Lessen voor de XXIste eeuw
De
De
triomf
triomf
van
van
het
het
embryo
embryo
Leuven, 28 februari 2005
danny.huylebroeck@med.kuleuven.ac.be
Lab. Moleculaire Biologie, Dept. Moleculaire Celbiologie, Fac. Geneeskunde
Dept. Ontwikkelingsbiologie, Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie
1. De XXIste eeuw is ...
2. Embryologie: principes, historiek,
modeldieren en moleculaire spelers
3. Voorbeelden: de kliniek nabij
4. Over klonen en stamcellen: principes en
regelgeving
5. Tenslotte: over [extra] armen en benen,
[extra] vingers en tenen, en over [extra]
ogen
De XXIste eeuw is die van de biologie
De biologie is al 30 jaar een moleculaire wetenschap
recombinant DNA technologie
eiwitbiochemie
De XXIste eeuw is die van de biologie
De biologie
is al 30 jaar een moleculaire wetenschap
… neemt in impact snel toe
Genoomsequenties
Mens dichter bij worm dan gedacht
Twee concurrerende groepen onderzoekers hebben gisteren de erfelijke code van de mens bekend
gemaakt. Mensen hebben maar 30.000 tot 40.000 genen, veel minder dan werd gedacht.
De XXIste eeuw is die van de biologie
De biologie
is al 30 jaar een moleculaire wetenschap
… neemt in impact snel toe
Genoomsequenties
Eiwitidentificatie
Imaging
De XXIste eeuw is die van de biologie
De biologie
is al 30 jaar een moleculaire wetenschap
… neemt in impact snel toe
… is multi-disciplinair en integreert deelgebieden
Celbiologie
Genetica
Biochemie
Recombinant DNA technologie
Biotechnologie
De XXIste eeuw is die van de biologie
De biologie
is al 30 jaar een moleculaire wetenschap
… neemt in impact snel toe
… is multi-disciplinair en integreert deelgebieden
… bestudeert de functie(s) van genen en eiwitten in
de cel, in de wisselwerking tussen cellen in weefsels,
en in het ganse dier
functional genomics
… onderzoek dat zich toespitst op de wijze waarop genen, RNA, eiwitten of metabolieten samenwerken in het functioneren van cellen, weefsels,
organen en het ganse dier, door middel van karakterisatie van genen en eiwitten op grote schaal
De XXIste eeuw is die van de biologie
De biologie
is al 30 jaar een moleculaire wetenschap
… neemt in impact snel toe
… is multi-disciplinair en integreert deelgebieden
… bestudeert de functie(s) van genen en eiwitten in
de cel, in de wisselwerking tussen cellen in weefsels,
en in het ganse dier
… bestudeert gezond vs. ziek vs. herstellend weefsel
in vitro fertilisatie
diagnostiek van erfelijke ziekten en afwijkingen
herstel van orgaanbeschadiging
De XXIste eeuw is die van de biologie
De biologie is al 30 jaar een moleculaire wetenschap
… neemt in impact snel toe
… is multi-disciplinair en integreert deelgebieden
… bestudeert de functie(s) van genen en eiwitten in
de cel, in de wisselwerking tussen cellen in weefsels,
en in het ganse dier
… bestudeert gezond vs. ziek vs. herstellend weefsel
→
Het embryo biedt voor de hoge eis van integratie van al
deze activiteiten en kennis een uitstekend studie-object
← bevruchte eicel
← vroeg meercellig embryo
← eerste celspecialisatie
← foetus
embryologie
modeldieren
(Ontleend aan Rosa Beddington, London)
2-cel
64-cel
late blastula late neurula
tailbud (dorsaal)
tailbud (lateraal)
eicel
basisprincipes
?
?
Triturus taeniatus
Celkernen van het zeer vroege embryo zijn alle identiek
?
Cellen in het
kikkerembryo verliezen
progressief hun breed
ontwikkelingspotentieel
en hun lot wordt ook
stapsgewijs vastgelegd ;
het vroegste voorbeeld
hiervan vindt men rond
het moment van de
gastrulatie
“It is not birth, marriage,
retirement, or death, but
gastrulation, which is
truly the important event
in your life” (Lewis Wolpert)
*
*
Celdeling
Patroonvorming
Morfogenese
Celdifferentiatie
Groei (organisme)
Deze vijf processen zijn
noch onafhankelijk van elkaar
noch strikt sequentieel !
*
*
Triturus
vroege gastrula
vroege gastrula vroege gastrulavroege gastrula
Op zoek naar
cruciale, sturende
celgroepen
duplicated tadpole
plane of section
section
Hoe komt zo een “Organizer” tot stand?
Hoe oefent die celgroep zijn activiteit uit
op de omgevende cellen?
De vragen in de embryologie zijn dan:
- wat zijn deze pijlen? En hun remmers?
- hoe herkennen de cellen deze pijlen en hoe worden de signalen
verwerkt? Hoe reageren de cellen?
- is hun reactie definitief? Of slechts een tussenstap naar het
verwerven van een nieuw lot? Of is er zelfs een weg terug?
- wat gaat er mis als één pijl of de verwerking ervan helemaal
(knockout)
of gedeeltelijk
(knockdown)wordt uitgeschakeld of de
pijl/verwerking meer subtiel
(knockin)wordt gewijzigd?
- worden deze pijlen en hun verwerking ook hergebruikt bij
latere processen, zowel in het embryo als in het adulte dier?
- is er iets mis met deze pijlen en hun verwerking bij chronische
ziekte, zoals kanker, of bij aangeboren afwijkingen bij de mens?
activin, een groei- en differentiatiefactor
van de TGFβ familie
1996: inductie van de meest anterieure
hoofdstructuren kunnen ectopisch bekomen
worden door injectie van RNA dat codeert
voor
cerberus*
in vegetaal-ventrale cellen van
het 32-cel embryo. Deze nieuwe kop is
samengesteld uit de geïnjecteerde cellen
maar ook uit niet-geïnjecteerde, naburige
cellen
*Cerberus is een remmer van Nodal, Bmp en Wnt
FGFs (20)
Receptor tyr kinases (4)
Inductie van spinal cord
Signaal van AER in limb
Groei van ICM (muis)
TGFβs
Receptor ser/thr kinases
Mesoderminductie in
Xen.
Patroonvorming van meso
DV patroon neurale buis
L-R asymmetrie
Neurale inductie
Chondro/skeletogenese
Hhs
Patched / smoothened
Positiesignaal limb/NT
L-R asymmetrie
Wnts
Frizzled, …
D-V as specificatie
Xen.
Chondro/skeletogenese
Gewrichten
Delta/Serrate Notch
Zenuwstelsel
signaaltransductie
Groeifactoren, en de eiwitten die hun signaal vangen of overbrengen, doen hun intrede; deze spelers liggen ook dikwijls aan de basis van kanker
binnen één familie een breed spectrum aan
activiteiten maar ook celtype-specifieke activiteiten
betrokken in inducties, patroonvorming en
morfogenese in embryo’s, maar ook in ziekte*
effecten op celniveau op
celproliferatie en -differentiatie
celoverleving en geprogrammeerde celdood
celmigratie
cel-cel and cel-substraat interactie
celvorm (inbegrepen EMT)
Kanker is een uit de hand gelopen embryogenese
proces
Embryogenese is een uniek, strikt gecontroleerd
kankerproces
Bij herstellen van beschadigde weefsels wordt
Deel 3
Knockouts in de muis
Voorbeeld: studies van het hart
heart field specification (cardiogenic mesoderm) migration to the ventral midline
heart tube formation onset of contraction
molecular chamber definition
morphological chamber definition looping
valve formation
atrial septation (not in fish)
adult configuration Olson & Schneider (2003),
Wegnemen van de antenne voor BMPs in alle hartspiercellen
op een “laat” stadium van hartmorfogenese in de muis
-
αMHC-Cre
+αMHC-Cre
-
αMHC-Cre
+αMHC-Cre
RA RV LA LV EC RA RV LV LA OT
c,d: at the level of the outflow tract (E11.5) e-h: at the level of the AV cushion (EC)
De BMP – TGFβ connectie in het zoogdierhart:
hoe hartspiercellen praten
met kussencellen die hartkleppen vormen
septation septation / / trabeculation
trabeculation valve valve morphogenesismorphogenesis
X X
X
X
X
BMPs, oorspronkelijk geϊdentificeerd als inducers van
Wegnemen van de antenne voor BMP in hartspiercellen van
het AV kanaal op een “laat” stadium van hartmorfogenese
E11.5
P7
P56
ventral view dorsal view
E11.5
E11.5
E11.5
E14.5
MF20
βgal
Histology of mice (3 mo) with AV canal targeted deletion of
Alk3
LV
RV
TriVa MiVa MiVa TriVaIVS
RV
RA
RA
IVS
morphological anomalies in the tricuspid
and mitral valves
control littermates (null/flox)
downward displacement of a specific
leaflet of the tricuspid valve
knockouts
Alk3 is required for tricuspid valve delamination (E15.5) and periostin
expression in the developing AV valves (E14.5)
Layer of cardiac myocytes underlying the smooth atrial
surface of the tricuspid valve (attached to papillary muscle)
decreased expression
in both AV valves
MHC
Hem
periostin mRNA
Hoechst
LV
RV
RA
LA
LA
RA
RV
LV
LV
RV
LA
RA
*
*
-/F
-/F
-/F
KO
KO
KO
pm
pm
pm
Probleem op dat moment:
De [muis]embryoloog moet nu ook
nog een [muis]dokter worden, liefst
in een [muis]kliniek
Surface ECG from 6-months old mice
High-resolution optical mapping with the voltage sensitive dye
Di-4-ANEPPS in isolated Langendorff perfused hearts
- /F
KO
short PR interval and increased duration of the QRS complex- /F
KO
-/flox controls showed a mature apex-to-base ventricular activation pattern
In hearts with abnormal surface ECG, a base-to-apex activation pattern was observed, with evidence of a posterior paraseptal bypass tract
Mutant mice display
AV valve defects (longer
leaflets; downward
displacement of tricuspid
leaflet)
conduction abnormalities, i.e.
an AV bypass tract resulting
from the disruption of the
annulus fibrosus
a pre-excitation syndrome
compatible with
Wolff-Parkinson-White syndrome
►
ALK3 signaling is essential in
the embryonic AV canal for
its proper morphogenesis and
the subsequent coordinated
development of functional
valves and the conduction
system
►
compatible with the clinical
syndrome of
Ebstein’s anomaly
(1864)
1 in 20,000 live births; males
and females equally affected
bit less than 1% of all cases
of congenital heart disease
40% of congenital formations
of the tricuspid valve, often
accompanied by defects in the
mitral valve and the AV
conduction system; few
single-gene etiologies known in this
case
gdf8 (myostatin) knockout muis
Piebaldismwordt gekenmerkt door steriliteit, anemie en ondergepigmenteerde regio’s van huid en haar, samen met defectieve ontwikkeling van darmneuronen en het oor. Dit wordt veroorzaakt door een mutatie in het c-KIT gen. Het hierdoor gecodeerde eiwit is essentieel voor de proliferatie en migratie van neurale lijst cellen, kiemcelprecursors en bloedcelprecursors;
Mowat-Wilson syndroom
(ziekte van Hirschsprung – Mentale retardatie syndroom)
• characteristic facial features • microencephaly
• aganglionic megacolon (68%)
• congenital heart disease • mental retardation
• epilepsy (82%)
• delayed motor development
• agenesis of the corpus callosum (35%) • postnatal growth retardation
SIP1/ZFHX1B :
knockout muismodel verklaart pathologie
SIP1
∆ex7fl→
EIIA-
Cre
: the neural crest and neural plate phenotype
vagal neural crest
specification of neuroectoderm
Embryomodellen helpen dus aangeboren
afwijkingen en ziektes verklaren
Deel 4
embryonale stamcellen?
en/of
adulte stamcellen?
Research on embryos older than fourteen days (or when the
"primitive streak“ has appeared, if earlier) is prohibited. Research [with stem cells] may not be undertaken except under a
licence...
Under Schedule 2 to the Act such a licence may not be granted
unless the Authority is satisfied that any proposed use of
embryos is necessary for the purposes of the research… and
cannot authorize any activity unless it appears to the Authority to be necessary or desirable for the purposes of:
(a) promoting advances in the treatment of infertility, (b) increasing knowledge about the causes of congenital disease,
(c) increasing knowledge about the causes of miscarriages, (d) developing more effective techniques for contraception, (e) developing methods for detecting the presence of gene or chromosome abnormalities in embryos before implantation, or for such other purposes as may be specified in regulations“ The Regulations added three new purposes to the five in the Act:
(a) increasing knowledge about the development of embryos, (b) increasing knowledge about serious disease, or
(c) enabling any such knowledge to be applied in developing treatments for serious disease
Therapeutisch klonen als middel om
afstoting tegen te gaan
Deel 5
Tenslotte: over armen en benen,
vingers en tenen, en over ogen
En ook: over extra armen/benen,
extra vingers/tenen en over extra
ogen !
Extremiteiten ontstaan elk uit een knop die zich vormt,
en verder groeit, in de flank van het embryo
Triviaal, maar terzelfdertijd
fascinerend
1. Maak de knop op de juiste plaats;
2. Zorg ervoor dat het lot van de cellen
De regulatieve ontwikkeling van het limb veld, geïllustreerd door een
experiment van de natuur zelf. De “multi-limb” kikker Hyla regilla is het resultaat van een infectie van de tadpole stadium limb bud door cysten van parasieten.
Signalisatiecentra in de
knop zelf
Cellen “lezen hun positie”:
positionele informatie kan gebruikt worden om
een enorme
vari
vari
ë
ë
teit aan patronen te genereren
teit aan patronen
FGF8 mRNA in de AER (kip). (A) limb bud begint te vormen, (B) in de AER zelf, (C) 3d embryo, in AER van vleugel en poot, plus enkele andere plaatsen.
FGF10 expressie in de ontwikkelende kippenvleugel. FGF10 expressie wordt aangehouden in het LPM precies op de plaatsen waar de limbs zullen vormen.
Tbx5
Sonic hedgehog
expressie in ZPA
Defecten in de interpretatie van de “vingersignalen”
Deletie van beenderen door deletie van Hox paralogen.
(A) wild-type voorpoot, (B) Hoxa11-/-, Hoxd11-/- knockout muizen, (C) HOXD13 homozygote mutatie in de mens, (D) 5’ paralogen van Hox genen specifiëren welbepaalde regio’s van de [voor]extremiteit.
Pax6, Eyeless
met heel veel dank aan …
maart 2004
