerde muizen die geen van beide cannabinoid receptoren (CBRs) tot expressie brengen (‘knockout muizen’). Uiteindelijk zouden beide onderzoeksrichtingen kunnen leiden tot de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe CB2R moleculen die minder bijwerkingen hebben dan cannabis.

Nederlandse Samenvatting Het werk beschreven in dit proefschrift heeft zich vooral gericht op de ontdekking, synthese en toepassing van chemische ‘tools’ (letterlijk: ‘gereedschappen’) om de CB2R te bestuderen (Hoofdstukken 3-6) en om nieuwe eiwit targets van THC te identificeren (Hoofdstuk 7).

Chemische tools voor het bestuderen van de CB

receptor

In Hoofdstuk 1 worden de algemene aspecten van medicijnonderzoek die besproken worden in dit proefschrift geïntroduceerd (i.e. target identification, target validation, hit-to- lead optimization, target engagement), wat wordt gevolgd door een algemene introductie van G eiwit-gekoppelde receptoren, de eiwitfamilie waar CBRs bij horen. Deze receptoren zitten aan de buitenkant van verschillende cellen, geven signalen door van de buitenkant naar de binnenkant en regelen daarbij belangrijke biologische processen in deze cellen (‘signaaltransductie’). In dit hoofdstuk worden de cannabinoid receptoren CB1R en CB2R geïntroduceerd en dat ze onderdeel uitmaken van een belangrijk biologisch systeem, het endocannabinoid systeem (ECS). Het ECS bestaat naast de CBRs ook uit lichaamseigen stoffen (‘endocannabinoiden’), die de CBRs activeren, en enzymen die de endocannabinoiden synthetiseren of afbreken. Het hoofdstuk sluit af met het probleem dat, ondanks twee decennia aan medicijnonderzoek specifiek gericht op CB2R-selective moleculen, er nog geen zijn goedgekeurd en geregistreerd als geneesmiddel. Om dit medicijnonderzoek te helpen is er meer informatie nodig over CB2R distributie in het lichaam, expressieniveaus, beschikbaarheid en farmacologische activiteit. Deze informatie kan worden verkregen met chemische ‘tools’ of ‘probes’, bijvoorbeeld radioactieve of fluorescente stoffen, of door stoffen die irreversibel binden aan CB2R, door middel van een zeer reactieve groep of een licht-gevoelige groep, die een irreversibele binding aangaat door bestraling (‘photoactivatable probe’).

In Hoofdstuk 2 worden alle chemische tools voor CB2R die tot nu toe zijn gepubliceerd samengevat, met een beschrijving van de voor- en nadelen van elke verschillende soort probe. Over het algemeen hebben CB2R probes veel te lijden onder een verlies aan metabole stabiliteit, selectiviteit en affiniteit voor CB2R, of juist een toename in aspecifieke binding. Irreversibele probes zijn succesvol toegepast in het in kaart brengen van de bindingsplaats voor moleculen in de CB2R, mits gecombineerd met mutagenese-studies.

Echter hebben deze moleculen geen detectie element, zoals een fluorescente groep, waardoor ze niet bruikbaar zijn om CB2R expressieniveaus te bepalen of interacties met moleculen te bestuderen (‘target engagement’). In het verleden zijn artikelen gepubliceerd voor andere eiwitten waarin target engagement wordt aangetoond met ‘two-step photoaffinity-based protein profiling’ (pAfBPP), een techniek waarin de irreversibele (‘covalente’) interactie tussen probe en eiwit worrdt gecombineerd met een detectie element, maar waarin de problemen die geassocieerd worden met grote groepen (zoals verlies aan selectiviteit en affiniteit) wordt vermeden (zie Figuur 11 in Hoofdstuk 2).

Medicijnonderzoek omvat het hele proces vanaf de ontdekking van een therapeutisch relevant eiwit tot de officiële registratie van een effectief en veilig geneesmiddel in de maatschappij. Dit proces kan meer dan een decennium duren en meer dan een miljard euro kosten. Geneesmiddelenonderzoek kan worden opgedeeld in de ontdekkingsfase (‘drug discovery’) en ontwikkelingsfase (‘drug development’). De ontdekkingsfase kan vervolgens worden opgedeeld in verschillende fasen, waarin eerst een therapeutisch relevant eiwit wordt geïdentificeerd (‘target identification’), waarvan vervolgens moet worden gevalideerd dat modulatie van dit eiwit daadwerkelijk een gewenste invloed heeft op de remming of behandeling van een bepaalde ziekte (‘target validation’). Vervolgens moet er voor dit eiwit stoffen worden ontdekt (‘hit discovery’) en geoptimaliseerd op het gebied van selectiviteit, effectiviteit en veiligheid (‘hit-to-lead optimization’). In de ontwikkelingsfase wordt een veelbelovende stof, een ‘lead compound’ of ‘geneesmiddel kandidaat’, in dieren getest en als laatste ook in mensen. In deze fase is het onder andere belangrijk dat het wordt aangetoond dat de lead compound daadwerkelijk een dosis-afhankelijke, moleculaire interactie aangaat met het eiwit waar het voor is ontwikkeld (‘target engagement’). Vooral in deze laatste fase van medicijnonderzoek zijn er veel geneesmiddel kandidaten die afvallen omdat ze geen effectiviteit, of juist heel veel vervelende bijwerkingen laten zien, wat vervolgens leidt tot hele hoge kosten.

Een eiwit waarvoor veel geneesmiddel kandidaten in late stadia van het medicijnonderzoek zijn afgekeurd is de cannabinoid receptor type 2 (CB2 receptor, CB2R). Dit eiwit is samen met de cannabinoid receptor type 1 (CB1 receptor, CB1R) een bekend aangrijpingspunt (‘eiwit target’) van tetrahydrocannabinol (THC). THC is een van de meest voorkomende stoffen in de cannabis plant en is het meest bekend voor de psycho-actieve effecten die het teweeg brengt. De cannabis plant kan gezien worden als een van de oudst bekende medicijnen ter wereld voor veel verschillende condities. Omdat de CB2R vooral voorkomt in immuun cellen is het een mogelijk veelbelovend eiwit voor therapeutische behandeling van verschillende ziektes waarin ontstekingen en afbraak van neuronen een belangrijke rol spelen, zoals multiple sclerosis. De CB1R komt vooral voor in het centraal zenuwstelsel en is daarom vooral verantwoordelijk voor de psycho-actieve bijwerkingen die geassocieerd worden met cannabis gebruik, zoals ‘high’ worden en een verhoogd risico op psychoses.

Medicijnonderzoek heeft zich daarom vooral gericht op het ontwikkelen van CB2R- selectieve moleculen, omdat verwacht wordt dat deze stoffen geen vervelende, CB1R- gemedieerde bijwerkingen zullen hebben. Daarnaast wordt er ook veel onderzoek gedaan naar andere eiwit targets van THC, omdat het is ontdekt dat niet alle effecten van THC verdwijnen in genetisch gemodificeerde muizen die geen van beide cannabinoid receptoren (CBRs) tot expressie brengen (‘knockout muizen’). Uiteindelijk zouden beide onderzoeksrichtingen kunnen leiden tot de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe CB2R moleculen die minder bijwerkingen hebben dan cannabis.

Het werk beschreven in dit proefschrift heeft zich vooral gericht op de ontdekking, synthese en toepassing van chemische ‘tools’ (letterlijk: ‘gereedschappen’) om de CB2R te bestuderen (Hoofdstukken 3-6) en om nieuwe eiwit targets van THC te identificeren (Hoofdstuk 7).

Chemische tools voor het bestuderen van de CB

receptor

In Hoofdstuk 1 worden de algemene aspecten van medicijnonderzoek die besproken worden in dit proefschrift geïntroduceerd (i.e. target identification, target validation, hit-to- lead optimization, target engagement), wat wordt gevolgd door een algemene introductie van G eiwit-gekoppelde receptoren, de eiwitfamilie waar CBRs bij horen. Deze receptoren zitten aan de buitenkant van verschillende cellen, geven signalen door van de buitenkant naar de binnenkant en regelen daarbij belangrijke biologische processen in deze cellen (‘signaaltransductie’). In dit hoofdstuk worden de cannabinoid receptoren CB1R en CB2R geïntroduceerd en dat ze onderdeel uitmaken van een belangrijk biologisch systeem, het endocannabinoid systeem (ECS). Het ECS bestaat naast de CBRs ook uit lichaamseigen stoffen (‘endocannabinoiden’), die de CBRs activeren, en enzymen die de endocannabinoiden synthetiseren of afbreken. Het hoofdstuk sluit af met het probleem dat, ondanks twee decennia aan medicijnonderzoek specifiek gericht op CB2R-selective moleculen, er nog geen zijn goedgekeurd en geregistreerd als geneesmiddel. Om dit medicijnonderzoek te helpen is er meer informatie nodig over CB2R distributie in het lichaam, expressieniveaus, beschikbaarheid en farmacologische activiteit. Deze informatie kan worden verkregen met chemische ‘tools’ of ‘probes’, bijvoorbeeld radioactieve of fluorescente stoffen, of door stoffen die irreversibel binden aan CB2R, door middel van een zeer reactieve groep of een licht-gevoelige groep, die een irreversibele binding aangaat door bestraling (‘photoactivatable probe’).

In Hoofdstuk 2 worden alle chemische tools voor CB2R die tot nu toe zijn gepubliceerd samengevat, met een beschrijving van de voor- en nadelen van elke verschillende soort probe. Over het algemeen hebben CB2R probes veel te lijden onder een verlies aan metabole stabiliteit, selectiviteit en affiniteit voor CB2R, of juist een toename in aspecifieke binding. Irreversibele probes zijn succesvol toegepast in het in kaart brengen van de bindingsplaats voor moleculen in de CB2R, mits gecombineerd met mutagenese-studies.

Echter hebben deze moleculen geen detectie element, zoals een fluorescente groep, waardoor ze niet bruikbaar zijn om CB2R expressieniveaus te bepalen of interacties met moleculen te bestuderen (‘target engagement’). In het verleden zijn artikelen gepubliceerd voor andere eiwitten waarin target engagement wordt aangetoond met ‘two-step photoaffinity-based protein profiling’ (pAfBPP), een techniek waarin de irreversibele (‘covalente’) interactie tussen probe en eiwit worrdt gecombineerd met een detectie element, maar waarin de problemen die geassocieerd worden met grote groepen (zoals verlies aan selectiviteit en affiniteit) wordt vermeden (zie Figuur 11 in Hoofdstuk 2).

206

Nederlandse Samenvatting

In dit proefschrift is deze techniek opgezet om CB2R expressieniveaus en moleculaire interactie te bestuderen (Hoofdstuk 6) en om nieuwe eiwit targets van THC te identificeren (Hoofdstuk 7).

In Hoofdstuk 3 is de PathHunter® β-arrestin recruitment assay beschreven, die gebruikt kan worden om te meten hoeveel β-arrestine er na receptor activatie naar de receptor toe ‘getrokken’ worden. β-arrestine kan zorgen voor receptor deactivatie, of voor het sturen van biologische processen binnen de cel. De Pathhunter assay is een zeer gemakkelijke assay met reproduceerbare resultaten. Daarnaast is de 384-well opzet zeer geschikt voor snelle screeningen van nieuwe moleculen; een nuttige toepassing van de assay voor lead optimization in de ontdekkingsfase van medicijnonderzoek. De assay is succesvol opgezet en gevalideerd en vervolgens gebruikt voor het karakteriseren van nieuwe moleculen in Hoofdstukken 4-6.

Hoofdstuk 4 beschrijft de data van een grote samenwerking tussen 11 academische onderzoekslaboratoria en twee farmaceutische bedrijven. In dit hoofdstuk is een set van de 18 meest gebruikte cannabinoid receptor moleculen uitgebreid geprofileerd en gekarakteriseerd om een geschikt molecuul te vinden voor CB2R target validation. Om de therapeutische rol van CB2R aan te tonen in de vroege fases van medicijnonderzoek, is het essentieel dat hier selectieve stoffen voor worden gebruikt die een duidelijke, goed gedefinieerde werking hebben. De stoffen zijn allemaal getest op bindingsaffiniteit op CB2R, zowel de menselijke als de muis-variant, en ook op hun functionele activiteit in vijf verschillende signaaltransductie ‘paden’ (verschillende signaleringsmechanismen die tot verschillende biologische processen kunnen leiden). Daarnaast werden fysicochemische en farmacokinetische eigenschappen (eigenschappen zoals vettigheid en stabiliteit die een grote rol spelen in een levend organisme) gemeten, en de affiniteit bepaald voor andere eiwitten (‘off-targets’), om de selectiviteit van de stoffen te bepalen.

Over het algemeen werden verschillen in activiteit tussen de humane en de muis variant van de receptoren (‘inter-species differences’) ontdekt voor verschillende stoffen, maar ook verschillen in signaaltransductie (‘biased signaling’). Verschillen in activiteit van moleculen tussen muis en mens kunnen vervelende gevolgen hebben in de vertaling van resultaten uit proefdiermodellen naar de menselijke situatie, en biased signaling kan leiden tot verschillende activatie patronen van biologische processen door verschillende moleculen wat de interpretatie van data ook ingewikkelder kan maken. Daarnaast hadden veel moleculen ook veel andere eiwit targets, naast de CBRs, wat kan leiden tot onverwachte biologische effecten wanneer deze moleculen in dieren of mensen worden getest. De stoffen HU308, HU910, JWH133 en SR144528 waren het meest selectief en hadden relatief goede eigenschappen om in levende organismen te gebruiken en waren daarom gekozen als

‘gouden standaarden’ om gebruikt te worden voor target validation.

Hoofdstuk 5 beschrijft de synthese en moleculaire farmacologie van 24 verschillende stoffen, die allemaal gebaseerd zijn op een CB2R-selectieve stof, LEI101, die in diermodellen met nierschade goede activiteit en selectiviteit vertoonde.

Nederlandse Samenvatting Het doel van dit hoofdstuk was om te identificeren of er relaties bestonden tussen de kinetische eigenschappen van de moleculen en de functionele activiteit. Kinetische eigenschappen zijn bijvoorbeeld hoe snel ze aan de receptor binden, hoe snel ze er weer af gaan en hoe lang ze dus uiteindelijk binden. Voor andere receptoren is aangetoond dat hoe langer de moleculen binden aan de receptoren, hoe actiever ze zijn. De stoffen waren allemaal een beetje verschillend, en verschillen ook in vettigheid en zuurgraad, zodat de functionele activiteit van deze moleculen terug te leiden valt tot de moleculaire groepen. Dit leidde tot de conclusie dat de zuurgraad van de moleculen geen relatie vertoonde met de verschillende effecten, terwijl een verhoogde vettigheid, maar alleen op een specifiek deel van de moleculen, kon leiden tot een langere bindingstijd aan de receptor, wat vervolgens was gecorreleerd met een verhoogde ‘potency’, maar niet ‘efficacy’. Potency en efficacy drukken beiden de activiteit van een molecuul uit, maar efficacy geeft de maximale hoogte van het signaal aan, en de potency de hoeveelheid molecuul die nodig is om dit maximale effect te bereiken. Dit betekent dat de langere bindingstijd van deze geteste moleculen ertoe zou kunnen leiden dat een lagere dosis nodig is om hetzelfde effect te bereiken. Deze bevindingen leiden tot belangrijke inzichten in hoe moleculen ontworpen kunnen worden om optimale kinetische en functionele eigenschappen te hebben, wat de lead optimization fase zou kunnen helpen om ontstekingsziekten te bestuderen of te behandelen.

In Hoofdstuk 6 wordt het ontwerp, de synthese en de toepassing beschreven van een licht activeerbare tool (‘photoaffinity probe’), gebaseerd op de structuur van LEI101.

Het doel van dit molecuul is om het te gebruiken om CB2R expressie te detecteren in verschillende cel types en om target engagement aan te kunnen tonen. De photoaffinity probe, LEI121, was ontworpen door eerder verkregen kennis met betrekking tot de structuur-activiteits relaties van LEI101 toe te passen en de ontworpen structuur in een computer model te analyseren of het in de bindingsplaats van CB2R zou passen. In dit hoofdstuk wordt de synthese van LEI121 beschreven, dat de probe affiniteit heeft voor CB2R en selectief is over CB1R. Vervolgens wordt beschreven hoe de probe gebruikt kan worden voor verschillende biologische assays met behulp van de twee-staps labeling methode die geïntroduceerd is in Hoofdstuk 2. De probe werd gevalideerd in cellen die een verhoogde expressie hebben van CB2R, door middel van gel electroforese en proteomics, waarna de probe gebruikt kon worden om de natuurlijke CB2R expressie te bepalen, eerst in leukemie cellen, en vervolgens in specifieke immuun cellen, verkregen van gezonde mensen.

De ontwikkeling van probe LEI121 levert nieuwe mogelijkheden op om de biologie van CB2R te bestuderen. Het zou bijvoorbeeld mogelijk kunnen zijn om LEI121 als een alternatief voor de aselectieve CB2R antilichamen te gebruiken om CB2R expressieniveaus te bepalen in immuun cellen van patiënten die lijden aan ontstekingspijn en/of vergelijkbare ziektes, zoals reuma, multiple sclerosis of de ziekte van Crohn. Daarnaast zou de probe gebruikt kunnen worden om eventuele eiwit interactie partners van CB2R te identificeren, om medicijnonderzoek met betrekking tot dubbele geneesmiddelen te bevorderen, of om de CB2R zodanig te stabiliseren dat het eiwit gekristalliseerd kan worden, wat zou resulteren in meer essentiële kennis over de 3D structuur van CB2R.

In dit proefschrift is deze techniek opgezet om CB2R expressieniveaus en moleculaire interactie te bestuderen (Hoofdstuk 6) en om nieuwe eiwit targets van THC te identificeren (Hoofdstuk 7).

In Hoofdstuk 3 is de PathHunter® β-arrestin recruitment assay beschreven, die gebruikt kan worden om te meten hoeveel β-arrestine er na receptor activatie naar de receptor toe ‘getrokken’ worden. β-arrestine kan zorgen voor receptor deactivatie, of voor het sturen van biologische processen binnen de cel. De Pathhunter assay is een zeer gemakkelijke assay met reproduceerbare resultaten. Daarnaast is de 384-well opzet zeer geschikt voor snelle screeningen van nieuwe moleculen; een nuttige toepassing van de assay voor lead optimization in de ontdekkingsfase van medicijnonderzoek. De assay is succesvol opgezet en gevalideerd en vervolgens gebruikt voor het karakteriseren van nieuwe moleculen in Hoofdstukken 4-6.

Hoofdstuk 4 beschrijft de data van een grote samenwerking tussen 11 academische onderzoekslaboratoria en twee farmaceutische bedrijven. In dit hoofdstuk is een set van de 18 meest gebruikte cannabinoid receptor moleculen uitgebreid geprofileerd en gekarakteriseerd om een geschikt molecuul te vinden voor CB2R target validation. Om de therapeutische rol van CB2R aan te tonen in de vroege fases van medicijnonderzoek, is het essentieel dat hier selectieve stoffen voor worden gebruikt die een duidelijke, goed gedefinieerde werking hebben. De stoffen zijn allemaal getest op bindingsaffiniteit op CB2R, zowel de menselijke als de muis-variant, en ook op hun functionele activiteit in vijf verschillende signaaltransductie ‘paden’ (verschillende signaleringsmechanismen die tot verschillende biologische processen kunnen leiden). Daarnaast werden fysicochemische en farmacokinetische eigenschappen (eigenschappen zoals vettigheid en stabiliteit die een grote rol spelen in een levend organisme) gemeten, en de affiniteit bepaald voor andere eiwitten (‘off-targets’), om de selectiviteit van de stoffen te bepalen.

Over het algemeen werden verschillen in activiteit tussen de humane en de muis variant van de receptoren (‘inter-species differences’) ontdekt voor verschillende stoffen, maar ook verschillen in signaaltransductie (‘biased signaling’). Verschillen in activiteit van moleculen tussen muis en mens kunnen vervelende gevolgen hebben in de vertaling van resultaten uit proefdiermodellen naar de menselijke situatie, en biased signaling kan leiden tot verschillende activatie patronen van biologische processen door verschillende moleculen wat de interpretatie van data ook ingewikkelder kan maken. Daarnaast hadden veel moleculen ook veel andere eiwit targets, naast de CBRs, wat kan leiden tot onverwachte biologische effecten wanneer deze moleculen in dieren of mensen worden getest. De stoffen HU308, HU910, JWH133 en SR144528 waren het meest selectief en hadden relatief goede eigenschappen om in levende organismen te gebruiken en waren daarom gekozen als

‘gouden standaarden’ om gebruikt te worden voor target validation.

Hoofdstuk 5 beschrijft de synthese en moleculaire farmacologie van 24 verschillende stoffen, die allemaal gebaseerd zijn op een CB2R-selectieve stof, LEI101, die in diermodellen met nierschade goede activiteit en selectiviteit vertoonde.

Het doel van dit hoofdstuk was om te identificeren of er relaties bestonden tussen de kinetische eigenschappen van de moleculen en de functionele activiteit. Kinetische eigenschappen zijn bijvoorbeeld hoe snel ze aan de receptor binden, hoe snel ze er weer af gaan en hoe lang ze dus uiteindelijk binden. Voor andere receptoren is aangetoond dat hoe langer de moleculen binden aan de receptoren, hoe actiever ze zijn. De stoffen waren allemaal een beetje verschillend, en verschillen ook in vettigheid en zuurgraad, zodat de functionele activiteit van deze moleculen terug te leiden valt tot de moleculaire groepen. Dit leidde tot de conclusie dat de zuurgraad van de moleculen geen relatie vertoonde met de verschillende effecten, terwijl een verhoogde vettigheid, maar alleen op een specifiek deel van de moleculen, kon leiden tot een langere bindingstijd aan de receptor, wat vervolgens was gecorreleerd met een verhoogde ‘potency’, maar niet ‘efficacy’. Potency en efficacy drukken beiden de activiteit van een molecuul uit, maar efficacy geeft de maximale hoogte van het signaal aan, en de potency de hoeveelheid molecuul die nodig is om dit maximale effect te bereiken. Dit betekent dat de langere bindingstijd van deze geteste moleculen ertoe zou kunnen leiden dat een lagere dosis nodig is om hetzelfde effect te bereiken. Deze bevindingen leiden tot belangrijke inzichten in hoe moleculen ontworpen kunnen worden om optimale kinetische en functionele eigenschappen te hebben, wat de lead optimization fase zou kunnen helpen om ontstekingsziekten te bestuderen of te behandelen.

In Hoofdstuk 6 wordt het ontwerp, de synthese en de toepassing beschreven van een licht activeerbare tool (‘photoaffinity probe’), gebaseerd op de structuur van LEI101.

Het doel van dit molecuul is om het te gebruiken om CB2R expressie te detecteren in verschillende cel types en om target engagement aan te kunnen tonen. De photoaffinity probe, LEI121, was ontworpen door eerder verkregen kennis met betrekking tot de structuur-activiteits relaties van LEI101 toe te passen en de ontworpen structuur in een computer model te analyseren of het in de bindingsplaats van CB2R zou passen. In dit hoofdstuk wordt de synthese van LEI121 beschreven, dat de probe affiniteit heeft voor CB2R en selectief is over CB1R. Vervolgens wordt beschreven hoe de probe gebruikt kan worden voor verschillende biologische assays met behulp van de twee-staps labeling methode die geïntroduceerd is in Hoofdstuk 2. De probe werd gevalideerd in cellen die een verhoogde expressie hebben van CB2R, door middel van gel electroforese en proteomics, waarna de probe gebruikt kon worden om de natuurlijke CB2R expressie te bepalen, eerst in leukemie cellen, en vervolgens in specifieke immuun cellen, verkregen van gezonde mensen.

De ontwikkeling van probe LEI121 levert nieuwe mogelijkheden op om de biologie van CB2R te bestuderen. Het zou bijvoorbeeld mogelijk kunnen zijn om LEI121 als een alternatief voor de aselectieve CB2R antilichamen te gebruiken om CB2R expressieniveaus te bepalen in immuun cellen van patiënten die lijden aan ontstekingspijn en/of vergelijkbare ziektes, zoals reuma, multiple sclerosis of de ziekte van Crohn. Daarnaast zou de probe gebruikt kunnen worden om eventuele eiwit interactie partners van CB2R te identificeren, om medicijnonderzoek met betrekking tot dubbele geneesmiddelen te bevorderen, of om de CB2R zodanig te stabiliseren dat het eiwit gekristalliseerd kan worden, wat zou resulteren in meer essentiële kennis over de 3D structuur van CB2R.

208

Nederlandse Samenvatting

In Hoofdstuk 7 is het ontwerp, de synthese en de toepassing beschreven van een photoaffinity probe gebaseerd op de structuur van THC, met als doel om onbekende eiwit targets van THC te identificeren. Deze probe (‘probe 1’) werd gesynthetiseerd in 14 stappen, had hoge affiniteit voor beide CBRs, maar was niet in staat om de CBRs te labelen met de gel electoforese assay die is geoptimaliseerd in Hoofdstuk 6. In een proteomics experiment, labelde probe 1 ~150 andere eiwitten in Neuro2A cellen, een celtype die snel groeit en enkele neuronale kenmerken heeft. De labeling van vier van deze eiwitten (Cox4i1, Reep5, Mtch2 and Gnb1) werd significant verminderd door behandeling met THC, wat betekent dat deze eiwitten mogelijke targets zijn van THC. Vervolg onderzoek zou de interactie van THC met deze eiwitten moeten valideren, en of modulatie van deze eiwitten terug te leiden valt tot therapeutische effecten van THC geobserveerd in verschillende muis modellen.

Hoofdstuk 8 vat de verschillende hoofdstukken samen en presenteert enkele toekomstige uitdagingen met betrekking tot de behaalde resultaten.

Conclusies

Dit proefschrift heeft laten zien dat het uitgebreid profileren van moleculen op het gebied van eiwit binding, kinetiek en functionele activiteit op CBRs van de mens en muis, gecombineerd met het bepalen van de activiteit van deze moleculen op andere eiwitten, belangrijke kennis verschaft om biologische resultaten te interpreteren in medicijnonderzoek. Daarnaast heeft dit proefschrift het ontwerp, de synthese en de toepassing van de eerste twee-staps photoaffinity probe beschreven, die gebruikt kan worden om CB2R expressieniveaus te visualiseren op humane immuuncellen en target engagement door verschillende moleculen. De verwachting is dat deze nieuwe chemische tools en inzichten zullen helpen in het onderzoek en ontwikkeling van CB2R-selectieve moleculen als medicijnen.

List of Publications

List of Publications

M. Soethoudt, G. Alachouzos, M.D. Moya Garzon, E.J. van Rooden, L.H. Heitman, M. van der Stelt. Development of a Cannabinoid-based Photoaffinity Probe to Determine the Δ^8/9- Tetrahydrocannabinol Protein Interaction Landscape in Neuroblastoma Cells. Manuscript submitted

X. Yang,T.J.M. Michiels, M. Soethoudt, N. Dekker, E. Gordon, M. van der Stelt, D. van der Es, L.H. Heitmanand A.P. IJzerman. An Affinity-based Probe for the human Adenosine A2A

Receptor. Manuscript submitted

M. Soethoudt, M.W.H. Hoorens, W. Doelman, A. Martella, M. van der Stelt, L.H. Heitman.

Structure-Kinetic Relationship Studies of Cannabinoid Receptor Type 2 Agonists Reveal Substituent-Specific Lipophilic Effects on Residence Time. Manuscript submitted

M. Soethoudt, S.C. Stolze, M.V. Westphal, L. van Stralen, A. Martella, E.J. van Rooden, W.

Guba, Z.V. Varga, H. Deng, S.I. van Kasteren, U. Grether, A.P. IJzerman, P. Pacher, E.M.

Carreira, H.S. Overkleeft, A. Ioan-Facsinay, L.H. Heitman, M. van der Stelt. A Selective Photoaffinity Probe Enables Assessment of Cannabinoid Receptor Type 2 Expression and Ligand Engagement in Human Cells. Journal of the American Chemical Society. 2018, DOI: 10.1021/jacs.7b11281

A.C.M van Esbroeck, A.P.A Janssen, A.B. Cognetta, D. Ogasawara, G. Shpak, M. van der Kroeg, V. Kantae, M.P. Baggelaar, F.M.S. de Vrij, H. Deng, M. Allara, F. Fezza, Z. Lin, T. van der Wel, M. Soethoudt, E.D. Mock, H. den Dulk, I.L. Baak, B.I. Florea, G. Hendriks, L. de Petrocellis, H.S. Overkleeft, T. Hankemeier, C.I. De Zeeuw, V. Di Marzo, M. Maccarrone, B.F.

Cravatt, S.A. Kushner, M. van der Stelt. Activity-based protein profiling reveals off-target proteins of the FAAH inhibitor BIA 10-2474. Science 2017, 356, 1084-1087.

M. Soethoudt, U. Grether, J. Fingerle, T.W. Grim, F. Fezza, L. de Petrocellis, C. Ullmer, B.

Rothenhausler, C. Perret, N. van Gils, D. Finlay, C. MacDonald, A. Chicca, M.D. Gens, J.

Stuart, H. de Vries, N. Mastrangelo, L.Z. Xia, G. Alachouzos, M.P. Baggelaar, A. Martella, E.D.

Mock, H. Deng, L.H. Heitman, M. Connor, V. Di Marzo, J. Gertsch, A.H. Lichtman, M.

Maccarrone, P. Pacher, M. Glass, M. van der Stelt. Cannabinoid CB2 receptor ligand profiling reveals biased signaling and off-target activity. Nature Communications 2017, 8.

M. Soethoudt, N. van Gils, M. van der Stelt, L.H. Heitman. Protocol to Study beta-Arrestin Recruitment by CB1 and CB2 Cannabinoid Receptors. Methods in Molecular Biology 2016, 1412, 103-111.