UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (https://dare.uva.nl)
UvA-DARE (Digital Academic Repository)
CD44 glycoproteins in colorectal cancer; expression, function and prognostic
value
Wielenga, V.J.M.
Publication date 1999
Link to publication
Citation for published version (APA):
Wielenga, V. J. M. (1999). CD44 glycoproteins in colorectal cancer; expression, function and prognostic value.
General rights
It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Disclaimer/Complaints regulations
If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: https://uba.uva.nl/en/contact, or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible.
Summary
Mortality due to colorectal cancer is almost always the result of tumor metastasis, since colorectal tumors in an early stage of development which are mostly asymptomatic, are infrequently diagnosed. Roughly half of the patients with apparently localized disease at the time of diagnosis, who are operated with the intention to cure, will nevertheless have an eventual recurrence of the disease due to undetected micrometastases present at the time of surgery. In order to improve prognosis it is imperative that the molecular determinants of metastasis are identified. This would enable differentiation between patients with localized disease and patients in which the tumor is already disseminated and who might benefit from aggressive adjuvant therapy.
Cancer of the large bowel mucosa develops through a series of morphologically well defined precursor lesions known as the adenoma-carcinoma sequence. In Chapter 2 we demonstrate by immunohistochemistry and RT-PCR, that splice variants of CD44 are overexpressed during this process. Expression of CD44 variants that contain exon v5 was already detected during an early phase of colorectal carcinogenesis, i.e. in early adenomas, whereas expression of variants containing exon v6 sequences was largely restricted to more advanced stages of tumor development. In addition, v6 expression was more prevalent and intense in metastatic (Dukes C and D) than in nonmetastatic (Dukes B) cancers.
The mucosal changes that take place during colorectal tumor progression are the result of a series of genetic changes. A molecule that plays an important role during neoplastic transformation in the large bowel is the p53 tumor suppressor gene. Mutation of p53 was reported in 75% of the invasive colorectal cancers, in 30% of late adenomas, but rarely in early adenomas. This suggests a role during transformation from in situ to invasive carcinoma during the adenoma-carcinoma sequence. In Chapter 3, the relation between mutant p53 and CD44 splice variants v5 and v6 and the potential prognostic role of these molecules in colorectal cancer was investigated. Immunohistochemical detection of p53 and CD44v5 and v6 expression showed that, whereas normal mucosa has no detectable p53 expression and a highly restricted CD44
expression, a significant increase of p53 as well as CD44v6 expression was observed at the subsequent stages of tumorigenesis. Among adenomas, both expression of p53 and CD44v6 was related to the degree of dysplasia.
Homologues of the CD44v6 isoforms that are overexpressed during colorectal tumorigenesis in man, play a causal role in the metastatic spread of rat pancreatic carcinoma. In Chapter 4, we have assessed the prognostic significance of CD44v6 and CD44v5 variants. For the detection of CD44v6 we used a panel of three different antibodies that recognize the same epitope, but differ in affinity. The prognostic value of the CD44 variant expression was assessed using univariate and multivariate analysis. Expression of CD44v6, but not CD44v5, had significant prognostic value. By integrating the results of the three antibodies to a cumulative CD44v6 score, which represents a semi-quantitative assessement of CD44v6 expression, a superior discrimination between risk groups was obtained. Thus, analysis of CD44v6 expression by means of a combined scoring system based on a panel of three different mAbs, makes CD44v6 a highly significant prognostic marker that is independent of Dukes stage, tumor grade, or tumor localization.
Mutations involving components of the Wnt-Wingless signaling cascade i.e. APC and ß-catenin are crucial for the initial neoplastic transformation of colon epithelium. In humans and mice with a germline mutation in the APC gene, multiple colorectal adenomas will develop, with a virtually 100% chance of malignant transformation in time. As the result of APC (or ß-catenin) mutations, the Wnt-pathway is constitutively activated. Binding of ß-catenin with TGF-4 initiates uncontrolled transcription of target genes. Since CD44 is deregulated from an early point of colorectal tumorigenesis onwardly, it might be regulated by the Wnt-pathway. To explore this hypothesis, we analyzed in
Chapter 5 the CD44 expression in intestinal mucosa of mice and humans with
genetic defects in either APC or Tcf-4, leading to constitutive activation or blockade of the ß-catenin/Tcf-4 gene transcription, respectively. We show that CD44 expression in the non-neoplastic intestinal mucosa of Ape mutant mice is confined to the crypt epithelium, whereas CD44 is strongly overexpressed during tumor progression; not only is CD44 overexpressed in adenomas and invasive carcinomas, deregulated CD44 expression is already present in aberrant crypt foci with dysplasia (ACFs), the earliest detectable lesions of colorectal
neoplasia. Like ACFs of Ape-mutant mice, ACFs of familial adenomatous polyposis (FAP) patients also overexpress CD44. In sharp contrast, Tcf-4 mutant mice, without ß-catenin/Tcf-4 induced gene transcription, show a complete absence of CD44 in the epithelium of the small intestine. This loss of CD44 concurs with loss of stem cell characteristics, shared with adenoma cells. Our results in Chapter 5 indicate that CD44 expression is part of a genetic program controlled by the Wnt-signaling pathway and suggest a role for CD44 in the generation and turnover of epithelial cells.
What could be the mechanism by which CD44 provides tumor cells with a growth and/or motility advantage? Recent studies have shown that CD44 isoforms containing the alternatively spliced exon v3 carry heparan sulfate side chains and are able to bind heparin-binding growth factors. In Chapter 6 the possibility is explored of a physical and functional interaction between CD44 and hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF), the ligand of the receptor tyrosine kinase c-Met. The HGF/SF-c-Met pathway mediates cell growth and motility and has been implicated in tumor invasion and metastasis. We demonstrate that CD44v3 efficiently binds HGF/SF via its heparan sulfate-side chain. To address the functional relevance of this interaction, Namalwa Burkitt's lymphoma cells were stably co-transfected with c-Met and either CD44v3 or the isoform CD44s, which lacks heparan sulfate. We show that, as compared to CD44s, CD44v3 promotes: (i) HGF/SF-induced phosphorylation of c-Met, (ii) phosphorylation of several downstream proteins, and (iii) activation of the MAP kinases ERK1 and 2. By heparitinase treatment and the use of a mutant HGF/SF with greatly decreased affinity for heparan sulfate, we show that the enhancement of c-Met signal transduction induced by CD44v3 was critically dependent on heparan sulfate moieties. Our results identify heparan sulfate-modified CD44 (CD44-HS) as a functional co-receptor for HGF/SF which promotes signaling through the receptor tyrosine kinase c-Met, presumably by concentrating and presenting HGF/SF.
We subsequently investigated the expression of CD44-HS, c-Met and HGF/SF during colorectal tumorigenesis. Chapter 7 shows that c-Met is strongly expressed on primary colorectal adenomas, carcinomas and colorectal cell lines. Moreover, HGF/SF mRNA is present at increased levels within tumor tissue. In addition, adenomas and a subset of colorectal carcinomas with
unfavorable prognosis, strongly express CD44-HS. In a colorectal cancer cell line, activation of the c-Met pathway by HGF/SF was found to be dependent on HS. We hypothesize that in colorectal cancer, HGF/SF and c-Met are part of an auto- or paracrine loop. By promoting the activity of the HGF/SF-c-Met pathway, CD44-HS might promote tumor growth and metastasis.
In Chapter 8 the literature on the role of CD44 in colorectal cancer is reviewed and a model for CD44 functioning in colorectal tumorigenesis is proposed.
Samenvatting
Patiënten met kanker van de dikke darm overlijden meestal niet aan de tumor zelf, maar aan de gevolgen van de verspreiding van de kanker cellen door het lichaam, i.e. metastasering. Bij patiënten bij wie de ziekte ten tijde van de diagnose beperkt lijkt tot de darm, wordt het gezwel chirurgisch verwijderd. Echter, ongeveer de helft van deze patiënten krijgt uiteindelijk toch een hernieuwde aanval van de ziekte. Dit is het gevolg van reeds niet-waarneembare metastasering van de maligne cellen ten tijde van de operatie. Om nu de prognose van darm kanker patiënten te verbeteren is het van groot belang om inzicht te krijgen in het proces van tumor metastasering en te onderzoeken welke moleculen een causale rol spelen. Met die moleculen wordt het mogelijk om patiënten, bij wie de tumor reeds verspreid is, te identificeren en te behandelen met agressieve adjuvante therapie.
Dikke darm kanker ontstaat stapsgewijs via een aantal voorloper stadia, die morfologisch goed zijn gedefinieerd. Dit proces wordt samengevat in de adenoom-naar-carcinoom sequentie. In Hoofdstuk 2 tonen wij middels immunohistochemie en RT-PCR aan dat de expressie van splice varianten van CD44 toeneemt tijdens het ontstaan van darm kanker. Splice varianten die exon v5 bevatten worden al gezien in vroege adenomen, terwijl de expressie van varianten die exon v6 bevatten pas werd waargenomen in verder gevorderde stadia, i.e. carcinomen. Bovendien tonen reeds gemetastaseerde tumoren (stadium Dukes C en D) vaker deze toename van CD44, dan niet-gemetastaseerde tumoren (stadium Dukes A en B).
De veranderingen van het slijmvlies van de darm tijdens het ontstaan van kanker zijn het resultaat van genetische veranderingen in deze cellen. Een van de belangrijke moleculen die hier een rol bij spelen is het p53 tumor suppressor gen. Een mutatie van dit gen komt voor in circa 75% van de invasieve tumoren, en in 30% van de late adenomen. In vroege adenomen daarentegen, komt het zelden voor. Dit suggereert dat p53 van belang is bij de transformatie van een benigne fenotype naar een invasief fenotype, gedurende de adenoom-naar-carcinoom sequentie. In Hoofdstuk 3 wordt onderzocht of er een relatie is tussen het gemuteerde p53 enerzijds en CD44v5 en v6, anderzijds. Tevens werd de prognostische waarde van deze moleculen bepaald. In normaal darm
slijmvlies komt er geen p53 tot expressie komt en is CD44 slechts in beperkte mate detecteerbaar. Beide moleculen komen echter in toenemende mate tot expressie gedurende adenoom-naar carcinoom sequentie. In adenomen is er een relatie tussen expressie van p53 en van CD44 en de mate van dysplasie.
Homologen van CD44v6 isovormen, die tot overexpressie komen tijdens het ontstaan van darm kanker in de mens, spelen ook een causale rol in de metastasering van een cellijn van pancreascellen van de rat. In Hoofdstuk 4 hebben wij de prognostisch waarde bepaald van CD44v5 en v6 varianten in patiënten met darm kanker. Om CD44v6 te detecteren hebben wij gebruik gemaakt van een panel van drie verschillende antilichamen, die wel het zelfde epitoop herkennen, maar verschillen in de affiniteit hiervoor. De prognostische waarde van de expressie van CD44v6 werd door middel van univariaat en multivariaat analyse bepaald. In tegenstelling tot de expressie van CD44v5, had CD44v6 expressie een voorspellende waarde. Integratie van de resultaten van de drie antilichamen, die tezamen een semi-kwantitatieve weergave zijn van de CD44v6 expressie, resulteerde in een nog groter verschil tussen de groepen. Samenvattend, door de expressie van CD44v6 te bepalen middels een scorings systeem dat gebaseerd is op een panel van drie verschillende antilichamen, is CD44v6 te gebruiken als een sterk voorspellende marker voor overleving die bovendien onafhankelijk is van Dukes stadium, tumor graad en tumor lokalisatie.
Mutaties in componenten van de Wnt-Wingless signaal transductie cascade, zoals APC en ß-catenine, zijn cruciaal voor het initiëren van neoplastische transformatie van het darm slijmvlies. In zowel de mens als de muis resulteert een stamcel mutatie in het APC gen in het ontstaan van talrijke poliepen van de darm. De kans op uiteindelijke maligne ontaarding van een van die poliepen is eigenlijk 100%. Ten gevolge van mutaties in APC (of
catenine) is de Wnt-Wingless cascade continu geactiveerd. In dit geval bindt
ß-catenine aan TCF-4 en komt hierdoor een ongecontroleerde transcriptie op gang van verschillende target genen. Gezien het feit dat CD44 al in een vroeg stadium van darm kanker tot overexpressie komt, wordt het wellicht gereguleerd door de Wnt-Wingless cascade. Om deze hypothese te toetsen, hebben wij in
Hoofdstuk 5 gekeken naar de expressie van CD44 in de darm van mens en
activatie of blokkering, respectievelijk, van /?-catenine/TCF-4-gemediëerde gen transcriptie. Wij tonen aan dat CD44 expressie in het niet-neoplastische darm slijmvlies van Apc gemuteerde muizen beperkt blijft tot de crypt, maar dat CD44 sterk tot expressie komt in het gehele darm epitheel gedurende de ontwikkeling van tumoren; CD44 is niet alleen op gereguleerd in adenomen en carcinomen, maar zelfs al in het vroegste stadium van neoplastisch getransformeerd slijmvlies, de dysplastische aberrante crypt. In aberrante crypten van patiënten met een APC mutatie -patiënten met familiare adenomateuze polyposis coli (FAP)- wordt een vergelijkbare over expressie van CD44 gezien. Hier tegenover staat dat in het darm slijmvlies van muizen met een geblokkeerde /?-catenine/TCF-4-gemediëerde gen transcriptie, CD44 volkomen afwezig is. Hierbij komt dat de crypt cellen zonder CD44 ook andere eigenschappen missen, zoals die gezien worden in adenoom cellen. Onze resultaten in Hoofdstuk 5 laten zien dat CD44 expressie onderdeel is van een genetische programma, dat gecontroleerd wordt door de Wnt-signaal transductie cascade, en suggereren daarbij dat CD44 belangrijk is in de ontwikkeling van epitheliale cellen van de darm.
Een belangrijke vraag is wat het mechanisme zou kunnen zijn waarmee CD44 een groei en verspreidings voordeel geeft aan maligne cellen. Recente studies hebben aangetoond dat CD44 isovormen die exon v3 bevatten, met heparaan sulfaat ketens gemodificeerd kunnen worden, die vervolgens groeifactoren kunnen binden. In Hoofdstuk 6 is onderzocht of er een al dan niet functionele interactie bestaat tussen CD44 enerzijds en hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) , de ligand van de receptor tyrosine kinase c-Met, anderzijds. De interactie tussen HGF/SF en c-Met mediëert cel groei en beweging en is betrokken bij tumor invasie en metastasering. Wij laten zien dat HGF/SF efficiënt kan binden aan CD44v3 via de heparaan sulfaat keten. Om een eventuele functionele relevantie van deze interactie te bepalen, werden Namalwa Burkitt lymfoom cellijnen stabiel getransformeerd met c-Met en CD44v3 of met c-Met en CD44s, een CD44 isovorm zonder heparaan sulfaat keten. Wij laten zien dat, in vergelijking met CD44s, CD44v3 de fosforylering stimuleert van (i) c-Met door HGF/SF en (ii) van enkele eiwitten verderop in deze cascade en (iii) de activatie induceert van de MAP kinasen ERK1 en 2. Door middel van stimulatie door een gemuteerde vorm van HGF/SF met een sterk verlaagde
affiniteit voor heparaan sulfaat en heparitinase behandeling voor HGF/SF stimulatie, werd aangetoond dat de versterking van de c-Met signaal transductie, zoals geïnduceerd door CD44v3, afhankelijk is van HGF/SF binding aan heparaan sulfaat. Met onze resultaten identificeren wij heparaan sulfaat-gemodificeerde CD44 isovormen (CD44-HS) als functionele co-receptor for HGF/SF. Door groeifactoren op het cel oppervlak te concentreren en te presenteren, zou dit een versterkte inductie van signalering via c-Met kunnen bewerkstelligen.
De volgende stap was om de expressie van zowel CD44-HS, c-Met en HGF/SF in darm slijmvlies gedurende het ontstaan van kanker, te inventariseren.
Hoofdstuk 7 toont aan dat c-Met sterk tot expressie komt in adenomen en
carcinomen van de darm en in verschillende colorectal cel lijnen. Bovendien is een toegenomen hoeveelheid HGF/SF mRNA aanwezig in het tumor weefsel, in vergelijking met normaal darm weefsel. Zowel adenomen, als carcinomen van patiënten met een slechte prognose brengen CD44v3 sterk tot expressie. In een colorectale cel lijn was de activatie van c-Met door HGF/SF afhankelijk van HS. Onze hypothese is dan ook dat in kanker van de dikke darm de activatie van c-Met door autocrien of paracrien gesecerneerd HGF/SF een belangrijke rol speelt. Door de activiteit van c-Met te induceren zou HGF/SF cellen aan kunnen zetten tot groei en metastasering.
Hoofdstuk 8 is een beschouwing over de recente literatuur betreffende
de rol van CD44 in darm kanker. Tevens wordt er een model geïntroduceerd van het causale verband tussen de expressie van CD44 en het ontstaan van dikke darm kanker.
