Cover Page
The handle http://hdl.handle.net/1887/37582 holds various files of this Leiden University dissertation.
Author: Oever, Jessica Maria Elisabeth van den
Title: Noninvasive prenatal detection of genetic defects
Issue Date: 2016-02-03
107
Samenva ng
De huidige prenatale diagnos ek is voornamelijk gebaseerd op analyse van foetaal DNA verkregen met behulp van invasieve procedures. Deze procedures zijn geassocieerd met een klein, maar signifi cant risico op een miskraam. De ontdekking dat er kleine stukjes celvrij foetaal DNA (cff DNA) in het (bloed)plasma van moeder aanwezig zijn, opende mogelijkheden voor minder of niet invasieve alterna even voor het verkrijgen van foetaal DNA voor prenatale diagnos ek.
Cff DNA bestaat uit kleine fragmenten foetaal extracellulair DNA dat a oms g is uit cellen van de placenta die in apoptose zijn gegaan (ofwel geprogrammeerde cel dood heb- ben ondergaan). Dit DNA circuleert in het plasma van de zwangere vrouw en kan al vroeg in de zwangerschap gedetecteerd worden. De meerderheid van het aanwezige cel-vrije DNA in maternaal plasma is echter van maternale origine en de bijdrage van de foetus in het eerste trimester van de zwangerschap is rela ef klein. Ondanks deze hoge maternale achtergrond is het gebruik van cff DNA voor niet-invasieve prenatale diagnos ek (NIPD) en niet-invasieve prenatale testen (NIPT) al eerder succesvol beschreven. In dit proefschri worden een aantal nieuwe applica es en toepassingen besproken voor het gebruik van cff DNA voor zowel NIPD als NIPT.
Voor zowel NIPD of NIPT, is het van belang om de foetale frac e in de maternale achter- grond te weten. Daarom is het noodzakelijk om de aanwezigheid van cff DNA in een sample te bepalen. Voor het beves gen van de aanwezigheid van foetaal DNA of voor het bepalen van de foetale frac e worden meestal markers gebruikt die op het Y chromosoom liggen en die dus specifi ek zijn voor mannelijke sequen es, zoals SRY en DYS14. Helaas kunnen deze mark- ers alleen een resultaat geven indien de foetus mannelijk is. Daarom is een nieuwe methode om de aanwezigheid van cff DNA te kunnen beves gen ontwikkeld, die in elke zwangerschap gebruikt kan worden, dus ongeacht het geslacht van de foetus. In hoofdstuk 2 wordt een nieu- we test beschreven voor de detec e van foetus specifi eke sequen es van gemethyleerd RASS- F1A (mRASSF1A), waarbij gebruik gemaakt wordt van een combina e van bisulfi et omze ng en pyrophosphorolyse-geac veerde polymerisa e (PAP). RASSF1A is diff eren eel gemethyl- eerd tussen moeder en foetus. Deze verschillen in methyla e patroon worden gebruikt om specifi ek de foetale sequen es te kunnen detecteren en daarmee dus de aanwezigheid van deze sequen es te kunnen beves gen. De resultaten laten zien dat deze kwalita eve toe- passing al vroeg in de zwangerschap met hoge sensi viteit en specifi citeit succesvol gebruikt kan worden. In de toekomst zou digitalisa e en kwan fi ca e van deze test tevens uitkomst kunnen bieden in het bepalen van de foetale frac e in een sample.
NIPT, voor het screenen naar foetale aneuploïdieën, is op dit moment een van de best bestudeerde toepassingen van het gebruik van cff DNA. Voor NIPT wordt meestal gebruik ge- maakt van Next Genera on Sequencing (NGS) pla ormen die PCR gebaseerd zijn. Deze plat- formen staan bekend om de invloed die het GC percentage van een chromosoom hee op de hoeveelheid data die geproduceerd wordt. In hoofdstuk 3 beschrijven we het gebruik van Hel- icos Single Molecule Sequencing (SMS) bij NIPT voor trisomy 21 (T21 ofwel Down Syndroom) detec e als een alterna ef pla orm dat niet gebaseerd is op een PCR techniek. We hebben SMS een-op-een vergeleken met het PCR gebaseerde Illumina pla orm en laten zien dat het gemiddelde aantal sequen es bij SMS niet beïnvloed wordt door het GC percentage. Bij het Illumina pla orm daarentegen zien we dat het gemiddeld aantal sequen es toeneemt bij toenemend GC percentage. Daarbij laten we ook zien dat bij SMS alle T21 foetussen correct geïden fi ceerd worden en zelfs nog beter te onderscheiden zijn van euploïde foetusen als
Samenva ng
8
108
vergeleken met het Illumina pla orm. In hoofdstuk 4 laten we bovendien de toepassing van SMS zien voor het screenen naar andere trisomieën. Het gebruik van SMS is ook succesvol voor trisomie 18 (T18 ofwel Edward’s syndroom) screening. Voor trisomie 13 (T13 ofwel syndroom van Patau) is deze methode minder succesvol. Om de exacte reden van deze mindere presta e beter te kunnen duiden, zou verder onderzoek uitgevoerd moeten worden.
In tegenstelling tot NIPT, beslaat NIPD voor monogene erfelijke aandoeningen slechts een klein deel van het veld van niet-invasief prenataal testen. NIPD kan gebruikt worden voor de detec e van paternaal overgeërfde sequen es. Momenteel is het nog niet mogelijk om alle NIPD uit te voeren met één enkele of universele aanpak, zoals bijvoorbeeld het gebruik van NGS. In hoofdstuk 5 wordt het gebruik van PCR en hoge resolu e smelt curve analyse (HR-MCA) als een alterna ef voor NGS beschreven. Door het blokken van de maternale ach- tergrond jdens de PCR met behulp van een LNA probe, wordt de detec e van het paternaal overgeërfde allel in de foetus sterk verbeterd. Als “proof of principle” tonen we dit voor zowel een autosomaal dominant als een autosomaal recessief overervende aandoening aan.
Daarnaast wordt in hoofdstuk 6 nog een andere PCR gebaseerde toepassing getoond voor de ziekte van Hun ngton (HD) en de detec e van het paternale allel in de foetus. HD wordt veroorzaakt door een expansie van een trinucleo de (CAG) herhaling/repeat in het hun ng ne gen (HTT). De paternale overgeërfde repeat in de foetus kan worden gedetecteerd met behulp van een PCR waarbij gebruik gemaakt wordt van primers die rondom de repeat liggen. In deze valida e studie voor NIPD van HD konden we een foetale repeat van tot wel 70 CAG herhalingen aantonen in maternaal plasma. Bovendien laten we zien dat we bij alle foetussen die risico lopen op het krijgen van HD, de paternaal overgeërfde repeat werd aange- toond. Bij de foetussen die het normale allel van vader hebben gekregen, blijkt de detec e ervan sterk a ankelijk te zijn van het genotype van beide ouders.
Het is zeer waarschijnlijk dat het aantal toepassingen voor NIPT en zeker voor NIPD de komende jd sterk zal toenemen. Ondanks het feit dat het gebruik van gefragmenteerd cff D- NA uit maternaal plasma nog steeds uitdagingen kent (bijvoorbeeld de rela ef lage hoe- veel- heid en de korte lengte), laat dit proefschri zien dat deze uitdagingen overwonnen kunnen worden door voor iedere toepassing de meest effi ciënte aanpak te gebruiken. Kortom, cff DNA is een uitermate geschikte bron van foetaal DNA voor NIPT en NIPD. Met het verbeteren van de huidige technieken, zullen zowel NIPT als NIPD in de toekomst voor meer vrouwen beschik- baar komen, alhoewel het op dit moment nog niet mogelijk lijkt om hiervoor een universele aanpak voor te gebruiken. Desalnie emin is de verwach ng dat in de toekomst het merendeel van invasieve procedures voor prenatale diagnos ek vervangen gaat worden door NIPD of NIPT.
Chapter 8
