Eindrapportage PT10314
Indirect selectie in lelie en tulp met moleculaire merkersUitvoerder: Plant Research International
Business Unit Biodiversiteit en Veredeling Projectmedewerkers: Dr. F.A. Krens (coördinator)
Dr. ir. J.M. van Tuyl Dr. ir. A.W. van Heusden Dr. ir. T.W. Prins
Eindrapportage PT10314
Indirect selectie in lelie en tulp met moleculaire merkersResultaten en opgeleverde producten:
- Getoetste lelie- en tulppopulaties, dus gefenotypeerd plantmateriaal
- Een op lelie en tulp toepasbare merkertechnologie, nl de AFLP-technologie
- Genetische koppelingskaarten van de ouders in lelie en tulp en aan diverse kenmerken gekoppelde merkers, nl in tulp aan bloemkleur, bloemblad, bloemhart, TBV (Tulip Breaking Virus)-resistentie; in lelie aan mannelijke steriliteit, TBV-resistentie en
Fusarium-resistentie.
- Moleculaire, indirecte selectie kan toegepast worden in lelie- en tulpveredeling.
Conclusies:
- Het is mogelijk in lelie en tulp om moleculaire merkers gebaseerd op de AFLP
technologie te vinden en hiermee koppelingskaarten op te stellen.
- Koppeling met belangrijke eigenschappen in lelie en tulp kan gevonden en
toegepast worden.
- Ombouw van AFLP tot ‘makkelijke’ PCR merker (SCAR of CAPS) is moeilijk,
maar niet onmogelijk. Een aan te bevelen strategie voor de toekomst is om meerdere merkers hiervoor te kiezen en je niet te beperken tot één. Recent ontwikkelde, moderne technieken geven de mogelijkheid de benodigde
sequentiegegevens sneller en nauwkeuriger te produceren. De geïdentificeerde Fusarium merkers in lelie lenen zich hier bij uitstek voor.
Inhoudsopgave
Resultaten en opgeleverde producten 2
Conclusies 2
Samenvatting oorspronkelijke projectvoorstel 3
Plan van aanpak 3
Gebruikte afkortingen 4
Resultaten 4
Toetsen en ontwikkelen van uitsplitsende populaties 5 Het vinden en uitvoeren van een goede merkermethode 9
Vergelijken datasets en identificatie merkers 10
Stand van zaken na koppelingsanalyse 14
Eerste nabeschouwing 15
Van AFLP-merker naar enkelvoudige PCR-merker 16
Finale nabeschouwing 20
Flowchart van AFLP naar PCR-merker 21
Eindrapportage
Indirecte selectie in lelie en tulp met moleculaire merkers
Oorspronkelijke looptijd project: 01-01-1999 t/m 31-12-2001Financier: Productschap Tuinbouw PT projectnummer: 10314
Samenvatting van het oorspronkelijke projectvoorstel
Doelstelling
Als doelstellingen dienen minimaal te worden gehaald:
1. Bepalen van 1 ‘monogene’ morfologische “voorbeeld” eigenschap (bijv. bloemkleur), 1 ‘monogene’ toetsbare eigenschap (virusresistentie) en 1 polygene toetsbare eigenschap (Fusarium-resistentie) in uitsplitsende populaties.
2. Toepasbaar maken van de AFLPTM / PCR-technologie voor lelie en tulp. 3. Uitvoeren van koppelingsberekeningen, het maken van een merkerkaart (per onderzochte populatie) en het vaststellen van de best gekoppelde merkers aan de onder punt 1 genoemde eigenschappen.
Maken van SCARs gekoppeld aan de onder punt 1 genoemde eigenschappen. Toetsen van de SCARs op bijbehorende populatie(s) en belangrijke cultivars.
Plan van aanpak
1. Toetsen (en ontwikkelen) van uitsplitsende populaties.
Jaar Gewas Eigenschap Populatie
1999 Tulp
Lelie
Alle morfologische eigenschappen TBV-resistentie (besmetting) Alle morfologische eigenschappen
Fusarium-resistentie T1, T2, T3 T1, T2 L1 L1 2000 Tulp Lelie TBV-resistentie (nateelt) Fusarium-resistentie TBV-resistentie (besmetting) T1, T2 T1 L1 2001 Tulp Lelie Fusarium-resistentie TBV-resistentie (nateelt) T3 L1
2. Ontwikkelen van geschikte merkers voor bolgewassen.
Onderdeel Variabelen
DNA isolatie Blad, spruit, schubbol Enzym combinaties EcoR I / Mse I, Pst I / Mse I
3. Koppelingsberekeningen.
Koppelingsberekeningen met JoinMap® en MapQTL® en een merkerkaart zullen geconstrueerd worden. Voor fijnkartering van monogene eigenschappen zal mogelijk gebruik gemaakt gaan worden van de Bulked Segregant Analysis (BSA).
4. Maken van Sequence Characterised Amplified Region’s (SCARs).
Dit is een nieuwe primerset, gebaseerd op een deel van de sequentie van het fragment, die zeer specifiek gekoppeld is aan het betreffende locus. De betrouwbaarheid van de SCAR zal worden gecontroleerd op de bijbehorende populatie. Tevens zal de SCAR, om de algemene bruikbaarheid vast te stellen, worden getoetst op een reeks cultivars, waarvan de betreffende eigenschap bekend is, en bij tulp op populatie T2 of T3. Hierbij zal extra aandacht worden besteed aan cultivars met een andere genetische achtergrond zoals
Fusarium-resistentie afkomstig uit T. gesneriana en T. fosteriana.
Gebruikte afkortingen:
ConKing Leliecultivar Connecticut King Orlito Leliecultivar Orlito
Pirate Leliecultivar Pirate
KN Tulpcultivar Kees Nelis
Cant Tulpcultivar Cantate
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
PCR Polymerase Chain Reaction
BSA Bulked Segregant Analysis
QTL Quantitative Trait Locus
CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Section TBV Tulip Breaking Virus (Lily Mottle Virus)
F Fusarium
Resultaten
Dit verslag geeft de resultaten zoals die verkregen zijn in het bovenstaande project en binnen de oorspronkelijke looptijd. Daarna is nog verder gegaan met populatieopbouw en met het omzetten van de verkregen arbeidsintensieve merkers in gebruikersvriendelijke merkers (zie hieronder onderdeel 4). Dit laatste onderdeel zal hier ook in detail besproken worden.
Voor het bereiken van de doelstellingen is uiteindelijk gekozen om te concentreren op de volgende vier onderdelen:
Toetsen en ontwikkelen van uitsplitsende populaties in lelie en tulp TBV en Fusarium in lelie
TBV, Fusarium en morfologische eigenschappen, zoals bloemkleur, bloemhart en bloemblad, in tulp
Het vinden en uitvoeren van een goede moleculaire merkermethode Optimaliseren AFLP-methode
Uitrekenen koppelingskaarten
Vergelijken datasets (toetsresultaten en merkers) en identificatie merkers geassocieerd met TBV en Fusarium
Het converteren van de arbeidsintensieve merkers naar merkers die gemakkelijk in de praktijk gebruikt kunnen worden
1) Toetsen en ontwikkelen van uitsplitsende populaties in lelie en tulp a) Lelie populatie
Connecticut King x Pirate (TBV, F) (tbv, f)
Connecticut King x Orlito (TBV, F) (tbv, F)
100 nakomelingen
(uitsplitsing TBV, F)
Deze populatie van 100 nakomelingen is in totaal driemaal getoetst op TBV-resistentie en viermaal op Fusarium resistentie. De resultaten van de toetsen zijn gebruikt in de
koppelingsberekeningen. Een résumé van de uiteindelijke resultaten voor wat betreft de bepalingen van de eigenschappen komt op het volgende. Voor Fusarium zijn met deze populatie zijn in totaal vier toetsen gedaan. De aantasting is visueel bepaald op een ordinale schaal met zes klasses: 1 = gezond; 2 = licht aangetast; 3 = zwaarder aangetast; 4 = zwaar verrot; 5 = erg zwaar verrot; 6 = volledig vergaan. De gemiddelde score
verschilde nogal tussen de jaren (2.9 +/- 0.95, 2.2 +/- 0.95, 2.4 +/- 1.00 en 2 +/- 0.5 for
1992, 1993, 1994 en 1999 resp.). Ook de range van de resistentiescores varieerde tussen de jaren. (resp. 1.4-6, 1.0-5.4, 1.0-5.6, 1.1-3.7). Als voorbeeld zijn hieronder in figuur 1 de proefgegevens van 1999 weergegeven. Er waren destijds geen significante blok effecten gevonden (p<0.001). De cultivars ‘Connecticut King’ en ‘Orlito’ waren resistent met een gemiddelde aantasting van respectievelijk 1.4 en 1.8. De cultivar ‘Pirate’ was gevoelig voor Fusarium met een aantastingsgemiddelde van 3.2. De populatie vertoonde aantasting die lag tussen de 1.1 en 3.7 en welke normaal verdeeld was zoals in eerdere proeven gevonden.
Figuur 1. Verdeling van de ziekte-index waarden van de 100 nakomelingen Van de kruising tussen CK en Pirate over de categoriën.
Voor TBV bleek de resistentie aanwezig in Connecticut King en waarschijnlijk enkelgens bepaald ( 1:1 uitsplitsing). De resistentie is verscheidene keren met de ziektetoets
bepaald.
De mannelijke steriliteit is visueel gescoord.
b) Tulp populatie
Kees Nelis x Cantate (tbv, F) (TBV, f)
Populatie van 89 nakomelingen (uitsplitsend voor TBV en Fusarium resistentie)
De populatie is gebruikt om de gekozen eigenschappen aan te bepalen. Voor Fusarium gold dat voor een betrouwbare toets voldoende materiaal nodig is om de benodigde testen uit te voeren. Gebleken is dat de toets ook een grote jaarlijkse variatie heeft en dus in verschillende jaren getoetst moet worden. In dit project heeft daarom het accent voornamelijk op materiaalontwikkeling gelegen en is een enkele toets gedaan. Dit is voortgezet in de jaren na de officiële looptijd van het project. Een en ander natuurlijk wel aan die planten waar alle merkers aan bepaald zijn.
Voor de TBV toetsen zijn voor en tijdens de bloei van alle planten, op zowel blad als bloem de TBV symptomen gescoord. In grote lijnen kwamen waarnemingen van het blad en bloem overeen. Alle bollen van de TBV-test die nog gezond waren, zijn een jaar later opnieuw in het veld beoordeeld op virusaantasting. Bovendien zijn al deze nummers m.b.v. Elisa getest op aanwezigheid van TBV. Bij de KN x Cant werden 37
Tot slot zijn als morfologische eigenschappen de bloemkleur, bloemhart en bloemblad van alle nakomelingen van de populaties KN x Cant zijn gescoord. De resultaten zijn gebruikt voor koppelingsberekeningen.
Tabel 1.
TBV waarnemingen populatie Kees Nelis x Cantate. Oordeel 95/98 (C) zijn de oorspronkelijke scoringen, in 2000 is dit herhaald op een aantal planten van de kloontjes en op blad en bloem (A en B). In 2001 is op de aanwezigheid van virus getoetst (D). De groen en rood benadrukte planten zijn gebruikt voor de BSA om beter gekoppelde merkers te vinden. 0=ZIEK/VATBAAR
1=GEZOND/RESISTENT
Plant nr Aantal geplant 2000
Blad Bloem Oordeel 2000 (A en B) Oordeel 95/98 (C) BKD-2001 (D) Uiteindelijk oordeel kn 3 0 0 0 0 0 0 ca 3 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 2 2 2 1 1 1 1 1 1 3 3 2 1 1 1 0 0 0 4 5 3 1 1 1 1 1 1 5 6 3 1 0 0 0 0 0 6 7 3 1 1 1 1 1 1 7 10 3 0 0 0 0 0 0 8 11 3 0 0 0 0 0 0 9 13 2 0 0 0 0 0 0 10 14 2 1 0 0 0 0 0 11 16 3 0 1 1 1 1 1 12 18 3 1 1 1 1 1 1 13 20 3 1 1 1 0 1 1 14 21 3 1 1 1 1 1 1 15 22 3 1 1 1 1 1 1 16 24 3 1 1 1 1 1 1 17 26 3 1 1 1 1 1 1 18 28 3 1 0 0 0 0 0 19 29 3 1 0 0 0 0 0 20 30 3 0 0 0 0 0 0 21 31 3 1 1 1 0 1 1 22 32 3 1 1 1 1 1 1 23 33 3 1 1 1 1 1 1 24 34 3 1 1 1 1 1 1 25 35 3 1 1 1 1 0 9 26 39 3 1 1 1 1 1 1 27 40 3 1 1 1 1 1 1 28 41 2 1 1 1 1 1 1 29 42 3 1 0 0 0 0 0 30 43 3 0 0 0 0 0 0 31 45 3 1 0 0 0 0 0 32 46 3 1 0 0 0 0 0 33 48 3 1 1 1 1 0 9 34 49 2 0 0 0 0 0 0 35 50 2 1 0 0 0 0 0 36 52 3 1 1 1 1 1 1
Plant nr Aantal geplant 2000
Blad Bloem Oordeel 2000 (A en B) Oordeel 95/98 (C) BKD-2001 (D) Uiteindelijk oordeel 37 53 3 1 1 1 1 1 1 38 54 3 1 1 1 1 1 1 39 56 3 1 1 1 0 1 1 40 58 3 1 1 1 1 0 9 41 59 3 1 1 1 1 1 1 42 60 3 1 1 1 1 1 1 43 61 3 0 0 0 0 0 0 44 62 3 1 0 0 0 0 0 45 63 3 1 1 1 1 1 1 46 64 3 1 1 1 0 1 1 47 65 3 1 1 1 1 1 1 48 66 1 1 1 1 1 1 1 49 67 3 0 1 9 1 1 9 50 68 3 1 1 1 1 1 1 51 69 3 1 1 1 1 1 1 52 70 3 0 0 0 0 0 0 53 71 3 1 1 1 1 1 1 54 72 3 1 0 9 1 0 9 55 73 3 1 1 1 1 1 1 56 74 3 0 0 0 0 0 0 57 75 3 1 1 1 1 1 1 58 76 1 0 1 9 1 0 9 59 77 3 1 1 1 1 0 9 60 78 2 1 1 1 0 1 1 61 79 2 1 1 1 1 1 1 62 80 3 0 0 0 0 0 0 63 81or 3 0 0 0 0 0 0 64 81ro 3 0 0 0 0 0 0 65 83 3 1 1 1 1 1 1 66 84 3 0 1 9 1 1 1 67 86 3 1 1 1 1 1 1 68 87 2 1 1 1 0 1 1 69 88 1 1 0 0 0 0 88 = 50 70 89 2 1 1 1 0 0 0 71 90 2 1 1 1 1 1 1 72 91 3 0 0 0 0 0 0 73 92 3 1 0 0 1 0 92 = 45 74 93 3 0 1 9 0 0 0 75 94 3 0 0 0 0 0 0 76 95 3 1 1 1 1 1 1 77 96 3 1 1 1 1 1 96 = 40 78 97 3 1 1 1 1 1 1 79 99 3 1 1 1 1 1 1 80 101 3 1 1 1 1 1 1 81 103 3 1 0 0 1 0 81 = 30 82 104 3 0 1 9 1 1 1 83 105 2 0 0 0 1 0 0 84 106 3 1 1 1 0 1 1 85 107 1 1 1 1 1 1 1 86 108 3 1 1 1 0 0 0
Plant nr Aantal geplant 2000
Blad Bloem Oordeel 2000 (A en B) Oordeel 95/98 (C) BKD-2001 (D) Uiteindelijk oordeel 87 109 3 9 9 9 0 0 0 88 110 3 1 1 1 1 1 1 89 111 3 1 0 0 0 0 0
De uiteindelijke TBV-scores over de jaren klopt in grote lijnen maar er zijn toch altijd een aantal afwijkers (grijs getint). De aanwezigheidstoets op virus is als maatstaf genomen, in de gevallen dat dat niet klopt met het eerdere oordeel is gekeken of dat eerdere oordeel éénduidig was, indien ja dan is voor deze kloon een missende waarneming ingevoerd.
2) Het vinden en uitvoeren van een goede moleculaire merkermethode Optimaliseren AFLP-methode.
De AFLP methode is een veel gebruikte merkermethode met een paar in het oog springende voordelen. Voordelen zoals het kunnen beginnen zonder moleculaire voorkennis over het gewas en het grote aantal merkers wat bepaald kan worden in een segregerende populatie. Dit laatste is vooral voor gewassen met een hoog niveau heterozygotie. Voor zowel lelie als tulp was de grootte van de genomen (voor lelie bijvoorbeeld 70 x het genoom van tomaat) een potentieel probleem om betrouwbare AFLP-patronen te verkrijgen. Voor beide gewassen was wel de verwachting een hoog aantal polymorfismen te vinden.
a) Lelie
Met een mini-isolatiemethode is DNA geisoleerd van lelie. Na het bepalen van een aantal AFLP-patronen konden de volgende conclusies getrokken worden: de gangbare methode met zes selektieve basen en de enzymprimercombinatie Eco/Mse gaf een te complex patroon. Met zeven selektieve basen worden de patronen interpreteerbaar.
zes selektieve basen en de enzymprimercombinatie
Pst/Mse gaven goede patronen
de methode is goed reproduceerbaar
er worden voldoende polymorfe, uitsplitsende merkers gevonden.
b) Bepalen merkers in lelie populatie
15 AFLP enzymprimer kombinaties, met gemiddeld 80-120 fragmenten, zijn gebruikt om in totaal 527 segregerende, scoorbare AFLP merkers te krijgen. Twee enzyme primer combinaties zijn gebruikt om het risico van klustering van merkers te verminderen (Haanstra et al., 1999). Van de 527 markers in de 'Connecticut King' x 'Orlito' kruising waren er 176 afkomstig van 'Connecticut King' en 201 van 'Orlito';
INFORMATIEBOX 1
DNA isolatieprotocol (mini-isolatie) 1. Buizen met (blad)materiaal uit de vriezer (-50°C)
met behulp van vloeibare stikstof nog verder laten afkoelen. Het bladmateriaal in kleine stukjes stampen en 0.2-0.3 gram gestampt materiaal overbrengen naar een eppendorfvaatje (epje). 2. 750 ml DNA-isolatiebuffer (IB) met Na2S2O5 (3.8 g/l)
wordt toegevoegd aan het bladmateriaal. Dit mengsel wordt gedurende 60 minuten bij 65°C geincubeerd; het epje wordt af en toe geschud (IB = 1 M NaCl, 0.175 M Sorbitol, 1% w/v CTAB, 1% sarkosyl, 0.015 M EDTA, 0.15 M Tris.HCl pH=7.5).
3. Epjes uit het waterbad halen, schudden en daarna 750 µl chloroform/ isoamylalcohol (24:1) toevoegen. Enkele keren schudden en vervolgens 5 minuten centrifugeren op toerental 15.000.
4. Pipetteer 400 µl van de bovenstaande vloeistof in een nieuw 1.5 ml epje en voeg 400 µl koude (-20°C) isopropanol toe. Ieder epje voorzichtig schudden. 5. De epjes 6 minuten bij kamertemperatuur
centrifugeren op maximale snelheid.
6. Afgieten van bovenstaande vloeistof; zorg dat pellet in epje achterblijft. Pas op: het pellet zit niet al te vast!
7. Voeg 500 µl 70% koude (-20°C) ethanol toe en schud de epjes, centrifugeer vervolgens 6 minuten en giet de ethanol af. De pellet wordt gedroogd in een
vacuümdroger.
8. Voeg 100 µl TE (o.1 M Tris, 0.005 M EDTA) toe. 9. Na het resuspenderen wordt standaard 10 µl van de
de overige 150 merkers waren in beide ouders (heterozygoot) aanwezig en splitsten daarom ook in de nakomelingen uit.
c) Koppelingskaart Lelie
Er is een kaart gemaakt van alle ConKing merkers en de merkers die in zowel ConKing als Orlito aanwezig zijn. 251 van deze 326 uitsplitsende merkers konden geplaatst worden in koppelingsgroepen met minimaal 5 merkers (zie informatiebox 2). In totaal konden 24 koppelingsgroepen worden geïdentificeerd met als genetische lengte 1400 cM. Aangezien lelie 12 chromosomen heeft zouden met een ideaal scenario ook 12
verschillende koppelingsgroepen gevonden moeten worden. Ongeveer 25% van de merkers (75) waren niet significant gekoppeld met ten minste vier andere merkers. De kaarten zijn aan het eind van dit verslag te vinden als figuren 7 en 8.
Tulp
Ook hier kon de AFLP-techniek gebruikt worden om snel een groot aantal merkers te krijgen.
Bepalen merkers in tulp populatie
In totaal zijn 12 verschillende primercombinaties gebruikt om een gemiddeld aantal polymorfismen van ongeveer 50 te vinden met als uitschieter een combinatie met maar liefst 105 polymorfe fragmenten. De populatie bestaat uit 89 planten. In totaal zijn 595 segregerende merkers gescoord en zijn er 12 primercombinaties gebruikt, de kaart is op dezelfde wijze berekend als beschreven voor lelie.
Bij 117 van de 595 merkers werden segregatieratio's gevonden die duidelijk afweken van wat verwacht werd. Zulke scheve uitsplitsingen komen veel voor bij kruisingen, omdat ze echter het maken van een kaart compliceren doordat ze koppeling suggereren die er in werkelijkheid niet is, zijn ze niet gebruikt.
Koppelingskaart tulp.
Er is een genetische koppelingskaart gemaakt met de KN merkers en enkele merkers die in beide ouders voorkwamen. In totaal werden 17 koppelingsgroepen gevonden en 1238 cM berekend. Tulp heeft 12 chromosomen, dus in het ideale geval zouden ook 12 koppelingsgroepen gevonden moeten worden. Voor Cant werden 16 koppelingsgroepen berekend (1004 cM). Er is een aparte vaderlijke (KN) en moederlijke (CANT) kaart berekend. De kaarten zijn aan het eind van dit verslag te vinden als figuren 5 en 6.
3) Vergelijken datasets (toetsresultaten en merkers) en identificatie merkers geassocieerd met TBV en Fusarium
Vergelijken datasets (toetsresultaten en merkers) en identificatie van merkers geassocieerd met de betrokken eigenschappen in lelie
TBV
Het gen verantwoordelijk voor TBV resistentie is geplaatst op koppelingsgroep 7 met de significantste koppelingen met merkers P31M55-21, P31M59-28, P31M59-17 en
E40M52T-5.
Omdat de best gekoppelde merker nog steeds ongeveer 10 cM (één op 10 nakomelingen heeft een recombinatie tussen merker en gen) is geprobeerd met Bulked Segregant Analysis (BSA) beter gekoppelde merkers te vinden. In totaal zijn 64 nieuwe
Informatiebox 3
Er waren in de hele populatie acht planten zonder één van de vier positieve resistentie allelen (of eigenlijk zonder de gekoppelde merkers van de resistentiegenen). Vijftien planten hadden wel alle merkers gekoppeld aan de resistentie-allelen. De verschillen waren overduidelijk (Tabel 3).
enzymprimer combinaties gebruikt maar zonder succes. De al gevonden merkers bleven de best gekoppelde merkers. Eén van deze merkers is succesvol getest op een aantal cultivars waaruit bleek dat de koppeling tussen merker en resistentie ook in de
verschillende cultivars bleef bestaan. Deze merker is toen gekozen om omgezet te worden in een gebruikersvriendelijke PCR-merkers om proof of concept te geven over de
haalbaarheid van het omzetten van merkers in een gewas met zulk een groot genoom.
Fusarium
Om de associates van Fusarium resistentie met de moleculaire merkers op de AFLP-koppelingskaart te vinden zijn de vier data sets apart geanalyseerd. The statistische test geeft de significantie en hoogte van het effect. Onderstaande tabel laat de verschillende effecten en de significantie zien.
Tabel 2. De chromosoomgebieden met een significante koppeling met Fusarium resistentie in 1992, 1993, 1994 of 1999
__________________________________________________________________________ Linkage groep 1992 1993 1994 1999 De merker in het gebied
met de grootste koppeling
______________________________________________________________________ Linkage group 1 (17 - 27 cM) **** * - **** E41M52A-35, E40M52A-27 Linkage group 5 (65 - 90 cM) ****** **** ** ***** P31M52-12, P31M59-21 Linkage group 13 (35 - 50 cM) *** ** ** **** E41M52A-1 Linkage group 16 (0 - 20 cM) *** **** * ** E41M52A-11, P31M55-1 _______________________________________________________________________
-, *, **,***,****,*****,******, Niet significant of significant bij P = 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 or 0.0005.
Op deze wijze werden vier verschillende QTLs geïdentificeerd. Door de jaarlijkse variatie in de Fusarium testen werden niet alle QTLs ieder jaar weer gedetecteerd. De significantie was lager of er was zelfs helemaal geen significantie meer. Alle merkers waren in koppelingsfase met de resistentie. Dit betekent dat planten met de merker minder gevoelig zijn voor Fusarium (zie informatiebox 3).
Tabel 3
1992 1993 1994 1999
_____________________________________________________________________
Gemiddelde (100 planten) 2.9 2.2 2.4 2.0
Zonder merkers van de QTLs (8 plants) 3.6 3.5 3.1 2.3 Met de merkers van de QTLs (15 plants) 2.2 1.8 1.9 1.5
_____________________________________________________________________
Mannelijke steriliteit
De factor die mannelijke steriliteit veroorzaakt kon gelokaliseerd worden. De meest nauw gekoppelde merkers waren P31M59-32 en E37M52T-17.
Vergelijken datasets (toetsresultaten en merkers) en identificatie van merkers geassocieerd met de betrokken eigenschappen in tulp
TBV
Cant is TBV (tulip breaking virus) resistent. Deze eigenschap splitst uit in de populatie en is gescoord door te kijken naar de breking van de bloemkleur na infectie. De TBV-resistentie lijkt bepaald te worden door een dominant enkelgens kenmerk. In eerste instantie waren de significante koppelingen met merkers die helaas nog verder dan 20 cM van het resistentiegen verwijderd lagen. Hoewel het betrouwbare koppelingen zijn, zijn deze merkers niet geschikt als selectiemerkers en zullen er dus merkers dichterbij het resistentiegen gevonden moeten worden. Dit is gebeurd met Bulked Segregant Analysis (BSA). Aan de hand van de TBV resistentie gegevens van dit jaar en de merkers zijn 10 planten geselecteerd voor een resistente pool en 10 voor een vatbare pool. Met deze methode zijn een aantal merkers dichterbij het TBV-resistentiegen gevonden. Een aantal hiervan kunnen voor een geselecteerd assortiment van tulpen cultivars bepaald worden. Figuur 2. Koppelingskaart rondom TBV-resistentiegen gebaseerd op eerdere data. tbvbloem 0 E37M52G-7 23 E36M52G-48 25 E37M52T-53 26 E36M52T-7 26 P31M48-54 26 P31M54-35 26 P31M54-2 26 P31M50-1 27 P31M54-1 30 E36M52G-29 32 E36M52G-42 32 P31M48-5 40 P31M47-24 43 P31M54-45 3 9tbvbloem 0 9xE37M52G-7 23 9xE36M52G-48 25 9xE37M52T-53 9xE36M52T-7 9xP31M48-54 9xP31M54-35 9xP31M54-2 26 9xP31M50-1 27 9xP31M54-1 30 9xE36M52G-29 9xE36M52G-42 32 9xP31M48-5 40 9xP31M47-24 43 9xP31M54-45 53 9
Figuur 3. Koppelingsgroep rondom TBV-resistentiegen na BSA
Fusarium
Voor betrouwbare analyses is het nodig de Fusarium toets verscheidene jaren achtereen uit te voeren. Dit kon helaas niet in de tijd van dit project, maar in de daarna volgende jaren is dit verder voltooid. De associatie is niet uitgevoerd, maar met de populatie en de merkerdata voorhanden kan dit indien gewenst in de nabije toekomst nog gedaan worden.
group 1 tbvfinal 0.000 P31M51-415 3.014 E37M52C-385 6.439 E45M52G-96 7.948 E33M52G-175 9.551 12xP31M54-1 14.874 12xE37M52T-53 16.705 12xP31M54-2 16.712 12xE36M52T-7 16.717 12xP31M48-54 16.785 12xP31M54-35 16.830 12xE36M52G-48 17.406 12xP31M50-1 18.213 12xE37M52G-7 19.825 12xE36M52G-42 21.236 12xP31M47-24 23.082 E38M52G-75 24.152 12xE36M52G-29 30.025 E38M52G-30 33.535 12xP31M48-5 39.660 12xP31M54-45 45.357 13xP31M47-15 57.594 13xE40M52A-37 62.595 13xP31M54-49 70.447 13xE37M52A-41 80.378 13xE37M52A-19 80.378 13xE37M52A-15 90.246 tbvfina 0 P31M51-415 3 E37M52C-385 6 E45M52G-96 8 E33M52G-175 10 12xP31M54 15 12xE37M52T-53 12xP31M54 12xE36M52T12xP31M48-54 12xP31M54- 12xE36M52G-48 17 12xP31M50-1 18 12xE37M52G-7 20 12xE36M52G-42 21 12xP31M47-24 23 E38M52G-75 24 12xE36M52G-29 30 E38M52G-30 34 12xP31M48-5 40 12xP31M54-45 45 13xP31M47-15 58 13xE40M52A-37 63 13xP31M54-49 70 13xE37M52A-41 13xE37M52A-19 80 13xE37M52A-15 90
Stand van zaken voor lelie en tulp na de koppelingsanalyse:
Ook voor lelie en tulp met hun grote genoom is het mogelijk AFLPs te gebruiken en koppelingsanalyses uit te voeren.
Er zijn gekoppelde merkers voor morfologische kenmerken
Fusarium resistentie moet in meerdere jaren bepaald worden om betrouwbare
koppelingsanalyses te doen. Er zijn in lelie vier chromosoomgebieden geïdentificeerd met een associatie met Fusarium resistentie. De positieve allelen van deze vier gebieden geven een grote mate van resistentie.
Er zijn gekoppelde merkers met aan TBV resistentie gevonden en deze koppeling blijft overeind in het assortiment (resistente cultivars hebben veel vaker de merker dan vatbare planten)
Figuur 4. AFLP gel met de lelie ouders, nakomelingen en
assortimentsvertegenwoordigers die de koppeling tussen merker en TBV-resistentie tonen. Zie ook verderop.
Eerste Nabeschouwing:
In de eerste jaren van dit project zijn de koppelingskaarten gemaakt van lelie en tulp op basis van AFLPs en twee enzymcombinaties (EcoMse en PstMse). Met beide
combinaties werden goed scoorbare en segregerende verschillen gevonden. De lelie- en tulpenpopulatie zijn ook gefenotypeerd voor TulipBreakingVirus- en Fusarium
resistentie. De ontwikkeling van de tulpenpopulatie nam zoveel tijd in beslag dat het niet meer mogelijk was voldoende, onafhankelijke Fusarium toetsen uit te voeren in de gegenotypeerde tulpenpopulatie. Er werden ook
goede koppelingen gevonden voor het enkelgens resistentiegen tegen TBV in lelie en tulp en enkele QTLs voor Fusarium-resistentie in lelie. In tulp is ook gebleken dat met BSA op een snelle, efficiënte wijze nauwer gekoppelde merkers gevonden konden worden. Dit lukte niet bij lelie maar dat kan ook zijn oorzaak hebben in de opbouw van de populatie van lelie (een terugkruising op ConKing). Als finale in het project zou een aantal van de gevonden AFLP-merkers "omgebouwd" worden naar andere, gemakkelijker te gebruiken, PCR markers. In deze fase van het onderzoek aangekomen bleek dat de gevonden AFLP-patronen moeilijk te reproduceren waren door anderen (Keygene en
IdQ). Dit heeft veel vertraging en onnodige kosten opgeleverd. Hoewel dus bijna alle doelstellingen bereikt zijn (zie informatiebox 4) resteert het converteren van de merkers. Besloten is vervolgens in samenspraak met de Begeleidingscommissie en PT na afloop van het project door te gaan en één PstMse merker gekoppeld aan TBV resistentie van AFLP merker om te zetten in een enkelvoudige gemakkelijk te bepalen PCR-merker (p31m55-21; 130bp).
Informatiebox 4
Als doelstellingen dienen minimaal te worden gehaald:
1. Bepalen van 1 ‘monogene’ morfologische “voorbeeld” eigenschap (bloemkleur of mannelijke steriliteit), 1 ‘monogene’ toetsbare eigenschap (virusresistentie) en 1 polygene toetsbare eigenschap (Fusarium-resistentie bij lelie) in uitsplitsende populaties.
2. Toepasbaar maken van de AFLPTM /
PCR-technologievoor lelie en tulp.
3. Uitvoeren van koppelingsberekeningen, het maken van een merkerkaart (per onderzochte populatie) en het vaststellen van de best gekoppelde merkers aan de onder punt 1 genoemde eigenschappen.
4. Maken van SCAR’s gekoppeld aan de onder punt 1 genoemde eigenschappen. Toetsen van de SCAR’s op bijbehorende populatie(s) en belangrijke cultivars.
iP31M59-28 0 P31M48-14 iE40M52T-5 2 iP31M59-17 4 E41M52A-9 5 iP31M55-21 6 TULIPBREAKV 16
4) Van AFLP-merker naar enkelvoudige PCR-merker
Inleiding
Zoals boven beschreven is voor dit project een genetische koppelingskaart van lelie gemaakt bestaande uit AFLP-merkers. De ongeveer 100 fragmenten per laan en 35-50 polymorfismen maakten het mogelijk redelijk efficiënt een genetische kaart te maken. Er is zowel een vaderlijke als een moederlijke kaart gemaakt.
Resultaten
Gekoppelde merker
De TBV-resistentie splitste 1:1 uit en berust dus hoogstwaarschijnlijk op één dominant overervend allel. P31M55-21 is het best gekoppelde merker, maar bevindt zich toch nog steeds op 10cM afstand (significantie wel hoog: LOD=8).
Korte toelichting:
De merker (het AFLP-fragment) wordt zowel gevonden in ConKing (resistent) als in Orlito als in Pirate (beide vatbaar). De koppeling is gebaseerd op de 1:1 uitsplitsing van TBV in de nakomelingen van de kruising Connecticut King x Orlito en de 3:1 uitsplitsing van de merker.
Als de resistentie als type ab x aa (enkelgenskenmerk) gescoord wordt en de merker als type ab x ab worden het resistentiegen en de extra merker op de koppelingsplaats geplaatst en is afstand tussen het resistentiegen en de merkers bekend. De afstand met de dichtsbijzijnde merker (M) is 10cM met een hele hoge significantie (LOD=8.0).
In alle kruisingen hebben alle ouders de merker (dus ook de vatbare Pirate en Orlito), toch is er een koppeling tussen merker en resistentie-allel. Dit kan als volgt verklaard worden:
Mogelijkheid 1:
Merker is zowel aanwezig in ConKing als in Pirate; Orlito heeft het merkerallel van Pirate gekregen zonder de resistentie. Bij de terugkruising op CK splitst de gekoppelde merker aan TBV-resistentie 3:1 uit. En de resistentie 1:1. In de resistente planten is de merker aanwezig dus de merker en het resistentiegen zijn in koppelingsfase.
Mogelijkheid 2:
Merker is zowel aanwezig in CK als in Pirate. Koppeling tussen merker en resistentiegen zal door recombinatie verdwijnen in sommige van de voortplantingscellen van CK, Orlito is het resultaat van één van deze cellen samen met het allel van Pirate wat geen band geeft. Orlito wordt teruggekruist met CK en de merker splitst 3:1 uit.
Feitelijk hebben mogelijkheid 1 en 2 dezelfde gevolgen en kunnen hetzelfde geïnterpreteerd worden.
CONCLUSIE:
We hebben een duidelijke, in koppelingsfase zijnde, AFLP-merker aan het resistentiegen; deze merker is 130 baseparen lang.
Merker over gedeelte assortiment
Bovenstaande merker is getest op een aantal leliecultivars, bij het bepalen van de merker bleken zes van de zeven resistente cultivars (Sarina, Dreamland, Sorbet, Pollyanna, Elite, Gran Cru, Chianti, Cordelia, Jolanda) het AFLP-fragment te hebben en acht van de negen vatbare cultivars Ster Star, Mont Blanc,L. Maculatum, L. Dauricum, Juliana, Chinook, wilsonii, Enchantment, L. Tigrinum) hadden het fragment niet.
In 2004 is nog eens opnieuw de betrouwbaarheid en robuustheid van de
merker bevestigd doordat een nieuw persoon met oud én nieuw DNA van
eerder geteste én nieuwe assortimentsvertegenwoordigers waarvan de
resistentie bekend is, het AFLP-bandje kon reproduceren. De uitsplitsing en
koppeling bleken zoals verwacht.
CONCLUSIE:
We hebben een duidelijke, in koppelingsfase zijnde, AFLP-merker aan het resistentiegen; deze merker is 130 baseparen lang en ook bij het assortiment is er duidelijk sprake van een koppeling tussen merker en de aanwezigheid van resistentie.
Bepalen sequentie van de merker
Het sequencen en ombouwen van AFLP-banden is bij lelies en tulpen zeker moeilijker dan bij andere planten door de complexe AFLP-patronen en de grootte van het genoom van lelie en tulp. Er zijn veel repetitieve sequenties in deze genomen die het ombouwen kunnen compliceren.
Om de complexe AFLP-patronen te simplificeren (zie A in flowchart) is een specifieke methode toegepast die op het hieronder beschreven principe gebaseerd is:
Enzymprimercombinatie
P31M55 a) P31M55 a) P31M55
P31M55A b) P31M55CA b) P31M55CAA
P31M55T c) P31M55CT c) P31M55CAT
P31M55C d) P31M55CC d) P31M55CAC
P31M55G e) P31M55CG e) P31M55CAG
Aan de M55 kant zijn de selectieve basen TCG; hierbij wordt het gekoppelde AFLP fragment gevonden. Als dezelfde reactie over wordt gedaan met vier andere primers die elk één van de vier mogelijke baseparen hebben, dan zal hetzelfde fragment maar met één van deze vier fragmenten teruggevonden worden. In ons geval was dit met de C (zie vetgedrukt), dezelfde truc kan herhaald worden en de volgende selectieve base wordt bekend (een A) en nogmaals ... ( weer een A).
Als nu de AFLP reactie wordt gedaan zal een veel rustiger patroon ontstaan ( theoretisch maar ¼ x ¼ x ¼ = 1/64 van het totaal aantal banden (zie B in flowchart).
In dit minder gecompliceerde patroon kan het fragment uit de gel gesneden worden en kan de sequentie direct bepaald worden of kan het gebruikt om te kloneren. M.b.v. een de gekloneerde sequentie kan dan ook de sequentie bepaald worden (zie C in flowchart). Dit is gedaan en de volgende sequentie is gevonden:
P31 kant – AAACCTCCACCATCATCAAACGTGATAAGACTTGAAAACTCCA CCATCATCAAATATTATAGGACTTGAAAACTGCAAGCTTTTACAATCG – M55 kant
CONCLUSIE:
Het gekoppelde fragment is succesvol gesequenced. De sequentie is wel te kort om succesvol omgezet te kunnen worden naar een enkelvoudige PCR-merker. Daarom moet de sequentie verlengd worden.
Verlengen sequentie AFLP-fragment:
Om de sequentie te verlengen wordt het gehele genoom van lelie geknipt met een bepaald restrictie-enzym (zie D in flowchart). Alle fragmenten worden nu begrensd door bekende restrictiesites en aan deze restrictiesites worden nu bekende sequenties geplakt (adapters, zie E in flowchart). Slechts enkele van deze fragmenten hebben de sequentie van het AFLP-fragment. De fragmenten die de sequentie van het AFLP fragment hebben bestaan uit een adaptersequentie, een stukje onbekende sequentie, de AFLP-sequentie, weer een stukje onbekende sequentie en tenslotte ook weer een adaptersequentie (F).
Er worden primers gemaakt mbv de bekende AFLP sequentie en de bekende
adaptersequentie. Indien het fragment niet te groot is zal (in twee aparte reacties) met een PCR-reactie zowel het fragment rechts als links van de AFLP-sequentie bepaald kunnen worden. Als geen amplificatieproducten verkregen worden kan hetzelfde proces herhaald worden met een ander restrictie-enzym totdat uiteindelijk het restrictie-enzym gevonden wordt wat dicht genoeg bij de bekende AFLP-sequentie knipt (zie G in flowchart) en dus producten oplevert. Dit fragment kan gekloneerd worden en van een aantal apart klonen kan de sequentie bepaald worden.
De sequentie kon inderdaad verlengd worden na knippen met het restrictie-enzym HaeI . Een aantal klonen is gesequenced. Het was opvallend dat er nog veel iets afwijkende sequenties gevonden werden. Afwijkende sequenties kunnen komen door
sequentiefoutjes, maar het kan ook een teken zijn dat niet alleen de sequentie rondom het AFLP-fragment wordt opgepikt, maar ook nog (iets afwijkende) gedupliceerde
sequenties. Een fenomeen wat in lelie met zijn grote genoom tot de mogelijkheden behoort.
Er werden ook een aantal dezelfde sequenties gevonden. Bij 10 sequenties van ConKing was het enige verschil in de 213 basenparen een polymorfisme in de Mse-site ( bij een AFLP-merker kan het polyformisme veroorzaakt worden door een polymorfisme in éen van de twee restrictiesites (in dit geval Pst/Mse ). Een verschil wat verwachten kon
worden en waarvan het aannemelijk was dat het gebruikt zou kunnen worden om er een enkelvoudige PCR-merker (CAPS) mee te maken.
CONCLUSIE:
Een sequentie van 213 basepaar lengte met een polymorfisme in de Mse-site, bij ConKing hebben 5 sequenties wel de site en vijf niet (Restrictiesite MseI TTAA, Niet-restrictie TTAT). Deze sequentie is ook aanwezig in Pirate en Orlito.
Via de gevonden sequentie naar een enkelvoudige PCR-merker
De vraag was: Is het mogelijk primers te maken die alleen de sequentie met in het midden het polymorfisme amplificeren. Als dit mogelijk is wordt het volgende resultaat verwacht (zie onderstaand figuur en flowchart):
In alle genotypen wordt het fragment geamplificeerd (de sequentie is overal aanwezig) In Pirate, Orlito en ConKing zal het geamplificeerde allel met de knipplaats wel geknipt worden en het allel zonder de knipplaats niet. Na digestie zal een patroon van drie banden ontstaan.
Alle vatbare nakomelingen (4, 7, 37 en 40) hebben alleen de allelen zonder de knipplaats en na digestie is er niets veranderd.
De resistente nakomelingen kunnen zowel een allel met knipplaats samen met een allel zonder knipplaats hebben (bv 19,23) als twee allelen met beide een knipplaats (bv 6,9). In het eerste geval zal weer een patroon van drie banden ontstaan en in het tweede geval worden alleen de geknipte fragmenten gevonden.
Dit experiment is uitgevoerd en helaas werd bij alle genotypen het patroon met drie banden gevonden en bleek onderscheid niet mogelijk; kortom de helft van de allelen die we amplificeerden met de door ons gekozen primers werd geknipt en de andere helft niet.
Inmiddels hadden we toegang gekregen tot een nieuwe techniek: Het
PYROSEQUENCEN. Deze techniek werkt als volgt: Op een bekende sequentie wordt een primer ontworpen en op ingenieuze manier worden een aantal baseparen (30-40) volgend op de sequentie van de pyrosequence primer afgelezen. Op deze manier kan over de Mse-site heengelezen worden en kunnen op deze manier allelen gescoord worden. Ook
23
19
9
6
4
CK
Or
Pi
7
37
40
23
19
9
6
4
CK
Or
Pi
7
37
40
( )
( )
Geknipt
Ongeknipt
hier kwamen we niet tot een bevredigend resultaat omdat het geamplificeerde product (gemaakt met nieuw gekozen primers) niet zuiver was maar uit meerdere sequenties door elkaar bestond. Dit leidde tot niet interpreteerbare resultaten.
CONCLUSIE:
Onze gekozen primers amplificeren niet selectief genoeg, er worden waarschijnlijk naast de beoogde sequentie een paar andere erg vergelijkbare sequenties gelijktijdig
geamplificeerd. Bijvoorbeeld één die homozygoot aanwezig is maar geen knipplaats heeft en één die homozygoot aanwezig is met de knipplaats. Het verschil wat aangetoond moest worden werd hierom niet zichtbaar. Hierdoor was de laatste stap van de AFLP_merker naar een CAPS marker nog niet mogelijk.
Finale nabeschouwing
Hoewel de meeste doelstellingen van het project gehaald zijn en gebleken is dat het gebruik van moleculaire merkers en koppelingsanalyses leidt tot het identificeren van gebieden in het genoom met een associatie met de onderzochte eigenschap is de vierde en laatste doelstelling, het succesvol kunnen omzetten van de AFLP-merker in een
handzame eenvoudige andere merker, onvoltooid.
Het grote genoom van zowel lelie als tulp met de vele repetitieve sequenties zal hier zeker debet aan zijn. Maar wellicht kan ook de keuze welke AFLP-merker om te zetten hier aan bijgedragen hebben. Veel meer sequentie-informatie blijkt nodig om de juiste amplificatieprimers te kunnen kiezen.
Natuurlijk is er nu een merker voor TBV resistentie maar het blijft een arbeidsintensieve AFLP-bepaling waarvan gebleken is dat deze niet altijd in andere laboratoria te
reproduceren zijn (intern hebben we hier geen problemen mee). Afsluitend:
- Het is mogelijk in lelie en tulp om moleculaire merkers gebaseerd op de AFLP
technologie te vinden en hiermee koppelingskaarten op te stellen.
- Koppeling met belangrijke eigenschappen in lelie en tulp kan gevonden en
toegepast worden.
Ombouw van AFLP tot ‘makkelijke’ PCR merker (SCAR of CAPS) is moeilijk, maar niet onmogelijk. Een aan te bevelen strategie voor de toekomst is om meerdere merkers hiervoor te kiezen en je niet te beperken tot één. Recent ontwikkelde, moderne
technieken geven de mogelijkheid de benodigde sequentiegegevens sneller en
nauwkeuriger te produceren. De geïdentificeerde Fusarium merkers in lelie lenen zich hier bij uitstek voor.
Meest waarschijnlijke sequentie van het AFLP-fragment
Simplified AFLP-pattern Kloneren Direct sequencen Sequencen Complex AFLP-pattern P31 kant – AAACCTCCACCATCAT CAAACGTGATAAGACTTGAAAAC TCCACCATCATCAAATATTATAGG ACTTGAAAACTGCAAGCTTTTACA ATCG – M55 kant
De unieke sequentie voor dit fragment is 92 unieke basen (de primer- en adaptersequenties tellen niet mee).
Bepaling sequentie van het AFLP-fragment
B.
C.
A.
Primer gebaseerd op gedeelte sequentie AFLP fragment Adapters Sequentie AFLP-fragment Adapters Primer gebaseerd op adaptersequentie Pcr-reaction cloning en sequentiebepaling AACCTCCACCATCATCAAACGTGA TAAGACTTGAAAACTCCACCATCA TCAAATATTATAGGACTTGAAACT GCAAGCTTTTACAATCGTTAA/TCAC ACAACGAGCTAAGTACAAATTTGG ATCTGAATAATAAACAAGGTTTTCA GTCTGCTTCTATCGCATTATATAA TGATATATCTACATTCTTTTTCCTG TGTTTCTGAGCCCGCGTC
Verlengen sequentie AFLP-fragment
E.
F.
G.
D.
Mse-site
Geamplificeerde sequentie met primers Gebaseerd op de leliesequentie
Sequentie flankerend aan AFLP-fragment
Nieuwe primers
Digestie of niet van fragment (CAPs-merker)
Totale bekende sequentie (blz 15)
Figuur 5 Tulp, Kees Nelis 1P31M49-32 0 1iE36M52G-32 1E37M52A-44 1 1iP31M48-33 1E40M52A-20 2 1E37M52A-104 1P31M49-22 1P31M54-42 3 1E36M52G-23 4 1E37M52T-6 31 1E37M52T-35 38 1iE40M52A-32 43 1E37M52T-17 49 1P31M49-34 53 1E37M52G-32 62 1P31M48-15 74 1P31M54-24 78 1E36M52T-1 84 1E37M52G-4 86 1E37M52G-8 94 1 1aP31M50-27 0 1aiP31M48-33 1aE37M52T-4 9 1aE35M52T-14 10 1aE37M52G-12 11 1aiE36M52G-32 12 1aE40M52A-6 14 1aiE36M52T-35 1aP31M54-25 15 1aiE37M52T-29 1aE37M52T-5 17 1a 2E37M52G-38 0 2E37M52A-81 2 2E37M52A-59 9 2P31M50-12 13 2P31M47-23 17 2E40M52A-7 18 2E36M52T-23 23 2E37M52T-54 33 2E35M52T-15 43 2E37M52A-84 51 2E36M52G-8 52 2P31M48-41 65 2E35M52T-17 72 2P31M50-4 74 2E37M52A-2 86 2P31M50-39 90 2P31M48-50 96 2E37M52T-40 97 2E37M52A-12 114 2E36M52T-28 116 2E37M52T-26 121 2P31M50-7 133 2P31M47-26 139 2E40M52A-34 151 2 3E40M52A-3 0 3E37M52G-1 6 3E36M52T-32 7 3E35M52T-21 10 3E36M52T-17 11 3P31M50-10 3E40M52A-47 3E37M52G-13 18 3iE37M52A-18B 21 3E40M52A-38 3E36M52T-16 3E37M52T-61 22 3P31M48-53 23 3E37M52T-3 38 3E35M52T-10 41 3P31M48-29 46 3P31M54-34 68 3P31M49-31 71 3P31M54-17 73 3E36M52G-20 75 3P31M49-21 77 3E40M52A-45 93 3 4P31M50-17 0 4P31M50-31 7 4E36M52G-45 4E37M52G-33 8 4P31M49-39 9 4E36M52T-25 10 4P31M48-32 13 4E36M52T-12 4P31M50-16 14 4P31M47-9 15 4P31M48-1 26 4E37M52G-36 34 4E37M52A-5 53 4 5iE40M52A-29 0 5E37M52G-19 10 5iP31M54-32 5E36M52G-6 12 5E36M52G-17 14 5E37M52A-28 18 5E37M52A-102 23 5P31M48-4 25 5P31M47-4 32 5 6iE37M52G-25 0 6P31M48-56 3 6E37M52A-72 11 6P31M47-14 20 6E37M52A-37 22 6P31M54-6 31 6E35M52T-1 36 6E36M52G-18 48 6P31M48-51 60 6P31M48-16 66 6iE36M52T-38 74 6E40M52A-24 84 6E37M52A-101 102 6P31M54-13 6P31M54-26 114 6iP31M54-8 116 6E36M52G-24 6E37M52G-37 119 6E37M52G-35 120 6P31M47-42 128 6E37M52T-19 6E37M52G-22 129 6P31M49-15 135 6 6aE37M52A-27 0 6aiP31M54-8 14 6aE40M52A-30 18 6aP31M48-38 29 6aiE37M52T-19 31 6aP31M50-37 33 6aE37M52A-94 34 6aP31M54-41 45 6a 7P31M47-20 0 7P31M50-14 13 7E36M52G-31 19 7P31M48-10 33 7E37M52T-64 48 7E36M52G-35 59 7P31M54-48 81 7E40M52A-41 89 7E37M52G-15 117 7P31M49-13 7E40M52A-43 120 7E36M52T-19 7E40M52A-28 7iP31M49-37 121 7E37M52T-24 7P31M49-6 7E37M52A-51 7E37M52A-57 122 7E37M52G-14 123 7E35M52T-13 124 7E37M52A-56 125 7 8E37M52T-50 0 8P31M49-2 12 8E36M52T-14 14 8P31M48-9 17 8E37M52A-10 8E37M52A-31 18 8P31M49-23 19 8E36M52G-54 20 8E36M52G-36 21 8E36M52G-14 25 8E36M52T-15 42 8P31M50-13 48 8E37M52A-60 65 8E37M52G-27 74 8P31M48-52 8P31M47-16 79 8E37M52A-50 8E37M52T-38 83 8E36M52G-16 85 8E35M52T-8 108 8 9iP31M54-9 0 9E37M52T-57 7 9P31M49-27 10 9iP31M50-30 17 9P31M54-20 9E37M52A-98 23 9iE36M52G-15 42 9E37M52G-21 50 9E40M52A-9 9P31M54-19 51 9iE37M52A-87B 52 9E40M52A-46 53 9E36M52T-36 58 9P31M47-21 84 9E36M52T-34 88 9 9aE37M52A-43 0 9aE37M52G-10 3 9aE40M52A-4 9aE36M52G-9 7 9aP31M48-26 24 9aP31M48-22 25 9aiE40M52A-36 27 9aE37M52A-39 39 9aE37M52T-59 46 9aE37M52A-73 53 9aE40M52A-33 70 9a 10E37M52T-12 0 10P31M48-55 10E37M52A-8 10P31M47-41 4 10P31M48-11 10 10P31M47-22 15 10P31M54-54 37 10P31M48-34 51 10 11iE37M52A-76B 0 11E37M52T-20 1 11E37M52A-13 11E37M52A-78 7 11E40M52A-16 12 11E36M52G-40 30 11P31M47-6 33 11iP31M47-5 34 11E37M52A-52 40 11iE37M52A-35B 47 11P31M47-29 61 11 12E36M52G-53 0 12E37M52G-9 11 12iE36M52T-20 12E37M52T-1 18 12P31M49-18 25 12iP31M49-26 27 12E37M52T-47 33 12E37M52A-100 36 12P31M50-40 40 12E36M52G-1 45 12P31M48-45 61 12 13E37M52A-32 0 13P31M49-7 2 13P31M49-38 10 13E37M52A-70 20 13P31M47-32 31 13E37M52A-58 45 13 14E37M52T-36 0 14P31M48-46 3 14E37M52A-68 6 14E37M52A-99 7 14E40M52A-31 9 14E36M52T-26 18 14E37M52A-79 29 14E37M52T-44 33 14P31M49-30 34 14P31M48-18 35 14E37M52G-3 49 14P31M50-38 54 14
Figuur 6 Tulp, Cantate 1iP31M47-5 0 1xE36M52T-8 1 1iE40M52A-29 4 1xE37M52T-15 1xE40M52A-14 7 1xP31M50-34 9 1xP31M50-35 12 1xE37M52A-11 20 M02seq1-3 30 1xE37M52G-28 37 1iE36M52G-32 1xE37M52G-6 47 1xP31M49-10 1xE37M52T-46 48 1 2xE36M52G-11 0 2iP31M47-19 27 2xP31M48-6 30 2xE37M52T-13 2xE36M52G-33 31 2xE36M52T-9 33 2xE36M52G-10 46 2iP31M47-3 47 2xE37M52T-34 52 2xE40M52A-17 72 2iE40M52A-13 2xE37M52T-52 2xP31M48-21 2xP31M54-10 2xP31M54-15 75 2iP31M48-20 76 2xP31M47-10 84 2 3xE37M52A-30 3xP31M54-30 0 3xP31M48-37 8 3xP31M48-3 16 3xE36M52T-4 20 3xE37M52A-66 31 3iE37M52A-35B 33 3xE37M52A-63 35 3xP31M48-23 37 3xE37M52A-86 3xE40M52A-25 40 3xP31M50-11 58 3xE37M52A-36 77 3 4xE36M52G-19 4xP31M49-28 4xE37M52G-29 0 4xP31M48-12 4 4xP31M49-4 7 4xP31M47-7 14 4xE35M52T-20 4xE37M52A-16 23 4iP31M47-11 42 4xE37M52A-83 50 4xP31M54-21 63 4xP31M48-13 66 4xP31M48-49 70 4xP31M49-16 75 4iE37M52T-19 87 4xE37M52A-85 88 4xP31M50-36 90 4iP31M47-31 91 4iE36M52T-20 92 4xE35M52T-18 96 4iE37M52T-18 106 4xP31M54-56 117 4xE40M52A-12 140 4 4axE36M52G-22 0 4axE36M52G-12 22 4axP31M49-19 23 4aiE37M52T-19 4axE37M52G-20 27 4axP31M54-18 29 4axE35M52T-12 32 4aiE36M52T-20 34 4aiP31M47-31 37 4axP31M47-13 46 4a 4bxP31M54-16 0 4bxE37M52T-28 12 4bxE37M52A-97 13 4bxE36M52G-55 27 4bxE36M52T-33 32 4bxP31M54-47 45 4 4cxP31M47-8 0 4cxP31M49-17 3 4cxE37M52G-5 6 4cxE37M52A-17 7 4cxE37M52A-54 10 4c 5xP31M47-30 0 5xE36M52G-44 1 5xP31M48-47 5xE37M52T-63 5xE37M52A-93 2 5xE36M52G-46 3 5xE37M52A-3C 4 5xE40M52A-5 20 5xE40M52A-39 22 5xE36M52G-50 23 5xE37M52A-62 5xE37M52A-80 5xE36M52G-21 26 5xP31M54-29 31 5xP31M50-2 37 5iP31M54-8 59 5xP31M49-1 62 5xP31M48-25 5xP31M48-31 74 5xE37M52T-7 75 5 5axE35M52T-6 0 5axE37M52G-11 19 5axE37M52T-33 5axP31M48-43 5axP31M48-44 24 5aiP31M48-7 34 5axE40M52A-44 40 5axE37M52A-49 48 5aiP31M48-8 54 5axP31M48-28 58 5axE37M52A-88 65 5axP31M47-36 5axP31M54-33 67 5axE37M52T-39 68 5axE37M52A-45 72 5axP31M47-37 5axE37M52G-26 80 5a 6xE40M52A-18 0 6xP31M47-27 1 6xE37M52T-23 2 6xE37M52G-23 4 6xE36M52G-5 6 6iE35M52T-9 17 6xP31M49-24 6xP31M47-33 40 6xE37M52A-20 45 6xE40M52A-8 56 6xE37M52T-41 58 6xE37M52A-7 68 6iE37M52A-87B 71 6xE35M52T-3 77 6xE37M52A-92 78 6xE37M52A-53 81 6 7xE37M52G-16 0 7xE36M52G-49 6 7xE37M52A-42 20 7xE36M52G-7 24 7xE37M52A-90 25 7xE37M52A-69 29 7 8xE40M52A-15 0 8xE37M52T-27 8xE37M52T-37 3 8iE37M52A-76B 8xP31M47-40 8xE37M52A-47 6 8xP31M54-50 7 8xE37M52A-91 11 8xP31M54-3 17 8xE37M52T-32 33 8xE37M52A-71 35 8xE37M52A-14 38 8xP31M50-33 42 8xP31M54-28 49 8xE36M52T-29 63 8xP31M47-1 82 8 9tbvbloem 0 9xE37M52G-7 23 9xE36M52G-48 25 9xE37M52T-53 9xE36M52T-7 9xP31M48-54 9xP31M54-35 9xP31M54-2 26 9xP31M50-1 27 9xP31M54-1 30 9xE36M52G-29 9xE36M52G-42 32 9xP31M48-5 40 9xP31M47-24 43 9xP31M54-45 53 9 10xE37M52A-15 0 10iE37M52A-26B 3 10iE37M52A-61B 9 10xE37M52A-19 10xE37M52A-41 10 10iE37M52A-6B 18 10xP31M54-49 20 10xP31M47-15 27 10xE40M52A-37 36 10 11xE36M52G-13 0 11xE37M52A-34 3 11xE36M52T-10 11xE37M52A-65 8 11xE37M52A-25 9 11xE37M52A-103 10 11xP31M54-36 29 11xE37M52A-77 32 11 12xE37M52T-56 12xE36M52G-34 0 12iP31M54-9 4 12xP31M50-23 12xP31M50-42 7 12xP31M54-55 14 12xP31M54-37 18 12xP31M49-14 26 12xE36M52T-2 44 12xE40M52A-48 54 12xE37M52T-60 70 12xE40M52A-22 73 12xE37M52T-9 75 12xE37M52A-95 86 12
Figuur 7 Lelie, Orlito 1 aE02Seq 1-15 0.0 1 aP31M51 -3 1 20.7 1 aiP 31M 51-28 25.6 1 aE40M52 T-2 1 29.6 1 aP31M54 -2 0 30.5 1 aE40M52 T-1 0 31.3 1 aP31M51 -3 0 31.5 1 aiE 37M 52A-10 35.9 1 aE37M52 G-34 40.1 1 aP31M55 -1 1 41.0 1 aE37M52 G-26 42.2 1 aE40M52 A-28 49.8 1 aiE 37M 52T-19 52.4 1 aE37M52 T-4 9 53.6 1 aE37M52 G-16 55.3 1 aE37M52 A-22 59.6 1 aiE 41M 52A-16 62.1 1 aiE 37M 52T-47 66.6 1 aE37M52 G-1 1aP 31M5 4-18 80.6 1 aP31M54 -2 3 84.8 1 aiE 37M 52A-34 94.2 1 aP31M49 -6 103.4 1 aE41M52 A-38 117.7 1a 1 biP31M 51-2 0 .0 1 biE37M 52G-38 9 .4 1 biE01seq1 -1 9 15 .2 1 bP3 1M47 -1 0 20 .5 1 biP31M 51-25 24 .2 1 biE40M 52A-5 29 .1 1 biP31M 52-15 31 .2 1 biE37M 52G-13 40 .1 1 biP31M 49-9 52 .6 1 biP31M 51-13 54 .8 1 bE4 0M52 A-31 61 .1 1 bE4 1M52 A-28 63 .3 1 bE0 1Seq 1-25 70 .1 1b 2P31 M59 -3 6 0.0 2P31 M47 -1 1 2.6 2iP31M5 4-28 6.9 2iP31M5 9-22 1 3.9 2E02 Seq 1-2 1 8.6 2iP31M4 7-7 2 2.0 2E41 M52 A-12 2 8.3 2P31 M49 -3 1 3 9.1 2E37 M52 A-20 4 3.5 2iE41M5 2A-7 4 8.6 2P31 M54 -5 5 5.1 2P31 M52 -2 0 5 7.9 2iP31M4 9-27 6 0.1 2E37 M52 A-26 6 0.7 2E37 M52 A-37 6 1.4 2E37 M52 T-5 6 2.1 2E01 Seq 1-18 6 3.0 2iP31M4 7-25 6 5.8 2iP31M4 7-18 6 6.8 2iE41M5 2A-20 7 2.2 2iE41M5 2A-3 8 0.9 2E37 M52 G-25 8 5.8 2E37 M52 T-3 9 8 8.2 2iE37M5 2T-32 9 2.8 2E37 M52 T-5 4 9 3.0 2E37 M52 A-16 9 3.6 2E41 M52 A-4 10 1.1 2 3P31M4 9-13 0.0 3iE41M 52A-30 3.3 3iE40M 52T-7 3.8 3iP31M 49-20 5.2 3iP31M 49-8 6.3 3E40M5 2T-17 17.3 3E37M5 2A-6 27.4 3iP31M 55-1 32.3 3iE01seq 1-31 34.6 3iE41M 52A-11 38.1 3E01S eq1-10 46.1 3E01S eq1-14 47.4 3P31M4 9-1 52.8 3P31M5 0-7 59.7 3E37M5 2T-58 63.4 3iE37M 52T-45 64.1 3P31M4 7-22 84.4 3 4P01seq1 -6 0. 0 4iP31 M52 -1 3 0. 9 4iP31 M52 -8 7. 8 4E37M 52T-42 13. 6 4iE37 M52 A-19 15. 5 4iP31 M52 -1 9 16. 0 4E37M 52G-28 21. 0 4iP31 M54 -2 1 25. 3 4E37M 52A-1 8 28. 8 4P31M 55-20 29. 7 4iP31 M47 -2 1 31. 6 4iE40 M52 T-1 4 33. 9 4E37M 52T-28 35. 8 4iE01 se q1-27 37. 5 4E37M 52A-1 54. 7 4iE37 M52 A-14 56. 4 4E40M 52A-2 2 58. 7 4P01seq1 -2 3 86. 0 4 5P3 1M51 -3 6 0.0 5iP31M 51-24 16.5 5E4 0M52 A-4 18.8 5E4 0M52 A-3 25.0 5iE41M 52A -3 2 27.8 5E4 0M52 T-31 40.1 5iE37M 52T-43 47.3 5P0 1seq1-25 50.4 5iP31M 50-8 53.1 5iP31M 50-3 54.5 5P3 1M50 -1 3 55.0 5iE41M 52A -1 7 55.7 5iP31M 50-5 63.2 5P3 1M50 -4 67.6 5E4 0M52 T-32 78.2 5P3 1M51 -8 98.1 5P3 1M59 -4 1 04.3 5 6 iE4 0M52T-15 0 .0 6 iP3 1M47-13 5 .0 6 E37M 52T-55 18 .8 6 iE3 7M52T-35 19 .1 6 E37M 52A-32 27 .5 6 E41M 52A-24 37 .1 6 E37M 52A-42 49 .1 6 iE4 1M52A-1 54 .0 6 iE4 0M52T-4 86 .0 6 P31M 55-16 91 .0 6 iE3 7M52A-39 91 .7 6 E41M 52A-10 95 .7 6 iE0 1seq1-12 100 .9 6 7E4 0M52 A-21 0.0 7E3 7M52 A-7 6.2 7E4 0M52 T-24 19.6 7E3 7M52 A-23 33.5
7E3 7M52 G-3 7 7iE37 M52A-44 40.0 7E3 7M52 G-1 5 42.4 7iE 37M 52T-57 44.9 7E3 7M52 T-63 45.0 7P3 1M49 -2 1 48.3 7P3 1M48 -2 0 67.4 7 8E37M 52T-9 0. 0 8E01S eq1-20 6. 5 8iE37 M52 G-18 11. 1 8P31M 59-27 13. 5 8E01S eq1-6 25. 6 8P31M 59-23 44. 9 8iP31 M48 -9 49. 7 8iP31 M48 -1 2 52. 8 8iE37 M52 T-3 8 54. 3 8E40M 52T-18 57. 1 8 9iP31M 51-39 0.0 9iE37M 52G-9 5.3 9P31M4 7-27 6.8 9iE40M 52T-6 9.5 9iP31M 51-1 11.7 9P31M5 1-20 17.8 9E41M5 2A-8 22.1 9P31M5 9-15 27.7 9E37M5 2G-3 5 33.2 9 1 0E3 7M52 G-2 0 .0 1 0P3 1M59 -10 20 .7 1 0E3 7M52 G-32 27 .1 1 0E3 7M52 G-14 32 .8 1 0P3 1M50 -11 51 .2 1 0P3 1M51 -11 61 .5 1 0P3 1M47 -16 63 .7 1 0E3 7M52 A-17 82 .4 1 0P0 1se q1-9 100 .6 10 11E02Seq1-6 0.0 11E37M 52T-2 17.7 11iP31 M49-1 7 20.6 11iP31 M59-1 1 22.1 11P31M 49-30 26.9 11E40M 52A -3 2 37.1 11E40M 52A -9 56.3 11iP31 M51-2 1 58.5 11iP31 M49-1 0 58.9 11P31M 54-3 67.6 11P31M 48-5 67.7 11E01Seq1-13 72.3 11 12 P01seq1-2 0.0 12 iP3 1M59 -3 5 17.9 12 E40M 52A-1 3 18.2 12 iE0 1seq1-22 18.6 12 iE3 7M52 G-1 0 19.7 12 iP3 1M52 -1 0 21.1 12 E41M 52A-3 6 25.8 12 P31M 54-1 43.1 12 13P31M50-1 0.0 13P31M59-16 14.2 13E40M52A-6 27.0 13E37M52A-2 28.5 13E40M52T-3 35.0 13E41M52A-37 40.9 13E40M52A-10 71.6 13P31M48-2 80.7 13P31M49-15 81.8 13 14iP31M47-20 0.0 14E41M52A-29 1.6 14E01Seq1-5 6.9 14E40M52T-28 8.0 14iP31M48-4 11.0 14iE37M52A-9 16.6 14E37M52T-34 35.5 14 15iE37M52G-19 0.0 15E41M52A-21 5.3 15iP31M51-15 14.8 15iP31M47-15 31.4 15iP31M52-21 33.4 15iE01seq1-3 34.7 15iE37M52A-35 41.1 15 16iE01seq1-7 0.0 16iE40M52T-1 2.4 16iP31M52-11 4.0 16P31M52-6 11.8 16P31M52-17 13.0 16P31M51-19 24.0 16P31M49-4 45.7 16 17iE37M52A-31 0.0 17iE40M52T-5 1.3 17iE40M52A-18 2.3 17iP31M59-17 3.4 17iP31M55-21 4.5 17iP31M59-28 5.7 17 18iP31M51-3 0.0 18E41M52A-2 8.5 18iP31M49-39 12.2 18E37M52T-20 12.5 18E37M52A-45 18.4 18P01seq1-22 37.2 18 19P31M55-2 0.0 19iE40M52T-11 5.6 19iP31M50-14 6.2 19iP31M55-18 16.8 19E37M52A-24 26.6 19 20iP31M49-3 0.0 20iE01seq1-28 5.9 20iE37M52A-27 9.0 20iE37M52G-33 10.8 20 21E37M52T-1 0.0 21E37M52G-20 11.5 21P31M54-22 24.5 21E37M52G-27 46.9 21E40M52T-22 48.1 21 22E37M52A-30 0.0 22E01Seq1-23 8.5 22E01Seq1-4 11.6 22P31M49-25 14.8 22P31M54-7 18.0 22
Figuur 8 Lelie, Connecticut King 1E40M52T-16 0.0 1iP31M54-9 0.9 1P31M48-3 14.7 1iE37M52A-39 17.0 1E41M52A-35 18.6 1E41M52A-33 26.3 1E40M52A-27 26.9 iE40M52A-5 36.0 1iP31M52-15 38.6 1E37M52T-21 49.2 1P31M51-26 55.8 1E02Seq1-13 59.3 1iE37M52G-13 62.8 1P31M51-17 68.1 1P31M54-16 70.1 1iP31M49-9 71.3 1iP31M51-13 76.3 1E37M52T-50 76.5 1E41M52A-6 79.0 1iE37M52T-62 81.5 1P31M50-10 87.0 1iP31M54-25 97.1 1P31M59-44 101.6 1P31M50-6 106.4 1iP31M59-2 110.7 1 2E37M52T-12 0.0 2E01Seq1-2 2E01Seq1-2 5.2 2E01Seq1-1 2E01Seq1-1 10.8 2E41M52A-34 2E41M52A-34 16.4 2E37M52G-11 2E37M52G-11 19.7 2iE41M52A-17 19.9 2iE41M52A-17 20.3 2P31M48-25 2P31M48-25 22.2 2iP31M50-3 2iP31M50-3 23.7 2P31M49-5 2P31M49-5 26.8 2iE37M52T-43 2iE37M52T-43 34.6 2iP31M50-8 46.6 2iE41M52A-32 57.7 2P31M52-9 67.7 2 3P01seq1-5 0.0 3P31M52-14 18.0 3E40M52T-26 22.0 3P31M54-13 27.3 3iE37M52T-26 27.6 3P31M49-22 28.3 3P31M51-22 34.7 3E37M52A-25 47.7 3iE37M52T-25 53.5 3E37M52A-29 72.3 3iE40M52T-25 80.5 3E40M52A-12 88.4 3iP31M49-39 90.8 3iP31M47-14 91.5 3iP31M51-1 98.7 3iE40M52T-12 103.7 3iE40M52T-6 107.2 3iE01seq1-29 108.8 3iE37M52G-9 117.0 3iP31M51-39 121.6 3 4P31M49-18 0.0 4E37M52A-12 4.8 4iP31M48-8 7.4 4iP31M47-17 13.0 4P31M49-28 22.5 4E40M52A-7 32.0 4iP31M49-41 32.4 4iP31M50-14 33.4 4E37M52A-43 4iE40M52T-11 34.3 4E37M52G-42 36.1 4E40M52T-2 42.0 4iP31M48-24 53.7 4iP31M55-18 56.9 4P31M49-11 59.1 4 5iP31M54-21 0.0 5P31M55-19 1.3 5iE01seq1-27 9.8 5iE40M52T-14 13.5 5E37M52T-15 14.4 5iP31M47-21 21.2 5E37M52T-52 32.9 5iP31M52-19 35.1 5iP31M52-8 49.1 5P31M52-12 67.3 5iP31M52-13 67.5 5P31M59-21 76.7 5P31M48-10 83.4 5P31M51-27 91.6 5E37M52G-7 102.0 5 6P31M59-1 0.0 6P31M59-26 2.4 6P31M51-16 3.0 6P31M55-3 8.9 6iP31M51-38 12.0 6iE37M52A-10 6iE37M52G-29 13.3 6iP31M49-33 16.7 6E37M52G-39 23.1 6E37M52G-5 24.2 6iP31M51-28 39.5 6P31M52-18 45.6 6P31M52-16 49.9 6iP31M49-16 59.9 6P31M55-22 62.2 6 7E37M52A-15 0.0 7P31M47-6 8.4 7E40M52A-30 22.5 7iP31M52-21 26.9 7iE37M52A-9 27.7 7iE01seq1-3 30.0 7iP31M47-15 32.7 7iE02seq1-7 37.1 7iP31M48-4 39.0 7iE37M52A-35 43.3 7E37M52T-53 48.6 7iP31M47-20 57.9 7iP31M51-15 60.2 7 8iE37M52T-57 0.0 8P31M59-30 16.7 8iP31M59-32 17.6 8P31M59-14 25.9 8iE37M52A-44 39.7 8iP31M55-8 48.3 8E41M52A-13 52.3 8iE01seq1-32 53.3 8E37M52T-27 57.3 8P31M49-35 61.1 8iP31M55-9 62.7 8E37M52T-14 73.2 8P31M55-7 90.8 8 9iE37M52A-31 0.0 9iE40M52T-5 2.0 9iE37M52T-10 2.3 9P31M48-14 3.4 9iE40M52A-18 3.9 9iP31M59-17 5.6 9E41M52A-9 6.5 9iP31M55-21 7.3 9iP31M59-28 9.3 9TULIPBREAKV 18.2 9 10E37M52A-5 0.0 10iE01seq1-7 34.0 10iP31M52-11 36.7 10E01Seq1-26 37.1 10iE40M52T-1 39.3 10E40M52A-29 42.5 10P31M48-19 49.3 10P01seq1-7 78.6 10P31M51-6 104.4 10E37M52A-33 122.3 10iP31M54-26 122.4 10iE37M52T-35 163.4 10 11iP31M49-20 0.0 11iP31M49-8 1.3 11iE37M52T-6 11E41M52A-27 3.3 11iE40M52T-7 3.7 11iE41M52A-30 4.3 11E37M52T-37 22.6 11P31M59-19 26.9 11E37M52A-21 35.1 11 12E40M52T-8 0.0 12P31M55-5 10.2 12P31M47-2 16.0 12E40M52A-14 18.2 12E37M52A-38 20.4 12P31M47-26 24.5 12iP31M51-4 28.5 12P31M50-2 31.3 12E40M52A-11 37.6 12 13iE37M52T-32 0.0 13iE41M52A-3 21.9 13iE37M52A-11 22.7 13iP31M52-2 26.9 13P31M55-12 29.0 13iP31M47-23 32.7 13P31M48-23 34.5 13E37M52G-21 42.5 13iE41M52A-1 48.6 13 14E40M52T-20 0.0 14iE37M52T-22 2.9 14E37M52A-36 3.1 14iE41M52A-20 4.4 14iP31M47-25 14.2 14E01Seq1-17 14.5 14iP31M47-19 15.8 14iP31M49-27 26.2 14 15P31M59-24 0.0 15P01seq1-26 14.4 15E41M52A-5 23.0 15P31M59-8 47.2 15P31M51-9 60.1 15P31M51-29 73.1 15P31M59-29 91.5 15 16iE37M52T-17 16aiE37M52T-17 0.0 16E01Seq1-8 5.0 16iE41M52A-11 6.8 16iE01seq1-31 13.7 16P31M59-42 15.0 16iP31M55-1 19.7 16 17E02Seq1-9 0.0 17iE02seq1-8 4.6 17P31M54-15 15.3 17P31M54-6 29.9 17E37M52G-4 50.9 17P31M47-3 65.4 17iP31M49-37 88.9 17 18E02Seq1-4 0.0 18iE40M52A-19 5.3 18E41M52A-23 11.9 18E40M52A-24 12.1 18E41M52A-15 18.5 18iP31M49-24 20.7 18 19P31M54-14 0.0 19E37M52T-16 31.7 19iP31M54-11 34.8 19E37M52T-8 35.7 19iP31M55-14 36.2 19P01seq1-15 52.4 19 20iE01seq1-22 0.0 20E01Seq1-11 0.4 20iE37M52G-10 1.6 20E01Seq1-24 3.6 20E01Seq1-9 4.7 20iP31M52-10 6.3 20 21P31M59-5 0.0 21iP31M59-37 2.3 21P31M49-2 20.0 21P31M48-7 30.8 21P31M59-3 34.8 21 22iP31M49-3 0.0 22iE01seq1-28 22iE01seq1-28 11.3 22iE37M52A-27 16.8 22iE37M52G-33 19.9 22 23iE01seq1-19 0.0 23iE40M52T-15 8.4 23iE37M52G-38 11.6 23iP31M47-13 23.3 23iP31M51-2 32.5 23 24E41M52A-25 0.0 24iP31M55-17 4.4 24P31M55-13 4.9 24P31M55-10 6.0 24E40M52T-29 18.4 24
