Implementeren van een
UPLC-FSA methode
Analyse van
14C gelabelde stoffen in water/sediment
studies
Joep van Beek -2015
Afstudeerstage WIL Research:
Implementeren van een UPLC-FSA methode
Analyse van
14C gelabelde stoffen in water/sediment studies
Scriptie versie 1
Student (2050351): Email adres:
Joep van Beek j.vanbeek1@student.avans.nl jvbeek1@hotmail.com Bedrijfsmentor:
Maud van den Bosch Maud.van.den.Bosch@wilresearch.com Praktijkbegeleider:
Deena van Logchem Deena.van.Logchem@wilresearch.com Docentbegeleider:
Bram Margry b.margry@avans.nl Periode: 4.3 & 4.4
Datum: 15-6-2015 School:
Avans Hogeschool
ATGM, Academie voor de Technologie van Gezondheid en Milieu Lovensdijkstraat 61-63, 4818 AJ Breda
Opleiding:
Chemie, Forensisch onderzoek Stage bedrijf:
WIL Research Europe B.V.
Afdeling Analytische en Fysische Chemie (AFC) Hambakenwetering 7, 5231 DD ’s-Hertogenbosch
Voorwoord
Dit verslag is het eindproduct van mijn afstudeerstage bij WIL Research in het 4e jaar van de opleiding
Forensische Laboratorium Onderzoek (FLO) aan de Avans Hogeschool. Het verslag bevat mijn onderzoek naar het implementeren van een UPLC-FSA methode voor de detectie van 14C gelabelde
stoffen uit water/sediment studies.
De stage opdracht om de UPLC te combineren met radiodetectie (FSA) was zeker een uitdaging, waarbij vele obstakels moesten worden overwonnen om de methodeontwikkeling mogelijk te maken. Gelukkig waren mijn stagebegeleiders, Maud van den Bosch en Deena van Logchem, altijd bereid om mij op weg te helpen of mijn vragen te beantwoorden. Ik heb gedurende mijn afstudeerstage bij WIL Research veel kunnen leren, waarvoor ik zeer dankbaar ben.
Bij dezen wil ik graag mijn stagebegeleiders bedanken voor hun geweldige begeleiding en ondersteuning gedurende mijn afstudeerstage. Daarnaast wil ik Bram Margry bedanken voor zijn begeleiding vanuit Avans Hogeschool. Verder wil ik graag mijn andere collega’s bij WIL Research Europe B.V. bedanken voor de fijne samenwerking. Als laatste wil ik ook de medewerkers van LabLogic en MetorX bedanken voor hun hulp gedurende het onderzoek.
Ik wens u veel leesplezier toe.
Joep van Beek
‘s-Hertogenbosch, 15 juni 2015
Samenvatting
Voor de analyse van radioactief gelabelde stoffen wordt er gebruikt gemaakt van een HPLC-FSA systeem. Dit bestaat uit een HPLC systeem gekoppeld aan een Flow Scintillatie Analyzer (FSA) voor de detectie van radioactieve isotopen. WIL Research wil deze analyse methode verbeteren door in plaats van HPLC, gebruik te maken van een UPLC-FSA systeem. De voordelen qua tijd- en kostenbesparing kunnen namelijk bij een UPLC-FSA systeem aanzienlijk zijn. De UPLC werkt onder een hogere druk en heeft een kleinere deeltjes grootte in de kolom (stationaire fase). Dit zorgt voor een betere resolutie, scherpere pieken en/of kortere retentietijden. Het probleem met een FSA detector is dat de flow cel in de detector er voor zorgt dat er significante piekverbreding optreedt. Wanneer er dus gebruik wordt gemaakt van een te korte gradiënt, zullen de pieken overlappen. De piekbreedte kan worden verkleind door gebruik te maken van een kleinere flow cel in de FSA detector. Het gebruik van kleiner volume flow cel heeft ook invloed op de gevoeligheid door de korter verblijftijd (meettijd) in de detector. Voor de ontwikkeling van een optimale UPLC-FSA methode, moet er een middenweg worden gevonden tussen de runtijd, resolutie, piekbreedte en gevoeligheid van de detector.
Het primaire doel van het onderzoek bij WIL Research is het ontwikkelen van een reversed phase UPLC-FSA methode voor de kwalificatie van 14C gelabelde stoffen in (geconcentreerde)
water/sediment extracten. Hierbij moet de piekverbreding die wordt veroorzaakt door de FSA detector worden verkleind, om gebruik te kunnen maken van een korte UPLC gradiënt.
Als secundaire doel werd er gekeken naar het creëren van een 2e analysemethode voor 14C gelabelde
stoffen in water/sediment extracten, met behulp van Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) in combinatie met een LC-FSA systeem.
Het optimaliseren van het UPLC-FSA systeem door de tubing te vervangen, had direct een positief effect op de piekbreedte en gevoeligheid. Ook het gebruik maken van een langere UPLC kolom had een positief effect op de piekbreedte en gevoeligheid, maar dit was te danken aan het feit dat er minder overbelading was van de kolom bij een grotere (kolom) volume. Dit werd later gecorrigeerd door het injectievolume te verlagen. Bij het onderzoek naar de dwell tijd was een lineair verband (R2
>0.99) te zien tussen de dwell tijd en hoeveelheid gemeten counts. Omdat het minimaal aantal meetpunten (10-15) te behouden, zal bij een scherpere piek de dwell tijd lager moeten worden gezet. Wat zal leiden tot een verlies in de gevoeligheid. Het vervangen van de flow cel voor een kleiner volume had niet het gewenste effect op de piekbreedte, ondanks dat de verblijftijd in de flow cel meer dan gehalveerd was. Bij het onderzoek naar de scintillatie flowrate, kwam naar voren dat de optimale eluens/scintillatie ratio 1:4 is. Doordat er bij de UPLC gebruik wordt gemaakt van een lagere eluens flowrate (0.45 ml/min) en kortere gradiënt, is het scintillatie cocktail verbruik nog steeds significant lager vergeleken met de HPLC (flowrate: 1 ml/min, eluens/scintillatie ratio 1:3). Door de AIM tubing te vervangen voor micro AIM tubing, was een daling te zien in het aantal gemeten counts. De Micro AIM tubing had niet het gewenste resultaat op de piekbreedte.
Het is nog niet gelukt om de voordelen van UPLC volledig te combineren met radiodetectie. Om de zelfde scheiding (resolutie) te behalen als bij de HPLC, moet eerst de piekbreedte verder worden verlaagd. Dit betekend een verdere afname in gevoeligheid, omdat er gebruik moet worden gemaakt van een nog kleinere flow cel. Voor HILIC is het gelukt om voor meerdere teststoffen een methode te ontwikkelen (teststof 205684 en 206433). Dit ondanks de problemen met de stabiliteit van teststof 206433. Bij de teststof 205341 is het gelukt om retentie te verkrijgen, maar door de lage aantal counts en hoge achtergrond is hier meer methodeontwikkeling vereist. Bij de teststof 206244 is het niet gelukt om retentie te verkrijgen, de teststof is waarschijnlijk te apolair om te worden gebruikt voor een HILIC methode. Het verlagen van de pH had een positief effect op de retentietijd van de teststoffen. Ook de concentratie verhoging van de buffer heeft een positief effect op retentie.
Summary
For the analysis of radioactively labeled substances a HPLC-FSA system is used. This consists of a HPLC system coupled to a Flow Scintillation Analyzer (FSA) for the detection of radioactive isotopes. WIL Research aims to improve this analysis method by using, instead of HPLC, a UPLC-FSA system. The benefits in terms of time and cost savings can be significant with a UPLC-FSA system. The UPLC operates under a higher pressure and has a smaller particle size in the column (stationary phase). This allows for better resolution and sharper peaks and/or shorter retention times. The problem with a FSA detector is that the flow cell in the detector causes a significant peak broadening. When a short gradient is used, the peaks will overlap. The peak width can be reduced by using a smaller flow cell in the FSA detector. The use of a smaller volume flow cell also has an influence on the sensitivity due to the shorter residence time (measuring time) in the detector. For the development of an optimal UPLC-FSA method, an optimum has to be found between the run time, resolution, peak width and sensitivity of the detector.
The primary objective of the research at WIL Research was developing a reversed phase UPLC-FSA method for the qualification of 14C-labeled substances (concentrated) in water/sediment extracts. Hereby, the peak broadening caused by the FSA detector had to be reduced, to be able to make use of a short UPLC gradient. As secondary objective we looked at the implementation of a 2e analysis
method for 14C-labeled substances in water/sediment extracts, using Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) combined with an LC-FSA system.
Optimizing the UPLC-FSA system by replacing the tubing, had an immediate positive effect on the peak width and sensitivity. Also, the use of a longer UPLC column had a positive effect on the peak width and sensitivity, but this is due to the fact that there was less overload of the column at a larger (column) volume. This was later corrected by reducing the injection volume. In the examination of the dwell time a linear relationship (R2> 0.99) was found between the dwell time and amount of measured counts. Since a minimum number of measurement points (10-15) is required in a peak, the dwell time should be lower in a sharper peak. Which will lead to a loss in sensitivity. The replacement of the flow cell for a smaller volume did not have the desired effect on the peak width, even though the residence time in the flow cell was reduced by more than half. In the study of the scintillation flow rate, it was shown that the optimal eluent / scintillation ratio is 1:4. Because of the use of a lower eluent flow rate (0.45 ml/min) and shorter gradient with UPLC, the consumption of scintillation is still significantly lower compared with the HPLC (flow rate: 1 ml/min, eluent/scintillation ratio 1: 3). Replacing the AIM tubing for micro AIM tubing, showed a decline in the number of measured counts. The Micro AIM tubing did not have the desired effect on the peak width.
So far it has not been possible to combine the benefits of UPLC with radio detection. To obtain the same separation (resolution) as with the HPLC, the peak width must first be further reduced. This means a reduction in sensitivity, because of the use of an even smaller flow cell. For HILIC it has been possible to develop a method for multiple test substances (test material 205684 and 206433). This despite the problems with the stability of test substance 206433.
For the test substance 205341 retention is already obtained, but because of the low number of counts and high background more method development is requires. With the test substance 206244 it has been unable to obtain any retention, the test substance is likely to non-polar to be used for a HILIC method. Lowering the pH had a positive effect on the retention time of the test substances. Also, the increase in concentration of the buffer has a positive effect on retention.
Inhoudsopgave
Voorwoord...III Samenvatting...IV Summary...V 1. Inleiding...1 2. Theoretische achtergrond...2 2.1 Water/sedimentstudies...2 2.1.1 Koolstof-14...32.2 Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)...3
2.3 Flow Scintillation Analyzer (FSA)...4
2.4 Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)...6
2.4.1 Stationaire fase...6 2.4.2 Mobiele fase...6 3. Materiaal en methode...7 3.1 Materiaal...7 3.1.1 Chemicaliën...7 3.1.1 Apparatuur...7 3.2 Methode...7 3.2.1 UPLC-FSA optimalisatie...7 3.2.2 HILIC...9 4. Resultaten...10 4.1 UPLC-FSA...10 4.1.1 Dwell tijd...11 4.1.2 Minimaliseren doodvolume...12 4.1.3 Water/sediment extracten...13
4.1.4 FSA flow cel...14
4.1.5 Injectievolume...15
4.1.6 Scintillatie flowrate...16
4.1.7 Accelerated In-line Mixer (AIM)...17
4.2 HILIC...18
Teststof 205684 (studie 505962)...18
Teststof 206433 (studie 508587)...20
5. Discussie...22 5.1 UPLC-FSA...22 5.1 HILIC...23 6. Conclusie...25 Aanbevelingen...26 Literatuur...27
Bijlage I: Teststof informatie 205655/506584...29
Bijlage II: Teststof informatie 205929/506786...29
Bijlage III: Teststof informatie SL 16 S-FIL (205929/506786)...29
Bijlage IV: Teststof informatie SL 16 W-ACN (205929/506786)...30
Bijlage V: Teststof informatie SW 20 S-FIL (205929/506786)...30
Bijlage VI: Teststof informatie SW 20 W-ACN (205929/506786)...30
Bijlage VII: Teststof informatie (205341/507909)...31
Bijlage VIII: Teststof informatie (206244/508159)...31
Bijlage IX: Teststof informatie (206433/508587)...32
Bijlage X: Teststof informatie (205684/505962)...32
Bijlage XI: Teststof informatie AS1529 (205684/505962)...33
Bijlage XII: Teststof informatie AS1530 (205684/505962)...33
Bijlage XIII: Teststof informatie AS1531 (205684/505962)...33
Bijlage XIV: HPLC-FSA (water/ sediment) metingen studie 506786...34
Bijlage XV: Dwell tijd metingen...39
Bijlage XVI: Injectievolume metingen...47
Bijlage XVII: Scintillatie flowrate metingen...53
1. Inleiding
WIL Research Europe B.V. is een bedrijf dat onderzoek verricht naar de toxiciteit van farmaceutische en (agro)chemische stoffen. Dit toxicologisch onderzoek is vereist voor de registratie en veiligheidsbeoordeling van chemicaliën, voordat deze op de markt komen. Omdat deze stoffen op verschillende manieren in het milieu terecht kunnen komen, is een belangrijk onderdeel van de veiligheidsbeoordeling de bepaling van de transformatie, distributie en afbraaksnelheid van een stof in een water/sediment systeem. Dit wordt gedaan met behulp van water/sediment studies.
Bij water/sediment studies wordt de afbraak, distributie en transformatie (metabolieten) van een stof bepaald in een gecontroleerd water/sediment milieu onder aerobe condities. Om de stof en (eventueel) gevormde metabolieten te kunnen traceren tijdens deze studies worden ze gelabeld met
radioactieve isotopen, zoals koolstof-14 (14C). Voor het kwantificeren van deze stoffen worden ze
geëxtraheerd uit het water/sediment en wordt de totale toegevoegde (14C) activiteit gemeten met
een Liquid Scintilation Counter (LSC). Voor het kwalificeren van de stoffen wordt, na eventueel een concentratiestap, gemeten met behulp van een HPLC-FSA systeem. Dit bestaat uit een HPLC systeem gekoppeld aan een Flow Scintillatie Analyzer (FSA) voor de detectie van radioactieve isotopen. Dit systeem wordt meestal gecombineerd met een Ultraviolet/Photodiode array (UV/PDA) detector. WIL Research wil deze analyse methode verbeteren door in plaats van HPLC, gebruik te maken van een UPLC-FSA systeem. De UPLC werkt onder een hogere druk en heeft een kleinere deeltjes grootte in de kolom (stationaire fase). Dit zorgt voor een betere resolutie, scherpere pieken en/of kortere retentietijden. Door de (mogelijk) kortere analysetijd van een UPLC-FSA systeem, kan er worden bespaard op eluens en scintillatie cocktail. De voordelen qua tijd- en kostenbesparing bij een UPLC-FSA systeem kunnen aanzienlijk zijn.
Als confirmatie op de UPLC-FSA methode wordt er gekeken naar het creëren van een Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) methode in combinatie met een LC-FSA systeem.
HILIC is normal phase chromatografie van polaire en geïoniseerde stoffen. Door gebruik te maken van een andere scheidingstechniek in de 2e analysemethode wordt het aantal metabolieten bevestigd en
gecheckt of er nog extra metabolieten zijn.
Het doel gedurende de afstudeerstage bij WIL Research is het ontwikkelen van een reversed phase UPLC-FSA methode voor de kwalificatie van 14C gelabelde stoffen in (geconcentreerde)
water/sediment extracten. Na de optimalisatie van de reversed phase UPLC-FSA methode, wordt er gekeken naar het creëren van een HILIC (normal phase) LC-FSA methode voor de kwalificatie van polaire 14C gelabelde stoffen.
De verwachting is dat het implementeren van een UPLC-FSA systeem zal leiden tot kortere runtijden, scherpere pieken en een vermindering in verbruik van eluens en scintillatie cocktail.
In deze scriptie zal de theorie die in verband staat met dit onderzoek worden uitgelegd in hoofdstuk 2. Hoofdstuk 3 bevat de gebruikte materiaal en methodes. In hoofdstuk 4 kunnen de resultaten van het onderzoek worden gevonden. De discussie is te vinden in hoofdstuk 5. Ten slotte kan de conclusie en aanbevelingen gevonden worden in hoofdstuk 6. Daarnaast is er ook een literatuurlijst met gebruikte bronnen en een aantal bijlages.
2. Theoretische achtergrond
2.1 Water/sedimentstudies
Om te bepalen hoe farmaceutische en agrochemische stoffen zich gedragen als ze in het milieu terecht komen, worden er met deze stoffen water/sediment studies uitgevoerd (milieurisico evaluatie). Met deze studies kan de afbraak, distributie en omzetting (metabolieten) van deze stoffen worden bepaald in een gecontroleerd milieu. Door gebruik te maken van 14C labeling kan de
omzetting en distributie van de stoffen tussen het water, sediment en gasfase in het milieu worden gevolgd. In totaal worden er twee
verschillende water/sediment systemen gebruikt gedurende een studie. Deze zijn afkomstig uit het Zwitser meer, Engeland en Schoonrewoerdsewiel, Nederland. Het is belangrijk dat de water/sediment systemen
verschillen in structuur (deeltjes grootte sediment), pH en gehalte aan organisch materiaal. Gedurende de studie wordt het zuurstof gehalte, redox potentiaal, pH en Total Organic Carbon (TOC) van de water/sediment systemen wekelijks bepaald. Deze parameters worden gemonitord om de stabiliteit van de water/sediment systemen te bewaken. De 14C gelabelde stof (minimaal ± 500 kBq)
wordt toegevoegd aan 1 L metabolisme flessen met daarin het water/sediment systeem. De metabolisme flessen worden vervolgens geincubeerd in een klimaat cel bij 20 °C (± 2 °C). Tijdens de incubatie wordt er voortdurend lucht door het water van het systeem geleid en zijn de metabolisme flessen aangesloten op meerdere vloeistof traps. Deze traps bestaan uit vloeistoffen die vluchtige componenten vangen afkomstig van de teststof in het water/sediment systeem (zie figuur 1). De eerste trap bevat 2-methoxyethanol voor het vangen van organische vluchtige stoffen, gevolgd door twee traps met natriumhydroxide (2 M) voor het vangen van (gelabelde) koolstofdioxide [ CITATION Bra14 \l 1043 ][ CITATION Org02 \l 1043 ].
Een water/sediment studie loopt totdat 90 % van de toegevoegde 14C gelabelde stof is afgebroken
(en/of omgezet) of maximaal 100 dagen. Voor elk water/sediment systeem wordt op vaste dagen gedurende de studie een monster gemeten (in duplo), namelijk na 3, 7, 14, 28, 63 en 100 dagen [ CITATION Org02 \l 1043 ]. Hierbij wordt de 14C gelabelde stof geëxtraheerd uit het water en
sediment. De hoeveelheid radioactiviteit in het sediment, water en traps wordt vervolgens gemeten met behulp van een LSC. Hiermee kan de verdeling van de radioactiviteit tussen water en sediment en traps (vluchtige stoffen) worden berekend. Voor het kwalificeren van eventueel gevormde metabolieten, worden de water- en sediment extracten aansluitend gemeten op een HPLC met radiodetectie (Flow Scintillatie Analyzer (FSA)). Metabolieten die meer dan 10 % van de oorspronkelijke toegevoegde hoeveelheid (applied %) radioactiviteit vertegenwoordigen worden geïdentificeerd. Dit wordt gedaan aan de
hand van het vergelijken van retentietijden met eventuele referentiestoffen. De
identificatie van de stof en metabolieten zal worden bevestigd door een tweede analysemethode (bijvoorbeeld LC-MS). Met de metingen van de verschillende dagen wordt de DT50 en DT90 waarden (DT= Disappearance Time) in water, sediment en gecombineerde water/sediment systeem berekend. De DT waarde is de tijd waarin het oorspronkelijke toegevoegde hoeveelheid teststof met 50 en 90 % is gereduceerd [ CITATION Bra14 \l 1043 ][ CITATION Org02 \l 1043 ].
Figuur 1: Water/sediment studie opstelling bestaande uit een metabolisme fles met water/sediment systeem en drie vloeistof traps (2-methoxyethanol en twee keer natriumhydroxide) [ CITATION Bra14 \l 1043 ]
2.1.1 Koolstof-14
Koolstof-14 (14C) is een radioactief isotoop van koolstof dat in de natuur voorkomt.
Het vervalt door het uitzenden van bèta (β-) straling naar stikstof-14. Koolstof-14 wordt gebruikt in
(bio)chemisch onderzoek om de chemische reacties en interacties van een stof te kunnen volgen. Dit wordt gedaan door een koolstof in je teststof te vervangen met de radioactieve koolstof-14. Hierdoor blijven de chemische eigenschappen van de teststof hetzelfde, maar wordt de teststof makkelijker te detecteren. Omdat koolstof voorkomt in bijna alle organische verbindingen en koolstof-14 een halfwaardetijd heeft van 5730 jaar, is het zeer geschikt als traceermiddel. De halfwaardetijd is de tijd waarna nog de helft van de oorspronkelijke hoeveelheid radioactiviteit over is. Door zijn matige ioniserend en doordringend vermogen kan er ook (redelijk) veilig mee gewerkt worden [ CITATION Bro10 \l 1043 ][ CITATION Vog09 \l 1043 ]
2.2 Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)
Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) is een van de laatste ontwikkelingen op het gebied vloeistofchromatografie voor het scheiden van stoffen in een matrix. Net zoals bij High Performance Liquid Chromatography (HPLC) vindt de scheiding van de stoffen plaats op basis van hun polariteit en interactie met de mobiele en stationaire fase. De UPLC maakt gebruik van een kleinere deeltjes grootte (<2 µm) in de kolom (stationaire fase), waardoor er een betere scheiding plaats vindt. De kleinere deeltjes grootte zorgt er ook voor dat er een veel hogere
druk ontstaat bij een optimale flow rate. Een HPLC (max. ± 400 bar) kan deze druk niet aan, maar op een UPLC kan er gewerkt worden onder zeer hoge druk (max. ± 1000 bar). De kleinere deeltjes zorgen er voor dat een betere resolutie, gevoeligheid en kortere retentietijden kan worden behaald [ CITATION Sha13 \l 1043 ][ CITATION Red12 \l 1043 ][ CITATION Nar14 \l 1043 ] [ CITATION Mee13 \l 1043 ][ CITATION Pat11 \l 1043 ][ CITATION
Nar141 \l 1043 ]. Dit kan worden aangetoond door middel van de Van Deemter vergelijking (zie figuur 2).
De scheiding in een kolom is het efficiëntst bij een zo laag mogelijk schotelhoogte (H). De Eddy diffusie (A) is de lengte die een molecuul aflegt door een kolom en wordt lager bij een kleinere deeltjes grootte. Longitudinale diffusie (B) is de verspreiding van moleculen over de lengte van de kolom en vermindert bij een hoge flow rate. De evenwichtsinstelling (C) gaat over het evenwicht die ontstaat tussen de moleculen in de mobiele en stationaire fase. Bij een hogere flow rate wordt het moeilijker om dit evenwicht te bereiken, waardoor moleculen er langer over zullen doen om van de stationaire fase over te gaan naar de mobiele fase. Dit probleem kan worden verminderd door gebruik te maken van een kleinere deeltjes grootte in de kolom en/of een hogere temperatuur, waardoor de teststof makkelijkere oplost in de mobiele fase. Het is dus mogelijk om de analyse tijd te verkorten zonder een negatief effect te hebben op de resolutie (zie figuur 3) [ CITATION Sha13 \l 1043 ][ CITATION Red12 \l 1043 ][ CITATION Nar14 \l
1043 ][ CITATION Mee13 \l 1043 ][ CITATION Pat11 \l 1043 ][ CITATION Nar141 \l 1043 ]
[ CITATION Bin03 \l 1043 ][ CITATION Har10 \l 1043 ][ CITATION htt15 \l 1043 ].
De kleinere deeltjes grootte in de kolom is de basis van de UPLC techniek en maakt het mogelijk om efficiënter analyse uit te voeren bij hogere flow rates. Om de zelfde retentie te behouden evenwaardig met de HPLC, moest er een kolom
Figuur 2: Van Deemter vergelijking, H = Schotelhoogte, A = Eddy diffusie, B = Longitudinale, C = Evenwichtsinstelling en u = Flow rate [ CITATION Bin03 \l 1043 ]
Figuur 3: Schotelhoogte (y-as) uitgezet tegenover de flow rate per deeltjes grootte kolom (x-as) [ CITATION htt15 \l 1043 ]
worden ontwikkeld met poreuze kleine deeltjes (<2 µm) die de hoge druk van de UPLC kon weerstaan. Silica kolommen worden vaak gebruikt vanwege hun (scheidings) efficiëntie, maar hebben een beperkte pH werkrange (2-8). Polymeer kolommen kunnen wel een bredere pH range (2-12) aan, maar hebben een lagere efficiëntie. De ontwikkeling van de Bridged Ethyl Hydrid (BEH) kolom gaf de oplossing voor dit probleem. Deze kolommen hebben, dankzij het overbruggen van methylgroepen in een silica matrix, een vergrote stabiliteit van 1.7 µm deeltjes. Hierdoor hebben BEH kolommen een hoge efficiëntie en brede pH werkrange (1-12) die een hoge druk kunnen weerstaan [ CITATION Sha13 \l 1043 ][ CITATION Red12 \l 1043 ][ CITATION Nar14 \l 1043 ][ CITATION Mee13 \l 1043 ][ CITATION Pat11 \l 1043 ][ CITATION Nar141 \l 1043 ].
Voor het scheiden van 14C gelabelde stoffen en hun metabolieten uit water/sediment studies kan de
UPLC verbetering bieden in run tijd en resolutie. De uitdaging ligt echter in het combineren van een UPLC systeem met een FSA detector (zie 2.3 flow scintillation analyzer). Dit komt door de relatief lange verblijftijd die nodig is in de radioactiviteit detector om de gewenste gevoeligheid te bereiken, waardoor er piekverbreding optreed. Het gebruik van een kleinere flow cel zorgt voor een betere resolutie, maar heeft een negatieve invloed op de gevoeligheid door de kortere meet tijd in de detector. In het artikel van F. Cuyckens et al. werd gebruik gemaakt van een 200 µl prototype flow cel met een kleinere buis diameter. Dit in combinatie met een flow rate van 0.6 ml/min en 4 ml/min scint. rate, werd er een middenweg gevonden tussen de resolutie en gevoeligheid. De UPLC-FSA methode vertoonde betere resolutie en kortere run tijd vergeleken met de conventionele HPLC-FSA methode [ CITATION Cuy08 \l 1043 ]. In het artikel van D. Franck et al. werd er gebruik gemaakt van nog kleinere flow cellen (100, 50 en 20 µl). Hierbij was te zien dat het gebruik van kleinere flow cellen zorgde voor scherpere pieken. Ook hier werd een hogere efficiëntie, nauwkeurigheid en gevoeligheid behaald met de UPLC-FSA methode [ CITATION Fra09 \l 1043 ].
2.3 Flow Scintillation Analyzer (FSA)
Radioactief gelabelde stoffen worden vaak geanalyseerd met behulp van chromatografie. Flow scintillation analyzer (FSA) meet de radioactiviteit van deze stoffen in het eluens bij een continue flow. Dit wordt gedaan met behulp van de scintillatie techniek, waarbij de intensiteit van de radioactiviteit wordt bepaald aan de hand van de hoeveelheid geproduceerde fotonen. Wanneer atomen in contact komen met de uitgezonden straling worden ze geïoniseerd door het toevoegen of verwijderen van elektronen. Sommige atomen (bijvoorbeeld fosfor) worden echter niet volledig geïoniseerd, maar hebben elektronen die in een aangeslagen toestand terecht komen. Deze aangeslagen elektronen zullen, bij het terugkeren naar hun grondtoestand,
energie vrijgeven in de vorm van een foton (licht) [ CITATION Ben12 \l 1043 ]. Deze energie (licht) kan worden gemeten en is evenredig aan de hoeveelheid uitgezonden straling. Om dit te bereiken word het monster (met radioactieve isotopen) voor het de detector ingaat gemixt met scintillatie cocktail. De scintillatie cocktail is speciaal ontwikkeld voor gebruik in chromatografie om blokkades en chemiluminescentie te voorkomen. Verder moet het zorgen voor een hoge efficiency, hoge monster capaciteit en lage viscositeit
[ CITATION LAn12 \l 1043 ].
Scintillatie cocktail bestaat uit twee basis bestandsdelen, namelijk een oplosmiddel en de scintillator. Het oplosmiddel (bijvoorbeeld tolueen) absorbeert de energie afkomstig van de bèta straling en geeft deze door aan de scintillator (bijvoorbeeld fosfor), die de energie vervolgens omzet in licht (foton (zie figuur 4)). De photo-multiplier tubes detecteren het licht dat wordt uitgezonden en zet deze om in een elektrisch signaal, dat vervolgens wordt versterkt. De intensiteit van de uitgezonden
Figuur 4: Werking scintillatie mechanisme met radioactief gelabeld materiaal opgelost in scintillatie cocktail [ CITATION Ben12 \l 1043 ]
straling wordt weergegeven op een computer in desintegraties per minuut (DPM) of counts per minuut (CPM) [ CITATION Nat04 \l 1043 ].
De FSA detector bestaat uit een doorzichtig opgerold teflon buis in een transparant kanaal (flow cel) dat tussen twee photo-multiplier tubes is geplaatst (zie figuur 5). Voordat het monster wordt er scintillatie cocktail aan toegevoegd en gemixt met behulp van Accelerated In-line Mixer (AIM) tubing. Gedurende de verblijftijd van het monster in de flow cel wordt de hoeveelheid licht dat wordt uitgezonden gemeten. De diameter van de buis is klein, zodat de bèta straling de scintillator (fosfor) bereikt en er fotonen worden geproduceerd (minder quenching) [ CITATION LAn12 \l 1043 ]. Quenching is het verlies van counts door eigenschappen van de cocktail of monster (matrix). Er zijn twee soorten quenchers, namelijk chemische en kleur quenchers. Chemische quenchers absorberen de radioactieve straling voordat deze kan worden omgezet in licht. Kleur quenchers absorberen licht van dezelfde golflengte als dat wordt uitgezonden door de scintillator (fosfor). In beide gevallen van uitdoving wordt de energie van de fotonen verminderd en daardoor het totale CPM [ CITATION Nat04 \l 1043 ].
De volume van de flow cel kan variëren van 10 - 2500 µL. De volume van de flow cel in combinatie met de flow rate en dwell tijd (tijd tussen meetpunten) van de photo-multiplier tubes, hebben invloed op de piekbreedte, resolutie en gevoeligheid van de metingen. Wanneer er bijvoorbeeld gekozen wordt voor een grotere flow cel, zal de gevoeligheid omhoog gaan omdat de photo-multiplier tubes langer de tijd hebben om de
radioactiviteit te meten (langere verblijftijd in loop). Het nadeel hiervan is dat de piekbreedte slechter is vergeleken met een kleinere flow cel. Dit kan worden gecompenseerd door de flow rate te verhogen of de dwell tijd te verlagen, maar dit zorgt weer voor een verminderde gevoeligheid. De keuze van de flow cel grootte, flow rate en dwell tijd heeft dus een prioriteit tijdens de methode ontwikkeling (resolutie, gevoeligheid of run tijd) [ CITATION Nat04 \l 1043 ][ CITATION Hor74 \l 1043 ].
Figuur 5: Flow Scintillation Analyzer (FSA) opstelling bestaande uit een flow cel met een constante flow van de mobiele fase gemengd met scintillatie cocktail tussen twee photo-multiplier tubes [ CITATION Nat04 \l 1043 ]
2.4
Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)
Bij normal phase chromatografie wordt, in tegenstelling van reversed phase, gebruik gemaakt van een apolaire mobiele fase en een polaire stationaire fase, waardoor polaire stoffen wel retentie zullen ondervinden. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) is normal phase chromatografie van zeer polaire of hydrofiele stoffen. HILIC bestaat uit een hydrofiele stationaire fase en een hydrofobe mobiele fase met een hoog gehalte (40-97%) aan organisch oplosmiddel (bijvoorbeeld acetonitril) [ CITATION Har10 \l 1043 ][ CITATION Kna13 \l 1043 ][ CITATION Cha10 \l 1043 ].
De scheiding bij HILIC vindt plaats aan de hand van drie mechanismen, namelijk: door waterstofbindingen met de dunne laag water op de stationaire fase, de verdeling van je analyten tussen de polaire stationaire en de mindere polaire mobile fase en elektrostatische interacties met geïoniseerde functionele groepen (zie figuur 6). Omdat een deel van de mobiele fase deel uit gaat maken van de stationaire fase, is er minstens 3 % water nodig in de mobiele fase om de stationaire fase te hydrateren. Voor het opzetten van een HILIC methode moet er eerst goed gekeken worden naar de stof die wordt geanalyseerd. Gegevens zoals LogP en pKa zijn belangrijk voor het kiezen van je kolom en mobiele fase. Hoe lager de logP waard is van een stof, hoe meer polair het is. De pKa is belangrijk om te weten bij welke pH een stof geïoniseerd is. geïoniseerde stoffen zijn meestal meer polair en hebben daarom meer interactie met de stationaire
fase (meer retentie) [ CITATION Kna13 \l 1043 ][ CITATION Cha10 \l 1043 ][ CITATION Dej10 \l 1043 ]. 2.4.1 Stationaire fase
Elke polaire kolom kan gebruikt worden als stationaire fase voor een HILIC methode. De meest gebruikte HILIC kolommen bestaan uit silica of silica gel met polaire functionele groepen. Amino-silica kolommen bijvoorbeeld komen relatief veel voor in HILIC methodes. In de laatste jaren zijn er meer HILIC kolommen ontwikkeld met pakkingmaterialen voor diverse doeleindes. Deze pakkingsmaterialen kunnen worden opgedeeld in neutraal polair, ionisch en zwitterion. Zwitterion kolommen worden gebruikt voor scheiden van zure, basische en neutrale hydrofiele
verbindingen. Ionenwisseling kolommen zijn weer nuttig voor het scheiden van ionen en polaire stoffen [ CITATION Hao08 \l 1043 ][ CITATION Bus12 \l 1043 ].
2.4.2 Mobiele fase
De mobiele fase van een HILIC methode bestaat meestal uit een hoge concentratie (40-97%) acetonitril (ACN) met water. Ook andere organische oplosmiddelen kunnen worden gebruikt, zoals tetrahydrofuran (THF), dioxaan en methanol. HILIC methodes kunnen worden uitgevoerd met een isocratische flow, waarbij er met een hoog percentage organisch oplosmiddel wordt gewerkt of een gradiënt. Met een gradiënt wordt er begonnen met een hoog percentage organische oplosmiddel en eindigt met een hoog percentage waterig oplosmiddel. Hierdoor zullen zeer polaire stoffen, die veel retentie hebben op de stationaire fase, alsnog kunnen elueren. Een buffer kan worden toegevoegd om de pH en ionensterkte van de mobiele fase te controleren. De buffer kan echter ook bijdragen aan de polariteit van het analyt. Voor ioniseerbare analyten moet de pH worden aangepast zodat deze maar in één ionische staat voorkomt [ CITATION Hao08 \l 1043 ][ CITATION Bus12 \l 1043 ].
Figuur 6: Scheidingsmechanismen HILIC (Eurospher II, C18) bestaande uit waterstofbindingen en verdeling tussen stationaire en mobiele fase [ CITATION Kna13 \l 1043 ]
3. Materiaal en methode
3.1 Materiaal
3.1.1 Chemicaliën
Mierenzuur (Merck, 98 %), Azijnzuur (Merck, 96 %), Ammoniumacetaat (Merck, 98 %), Ammoniumformaat(Biosolve, ULC/MS grade), Acetonitril (Biosolve, HPLC grade (99,95 %)), Methanol (VWR, HPLC grade), Aceton (Labscan, 99,8 %), Stockoplossingen van teststoffen en water/sediment extracten werden bewaard bij -20 ⁰C.
Monsters UPLC-FSA:
205655 (Stockoplossing, zie bijlage I) 205929 (Stockoplossing, zie bijlage II): SL 16 S-FIL (Sediment extract, zie bijlage III), SL 16 W-ACN (Water extract, zie bijlage IV), SW 20 S-FIL (Sediment extract, bijlage V), SW 20 W-ACN (Water extract, zie bijlage VI).
HILIC:
205341 (Stockoplossing, zie bijlage VII), 206244 (Stockoplossing, zie bijlage VIII), 206433 (Stockoplossing, zie bijlage IX), 205684 (Stockoplossing, zie bijlage X): AS 1529 (Referentiestof, zie bijlage XI), AS 1530 (Referentiestof, zie bijlage XII), AS 1531 (Referentiestof, zie bijlage XIII).
3.1.1 Apparatuur
pH-meter (WTW, pH 330), Magneetroerder (Heidolph, MR 3001), Vortex (Heidolph, Reax control). UPLC-FSA systeem: (Waters, Acquity H-class, BEH C-18 kolom (Waters, Acquity, 100/50 x 2.1 mm, 1.7 µm), FSA detector (Lablogic, β-RAM model 5, FSA flow cel 500, 200 µl), PDA detector (Waters, Acquity, 250-260 nm)).
HPLC-FSA systeem: (Waters, Alliance 2695, ZIC-HILIC kolom (Merck, SeQuant, 100 x 2.1 mm, 3.5 µm), HILIC Silica kolom (Waters, Atlantis, 100 x 2.1 mm, 3 µm), FSA detector (Lablogic, β-RAM model 4, FSA flow cel 500 µl), UV detector (Waters, 2487 Dual Absorbance, 254 nm)).
3.2 Methode
3.2.1 UPLC-FSA optimalisatie
Als eerste werd het eluens aangemaakt door 1 ml mierenzuur op te lossen in 1000 ml MilliQ (mobiele fase A) en 1000 ml 90/10 (v/v) acetonitril/MilliQ (mobiele fase B). Het UPLC systeem werd vervolgens gespoeld met het eluens en de ratio op 95/5 % (A/B) gezet. Er werd een gradiënt (runtijd: 10 min, flowrate: 0.7 ml/min) ingesteld waarbij het percentage van mobiele fase B toenam van 5 naar 100 % (23.8 %/min) en terug (95 %/min). De kolom (BEH C-18, 50 x 2.1 mm, 1.7 µm) temperatuur werd gezet op 30 ⁰C en samplecompartiment op 8 ⁰C. Voor de detectie van 14C gelabelde stoffen, werd er
gebruik gemaakt van een FSA detector (flow cel: 500 µl, scintillatie flowrate: 2.1 ml/min (ratio eluens/scintillatie 1:3), dwell tijd: 6 seconden) in combinatie met een PDA detector (250-260 nm). Omdat er nog geen in-line filter was geïnstalleerd op de UPLC kolom, konden er geen water/sediment monsters worden geïnjecteerd. Het was tijdelijk alleen mogelijk om stockoplossingen te injecteren. De eerste stockoplossing die werd geïnjecteerd was van de teststof 205655. Deze stock had voldoende retentie en was qua piekbreedte en aantal counts beter was dan de HPLC-FSA meting. Met behulp van deze stockoplossing werd er gekeken naar de invloed van de dwell tijd op de piekbreedte en gevoeligheid. Er werd een injectie gedaan bij een dwell tijd van 1, 3, 4, 5, 6, 8 en 10 seconden. Vervolgens werd op het advies van een Waters technicus de UPLC-FSA opstelling geoptimaliseerd door de tubing van en naar de PDA en FSA detector te vervangen door kortere tubing met een
smaller diameter (0.127 mm). Deze aanpassing had direct een positieve invloed op de piekbreedte en gevoeligheid.
Na het installeren van de in-line filter op de UPLC kolom, konden er water/sediment monsters worden geïnjecteerd. Hiervoor werden twee water (SL 16 W-ACN, SW 20 W-ACN) en twee sediment (SL 16 S-FIL, SW 20 S-FIL) monsters geselecteerd uit een andere studie (506786). Het eluens moest hierbij vervangen worden voor een 10 mM ammoniumacetaat buffer. Dit werd gedaan door 0.77 g C2H7NO2 op te lossen in 1000 ml MilliQ (mobiele fase A) en 90/10 (v/v) acetonitril/MilliQ (mobiele
fase B). Na het injecteren van de water/ sediment monsters was te zien dat er zeer weinig scheiding was tussen de pieken van de hoofdstof en metabolieten vergeleken met de HPLC-FSA metingen (zie bijlage XIV). Om de scheiding te verbeteren, werd de gradiënt verlengd naar 15 en vervolgens 30 minuten. Dit had echter te weinig effect op de resolutie, waardoor er werd besloten om de kolom te verwisselen voor een langere BEH C-18 kolom (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) om de resolutie te verbeteren. De hogere druk veroorzaakt door de UPLC kolom, zorgde er voor dat de flowrate verlaagd moest worden naar 0.45 ml/min. De langere UPLC kolom zorgde wel voor een betere resolutie, maar was nog steeds onvoldoende. De gradiënt werd weer verkort naar 20 minuten. Om de retentietijd van de hoofdstof en metabolieten meer naar het einde van het gradiënt te verplaatsen, werd er gekeken naar diverse gradiënt curves. Het gebruik van een langzamere oplopende gradiënt curve zorgde voor een langere retentietijd.
Om de piekbreedte verder te verkleinen en de resolutie te vergroten, werd de 500 µl flow cel in de β-RAM vervangen door een 200 µl flow cel. Het vervangen van de flow cel had veel invloed op de gevoeligheid van de β-RAM, maar weinig invloed op de piekbreedte. Om de hoeveelheid gemeten counts weer omhoog te krijgen werd er gekeken naar de injectievolume. Er werd een injectie gedaan van 1, 5, 10, 15, 20 en 25 µl. Bij een injectievolume van ≥10 µl is er echter sprake van fronting, waardoor het injectievolume op 5 µl werd gehouden. De volgende stap was om de invloed van de scintillatie flowrate op de gevoeligheid en piekbreedte te testen. Dit werd gedaan door een injectie bij een scintillatie flowrate van 1, 1.35, 2, 2.5, 3 en 4 ml/min (flowrate eluens: 0.45 ml/min).
Om de piekbreedte verder naar beneden te brengen, werd er voor gekozen om Accelerated In-line Mixer (AIM) tubing te bestellen met een kleiner diameter. Deze micro AIM tubing zijn speciaal ontwikkeld voor een lager flowrate en het verkleinen van het doodvolume. In totaal werden er twee verschillende micro AIM tubing besteld en getest (met en zonder mix loop).
3.2.2 HILIC
De metingen verricht voor de HILIC methode optimalisatie werden gedaan op een UPLC-FSA of HPLC met radiodetectie/UV detector. Voor mobiele fase werd 10 mM ammoniumacetaat buffer gebruikt (0.77 g C2H7NO2 in 1000 ml MilliQ, pH 6.76 (mobiele fase A)) en acetonitril (mobiele fase B). De eluens
ratio werd gezet op 25/75 % (A/B). De runtijd was 30 minuten (isocratisch) met een flowrate van 0.7 ml/min (ratio eluens/scintillatie 1:3). De kolom temperatuur werd gezet op 30 ⁰C en samplecompartiment op 8 ⁰C. De monsters bestonden uit stockoplossingen van twee verschillende teststoffen (205684 en 205341). Voor het injecteren van de monsters werd de kolom (ZIC-HILIC, 100 x 2.1 mm, 3.5 µm) altijd eerst minstens een half uur ingespoeld met de eluens ratio.
Omdat beide stoffen geen retentie hadden na de eerste injectie werd de concentratie ACN verhoogd in stappen van 10 % tot 95 %. Dit had echter geen invloed op de retentie van de stoffen. De volgende stap was het vervangen van de buffer voor 10 mM ammoniumacetaat + 0.05 % azijnzuur (0.77 g C2H7NO2 + 0.50 ml CH3COOH in 1000 ml MilliQ, pH 4.74). Dit had echter weinig effect op de retentie, waardoor de buffer weer werd vervangen door 10 mM ammoniumformaat+ 0.125 % mierenzuur (0.63 g CH5NO2 + 1.25 ml CH2O2 in 1000 ml MilliQ, pH 3.18). Ook deze buffer met een lagere pH had geen effect op de retentie van de stoffen.
De volgende stap was het vervangen van de stationaire fase (ZIC-HILIC) met een HILIC Silica kolom (100 x 2.1 mm, 3 µm). De nieuwe stationaire fase in combinatie met eluens ratio van 3/97 % (A/B) zorgde voor retentie bij de teststof 205684. Om de retentie van mogelijke metabolieten te bepalen werden er drie (metaboliet) ongelabelde referentiestoffen (AS 1529, AS 1530, AS 1531) geïnjecteerd. Deze referentiestoffen hadden echter bijna geen retentie. Dit werd verholpen door gebruik te maken van een sterkere buffer, namelijk 40 mM ammoniumformaat+ 0.125 % mierenzuur (1.26 g CH5NO2 +
0.625 ml CH2O2 in 500 ml MilliQ, pH 3.18). Om de pieken scherper te krijgen werd vervolgens de kolomtemperatuur verhoogd van 30 ⁰C naar 50 ⁰C. Door de hogere kolomtemperatuur verminderde de retentietijd van de teststoffen (stock 205684 en referentiestoffen), maar er was nog steeds voldoende scheiding om de methode te gebruiken voor water/sediment monsters. Water/sediment monsters van de studie 505962 werden vervolgens onder de zelfde instellingen geïnjecteerd. De metabolieten in de water/sediment monsters werden daarna geïdentificeerd door de retentietijd te vergelijken met die van de referentiestoffen. De metingen werden herhaald onder dezelfde instellingen op een nieuwere ZIC-HILIC kolom (100 x 2.1 mm, 3.5 µm), waarbij de stockoplossingen van de andere teststoffen (205341 en 206244) ook werden meegenomen. Hierbij hadden de teststoffen 205684 en referentiestoffen een verminderde retentietijd. De teststoffen 205341 en 206244 hadden weinig tot geen retentie.
De methode ontwikkeling werd voorgezet met teststoffen uit andere studies (205341, 206244 en 206433) en een 100 mM ammoniumacetaat buffer (3.85 g C2H7NO2in 500 ml MilliQ, pH 6.76). De
mobiele fase ratio werd op 20/80 % (A/B) gezet. Na de eerste injectie was geen retentie waargenomen bij de teststoffen, waardoor de concentratie ACN werd verhoogd in stappen van 5-10 % tot 95 %. Bij een eluens ratio van 10/90 % (A/B) had de teststof 205341 voldoende retentie, maar een laag aantal counts en een hoge achtergrond. Dit werd erger naarmate de concentratie ACN toenam. De teststof 206433 had bij een eluens ratio van 5/95 % (A/B) meer retentie, maar bestond uit 3 pieken. Bij een hogere kolomtemperatuur van 50 ⁰C waren dit nog maar twee pieken met een verminderde retentie. Teststof 206244 had geen retentie bij een verhoogde concentratie ACN. Vervolgens werd de buffer vervangen door 100 mM ammoniumformaat+ mierenzuur (3.15 g CH5NO2
+ 1.3 ml CH2O2 in 500 ml MilliQ, pH 3.46). Ook werd de ZIC-HILIC kolom verwisseld voor een HILIC Silica kolom en de kolomtemperatuur terug gezet naar 30 ⁰C. Hierbij was na injectie bij een eluens verhouding van 10/90 % (A/B) retentie te zien bij teststof 206433. Door de ACN concentratie te verhogen tot 95 %, was er ook retentie bij teststof 205341. De teststof had een grote piekbreedte en lage aantal counts.
4. Resultaten
4.1 UPLC-FSA
Bij de eerste meting gedaan op de UPLC-FSA met de stockoplossing van teststof 205655 met een gradiënt van 10 minuten is te zien dat er een smallere piekbreedte en hoger aantal counts is behaald vergeleken met de HPLC-FSA meting (zie figuur 7, 8). De piekbreedte bij de UPLC-FSA meting is 14 seconden smaller dan de piek in de HPLC-FSA meting.
Dankzij de kortere gradiënt bij de UPLC-FSA meting kon er een scherpere piek en hogere aantal counts worden verkregen, ondanks het gebruik van een lager flowrate (eluens/scintillatie flowrate). De piekbreedte bij de UPLC-FSA meting is echter niet veel smaller geworden dan die van de HPLC-FSA meting. Dit is te danken aan de piekverbreding die optreed in de FSA detector. Door de lagere flowrate (eluens/scintillatie flowrate) bij de UPLC-FSA meting heeft het monster een langere verblijftijd in de flow cel. Hierdoor wordt het aantal gemeten counts hoger, maar treed er ook meer piekverbreding op. Dit wordt waarschijnlijk voor een groot deel gecompenseerd door de scherpere piek verkregen met de kortere UPLC gradiënt. Om het mogelijk te maken om water/sediment monster te meten onder een korte UPLC gradiënt is het eerst nodig de piekbreedte verder te verkleinen.
4.1.1 Dwell tijd
Om de invloed van de dwell tijd op de piekbreedte en gevoeligheid te testen, werd er een injectie gedaan bij een dwell tijd van 1, 3, 4, 5, 6, 8 en 10 seconden. De resultaten van deze metingen (zie
Figuur 7: HPLC-FSA meting van stockoplossing 205655. Piekbreedte: 1.56 min. Counts: 1324 gradiënt 30 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 1 ml/min (scintillatie: 3 ml/min). flow cel: 500 µl
Figuur 8: UPLC-FSA meting van stockoplossing 205655. Piekbreedte: 1.42 min. Counts: 1800 gradiënt 10 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). flow cel: 500 µl
bijlage XV) zijn weergegeven in de grafieken (zie figuur 9 en 10), waarbij de dwell tijd is uitgezet tegenover de piekbreedte en de gemeten counts. Daarnaast zijn ook UPLC chromatogrammen weergegeven van metingen met een dwell tijd metingen van 1 en 10 seconden om het verschil in aantal gemeten counts en de piekvorming weer te geven (zie figuur 11 en 12).
In de grafieken (zie figuur 9) is te zien dat er een lineair verband is tussen de hoeveelheid gemeten counts en de dwell tijd. De hoeveelheid gemeten counts neemt toe naarmate de dwell tijd hoger wordt gezet, maar de invloed op de piekbreedte is minimaal (zie figuur 10). Dit komt omdat de dwell tijd alleen invloed heeft over de data die onder een meetpunt wordt weergegeven. Bij een langere dwell tijd, dus een langere meettijd, worden er meer counts gemeten bij elk meetpunt. Het heeft dus weinig effect op de piekbreedte, maar op wel de gevoeligheid en de piekvorming (zie figuur 11 en 12). De dwell tijd die standaard bij het HPLC-FSA systeem wordt gebruikt is 6 seconden. Normaal zou bij een detector (bijvoorbeeld
PDA) de dwell tijd staan op 1 seconden om zoveel mogelijk meetpunten in een piek te verkrijgen, maar door de lange verblijftijd van het monster in de FSA detector kan de dwell tijd hoger worden gezet en nog steeds een voldoende aantal meetpunten worden verkregen. Wanneer er een smallere piekbreedte wordt behaald door bijvoorbeeld een hogere flowrate, moet de dwell tijd van de FSA detector in verhouding lager worden gezet om hetzelfde aantal meetpunten te behouden.
4.1.2 Minimaliseren doodvolume
Om het UPLC-FSA systeem verder te optimaliseren en het doodvolume te verkleinen, werd de tubing (diameter: 0.25 mm) van en naar de detector (FSA en PDA) vervangen voor kortere tubing met een kleiner diameter (0.127 mm). Het vervangen van de tubing had direct een positief effect op de piekbreedte (zie figuur 13 en 14).
Figuur 9: Grafiek met de dwell tijd uitgezet tegenover de gemeten aantal counts van stockoplossing 205655. R2 = 0.9959
Figuur 10: Grafiek met de dwell tijd uitgezet tegenover de piekbreedte van stockoplossing 205655.
Figuur 11: UPLC-FSA meting van stockoplossing 205655. Piekbreedte: 1.23 min. Counts: 327 gradiënt 10 min. dwell tijd 1 sec. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). flow cel: 500 µl
Figuur 12: UPLC-FSA meting van stockoplossing 205655. Piekbreedte: 1.4 min. Counts: 2800 gradiënt 10 min. dwell tijd 10 sec. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). flow cel: 500 µl
0 2 4 6 8 10 12 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 R² = 1
Dwell tijd metingen (counts)
Dwell tijd (sec)
C o u n ts 0 2 4 6 8 10 12 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
Dwell tijd metingen (piekbreedte)
Dwell tijd (sec)
p ie kb re e d te ( m in )
Door de tubing te verkorten en te vervangen voor tubing met een kleiner diameter (0.127 mm), werd de piek van de stockoplossing scherper en het aantal counts hoger. Dit komt doordat het doodvolume van het systeem wordt verkleind waardoor er minder piekverbreding kan ontstaan. Hoewel het effect van de FSA detector vele malen groter is op de piekverbreding van het monster, is het toch belangrijk dat het UPLC-FSA systeem een zo klein mogelijke doodvolume heeft.
Figuur 13: UPLC-FSA meting van stockoplossing 205655 voor optimalisatie van het systeem. Piekbreedte: 1.42 min. Counts: 1800 gradiënt 10 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). flow cel: 500 µl. diameter tubing: 0.25 mm.
Figuur 14: UPLC-FSA meting van stockoplossing 205655 na optimalisatie van het systeem . Piekbreedte: 1.06 min. Counts: 327 gradiënt 10 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). flow cel: 500 µl. diameter tubing: 0.127 mm.
4.1.3 Water/sediment extracten
Na het injecteren van de water/ sediment extracten en stockoplossing van studie 506786, was te zien dat er zeer weinig scheiding en retentie was tussen de pieken van de hoofdstof en de metabolieten. Om de resolutie te verbeteren werd de UPLC kolom (50 x 2.1 mm) vervangen voor een langere kolom (100 x 2.1 mm). In figuur 15, 16, 17 en 18 zie je de UPLC-FSA metingen van de stockoplossing en sediment monster SL 16 S-FIL bij een korte en lange UPLC kolom.
Figuur 16: UPLC-FSA meting van SL 16 W-ACN. gradiënt 20 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.45 ml/min (scintillatie: 1.35 ml/min). flow cel: 500 µl. kolom: 100 x 2.1 mm.
Figuur 15: UPLC-FSA meting van SL 16 W-ACN. gradiënt 15 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). flow cel: 500 µl. kolom: 50 x 2.1 mm.
Figuur 17: UPLC-FSA meting van stockoplossing 205929. Piekbreedte: 3.42 min. Counts: 2169 gradiënt 30 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). flow cel: 500 µl. kolom: 50 x 2.1 mm.
Figuur 18: UPLC-FSA meting van stockoplossing 205929. Piekbreedte: 2.42 min. Counts: gradiënt 30 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.45 ml/min (scintillatie: 1.35 ml/min). flow cel: 500 µl. kolom: 100 x 2.1 mm.
Door gebruik te maken van een langere UPLC kolom, werd een betere resolutie en retentie bereikt (zie figuur 15 en 16). Bij de metingen van de stockoplossing (zie figuur 17 en 18) is ook te zien dat de piek scherper is geworden. Hoewel de resolutie, retentie en aantal counts van de stockoplossing en water/sediment monster erop vooruit zijn gegaan, is er nog steeds onvoldoende scheiding en retentie (bij de water/sediment monsters). Verder wil je bij het gebruik maken van een UPLC systeem geen lange runtijden hebben, maar door de piekverbreding in de FSA detector is het nog niet mogelijk om de resolutie te verkrijgen die nodig is. Bij de metingen van de stockoplossingen is verder ook te zien dat er veel fronting is bij de pieken. Dit wordt minder nadat er gebruik wordt gemaakt van een langere UPLC kolom. De fronting werd waarschijnlijk veroorzaakt door overbelading van de kolom en nam af toen er een kolom werd gebruikt met een groter kolom volume (zie 4.1.5 injectievolume).
4.1.4 FSA flow cel
Om de piekbreedte verder te verkleinen en de resolutie te vergroten, werd de 500 µl flow cel in de β-RAM vervangen door een 200 µl flow cel. In figuur 19 en 20 is het UPLC chromatogram te zien van de stockoplossing met een FSA flow cel van 500 en 200 µl.
In figuur 20 is te zien dat het aantal gemeten counts bij de 200 µl flow cel vele malen lager is vergeleken met de 500 µl flow cel. De piekbreedte is echter gelijk gebleven tussen de twee flow cellen. Bij een kleinere volume flow cel verwacht je dat de piekbreedte smaller wordt omdat het monster een kortere verblijftijd heeft in de cel, waardoor er minder piekverbreding kan optreden. De verblijftijd is door de flow cel te vervangen gedaald van 15 seconden naar 6 seconden, maar dit zie je niet terug in de piekbreedte.
Figuur 19: UPLC-FSA meting van stockoplossing 205929. Piekbreedte: 2.12 min. Counts: 3340 gradiënt 20 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.45 ml/min (scintillatie: 1.35 ml/min). flow cel: 500 µl.
Figuur 20: UPLC-FSA meting van stockoplossing 205929. Piekbreedte: 2.3 min. Counts: 2382 gradiënt 20 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.45 ml/min (scintillatie: 1.35 ml/min). flow cel: 200 µl.
4.1.5 Injectievolume
Om de hoeveelheid gemeten counts weer omhoog te krijgen na het installeren van de 200 µl flow cel, werd er gekeken naar het injectievolume. Er werd een injectie gedaan van 1, 5, 10, 15, 20 en 25 µl (zie bijlage XVI). De resultaten van deze metingen zijn weergegeven in tabel 1 met de piekbreedte en aantal counts. In figuur 21 en 22 zijn de UPLC chromatogrammen weergegeven van de stockoplossing 205929 met een injectievolume van 5 en 10 µl.
Tabel 1: Resultaten UPLC-FSA metingen stockoplossing 205929 bij diverse injectievolumes.
Injectievolume (µl) Piekbreedte (minuten) Counts
1 1.06 383 5 1.24 1774 10 2.05 2263 15 3.18 2739 20 4 3242 25 4.24 3333
Bij een injectievolume van ≥10 µl is er fronting te zien bij de piek van de stockoplossing. Dit komt waarschijnlijk doordat de UPLC kolom overbeladen is. Hierbij raakt de stationaire fase verzadigd en heeft geen interactie meer met het monster. Bij een injectievolume van 5 µl is deze fronting niet meer aanwezig en de piek significant scherper. Het standaard injectievolume dat vanaf het begin werd gebruikt is 10 µl. Dit is hetzelfde standaard injectievolume dat wordt gebruikt bij het HPLC-FSA systeem. het volume van een UPLC kolom (0.35 ml (100 x 2.1 mm)) is echter veel lager dan de HPLC kolom (2.5 ml (150 X 4.6 mm)), waardoor er minder geïnjecteerd kan worden voordat de kolom overbeladen raakt.
4.1.6 Scintillatie flowrate
Om de invloed van de scintillatie flowrate op de piekbreedte en gevoeligheid te testen, werd er een injectie gedaan van de stockoplossing en sediment monster SW 20 S-FIL bij een scintillatie flowrate
Figuur 21: UPLC-FSA meting van stockoplossing 205929. Piekbreedte: 2.05 min. Counts: 2263 gradiënt 20 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.45 ml/min (scintillatie: 1.35 ml/min). injectievolume: 10 µl.
Figuur 22: UPLC-FSA meting van stockoplossing 205929. Piekbreedte: 1.24 min. Counts: 1774 gradiënt 20 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.45 ml/min (scintillatie: 1.35 ml/min). injectievolume: 5 µl.
van 1, 1.35, 2, 2.5, 3 en 4 ml/min (eluens flowrate: 0.45 ml/min). De resultaten van deze metingen (zie bijlage XVII) zijn weergegeven in tabel 3 met de piekbreedte en aantal counts. In figuur 23 en 24 zijn de UPLC chromatogrammen weergeven van de SW 20 S-FIL metingen bij een scintillatie flowrate van 1 en 4 ml/min.
Tabel 2: Resultaten UPLC-FSA metingen stockoplossing 205929 bij diverse scintillatie flowrates.
Scintillatie flowrate (ml/min) Piekbreedte (minuten) Counts
1 1.24 1633 1.35 1.24 1701 2 1.3 1913 2.5 1.06 1797 3 1 1887 4 1 1784
In tabel 2 is te zien dat de piekbreedte afneemt naarmate de scintillatie flowrate toeneemt. Dit komt doordat de totale flowrate (eluens + scintillatie flowrate) toeneemt, hierdoor zal de verblijftijd in de FSA detector steeds korter worden waardoor er minder piekverbreding kan optreden. Verder is ook te zien dat de aantal gemeten counts eerst toeneemt en vervolgens weer afneemt. Wanneer er meer scintillatie cocktail aan het monster wordt toegevoegd, zullen er ook meer counts worden geproduceerd. Het monster neemt echter maar een bepaalde hoeveelheid cocktail op voordat het aan zijn capaciteit zit, waardoor bij een hogere scintillatie flowrate de extra scintillatie cocktail geen extra counts oplevert. Dit in combinatie met een kortere verblijftijd in de flow cel bij een hogere scintillatie flowrate, zal er voor zorgen dat de aantal gemeten counts lager wordt. Dit was ook goed te zien bij de metingen van het sediment monster SW 20 S-FIL (zie figuur 23, 24 en bijlage XVII). De hoeveelheid gemeten counts neemt eerst toe en daarna weer af bij een toenemende scintillatie flowrate. Ook neemt de resolutie van het sediment monster toe, naarmate de verblijftijd in de FSA detector korter wordt (minder piekverbreding).
4.1.7 Accelerated In-line Mixer (AIM)
Om de piekverbreding verder te verkleinen werden er twee verschillende micro AIM tubing getest. De micro AIM tubing die werd getest, bestond uit een kleinere diameter tubing met en zonder loop. De resultaten van deze metingen zijn weergegeven in figuur 25, 26, 28 en 29.
Figuur 23: UPLC-FSA meting van SW 20 S-FIL. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.45 ml/min (scintillatie: 1 ml/min). injectievolume: 5 µl.
Figuur 24: UPLC-FSA meting van SW 20 S-FIL. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.45 ml/min (scintillatie: 1 ml/min). injectievolume: 5 µl.
Het eerste wat opvalt bij de resultaten is dat het aantal gemeten counts gedaald is met de micro AIM tubing. Door de diameter van de AIM tubing te verkleinen wordt het eluens minder effectief gemixt met de scintillatie cocktail. Dit resulteert in een vermindering van het aantal gemeten counts. Het aantal gemeten counts wordt nog lager wanneer de loop eruit wordt gehaald (zie figuur 27 en 28).De piekbreedte is door het installeren van de micro AIM tubing echter niet scherper geworden. De verwachting dat de piekbreedte voor een deel zou dalen bij het gebruik van de micro AIM tubing is niet terug te zien in de chromatogrammen.
Figuur 25: UPLC-FSA meting van stockoplossing 205929 met micro AIM tubing (met loop). Piekbreedte: 1.18 min. Counts: 1240 gradiënt 20 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.45 ml/min (scintillatie: 1.35 ml/min). injectievolume: 5 µl.
Figuur 26: UPLC-FSA meting van SW 20 S-FIL met micro AIM tubing (met loop). gradiënt 20 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.45 ml/min (scintillatie: 1.35 ml/min). injectievolume: 5 µl.
Figuur 27: UPLC-FSA meting van stockoplossing 205929 met micro AIM tubing (zonder loop). Piekbreedte: 1.3 min. Counts: 1109 gradiënt 20 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.45 ml/min (scintillatie: 1.35 ml/min). injectievolume: 5 µl.
Figuur 28: UPLC-FSA meting van SW 20 S-FIL met micro AIM tubing (zonder loop). gradiënt 20 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.45 ml/min (scintillatie: 1.35 ml/min). injectievolume: 5 µl.
4.2 HILIC
Teststof 205684 (studie 505962)
Teststof 205684 had pas enige retentie toen op de HILIC silica kolom een eluens ratio werd gebruikt van 5/95 % (10 mM ammoniumformaat+0.125 % FA / ACN). Vervolgens werd de concentratie ACN verder verhoogd tot 97 % wat zorgde voor extra retentie (zie figuur 29 en 30).
Om meer retentie te verkrijgen werd er een sterkere buffer gebruikt van 40 mM ammoniumformiaat, hierbij is te zien dat bij het gebruik van deze buffer de retentietijd van de stockoplossing wordt verlengt (zie figuur 31). Om de piek scherper te krijgen werd de kolomtemperatuur verhoogd van 30 ⁰C naar 50 ⁰C (zie figuur 32). Deze HILIC methode is uiteindelijk gebruikt als tweede analyse methode voor de studie 505962 (zie tabel 3).
Tabel 3: LC-FSA instellingen 2e methode (HILIC) studie 505962
Stationaire fase Atlantis, HILIC Silica 100 x 2.1 mm, 3 µm
Injectievolume 5 µl
Flowrate 0.7 ml/min
Kolom temperatuur 50°C
Autosampler temperatuur 8°C
Mobiele fase A 40 mM HCO2NH4 + 0.125% CH2O2 in MQ (pH 3.18)
Mobiele fase B ACN
Figuur 29: LC-FSA meting stockoplossing 205684. Eluens ratio 5/95 % (10 mM ammoniumformaat+0.125 % FA / ACN). retentie: 1.3 min. gradiënt 10 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). flow cel: 500 µl.
Figuur 30: LC-FSA meting stockoplossing 205684. Eluens ratio 3/97 % (10 mM ammoniumformaat+0.125 % FA / ACN). retentie: 3.3 min. gradiënt 10 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). flow cel: 500 µl.
Figuur 31: LC-PDA meting stockoplossing 205684. Eluens ratio 3/97 % (40 mM ammoniumformaat+0.125 % FA / ACN). Kolomtemperatuur 30 ⁰C. retentie: 7.49 min. gradiënt 10 min. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). Golflengte: 254 nm.
Figuur 32: LC-PDA meting stockoplossing 205684. Eluens ratio 3/97 % (40 mM ammoniumformaat+0.125 % FA / ACN). Kolomtemperatuur 50 ⁰C. retentie: 5.34 min. gradiënt 10 min. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). Golflengte: 254 nm.
Eluens ratio (isocratisch) 3/97 % (A/B)
Runtijd 10 minuten
FSA flow cell 500 µl
FSA flow rate 2.1 ml/min
Dwel tijd 6 (sec)
Teststof 205684 is een groot molecuul met meerdere polaire groepen. Het molecuul is echter niet erg polair, wat ook te zien is aan de logP (zie bijlage X). Er is daarom ook een hoge concentratie ACN voor nodig om enige retentie te verkrijgen. Verder is er gebruik gemaakt van een sterkere buffer met een lage pH. De teststof heeft echter zowel zuur- en basische functionele groepen bevat, waardoor de teststof geïoniseerd is. De sterkere buffer heeft echter wel invloed op de retentie, omdat door de verhoging van de zoutconcentratie de hoeveelheid geladen deeltjes (NH4+ en HCO2-) in de waterige
laag toeneemt, hierdoor ontstaat meer interactie tussen de teststof en de waterige laag. De verhoging van de kolomtemperatuur zorgde voor een afname in retentie. De kolomtemperatuur heeft veel invloed op de verdeling van de teststof over de mobiele en stationaire fase. De overdracht van de teststof van de hydrofobe mobiele fase (ACN) naar de waterlaag gaat sneller bij een hogere temperatuur.
Teststof 206433 (studie 508587)
De teststof 206433 had pas retentie toen er een ZIC-HILIC kolom werd gebruikt met een eluens ratio van 5/95 (100 mM ammoniumacetaat/ ACN) met een sterkere buffer. Bij deze instellingen bestond de teststof uit drie pieken (zie figuur 33). Om dit te verhelpen werd de kolomtemperatuur verhoogd naar 50 ⁰C. Dit had echter niet genoeg effect op de pieken (zie figuur 34).
Na het verwisselen van de kolom (voor een HILIC Silica) en de buffer met een lager pH (100 mM ammoniumformaat+ mierenzuur , pH 3.46) was er bij de teststofpiek een piek te zien (zie figuur 35)
bij een eluens verhouding van 10/90 % (100 mM ammoniumformiaat/ ACN).
Figuur 33: LC-FSA meting stockoplossing 206433. Eluens ratio 5/95 % (100 mM ammoniumacetaat / ACN). Kolomtemperatuur 30 ⁰C. gradiënt 10 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). flow cel: 500 µl. kolom: ZIC-HILIC
Figuur 34: LC-FSA meting stockoplossing 206433. Eluens ratio 5/95 % (100 mM ammoniumacetaat / ACN). Kolomtemperatuur 50 ⁰C. gradiënt 10 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). flow cel: 500 µl. kolom: ZIC-HILIC
Bij de metingen op de ZIC-HILIC is te zien dat de stockoplossing bestaat uit meerdere pieken. Dit kan liggen aan meerdere redenen. De eerste is dat de kolom nog vervuild was met de stockoplossingen die ervoor zijn geïnjecteerd zoals teststof 205341. Deze werden bij de methodeontwikkeling namelijk achter elkaar gedraaid. Bij een hogere kolomtemperatuur waren er nog maar twee pieken, maar dit komt waarschijnlijk omdat twee pieken op elkaar liggen (zie figuur 30). Verder kan het ook liggen aan de stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel. De vial met daarin de stockoplossing was al meerdere keren uit de vriezer gehaald en bij kamertemperatuur en/of samplecompartiment van 8 ⁰C bewaard. Bij de LC-FSA meting in figuur 31 is er gebruik gemaakt van een nieuwe vial stockoplossing.
Teststof 205341 (studie 507909)
Bij de teststof 205341 was pas retentie te zien, toen er een ZIC-HILIC kolom werd gebruikt met een eluens ratio van 10/90 (100 mM ammoniumacetaat/ ACN). De piek was bij hierbij zeer breed en de achtergrond zeer hoog (zie figuur 36). Bij een HILIC Silica kolom met een buffer van 100 mM ammoniumformaat+ mierenzuur (pH 3.46) en eluens ratio 5/95 % (buffer/ACN) was te zien dat het aantal counts nog lager is met een piekbreedte vergelijkbaar met die van de vorige meting (zie figuur 37).
Figuur 35: LC-FSA meting stockoplossing 206433. Eluens ratio 10/90 % (100 mM ammoniumformaat+ mierenzuur / ACN). Kolomtemperatuur 30 ⁰C. retentie: 4.54 min. gradiënt 10 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). flow cel: 500 µl. kolom: HILIC Silica
Figuur 36: LC-FSA meting stockoplossing 205341. Eluens ratio 10/90 % (100 mM ammoniumacetaat / ACN). Kolomtemperatuur 30 ⁰C. gradiënt 15 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). flow cel: 500 µl.
Figuur 37: LC-FSA meting stockoplossing 206433. Eluens ratio 5/95 % (100 mM ammoniumformaat+ mierenzuur / ACN). Kolomtemperatuur 30 ⁰C. gradiënt 10 min. dwell tijd 6 sec. flowrate: 0.7 ml/min (scintillatie: 2.1 ml/min). flow cel: 500 µl.
Bij veel van de metingen van teststof 205341 is te zien dat het aantal counts laag is en de achtergrond hoog (zie figuur 32 en 33). Dit werd erger naarmate de concentratie ACN toenam. Er zijn ook veel metingen waarbij bijna geen counts gemeten zijn. Wanneer erna een blanco werd gedraaid was daar altijd een verhoogde aantal counts in te zien. Dit komt waarschijnlijk omdat de teststof op de kolom blijft zitten door een te hoge concentratie ACN in de mobiele fase. De teststof is zeer polair en blijft daarom op de kolom zitten. De logP waarde van de teststof geeft dit al aan (zie bijlage VII).
5. Discussie
5.1 UPLC-FSA
De eerste stap in het opzetten van een UPLC-FSA methode was gelijk een stap terug, omdat door de hoge druk van de UPLC kolom (50 x 2.1 mm) de flowrate (eluens/scintillatie flowrate) lager moest worden gezet. Dit was ook het geval in het artikel van D. Franck et al. waarbij de flowrate lager moest worden gezet, vanwege de hogere systeem druk van de UPLC [ CITATION Fra09 \l 1043 ]. Hierdoor werd bij een korte gradiënt wel een hoger aantal counts gemeten, maar bleef de piekbreedte ongeveer gelijk. Dit komt door de langere verblijftijd (meettijd) in de flow cel als gevolg van de lagere flowrate, waardoor de scherpere piek behaald met het kortere gradiënt voor een groot deel werd opgeheven door de piekverbreding in de flow cel. Verder was ook te zien dat bij de PDA detector de piek 10-15 seconden breed was, maar de piek van de FSA detector ruim 1 minuut. Dit laat duidelijk zien wat de invloed van de FSA detector is op de piekbreedte.
Bij het onderzoek naar de dwell tijd kwam naar voren dat de gevoeligheid toeneemt naarmate de dwell tijd hoger wordt gezet. Dit komt omdat de dwell tijd bepaald hoe vaak er een meetpunt worden genomen. Bij een dwell tijd van 6 seconden bijvoorbeeld wordt de aantal gemeten counts geaccumuleerd voor gedurende 6 seconden en onder een meetpunt geplaatst. Hoe langer de dwell tijd dus wordt, hoe hoger de gevoeligheid. Omdat je in een piek minimaal 10 meetpunten wilt hebben voor een goede piekvorming, wordt bij meeste detectors gewoonlijk een dwell tijd aangehouden van 1 seconden. Als gevolg van de lange verblijftijd van het monster in de FSA detector kan je gebruik maken van een hogere dwell tijd en nog steeds een voldoende aantal meetpunten in je piek hebben. De dwell tijd moet echter weer naar beneden worden gezet wanneer er met behulp van de UPLC scherpere pieken worden behaald om het minimaal aantal meetpunten in de piek te behouden. Er zal dus bij een scherpere piek een verlies zijn in gevoeligheid als gevolg van een lagere dwell tijd. Dit zal deels worden gecompenseerd door de hogere aantal counts als gevolg van een scherpere piek.
Voordat er een kleinere volume flow cel geïnstalleerd werd, er gekeken naar het verbeteren van de resolutie en retentie door gebruik te maken van een langere UPLC kolom (100 x 2.1 mm). Hierbij moest opnieuw de flowrate (eluens/scintillatie flowrate) lager worden gezet vanwege de druk. Na het in gebruik nemen van de langere UPLC kolom, was bij de metingen van de stockoplossing en water/sediment monsters meer scheiding te zien en een hoger aantal gemeten counts. Door de langere UPLC kolom hadden de monsters en stockoplossing ook langere retentietijden. Door deze langere retentietijden werd ook een beter scheiding (resolutie) bereikt bij de water/sediment monsters. Het hoger aantal gemeten counts is het gevolg van het verder verlagen de flowrate, waardoor het monster een nog langere verblijftijd had in de flow cel. Een andere reden voor het verhoogde aantal counts is het injectievolume. Vanaf het begin werd er gebruik gemaakt van een injectievolume van 10 µl (zoals standaard is bij HPLC), maar door het veel kleinere volume van de UPLC kolom is deze snellere overbeladen. Hierdoor raakt de stationaire fase verzadigd en heeft deze geen interactie meer met het monster. Dit is te zien aan de piek door fronting en werd minder toen er werd overgestapt naar een langere UPLC kolom (met een groter volume). Hierdoor had meer van het monster interactie met de stationaire fase en werd de piek scherper (minder fronting).De overbelading van de UPLC kolom werd later nog bevestigd met een onderzoek naar het injectie volume (zie 4.1.5 injectievolume).
Om de piekbreedte verder naar beneden te krijgen werd de 500 µl flow cel vervangen voor een van 200 µl flow cel. Hierbij zijn de rest van de instellingen het zelfde gebleven. Na het injecteren van de stockoplossing was te zien dat het aantal counts was gedaald. Dit is het gevolg van de kortere
