Wortelrot van de pinus caribaea Morelet : voortgezet onderzoek naar de etiologie, epidemiologie en ecologie van de ziekte

Landbouwhogeschool-Wageningen

CENTRUM VOOR LANDBOUWKUNDIG ONDERZOEK IN SURINAME

WORTELROT VAN PINUS CARIBAEA MORELET (onderzoekprojekt no. 69/1)

VOORTGEZET ONDERZOEK NAAR DE ETIOLOGIE, EPIDEMIOLOGIE EN ECOLOGIE. VAN DE ZIEKTE

A, de Jager

Verslag van een onderzoek verricht onder leiding van Dr. Th. Limonard

februari 1971

1. Samenvatting, . . . 5 2. Voorwoord 5 3. Inleiding . . . 6 4. Etiologie 7 4.1* Inleiding 7 4.2* Nieuwe isolaties . . . . , . . ; . . . . 8 4.3. Beschrijving van de geïsoleerde

. schimmel , , . . . « . * . 10

4.3*1. Makroskopisch 10 • 4.3.2* Mikroskopisch • 11

4.4. Beschrijving van het ziektebeeld . . . . 11 4.4.1. Makroskopisch . . . 11

• 4.4.2, Mikroskopisch . 11 4.5. Zoeken naar de generatieve fase. * . . , 15

4.5.1. Fruktifikatieproef. . . . 16 . 4.5.2, Isolaties uit vruchtlichamen. , , 16

4.6. Inokulaties. . . • 16 4.6.1, Kontrole vroegere inokulaties . * 16

4*6,1.1. Jonge Pinusplanten , , * 16 . . 4.6.1,2, Oudere bomen te Troeli , 17

4.6.2, Nieuwe inokulaties, . . . 17 4.6.2.1, Inokulaties van oudere '

bomen, 17 4.6.2.2, Inokulatie van jonge

Pinusplanten , 19 5. Epidemiologie . . . 19

5.1* I n l e i d i n g , . . . 19

5.2« Opname der proefperken . . . 20

5 , 3 , Verwerking van de gegevens , 20

6. Ecologie . . . . 28

6,1» Inleiding, 28 6.2, Abiotische faktoren. 28

Biz. 6.2.1, Temperatuur » 30 6.2.2, Vocht .' 32 6.2.3, Benlate 32 6.3* Biotische faktoren 33 6.3.1. Antagonisme . . . 33 6.3.2. Mycorrhiza . . . 34 7. Bespreking . . . » 35 8. Literatuur . . . 36

1. SAMENVATTING

Door VAN DER HOEVEN (1969) werd een oriënterend onder-zoek verricht naar de etiologie, epidemiologie en ecologie van een wortelrot van Pinus caribaea in Suriname. De

schrijver zette dit onderzoek voort gedurende de periode april- oktober 1970. Hierbij werden de resultaten van VAN DEE HOEVEN (1969) nader bevestigd en aangevuld met een aantal nieuwe gegevens.

Bij het maken van nieuwe isolaties van de reeds eerder geïsoleerde Pinuswortelrotschimmel, die als het vermoede-lijke pathogeen wordt beschouwd, kon ditmaal gebruik worden gemaakt van een goed selektief medium (moutagar 50 ppm

benlate). De Pinuswortelrotschimmel bleek namelijk hoge koncentraties vanndit fungicide goed te kunnen verdragen in tegenstelling tot Trichoderma spp.fdie voordien veel

moeilijkheden veroorzaakten. Isolaties uit in het bos ge-vonden vruchtlichamen leverden opnieuw geen identieke schimmelkolonies. Daar ook de pogingen om de schimmel in reinkultuur tot fruktifikatie te brengen tot nu toe faalden kan de schimmel nog steeds niet nader worden geïdentifi-ceerd.

Van ziek wortelmateriaal werden coupes gemaakt die aantoonden dat het mycelium vooral in de bast groeit. De schimmel kan de celwand doorboren en zo in de cel groeien.

Beschreven werden verder enkele nieuwgeziene struk-turen, zoals hyfezwellingen, en knop en kluwenvormingen. Van de geïnokuleerde bomen vertoonde nog geen enkele de

typische symptomen. Nieuwe inokulaties werden uitgevoerd. In de epidemiologische proefperken werden de zesde, zevende en achtste opname verricht. Het bleek d&t de uit-breidingssnelheid van de ziekte in de periode tussen de vierde en de achtste opname beduidend minder was geweest dan die tussen de eerste en vierde opname. De bomen die waren gestorven tussen de eerste en de achtste opname van de proefperken en die ten tijde van de eerste opname nog volledig gezond waren, bleken gemiddeld binnen acht maan-den gestorven te zijn.

De optimumtemperatuur voor de groei van de schimmel op moutagar ligt dicht bij de 30°C, de minimumtemperatuur waarbij nog groei optreedt ligt bij 10°C. Bij 35°C vindt nog enige, bij 40°C nauwelijks meer groei .plaats.

De resultaten van de eerdere proeven, waaruit een

grote gevoeligheid voor antagonisme bleek,werden bevestigd. Uit proeven waarin de nadruk gelegd werd op groei door niet

steriele grond, bleek wel enige uitgroei, doch alleen in grond arm aan mikrob'rganismen. De Pinuswortelrotschimmel bleek goed tegen uitdroging te kunnen.

2. VOORWOORD

Dit rapport betreft een onderzoek naar Pinuswortelrot in Suriname. Het werd voor een deel uitgevoerd aan het

Centrum voor Landbouwkundig Onderzoek in Suriname en voor een deel in de Pinuskultures van 's Lands Bosbeheer door A. de Jager, student in de bosbouw aan de Landbouwhogeschool

6

-Wageningen, ter vervulling van zijn praktijktijd van april-oktober 1970. Het onderzoek stond onder leiding van

Dr. Th. Limonard vanuit het Laboratorium voor Fytopathologie te Wageningen.

3. INLEIDING

Onderzoek dat ten doel heeft een organisme aan te tonen dat verantwoordelijk is voor een bepaalde ziekte, blijkt soms zeer langdurig te zijn. Zo wordt al tientallen jaren gezocht naar de oorzaak van floè'emnekrose van koffie, doch men kan nog niet meer dan een vermoeden uitspreken dat men

te doen heeft met een flagellaat (VERMEULEN, 1968). Het kan daarom nodig zijn bepaalde proeven steeds weer opnieuw te doen in de hoop op een uiteindelijk resultaat. Om deze reden zullen in het nu volgende verslag enkele proeven

vermeld worden die al eerder uitgevoerd en beschreven zijn. Ook het feit dat in eerder onderzoek een aantal proeven

afgebroken werden, is oorzaak dat deze opnieuw aangezet moesten worden.

In het nu volgende worden duidelijkheidshalve kort enkele feiten aangestipt, die ook van der HOEVEN in zijn inleiding geeft.

Een vijftiental jaren geleden werd in Suriname een begin gemaakt met de aanplant van een tropische houtsoort die hier niet van nature voorkomt, nl, Pinus caribaea

Morelet. Hiervan worden drie variëteiten onderscheiden, hondurensis, bahamensis, en caribaea, waarvan vooral de eerste aangeplant wordt. Het natuurlijke verspreidings-gebied ligt tussen de 12e en de 26e breedtegraad. Tot •

op heden werd + 7000 ha aangeplant met momenteel als be-langrijkste produktiedoel zaaghout. De pulpindustrie Weyerhauessr overweegt de aanplant van ongeveer 100.000 ha in samenwerking met de Surinaamse regering. Deze enorme schaalvergroting maakt uiteraard ook een goede verpleging veel belangrijker.

Naast een naaldziekte en een ziekte v/aarbij gehele takken en boomtoppen afsterven komt in deze Pinusopstanden vooral een ziekte voor gekenmerkt door rot van het

wortelstelsel. Dit laatste wordt sinds 1961 waargenomen onder verschillende omstandigheden en op verschillende plaatsen,zoals Powakka, Coesewijne, Blakawatra en vooral Zanderij.

Deze wortelrotziekte is voor zover bekend tot nu to6 nog niet waargenomen binnen het natuurlijke verspreidings-gebied van Pinus caribaea (ETHERIDGE, 1968). Voor het op-treden ervan kunnen twee mogelijke faktoren aangewezen worden die wellicht samen de predispositie van de bomen bepalen. In de eerste plaats kan Pinus caribaea als exoot gekonfronteerd worden met een nieuw pathogeen waar de soort geen duidelijke resistentie tegen bezit, en in de tweede plaats is het mogelijk dat de omstandigheden buiten het natuurlijke verspreidingsgebied niet optimaal zijn en de konditie van de boom zo verzwakken dat een zwakteparasiet die wellicht ook in het natuurlijke verspreidingsgebied voorkomt nu de kans krijgt tot aantasting.

Tijdens eerder onderzoek werd uit bomen met de

typische ziekte symptomen vaak een basidiomyceet geïsoleerd, die in zijn beschrijving veel gelijkenis vertoont met een isolaat afkomstig uit Trinidad (PAWSEY, 1970) en een

isolaat uit Brazilië" (CARDOZO MAY in PAWSEY, 1970). Verder werd de ziekte waargenomen in Frans Guyana (VAN DER HOEVEN) en Jamaica (PAWSEY, 1970). Het isolaat van PAWSEY behoorde volgens Nobles waarschijnlijk tot het rigidoporus complex van de familie van de Polyporaceae. Daar het vruchtlichaam nog onbekend is, is-verdere determinatie onmogelijk. Het vermoeden bestaat dat de Pwr-schimmel (=Pinuswortelrot-schimmel) aanwezig is in de oorspronkelijke vegetatie doch hij is hier nog niet aangetroffen.

Het onderzoek is gesplitst in een etiologisch, een epidemiologisch en een ecologisch deel. Etiologie is de leer van de ziekteoorzaken, de epidemiologie bestudeert het verloop van de ziekte, terwijl de ecologie de milieu-faktoren bestudeert die van invloed zijn op de ontwikke-ling van het pathogeen.

4. ETIOLOGIE 4.1. INLEIDING

Als we aannemen dat de ziekteverwekker met redelijke zekerheid aangewezen is, wordt het belangrijk om de ver-deling ervan na te gaan zowel binnen een aangetaste boom, als in de gehele aangetaste opstand. Verder is de eventuele aanwezigheid van deze schimmel in dode dan wel levende bomen uit de oorspronkelijke begroeiing van belang. Voor het optreden van het pathogeen zijn namelijk twee ver-klaringen mogelijk:

1, De schimmel kont van nature in de inheemse vegetatie voor.

2, De schimmel is ingevoerd met materiaal van Pinus caribaea.

Als (l) waar is, dan moet het mogelijk zijn uit andere

plantesoorten isolaten te verkrijgen van het vermoedelijke pathogeen.

Om het isoleren te vergemakkelijken werd gebruik ge-maakt van een nieuw selectief medium met het fungicide benlate,

Een makroskopische beschrijving van de schimmel in reinkultuur en van het 'aantastingsbeeld vond reeds plaats. Nu een mikrotoom beschikbaar was, werd het ook mogelijk coupes te maken van aangetast materiaal.

Omdat men voor de identifikatie van basidiomyceten noodzakelijkerwijs over vruchtlichamen moet beschikken, werden in vroeger onderzoek pogingen ondernomen om de

Pwr-schimmel tot fruktifikatie te brengen. Deze pogingen werden voortgezet.

8

-4.2. NIEUWE ISOLATIES

Isolaten werden verkregen uit de wortelschros, diep uit het wortelhout, uit levende wortels die nog harsten, uit recent afgestorven wortels en uit half vergane wortels«

Bij het maken van isolaties van de Pwr-schimmel kon gebruik worden gemaakt van een nieuw selektief medium. Dit bestond uit moutagar met 50 ppm benlate. De Pwr-schimmel bleek namelijk zeer hoge koncentraties van dit fungicide te tolereren, terwijl Trichoderma spp. reeds bij 5 ppm niet meer uitgroeien (BOLLEN & FUCHS, 1970). Het waren juist deze Trichoderma spp. die bij het isoleren de grootste moeilijkheden veroorzaakten en uitgroeien van de

Pwr-schimmel op andere media verhinderden (zie 6.2.3.). Per schaal werden ongeveer vijf stukjes hout uitge-legd, indien mogelijk in de vorm van dunne houtsplinters

(GRANT, 1964). Per isolatieplaats werden vijf tot tien schalen gebruikt. Het verzamelde materiaal werd altijd eerst afgespoeld en vervolgens na drogen afgenomen met alkohol 96$. Met geflambeerd mes en pincet werd de

bovenste laag weggesneden, waarna uit het blootgelegde hout vezels werden losgeprepareerd en uitgelegd. Soms werden ook deze nog behandeld hetzij met alkohol hetzij met Na-hypochloriet. Alle bomen op één na waaruit

geïsoleerd werd, bevonden zich in of rond .een haard in vak 12 van de houtvesterij Zanderij. De ene uitzondering betrof een afgestorven exemplaar in vak 24 te Blakawatra, De konklusie dat de Pwr-schimmel aanwezig was, werd pas getrokken, nadat de meest typische kultuurkenmerken ver-schenen waren, n.1, de crème-bruine korstvorming, en de bruine verkleuringszone op moutagar met tannine (VAN DER HOEVEN, 1969).

De Pwr-schimmel kon uitsluitend uit zieke Pinus-wortels worden geïsoleerd. Hierop was één. uitzondering; dit betrof een isolatie uit de wortel van een bospapaja; welke wortel tegen een Pinuswortel was aangegroeid die aangetast was. Weliswaar werd geïsoleerd uit levend weefsel (callus), doch vanwege de zeer dichte nabijheid van de aangetaste Pinuswortel verliest dit gegeven aan betekenis.

Uit bijna alle onderzochte Pinusbomen werd de Pwr-schimmel verkregen. Hierbij waren naast dode en zieke ook nabij ziektehaarden groeiende, uiterlijk nog gezonde bomen. Slechts isolaties uit wortels die er gezond uit-zagen leverden geen sukses op.

Behalve uit Pinusbomen werd ook geprobeerd isolaties te maken uit wortels en stamdelen van dode en levende

bomen uit de oorspronkelijke vegetatie. Tevens werd schim-melmateriaal uit de omgevind van aangetaste wortels van P.

caribaea uitgelegd. Het betrof hier vooral rhizomorfen, welk soms in grote massa voorkwamen, en rottende resten van de vroegere vegetatie. In geen enkel geval werd de Pwr-schimmel geïsoleerd.

Kontakt van Pinuswortels met dode wortels van de vroegere vegetatie werd een enkele maal waargenomen.

Tabel 1. Lijst van Pinusbomen waaruit getracht werd de Pwr-schimmel te isoleren (no. 1 te Blakawatra, nos. 2-9 te Zanderij) No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Lokatie v.d. boom haard in vak 24 aan de rand v.e. haard in vak 12 als 2 naast 3 in haard in vak 12 tussen tv/e e dode bomen als 2 naast 6 naast 7 als 2

Toestand v.d. boom (symptomen) bovengronds: dood

ondergronds: dood

bovengronds: top lichtgeel, stambasis harst ondergronds: wortelhals harsend mycelium

over wortels, uiteinden der wortels dood

bovengronds: onderin de kroon verbruinend ondergronds: myceliumgroei over wortels bovengronds: geen symptomen

ondergronds: " " bovengronds: kroon geelbruin

ondergronds: wortelhals verrot, worteIs harsend en overdekt met mycelium

bovengronds: dood ondergronds: vermolmd

bovengronds: geelbruine kroon

ondergronds: veel mycelium op de wortels bovengronds: geen symptomen

ondergronds: " " bovengronds: geen symptomen

ondergronds: wortels sterk harsend,enige myceliumgroei op wortels Resultaat v isolatie + + + — + + + -+

10

-Tabel 2. Lijst van bomen van de oorspronkelijke vegetatie te Zanderij, waaruit isolaten verricht werden No. 1. 2.

3.

4.

.• Lokatie v.d. boom i

j

naast boom no. 9 in tabel 1

naast boom no. 5 in tabel 1 in een haard in vak 12 in een haard in vak 12 Toestand v.d. boom bospapaja, gezond dood dood, rottend vlinderbloemige boom, gezond Resultaat v.d. isolatie +

-4.3. BESCHRIJVING VAN DE GEISOLEERDE SCHIMMEL 4.3.1. Makroskopisch

Voor een beschrijving van de geïsoleerde schimmel in reinkultuur, op moutagar, wordt verwezen naar VAN DER HOEVEN (1969). Toegepast werd toen ook de Bavendamm toets, waarbij de schimmel geè'nt wordt op een medium, dat tannine of galluszuur bevat. Een bruine diffusiezone duidt op de aanwezigheid van laccase, een extracellulair enzym. Dit is een belangrijke eigenschap, en wel zó* belangrijk, dat dit al een van de eerste keuzemogelijkheden is in de determi-natietabel van NOBLES (1965). Aanwezigheid van dit enzym is gekorreleerd met witrot, afwezigheid ervan met bruinrot. NOBLES (1965) vond dat men met behulp van een alcoholische oplossing van guaiac hars (0,5 gram in 30

aanwezigheid ervan ook heel eenvoudig kan Hierbij wordt een druppel op het mycelium

laccase aanwezig is treedt blauwkleuring op. Voor de Pwr-schimmel viel deze toets steeds positief uit. De tijd nodig voor een diepe blauwe verkleuring van de gehele plek die in kontakt was met de oplossing, bedroeg gemiddeld over 25 waarnemingen + 40 sekonden.

ml 95?S Et OH) de vaststellen, gelegd. Indien

4.3.2. Mikroskopisch

Zoals ook in NOBLES» beschrijving voorkomt (PAWSEY, I97O) vertoont het mycelium bijna geen gespen. Naast de andere, reeds bij eerder onderzoek beschreven strukturen, werden nog een drietal kenmerken gevonden:

1, hyfezwellingen of "hyphal swellings". Deze bevinden zich bijna altijd aan de top van een hyfe, in de

groeizone. Soms echter wordt een dergelijke struktuur ook in ouder mycelium of midden in een hyfe gevonden. De inhoud kleurt duidelijk met katoenblauw. Zie figuur 1.

2» kluwens. Na enkele weken vormen zich kluwenachtige strukturen (begin van pseudoparenchymvorming?); zie figuur 2.

3. knopvorming. Eveneens in ouder mycelium kan men altijd aan hyfen uit de pseudoparenchymatische laag in grote hoeveelheden uitstulpingen waarnemen. Zie figuur 3.

4.4. BESCHRIJVING VAN HET ZIEKTEBEELD 4.4.1. Makroskopisch

Als samenvatting van wat al eerder hierover geschreven is, kan worden opgemerkt dat een aantal ondergrondse

symptomen tenslotte hun uitdrukking vinden in een vrij egale verkleuring van de kroon, van groen via geel naar bruin, resulterend in de dood van de boom.

Deze ondergrondse symptomen zijn, vermoedelijk achtereenvolgens myceliumgroei over en in de wortel

(vooral schors), harsen van de wortel, verkleuring van de bast tot rozerood, harsen van de stamvoet en afsterving van de wortel. De afsterving van de wortel begint meestal op vele meters van de wortelhals, ddär waar het wortel-kontakt met buren mogelijk wordt. In één. geval werd een dood exemplaar aangetroffen, waarvan de wortels doorgerot waren aan de wortelhals. Verder van de boom zagen sommige wortels er nog gezond uit (boom 5 in tabel 1 ) ,

4.4.2. Mikroskopisch

Ter bestudering van de schimmel, groeiend in het hout, werden stukjes uit PinusworteIs'gesneden op plaatsen waar de Pwr-schimmel geïsoleerd werd. Met behulp van een

mikrotoom werden van deze stukjes coupes gemaakt, zowel dwars, radiaal als tangentiaal. De dikte der coupes kon gevarieerd worden van 10 tot 2 5 mu.

- Y?

Methode (volgens SASS, 1951)

De kubusvormige houtblokjes met ribben van drie tot vier mm, worden eerst een dag ter fixatie weggezet in een; PAPA-oplossing, in kleine flesjes met een inhoud van

ongeveer 3 ml.

PAPA is een mengsel bestaande uit een viertal komponenten. Bij een volume van 100 ml is de samenstelling als volgt: 95$ alkohol 50 ml, propionzuur 5 ml, formaline 10 ml, water 35 ml. In dit mengsel worden de blokjes ontlucht in een exsiccator, Vervolgens worden de blokjes door een reeks oplossingen gevoerd, waarbij het water en tenslotte ook de alkohol geleidelijk vervangen wordt door tertiaire butylalkohol

(TBA). De blokjes komen dus uiteindelijk terecht in zuivere TBA, een goed oplosmiddel voor paraffine.

De blokjes in TBA worden nu overgebracht in tablet-buizen, afgesloten door een kurk. Nu wordt voldoende paraffine toegevoegd om in gesmolten toestand de hout-blokjes geheel te omgeven. Deze lost op in de TBA en

penetreert zo de cellen van het hout. Nadat dit proces zich voltrokken heeft, wordt in de stoof bij 65°C, de kurk van het buisje verwijderd zodat alle TBA vrij kan verdampen, waarna de paraffine overblijft met het hout. De blokjes worden daarna overgebracht in een stollingsbakje met vloeibare paraffine, met de te snijden zijde boven, en na vorming van een stollingsvliesje ondergedompeld in water. De paraffine stolt nu snel, krimpt, en komt boven drijven.

Hierna worden trapeziumvormige blokjes uit de paraf-fine gesneden. Het grote benedenvlak wordt vastgesmelten aan een snijtafeltje dat in de juiste snijpositie t.o.v. het mes gebracht wordt. Na het snijden worden de coupes in twee rijen uitgelegd op objektglazen, welke tevoren ingesmeerd zijn met een weinig eiwitglycerine. Vervolgens worden deze objektglazen op een strekplaat gelegd met een temperatuur van 45°C. Aan de coupes wordt druppelsgewijs water toegevoegd waarna deze zich strekken. De coupes worden daarna twee dagen te drogen gelegd in een stoof bij 45°C.

Kleuring

Voorafgaande aan de kleuring werden de objektglazen in kleuringsbakjes met xyleen geplaatst, zodat de paraffine oplost. In totaal werden vier kleuringen geprobeerd. Deze zijn alle gericht op een tegenkleuring van mycelium t.o.v. lignine en cellulose. De kleuringen zijn (zie GURR, 1965): 1. safranine-fast green

2. safranine-anilineblauw 3. safranine-katoenblauw 4. picro-anilineblauw.

Pig. 1. Hyfezwellingen ("hyphal swellings")

-

14

/

I

Pig. 3, Uitstulpingen aan hyfen uit de pseudoparen-chymatische laag

»1

Pig. 4. Intracellulair groeiende hyfen van de Pwr-schlmmel in Pinushout

Ook werd gepoogd het mycelium met enkelvoudige kleuringen zichtbaar te maken, namelijk met katoenblauw en anilineblauw. Bij het kleuren deden zich met de tangen-tiale en radiale coupes grote moeilijkheden voor, doordat vele coupes afspoelden. Na veel proberen werd gevonden, dat overvloedig water toedienen tijdens de strekking en zeer voorzichtig spoelen ("doorvoeren") het afspoelen gedeel-telijk kunnen tegengaan. Behalve dwarscoupes spoelen

dunnere radiale en tangentiale coupes minder snel af daar ze beter strekken en minder krimpverschijnselen

(kromtrekken) vertonen; 10 of 15 mu is hier de aanbevolen dikte.

Resultaten

In geen enkel geval werd een duidelijke tegenkleuring van het mycelium bereikt. In alle gevallen werden de hyfen o'ók rood gekleurd door de safranine, onverschillig de duur van de tegenkleuring. Wel was dit rood iets lichter dan van het cellulose, maar er was geen blauwkleuring. Bij de

enkelvoudige kleuringen me t katoenblauw en anilineblauw werd naast het mycelium ook het houtmateriaal blauwgekleurd zodat ook hier geen duidelijk onderscheid optrad.

Opvallend was dat hoofdzakelijk de tangentiale coupes mycelium vertoonden. Evenals bij de radiale en soms bij de dwarscoupes bevond dit mycelium zich hoofdzakelijk in de bast. Dwarscoupes gaven zelden mycelium te zien; het beste voldeed hier een dikte van 2 5 mu. Ook in de

tracheïden van het hout werden hyfen aangetroffen, doch meestal dicht bij de bast. De hyfen zijn meer gedrongen

dan in reinkultuur. Ze groeien duidelijk intracellulair (fig. 4») en versmallen daar waar de celwand doorboord wordt. De dikte van het mycelium bedraagt gemiddeld 3,9 mu; daar waar een hyfe de celwand penetreert is zijn dikte gemiddeld de helft hiervan*

4.5. ZOEKEN NAAR DE GENERATIEVE FASE

Voor determinatie is bijna steeds de generatieve fase nodig. Twee wegen kunnen leiden tot identifikatie van het vruchtlichaam:

1. induceren van de vorming van vruchtlichamen in rein-kultuur

2. isolaties uit vruchtlichamen bij voorkeur op terreinen waar de Pwr-schimmel voorkomt.

_ 16 _

4.5.1. Fruktifikatie proef

Deze proef werd opgezet volgens de methode van

TAMBLYN & DA COSTA (1958) a l s beschreven door VAÏÏ DER

HOEVEN ( I 9 6 9 ) . Ondanks algemene v e r o n t r e i n i g i n g van de

kolven met v e r r i j k t z a a g s e l door Trichoderma, waardoor

v e e l t i j d v e r l o r e n g i n g , kon de proef toch nog v r i j

v o l l e d i g u i t g e v o e r d worden. Ten t i j d e van mijn v e r t r e k

u i t Suriname (7 weken nadat de houtblokken doorgroeid waren

met de Pwr-schimmel) hadden z i c h nog geen vruchtlichamen

gevormd.

4.5.2. Isolaties uit vruchtlichamen

Uitgaande van de v e r o n d e r s t e l l i n g , dat we h i e r t e

maken hebben met een s o o r t behorend t o t de f a m i l i e der

P o l y p o r a c e a e , werden u i t s l u i t e n d i s o l a t i e s v e r r i c h t u i t

s o o r t e n behorend t o t die f a m i l i e . Van een d e r t i g t a l

schimmels werden i s o l a t e n v e r k r e g e n , waarvan s l e c h t s één.

(Polyporus c i n n a b a r i n a ) een mycelium b e z a t , dat v e e l op

dat van de Pwr-schimmel l e e k . Het onderscheidde z i c h

daarvan e c h t e r door de s n e l l e r e g r o e i , door de r e g e l m a t i g e

aanwezigheid van gespen en door pfgmentering. Sommige

vruchtlichamen w a a r u i t g e ï s o l e e r d werd kwamen ook op dode

Pinus bomen voor. Dit was o . a . h e t geval met P . c i n n a b a r i n a .

4 . 6 . INOKULATIES

4 . 6 . 1 , Kontrole vroegere i n o k u l a t i e s

I n o k u l a t i e s waren r e e d s v e r r i c h t zowel aan kiemplanten

a l s aan oudere bomen. De geïnoculeerde jonge boompjes

bevonden z i c h op h e t CELOS-terrein. De bomen welke behandeld

waren bevinden z i c h te T r o e l i , een v e r l a t e n kwekerij van

' s Lands Bosbeheer.

4 . 6 . 1 . 1 . Jo^ge_P2nus_jlaüten

Bij schoonspoelen van het w o r t e l s t e l s e l van door VAN

DER HOEVEN (1969) met z i e k w o r t e l m a t e r i a a l geïnokuleerde

p l a n t e n , bleek z i c h v o o r a l op de hoofdwortels een wit

mycelium te bevinden, i n sommige g e v a l l e n over de k l e i n e r e

v e r t a k k i n g e n s p r e i d e n d . Op sommige p l a a t s e n h a r s t e n de

w o r t e l s . Deze schimmel werd g e ï s o l e e r d en bleek een

basidiomyceet t e z i j n , doch n i e t de Pwr-schimmel.

W a a r s c h i j n l i j k b e t r e f t h e t h i e r Telephora t e r r e s t r i s ,

waarvan vruchtlichamen gevonden waren op h e t inokulum.

Het mycelium op de w o r t e l s s l o o t ook aan b i j de i n o k u l a .

Zie v e r d e r 6 . 3 . 2 ,

4.6.1,2. 2uÉË£S._Ë22îê.^_ÎË._ï™Ë.li

Inokulaties waren verricht met drie soorten inokulum,

ni. verrijkt zaagsel, schaafkrullen en houtblokken. Het zaagsel werd gebracht in boorgaten; de beide andere typen werden tegen de wortel gelegd en overdekt met plastiek onder zo steriel mogelijke omstandigheden.

Tijdens drie kontroles in de loop van zes maanden, mei t/m oktober, werd geen enkele geïnokuleerde boom

aan-getroffen, welke voor wortelrot typische symptomen ver-toonde. Wel was er tijdens de laatste kontröle (medio oktober) een drietal bomen dat er verdacht uitzag. Twee maakten een iets vergelende indruk, één vertoonde onderin

de kroon enkele afgestorven takken.

Bij bomen welke geïnokuleerd waren met houtblokken was duidelijk myceliumgroei vanuit de blokken over de wortels waar te nemen, al ging deze groei nog niet verder dan e nice Ie centimeters. Vanwege allerlei onvoorziene

omstandigheden is het niet tot isolatiepogingen uit wortels van geïnokuleerde bomen gekomen.

4.6.2. Nieuwe inokulaties

Nieuwe i n o k u l a t i e s werden v e r r i c h t zowel aan oudere

bomen a l s aan jonge p l a n t e n van Pinus c a r i b a e a , ook weer

r e s p . te T r o e l i en op h e t CELOS-terrein.

4 , 6 , 2 . 1 , l£9.kula^ie s_aan_ou^ere_bom£n

Te T r o e l i werden i n t o t a a l nog 16 bomen g e ï n o k u l e e r d ,

n l . 6 bomen door middel van doorgroeide houtblokken op 26

a u g u s t u s , en 10 bomen met doorgroeid v e r r i j k t z a a g s e l i n

boorgaten op 15 o k t o b e r ,

I n o k u l a t i e _ 2 6 _ a u g u s t u s

x

_ d

i

m

i

v

i

_ h o u t b l o k k e n

De g e b r u i k t e houtblokken waren 18 mei geë'nt met de

Pwr-schimmel, en t e n t i j d e van gebruik goed d o o r g r o e i d .

De houtblokken waren verkregen door van levende

Pinustakken met een diameter van 4-6 cm ongeveer 6 cm lange

segmenten te zagen. Overlangs werd een s t r o o k afgesneden,

om met h e t a l d u s o n t s t a n e - min of meer p l a t t e - vlak een

b e t e r e a a n s l u i t i n g te v e r k r i j g e n op de te i n o k u l e r e n

w o r t e l . De houtblokken werden g e s t e r i l i s e e r d met

epoxypro-paan, i n p l a s t i e k zakken. Na een dag a f g e s l o t e n te hebben

g e s t a a n werden de zakken i n een s t e r i e l e k a s t o n t l u c h t .

Vervolgens werden de blokken overgebracht i n s t e r i e l e

jampotjes, welke 20 minuten b i j 120°C g e a u t o c l a v e e r d waren.

In de d e k s e l s ervan was een gat geboord, waarin vóór

a u t o c l a v e r e n een watteprop gedaan werd. Bij p o t t e n zonder

d e k s e l werd aluminiumfolie g e b r u i k t om de p o t t e n s t e r i e l

af te s l u i t e n , eveneens met een gat e r i n , a f g e s l o t e n door

een w a t t e p r o p . Aan de p o t t e n met houtblokken werd 10 ml

18

-De blokken werden geïnokuleerd met enkele ponsjes van een kuituur van de Pwr-schimmel op moutagar en vervolgens weggezet in een donkere kast. De temperatuur varieerde van

35°C overdag tot 270c 's nachts.

Na twee weken waren alle blokken overgroeid met de *

schimmel,behoudens enkele gevallen waarin verontreiniging optrad met o.a. Mucorales. Later werden deze bijna steeds

verdrongen door de Pwr-schimmel. Een Trichoderma veront-reiniging werd verdrongen door toevoegen van benlate. Steeds als het water verdampt was werd weer nieuw steriel water toegevoegd.

De inokulatie zelf geschiedde als volgt. Van de te inokuleren bomen werden de wortels, vooral de basis,

geheel rondom blootgelegd. Vervolgens werden deze wortels schoongeborsteld en bespoten met een oplossing van benlate, 50 ppm. De houtblokken werden tegen de wortel aangebonden en afgedekt met plastiek waarna het geheel weer omgeven' werd met zand dat doordrenkt werd met benlate oplossing, Kontrôles werden niet gemaakt.

ïG2^1iiaiiË._i5_oktober_dimiv_._zaagsel

Het verrijkte zaagsel (zie -VAN DER HOEVEN, 1969) waarmee geïnokuleerd werd was 25 augustus "geënt met de

Pwr-schimmel en uitstekend daarmee doorgroeid. In feite was het reeds 18 mei geënt, doch het bleek later geheel verdroogd, zodat opnieuw bevochtigen en autoclaveren nodig was.

Van de te inokuleren bomen werden worteldelen

blootgelegd, schoongeborsteld en afgenomen met alkohol. Met een houtboor werden gaten ter diepte van 3-4 cm en met een doorsnede van ongeveer 2 cm in de wortelhals

geboord. Met een geflambeerd lepeltje werd vervolgens het zaagsel overgebracht in het boorgat, dat tenslotte afge-dekt werd. Van vier bomen werden de boorgaten afgeafge-dekt met parafilm en vaseline. Bij zes bomen werden de boorgaten

afgesloten met de boorkrullen afkomstig uit dat gat, " doordrenkt met een 500 ppm benlate oplossing in water. Bij alle tien bomen werd de blootgelegde wortel afgedekt met zand, dat eveneens werd doordrenkt met benlate

oplossing. Van elke boom werden drie wortels

geïnokuleerd en indien minder wortels aanwezig waren werd ook de stambasis geïnokuleerd. Kontro'les werden niet gemaakt.

4 . 6 . 2 . 2 . Inokulaties_^an_kiera2lant8n

Van het LBB werden 200 jonge Pinus p l a n t j e s ontvangen

met een l e n g t e van 5 cm. Als inokulum werden h o u t b l o k j e s

t e r g r o o t t e van 3 x 1 x 1 cm g e b r u i k t . Deze b l o k j e s werden

op de zelfde wijze a l s beschreven i n 4 . 6 . 2 . 1 . geïnokuleerd

(24 a u g u s t u s ) . Het inokulum verkeerde t e n t i j d e van de

i n o k u l a t i e i n u i t s t e k e n d e s t a a t .

Vóór de i n o k u l a t i e werden de p l a n t e n mê't k l u i t o v e r

-gebracht i n m u l t i p o t p l a t e n , 24 p o t t e n per p l a a t , waarvan de

p o t t e n verlengd werden met g e p l a s t i f i c e e r d e kartonnen

b e k e r s , waar de bodem u i t verwijderd was. Hierdoor werd een

b e t e r e v/ortelontwikkeling gedurende de proef gewaarborgd.

Er werd op twee p l a a t s e n g e ï n o k u l e e r d , n a m e l i j k :

1 . de w o r t e l h a l s , met de b l o k j e s 3 x 1 x 1 cm;

2 . de s t e n g e l , met en zonder verwonding. Het inokulum werd

h i e r tegen de s t e n g e l gebonden, omgeven door een n a t t e

w a t t e p r o p , en omwikkeld met p l a s t i e k om u i t d r o g i n g te

voorkomen.

De i n o k u l a t i e s werden u i t g e v o e r d op 2 5 september

volgens h e t onderstaande schema:

ad 1 . : a) i n o k u l a t i e - 48 p o t t e n

b) k o n t r o l e - 24 p o t t e n

c) i n o k u l a t i e + b e n l a t e - 48 p o t t e n

d) k o n t r o l e + b e n l a t e - 24 p o t t e n

ad 2 , : a) i n o k u l a t i e zonder verwonding - 12 p o t t e n

b) k o n t r o l e - 12 p o t t e n

c) i n o k u l a t i e met verwonding - 12 p o t t e n

d) kontiv,le met verwonding - 12 p o t t e n

De b e n l a t e o p l o s s i n g werd b i j de e e r s t e s e r i e

twee-maal toegediend, n l . t e n t i j d e van de i n o k u l a t i e en een

week l a t e r , per p l a a t s t e e d s 50 ml van een suspensie van

20 ppm.

Vijf weken na de i n o k u l a t i e v/aren s l e c h t s twee

k o n t r o l e p l a n t j e s ( l b ) doodgegaan, a l l e andere p l a n t j e s

zagen e r nog gezond u i t .

5 . EPIDEMIOLOGIE

5 . 1 . INLEIDING

Teneinde een inzicht te krijgen in de snelheid en wijze van uitbreiding van het Pinus wortelrot, werden door LEMCKERT (1969) een vijftiental proef perken aangelegd. V/.IT DBB HOEVEN (1969) geeft hiervan een duidelijke beschrijving, Uit zijn gegevens blijkt reeds dat de ziekte zich

haard-vormig uitbreidt en dat kontakt van Pinuswortels onderling en met resten van de oorspronkelijke begroeiing voorkomt. Dit laatste ondersteunt de gedachte dat de wortelrotschim-mel afkomstig is uit de oorspronkelijke vegetatie en dus

- 20 _

Verder zij nog ongemerkt, dat omvangrijke haarden vooral gesitueerd zijn in oudere, d.w.z. 10-15 jarige opstanden, doch dat sterke aantasting en uitbreiding van de ziekte ook plaats kan vinden in jongere, zelfs twee-jarige opstanden (zie figuur 5 en 6 ) .

In een vak te Zanderij, waar zich thans een grote

haard bevindt, is destijds een ontginningswijze toegepast, waarbij grote bomen niet omgedozerd werden, doch slechts vergiftigd. Als gevolg hiervan bleef een aanzienlijke hoeveelheid organisch materiaal achter in de bodem. Het is mogelijk dat de wortels gekoloniseerd werden door de Pwr-schimmel waarna deze over kon gaan op "eraan voorbij" groeiende Pinuswortels, Wortel ver groeiingen van Pinusbomon onderling bieden dan mogelijkheden tot verder uitbreiding van de schimmel.

5.2. OPNAME DER PROEPPERKEN

De opname der proefperken geschieden ongeveer driemaandelijks. Gelet wordt hierbij slechts op de typische symptomen van de wortelrotziekte, te weten een vrij egale verkleuring der naalden, beginnend met licht-groen en via geel lopend naar bruin. Er worden vijf fasen

onderscheiden n.1. lichtgroen, geelgroen, geel, geelbruin en bruin (= dood). De afkortingen zijn achtereenvolgens LG, GG, G, GB en B. Verdwenen bomen worden aangegeven door een x. Een moeilijkheid vormt de subjektiviteit van de beoordeling, vooral ook omdat geen enkele boom helemaal egaal verkleurt. Terwijl het bovenste deel van de kroon al duidelijk geel is kan het onderste deel nog frisgroen zijn. De subjektiviteit wordt nog vergroot door het feit dat de opnamen steeds door een ander geschieden.

5.3. VERWEEKING VAN DE GEGEVENS

In een drietal tabellen zijn de gegevens uitgewerkt. In tabel 3 worden de resultaten per proefperk weergegeven voor alle acht tot op heden verrichte opnamen. Het beste beeld van de uitbreiding van de ziekte geeft de kolom

waarin het aantal dode bomen is vermeld. Het aantal.zieke bomen (d.w.z. de som der geelgroene, gele en geelbruine bomen) blijkt helaas sterk te variè'ren. Dit vindt zijn oorzaak in beoordelingsmoeilijkheden en wel vooral bij •de categorie geelgroen. Toch valt er een duidelijke

uitbreiding van de ziekte te konstateren als we de totaal-cijfers bezien (tabel 4 ) . In tabel 5 is weergegeven het aantal dode en zieke bomen als percentage van het tijdens de eerste opname aanwezige aantal. Het aantal gestorven bomen over 1 3/4 jaar bedraagt 56 of wel 2,94 fc van het

W A

©

0

Â

A

 ^^a m

A

Â

A

©

A

©

A

A A

^ f ^ ^

FIGUUR 5 :'proef perk 1. situatie in dec. 1968

verklaring der tekens in figuur 1 en 2 ;

o geelgroen o geelbruin 4 dood door onbekende

22

-©

WÊŒf

A

A

*

A

A

©

©

©

©

© ©

A © ©

© © ©

• A

3

© ©

© 0 3

A ©

A

A ®

© ©

©

^jgjj ^ ^

©

©

© 3

©

©

©

A A

A

FIGUUR 6 : proefperk 1. situatie in sept. 1970

(L*£sndô! ai« figuur 5)

1 m CM l ci CD CD ft «H CD O H ft CD ci CÖ > ci CD

Ü

Cl ft O 0 0 CD - P 03 fH CD CD CD T3 ci cö i> Ci CD - P CÖ - P H 3 ra CD rt • f^O r H CD ^ 2 CÖ EH •H S CD ^ CD Ö i 3 cd J4 o a o Ci CO ° M Ci ft ^ ^ -P CD O . CD T f a l bon i

erst

e

s

doo

d

'va

n

d

e

aa

k

n

i

geste

l

e

n

• P CD T f 5 N + " Ö d CD J3 H M H CÖ CD CD 2 O CÖ O CÖ.-Ö !4 ^ . O > & 10 1 o o T5 + CD • H ISJ _ . CÖ + CD C Ö • H N + CÖ CÖ y-^. " s 3 • H CÖ - P ÉH CD ft c CD H H cö ei -tf O O PI PP CÖ CÖ CÖ CÖ CÖ CÖ cö i-q CD S CÖ ei ft o ._. CD H g CÖ a - p ei 3 Ö 0) ci cd S CÖ o ^ . Q t CD - P CD ft CD - Ü « H X ! Ci CD CÖ O CÖ U c i - p ft CD co i C O C O C - O H C M H C T l r - l CM CM CM o - | r O — H H H H CM m r T 3 - «3-LT\ f - C — CO CT» 1 1 1 H O CM r*-)"3-H I r i N r*-)"3-H O O O -^••^d-CMCM r o m O c û H H H H CM CM CTiVO CTiOO E — C T > ^ r o H C M C M C M i n ' ^ t - r O P n H CM r o ^ - m v o C*-CO - - - •-• s-~* CO H i r -VH-' H ^ O ^ - s J - r o v û LPiU3 1 CM H H M I H H H <">o f**) r»") <"»") LTvm 1 H 1 .-1 M i l 1 H I | | | | | 1 1 H H 1 <M 1 H CM r O L T M T M > - ^ o | ,_) H T - CM ro«^-LTNVO [--CO - - — ,—., H CM "**• CM \\0 • CMCX)U5C— V O O - * ^ H LT» LT» *3- rr)KQ | | H r l r l r o r o ^ t ^ ^ -1 -1 CM -1 -1 H -1 -1 1 H H H 1 1 1 | H -3-CM r o n - i m | | r~\ rt r-{ H i-i (SI H C M n ^ L n ^ O [--CO o CM

1

,crv. •--•' <~r)'=t<OKOKOKû m a H H CM CM CM H 1 cr —— ' CM «"O "«i" "St" r t f - L f M T \ i n i 1 1 1 1 1 1 1 1 H I 1 | | | | H 1 CM CM CM H 1 rv) ^ ^ • I X M U3 CM | "=f H H CM i—1CM r ^ t i n v o t - c o — '-^ OO H

aanta l bome n di e bi j d e eerst e op -nam e reed s doo d zie k + doo d + CD Ü S • H N + e> CÏJ •H T 5 cd - p CQ CD ft E! CD H H cô - p cl 05 cd T J o o Pi e i ca CÖ e i C5 t-3 CD a 03 ft o u CD r-a c a + Ei C C J*J 54-CD + ft Q CD O H £ ft a 3 > Ö 1 CD ö o 3 CD D T * 3 Ei 05 o5 3 - p 0 CQ ware n e n waarva n d& -doodsoorzaa k nie t mee r vastgestel d ko n worde n O O r o C"- CM c\J r o i r \ H H C M C M r l H H H LT.MD MOOOOO CTiCTiCTi 1 1 1 1 1 1 1 H H H C M rOCM 1 l 1 <3- rv~) t r \ MD CM r ^ ^ J - L T N H H C O L r \ r o o O M D C " - L r > f O ^ ^ t - ^ H H CM H CM oO^t-LTNUD C—CO C— LT\CO CM (ÓV; v • LPvC— H ^ C M O O O J H H H W r i «3"«3- L f N O C--*3- -=tf-«sf-H -=tf-«sf-H H H C M r o LT. MD MD CO 1 1 1 1 1 H r O H H CM H H H 1 1 H PO CM •"* CTiMD f - | H CM H MD CO r O U ) MD CM C— H H H H H CM H C M r O ^ ü T N M D C-OO H MD O CM ( H ) C—CO r O Lf\ CM C — O CO H H H H H H ( - O r v - i f ^ L P i r O r O r O " ^ 1 H C M 1 1 1 rr> | H 1 H C M H 1 1 1 r O « = t C— COCO *d" s f ^ OiCO O CTi CM r O ^ C -H CM CM CM CM CM H CM CO "<*• LP» MD C—CO C— t - c o CM 'MD", CM CM r o r O r O L T i ^ t ' 1 1 H 1 1 CM H CM CM CM o n m r o r o -1 -1 H I -1 H -1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 H H 1 1 1 CM 1 m ^ i -H C M rv~)<=d-ir\MDD—C MD 0 0 H

f - • -•<3Û H O > t> « PO H CD , Q eu EH q • H (i) ai g H r Û fH ro' M O -p & U ' S ö <" - , •H S CÖ-H ö T^CÖ > Ö O d M .M Ö f t c Ö J s J ( C V a) o cö cö ti - . - ' S 5 -K5 H o a ) N ( D ^3-P £ în +3 ffl CO ö ra H H O CD cöa) c! a <^0 P CD CD r ö P ö ÎH o ra CÖCD CÖ O rö CO-Ö £ r ö f> o o T f + • ^ CD • H N m ci» + ^ i C Ü CD • H -!-N CÜ e» ^ I'S 1 o s • H cö P ca CD ft Ö CD H H cö - p Ö rö ; o m ÜJ CÜ t i -cö h-1 PO PO PO PO *3-V£> UD LT\ H l 1 1 M d 1 CM r n r n r o ^ - m m i n H 1 1 1 1 1 1 1 i i i i i i ; i 1 1 1 1 1 H H 1 H H P O P O C M CM 1 H J CÖ ft o 5H CD H S cö S -P £ Ö S | CÖ O CD - P CD ft © T * H - 3 El 0>* • cö o cö S Ö - P ft CD _ra H CM o o ^ - L P i ^ l > - 0 0 ^ H CTiCM J

'

r

y

L A U ) V O U } U D V £ > U D < 0 CM POCM 1 1 1 | | <-*")rO'<tf-c£>U)C£)ix>isO 1 H C M 1 1 1 I | CM H 1 | I | | | 1 H 1 I I | | i H 1 H CM H CM I H H CM PO "3-LT\ <£) [—CO H CM ! i .'av ^'"' muD C-ÇOf-c-co cr, (iûN "tWVO^ÛCOrOfn^-1 H w ^ m | l •—i cNj l w n r o p o i r , | i , - ^ -^J- "^}- LOi C— C— C~- E— • f • J 1 1 1 .-H 1 I 1 CM 1 1 | | H CM f ^ H 1 1 H H POCM P O P O I I *d- | H CM P O ^ - L r i k £ ) C—CO H CT* H CM v ' _ — CM PO PO m rn rn r o ^)-H 1 1 1 1 | | | I l 1 1 1 1 1 | H c o m m LT\ i | | CM H P O O - m v r j C M V O H H C M P O " v M T \ C £ ) C - c O CM ur\ H PO • s~-'

CM Tl I CD Pn ' H O T * O CD O Ei -P TJ o> ca g H m O ( D T i r Û O) CO H 0) H cö T $ -P CD cd - H ca ca rQ d I M eui ö ca PO co ca - P "ö N CQ ?H H çd O o ï> £ JH Ö Ei T J CD O CD -P H fH CO CD Cd CD H - P g t i ö ra T i o o i3 o •H cü + CD ÜJ • H N + e> • H T l cd - p CD ?4 co d CD H H cd - p Ö cd cd o o p ) pq Cjj cii C5 c i cis CD a cd CM m <3-LT\ i n «3-cri m H H CM rOCM H<^> I H C M C M C N j r n r O m r O I I I I I I I I H I I I I 1 I I I H CM fOCM H U D I H H f^OVO e n | VU H H O J r 0 ^ i r \ U D C - 0 0 ! H CD H a cd ä - P E! 3 Ö CD E! cd a cd o M & U • CD - P 0) Pi CD T3 t H ^ £! 0 cd o cd fH E i - P ft CD CO ^ ~ * s r O C T i H CM -—' m L T i u D M D m c T i H c n HH CMOJ n o m H m i n f -H ( - o r O f T ^ ^ U D M D I I I H I H I I I I H I I I I I C M C M C M C M H " * t n C — C ~ m t > - 0 CM H > ^ H C \ J r O - ^ m U 3 C-CO v t - c n H C -lin.' H CM CM n - ) t ~ c p , m c r i H H H H H H C M H CM r o r o m PO -d" C— CM ! CTiCTiCriO •^•LfMX) t > ' HHHHH I I CM CM H H CM H I H I I I r O I A r i (M CM H H CM I I I CM H H <M <-m^o I H CM f)«=}-Lr\U3 c - c o H O H Ö •H !4 X» H H CD CD d> CD QjO HO PQ cü o Ei CD O M ofl - P J d o • H H II c i i 1-3 d CD O H qfl H CD CD Pu II O cü

Tabel 4. Resultaten van de eerste acht opnamen voor alle proefperken samen opname 1 2 3 4 5 6 7 8

aantallen per stadium LG 108 126 151 191 162 193 144 104 • GG 22 28 54 61 44 38 53 55 G 7 8 7 11 5 3 5 2 GB 2 3 9 4 1 8 11 10 dood 40 48 53 65 77 83 89 96 ziek 31 39 70 76 50 49 69 67 dood + ziek 71 87 123 141 127 132 158 16 3 LG = lichtgroen GG = geelgroen G = geel GB = geelbruin Ziek = GG + G + GB

Tabel 5. Aantal per proefperk, tussen de eerste en achtste opname gestorven bomen, ook als percentage van het bij de eerste opname aanwezige aantal

proefperknummer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 gestorven bomen 6 4 3 3 4 7 1 2 3 3 3 2 2 5 8 percentage van het totaal 3,7 1,7 1,2 2,2 1,4 3,5 0,3 12,5 14,3 12,0 10,3 5,7 6,9 6,3 7,5 totaal: 56 2,94e_7° *

_ 28 _

Be snelheid van de uitbreiding van de ziekte schijnt na acht maanden veel lager te liggen dan de eerste vier opnamen deden vermoeden. Na vier opnamen waren er t.o.v. de eerste opname 70 zieke en dode bomen bijgekomen. Na acht opnamen bedroeg dit aantal niet meer dan 86, In tabel 6 is weergegeven het aantal ziekte- en sterf-gevallen, waarbij de kategorie GG de ene keer wél en de andere keer niet als ziek beschouwd wordt. In het laatste geval krijgen we een duidelijker beeld van het verloop van de ziekte. De teruggang in de kategorie GG maskeert

in het eerste geval de toename van het aantal sterftegevallen, De variatie in de kategorie geelgroen kan te wijten zijn

aan beoordelingsmoeilijkheden. Dat zieke bomen zich her-stellen is moeilijk aan te nemen. Als er tijdens de eerste vier opnamen sprake was van een foutieve beoordeling, dan is dat mogelijk nu gekorrigeerd. Als in de latere

opnamen ziektegevallen over het hoofd zijn gezien dan zal zich dat later moeten uiten in een sterke toename van het sterftecijfer.

Als we nu aan de gestorven bomen nagaan binnen v/elke tijd ze afgestorven zijn dan krijgen we misschien wel het duidelijkste beeld van de voortgang van de ziekte, In-tabel 7 is dit uitgewerkt. Het blijkt dat de bomen ge-middeld binnen acht maanden nadat de eerste symptomen

optraden afgestorven waren.

Samenvattend kunnen we zeggen dat jaarlijks 1,5$ sterft na een gemiddelde ziekteduur van 8 maanden«

6 . ECOLOGIE

6 . 1 . INLEIDING

Een d e e l van de werkzaamheden bestond u i t proeven

over de g r o e i van de Pwrschimmel door s t e r i e l e en n i e t

-s t e r i e l e grond. Dit ge-schiedde t e r b e v e -s t i g i n g van

e e r d e r verkregen gegevens, waarbij nu e c h t e r het fungicide

b e n l a t e t e r beschikking s t o n d .

Nieuw zijn de temperatuurproef en de proef over het antagonisme van Trichoderma t.o.v, de

wortelrot-schimmel. De temperatuurproef werd uitgevoerd op het Laboratorium voor Pytopathologie te Wageningen,

De faktoren die van invloed zijn op het pathogeen zijn te verdelen in biotische en abiotische.

6.2. ABIOTISCHE FAKTOREN

Onder abiotische faktoren worden verstaan die faktoren, die het milieu samenstellen en die niet van

"levende" aard zijn. Licht, vocht, temperatuur,

bodem-struktuur, bodemtextuur en bodemvruchtbaarheid zijn zulke faktoren.

eu d - p CD co g H a5 a) d a> ft o eu n3 -P -3 cl O CD CÖ a) CD - P - P CQ CO - P Î H - d CD Ü CD cd CD CD CD • H .CO H CÖ 'S o o CQ CD ,£2 - H CD • H 0 CÜ CD •H O OD CD -P co CU d CD Q H O - H ^ • d Ü CD CO " P H CO C D CÖ > - P CD - P CtO CD c3 aJ CO d CD d CD H •P •P isj CD CD i S - H N CD S co ra H d ra a O T3 CD 3 ^ O H , d CD Ü • H CO > CD CD e> d CD CD •H CD I H -P O CO q f l - P CD • d - P o ra ra ^ j CD CD d ^ CD K i V O H CD ra EH O o + CD • H CXI O o + CD •H IS] d CD a O .Q H 03 - P d 05 < H 1 0 0 0 0 c-vo i n < i -m CM H •<d-1 CO H 1 CO 0 0 c-VO • o jH m CD m "=:'~ d ft o m CM H CD d ft o CD H • P d CÖ H ft d cd c3 ^J M CD fH ft CD ' M S Cl) S ? CT r o H H H en CO co m <• <=d-CT H H r o CT H CM CM H CM O CM H CO CO 0 0 c— H O O CM H •<d-m m «d-r O r O m r O H CM LTN vo m VO m *d d *d -r o H H •«d-CM VO i n CM CM r o " d " «d" LT\ r o <=*-«d" CM H r o 1 CM "=d" " d -O H vo C~-VO VO CM O i n CM VO i n CM r O r o m m m <d-* t * d - *d-CM CM m CO m VO VO VO VO •=d-r o OO r o H «d" s f H *d" d -O H CT* CT« O H H H OO C -Vu CM H m H r o H CM H CM H C -CM r o CM O H O H c-VO CM O O r o — „ . -i n VO O H CT C -vo VO CT Vu • « * • r o 1 i n C M H O C M O H CM H i n H r o H CO c-H O CM " d -i n CM — . . — vo O *3-vo r o •«d- tr-C M H ^ t - <3-« H CO O H C -CM H i n H r o H CO c- r-0 r-0 CM o o _{r o} — ~ t -CM •«d-r o •^t-r o r o r o CM CM H CM ^J- •^t-i n r o r o r o CM CM VX) H C -H CO CM i n i n i n «* r O r o r o r o CM CM i n KO VO •>* r o r o r o r o H CM OO r O CT H vo VU vo vo VO VO t n i n O H vo vo vo vo vo vo VO i n i n CM c -CM O H «d-oo tr~ O cr-vo •^f •«d-• * d -CM •=d-CT oo c t - c~-c~ vo i n CT CM CO r O H H H «d-r o r o r o r o r o r o r o CM 1 O -3-r o r o CO VO vo VO <d-i n r o O •=d-CM H H r o r o r o r o CM CM CM CM CM 1 H r O CT * d -i n i n ' d -r O CM CT CM CT r o _ _ , _ r o H i n vo vo i n -«d- ^d- »d-r o H t ~ O H r o H H H CT i n vo vo i n r o CT C c -CM H ^d-H O H cr> H r o CM CT H i n H CM H H H O H ( T VO co CT H r o CM CT H c— H r O H C M H

S

H H VO O H CO i n H i n H i n i n vo ü i n O H <d-C T CM C O CM CO H CO CM VO H i n C M H CM CO c -i n H IcO i n H CM r o H r-C M H H ^ t -j H r o CM H te H c~-CM O CT H "=d-(Ti H CM c i + CD • H CM PS c i + o + es CD • H IS] H

30

-Tabel 7« Ziekteduur van bomen die gezond waren bij de eerste en dood bij de achtste opname aantal maanden waarbinnen sterfte optreedt aantal gestorven bomen

3

13

6

13 - , - M •

9

7

12

4

15

6

18 C\ J 6.2.1. Temperatuur

Teneinde de invloed van de temperatuur op de myceliumgroei na te gaan, werden de groeisnelheden gemeten bij de volgende temperaturen: 0, 5, 10, 15, 20, 2 5, 30, 35, 40 en 45°C. Per temperatuur werden vijf

schalen ingezet, waarop aan d6 onderzijde assenkruizen waren aangebracht. De schalen met moutagar werden in het midden geè'nt met een ponsje van een kuituur van de Pwr-schimmel op moutagar, en een etmaal geïnkubeerd bij 30 C. Vervolgens werd drie dagen lang een markering

verricht op dezelfde tijd van de dag als waarop de eerste markering geschiedde. De resultaten zijn te vinden in

tabel 8 en fig. 7.

Tabel 8. Gemiddelde koloniediameter (5 schalen per objekt) in mm, als funktie van de tijd en de temperatuur temperatuur

in °C

0

5

10 15 20 25 30 35 40 na 24 uur —

-3

13 30 38

8

— na 48 uur -• —

-6

31 69 ^ 9 0 18

.r>

0

• j na 72 uur t 1 -— -11 52 ~> 90 > 9 0 31

1

FIG. 7 Groeicurven voor de p. w. r. - schimmel op moutagar bij eenaantal verschillende temperaturen

IO

1

15

T

20 25

Temperatuur In °C

32

-Uit de tabel blijkt dat de Pwr-rschimmel een hoge optimumtemperatuur heeft. In de schalen die 5 dagen bij 0°C en bij 5°C gestaan hadden bleek na overbrengen naar kamertemperatuur alsnog groei op te treden. Na langere tijd aan deze lage temperaturen te zijn blootgesteld, groeide de schimmel echter niet meer uit. Bij een tempe-ratuur van 25°C doorgroeit de Pwr-schimmel binnen een week een petrischaal met een middellijn van 9 cm gevuld met moutagar, In de tabel van NOBLES (1964) vormt dit een determinatie kenmerk.

6.2.2. Vocht

Al eerder werd gevonden, dat de Pwr-schimmel niet door zeer natte grond groeit (VAN DlTc HOEVEN, 1969). Wel bleek de schimmel in staat om over een wateroppervlak te groeien. Dit laatste werd herhaalde malen waargenomen in de potten waarin inokula ge'inkubeerd waren en waarin zich een laag steriel water bevond.

6.2.3. Benlate

Uit recent onderzoek (BOLLEN & FUCHS, 1970) is ge-bleken, dat de weinige onderzochte basidiomyceten vrij ongevoelig zijn voor dit fungicide. Vele ascomyceten daarentegen blijken evenals de meeste Fungi Imperfecti zeer gevoelig. In dit beeld past ook de Pwr-schimmel» hetgeen blijkt uit tabel 9.

Tabel 9. Invloed van verschillende koncentraties van benlate in moutagar op de groei van de

Pwr-schimmel (de kolonie dxameters zijn gemiddelden van 5 schalen) ppm Benlate Koloniedia-meter na 2 dagen in mm

0

77

5

81 10 85 25 67 50 76 100 46 200 50

Ook hier werd gebruik gemaakt van plastiek schalen met assenkruizen op de achterzijde. De schalen werden geïn-kubeerd bij een temperatuur van 30°C. Meting vond plaats na twee dagen. Na drie dagen bleken alle schalen volge-groeid te zijn ($ = 9 cm). Er valt in de buurt van 100

ppm een lichte daling in de groei te konstateren.

Trichoderma spp. werden reeds bij 1 ppm grotendeels en bij 5 ppm geheel geremd. Dit resultaat was aanleiding om benlate te gebruiken bij de isolatiepogingen van de wortelrotschimmel, juist omdat deze in zijn uitgroei meestal geremd wordt door Trichoderma spp.

6 . 3 . BIOTISCHE. FAKTOREN 6 . 3 . 1 . Antagonisme

B i j h e t u i t l e g g e n van d e l e n van z i e k e w o r t e l s b l e e k de Pwrschimmel b i j n a n o o i t u i t t e g r o e i e n t e n z i j g e b r u i k g e -maakt werd v a n h e t f u n g i c i d e b e n l a t e , welk m i d d e l v e e l

a n t a g o n i s t e n u i t s c h a k e l t . Deze g e v o e l i g h e i d v o o r a n t a g o n i s -me d o e t vermoeden d a t we t e maken hebben -met e e n schim-mel met e e n k l e i n vermogen t o t k o m p e t a t i e f s a p r o f y t i s m e . Omdat h e t g e d r a g van de Pwr-schimmel i n de n a b i j h e i d van a n d e r e m i k r o o r g a n i s m e n e e n a a n w i j z i n g vormt o m t r e n t z i j n m o g e l i j k e e c o l o g i s c h e p o s i t i e , werden e n k e l e p r o e v e n u i t g e v o e r d b e -t r e f f e n d e de g r o e i door grond v a n u i -t e e n " f o o d b a s e " ,

I n e e n e e r s t e p r o e f werd o v e r e e n l a a g j e grond w a t e r -a g -a r g e g o t e n . V i e r v e r s c h i l l e n d e g r o n d b e h -a n d e l i n g e n werden t o e g e p a s t , t e .weten s t e r i l i s e r e n , alsmede t o e v o e g e n van b e n l a t e , t e r r a m y c i n e of e e n m e n g s e l van b e i d e . D a a r n a a s t werd één s e r i e o n b e h a n d e l d g e l a t e n . A l l e e n b i j de s t e r i e l e grond g r o e i d e de schimmel o v e r de a g a r . I n de a n d e r e g e -v a l l e n -vond wel u i t g r o e i p l a a t s -v a n u i t h e t p o n s j e m o u t a g a r b e g r o e i d met de Pwr-schimmel waarmee de w a t e r a g a r geè'nt w a s , maar i n k o n t a k t gekomen met de a g a r vond l y s i s van de h y f e n p l a a t s .

Omdat i n e e n a a n t a l o r i ë n t e r e n d e p r o e v e n i n e n k e l e g e v a l l e n ook g r o e i i n n i e t - s t e r i e l e grond p l a a t s vond werd e e n p r o e f o p g e z e t , w a a r i n a l l e e n met n i e t - s t e r i e l e grond g e w e r k t w e r d . I n deze tweede p r o e f werden twee g r o n d s o o r t e n g e b r u i k t , n l . grond van^de CELOS-kwekerij en g r o f z u i v e r z a n d , en vond s l e c h t s 44n g r o n d b e h a n d e l i n g p l a a t s , n l . t o e -voegen van b e n l a t e . D i t m a a l werd g e b r u i k gemaakt van g r o t e P e t r i s c h a l e n ($ = 20 cm) w a a r i n g r o t e r e s t u k k e n h o u t a l s

" f o o d b a s e " p a s t e n . Deze s t u k k e n van + 6 x 2 x 2 cm3 waren w e e l d e r i g met de Pwr-schimmel b e g r o e i d . Ze waren e e n maand l a n g g e ï n k u b e e r d geweest i n g e a u t o k l a v e e r d e j a m p o t t e n ,

Vó*<5r h e t e n t e n met de Pwr-schimmel waren de h o u t s t u k k e n e e r s t geweekt i n e e n b e n l a t e s u s p e n s i e e n d a a r n a g e s t e r i l i s e e r d met e p o x y p r o p a a n , I n e l k e s c h a a l werden twee s t u k k e n g e

-p l a a t s t , t e g e n o v e r e l k a a r . De grond werd b e v o c h t i g d , h e t z i j met e e n b e n l a t e s u s p e n s i e (50 p p m ) , h e t z i j met s t e r i e l w a t e r . D i t g e s c h i e d d e n a de h o e v e e l h e i d w a t e r gemeten t e hebben welke n o d i g was om e e n b e p a a l d e h o e v e e l h e i d g r o n d op de

gewenste v o c h t i g h e i d t e b r e n g e n . Voor h e t zand werd d i t op 14$ v o o r de k w e k e r i j a a r d e op 2 0 ^ v a n h e t o o r s p r o n k e l i j k e g e w i c h t b e p a a l d . E l k v a n de v i e r s e r i e s werd i n z e s h e r -h a l i n g e n i n g e z e t .

B i j de l a a t s t e k o n t r o l e op 29 o k t o b e r , 40 dagen n a h e t b e g i n van de p r o e f , b l e e k d a t i n de s e r i e met toveke r i j a a r d e b i j n a a l h e t mycelium van de i n o k u l a verdwenen w a s , k e n

-n e l i j k va-nwege de a -n t a g o -n i s t i s c h e m i k r o f l o r a va-n deze g r o -n d . I n de s e r i e met g r o f zand d a a r e n t e g e n vond t e n s l o t t e i n de m e e s t e s c h a l e n n a e n k e l e weken e n i g e u i t g r o e i p l a a t s v a n u i t

de i n o k u l a , zowel i n de o n b e h a n d e l d e s e r i e a l s i n d i e met b e n l a t e « We mogen wel aannemen d a t z i c h i n deze grond

w e i n i g mikrob'rganismen b e v i n d e n , h e t g e e n de r e d e n kan z i j n van de u i t g r o e i .

1. verrijkt zaagsel + 2. » + benlate 3. + + +

-34

Teneinde het gedrag van de Pwr-schimmel na te gaan in een substraat na besmetting met Trichoderma sp., werd deze schimmel toegevoegd aan erlemeyers van 100 ml gevuld met verrijkt zaagsel (TAMBLYN & DA COSTA, 1958) die twee weken

tevoren waren geënt met de Pwr-schimmel. De helft van-deze erlemeyers bevatte benlate (als suspensie van 50 ppm toege-voegd). Trichoderma werd toegevoegd in de vorm van een ponsje uit een kuituur en als konidiënsuspensie. Aldus ontstonden de volgende kombinaties:

agar ponsje met Trichoderma idem idem idem idem konidiënsuspensie van

Trichoderma

4. » « + benlate + idem idem idem Na verloop van tijd vormde zich in alle gevallen een soort van grens welke langs de glasrand zichtbaar was als een witte lijn. In gevallen waarin Trichoderma als

konidiënsuspensie was toegediend werd de Pwr-schimmel het meest teruggedrongen. Vooral daar waar het zaagsel benlate bevatte en Trichoderma als ponsj6 was toegediend, leek de Pwr-schimmel nauwelijks terrein te verliezen.

Na vier maanden, op 16 oktober, werd van het totaal uit-gedroogde zaagsel beneden de grens tussen de Pwr-schimmel en Trichoderma zaagsel genomen en uitgespreid over een medium van moutagar met 50 ppm benlate. In eerste instantie ontwikkelde zich overal Trichoderma op het zaagsel. Dit groeide echter niet uit op het medium. Na verloop van tijd echter groeide in alle gevallen, volkomen onverwacht, de

Pwr-schimmel in het medium en doorgroeide de schaal. Misschiet is het aan de uitdroging te danken, dat Trichoderma de

Pwr-schimmel niet geheel heeft kunnen verdringen. In ieder geval is wel duidelijk dat de Pwr-schimmel zeer droogte-resistent is.

6*3*2. Mycorrhiza

Zoals vermeld onder het hoofd inokulaties, werden in de bakken met door VAN HE-B. HOEVEN gei'nokuleerde jonge Pinus-planten (op het CELOS -terrein) paddestoelen aangetroffen van Telephora terrestris« Het is bekend dat deze schimmel

mycorrhiza vormt met wortels van bepaalde Pinussoorten, waaronder ook Pinus caribaea. Isolaties uit mycorrhizae hadden geen sukses. Met de mikrotoom werden enkele coupes gemaakt. Het mycelium vertoonde duidelijk gespen.

Uit proeven van MARX (1969) is duidelijk gebleken, dat o.a. Telephora terrestris als mycorrhizavormer de gastheer bescherming kan bieden tegen pathogenen. Hij gebruikte als pathogeen Phytophtora cinnamomi,

7. HSSPHERING

De Pwr-schimmel behoort zeer waarschijnlijk tot de familie van de Polyporaceae. Dit is allereerst gebaseerd on de gelijkenis van de in Suriname geïsoleerde schimmel met een isolaat van Dr. PAWSEY dat tot de Polyporaceae

leek te behoren. Determinatie van de Pwr-schimmel op grond van kultuurkenmerken (NOBLES, 1964) bleek onmogelijk, maar vele kenmerken wijzen samen duidelijk in de richting van de Polyporaceae. Slechts de vondst van het vruchtlichaam

kan de oplossing brengen. _ Het feit dat de Pwr-schimmel bijna alleen door steriele

srond proeit wijst er op dat deze gevoelig is voor

antagonisme (in arme grond vindt nog .enige groei plaats). Ook het achterwege blijven van groei uit stukjes ziek hout uitgelegd op moutagar, in aanwezigheid van andere schim-mels is hiervoor een aanwijzing. In de bodem zal de aan-wezigheid van de Pwr-schimmel waarschijnlijk beperkt zijn

tot de wortel; het vermogen tot kompetatief saprofytisme is klein hoewel de groei redelijk snel is. Mogelijk ont-breekt er op plaatsen waar de ziekte optreedt voldoende

antagonisme. ... , . _, „. j. • -, Hoewel de Pwr-schimmel uitsluitend uit Pmusmateriaal seïsoleerd werd, wijst de sterke verspreiding van de ziekte er toch wel duidelijk op dat de ziekteverwekker afkomstig moet- zijn uit de oorspronkelijke vegetatie. Het verdient aanbeveling in de toekomst meer aandacht te besteden aan isolaties uit bomen behorend tot de oorspronkelijke

vesetatie. _ . ., . . . Voor het opruimen van de oorspronkelijke vegetatie

ziin of worden drie methoden gebruikt:

1 dozeren, d.w.z. omduwen van de boom, zodat deze met ziin wortels verdwijnt;

? vergiftigen (dit gebeurt met de grootste exemplaren);

%' afsniideS. met K.G. blad ter hoogte van de grond.

im a i w u j iaatste twee methoden blijft het wortelstelsel

achter in de bodem. In beide gevallen is het wortelstelsel »?*+ meteen dood, doch sterft geleidelijk af. Tijdens dit proces krijgt mogelijk de Pwr-schimmel de kans het wortel-materiaaï tf koloniseren. Aldus ontstaat wellicht een ^foodbase" die het inokulumpotentiaal verschaft, nodig voor een geslaagde infektie van de Pmusaanplant. Als nl. Ia verloop van tijd de wortels van de aangeplante Pinus n«r!baea hiermee in kontakt komen kan de Pwr-schimmel hierover uitgroeien en de boom doden. Via onderlinge wor-^ïverproeiingen kan dan de schimmel zich verder uit-breiden! de gedode exemplaren weer als "foodbase"

ge-bïHikend. Op deze wijze ontstaat een haardvormige uitbrei-ding die ook inderdaad waargenomen wordt.

36

-De snelheid waarmee de ziekte zich uitbreidt, schijnt na acht opnamen van de proefperken beduidend kleiner te zijn dan na vier opnamen gekonstateerd werd. Naast een lagere sterfte bleek vooral de toename van het aantal zieke bomen kleiner te zijn. Naast de kategorie LG is

waarschijnlijk ook de kategorie GG niet met zekerheid als ziek te beschouwen. Het aantal bomen in deze categorieën varieert nl. per opname dusdanig, dat hier andere verschijn-selen doorheen spelen. Mochten bomen met de kleur GG toch allen ziek zijn, dan betekent dit dat er in deze fase nog een beduidend aantal ontsnapt aan de dood en weer gezond wordt. Gele én geelbruine bomen gaan echter altijd dood

(G resp. GB).

Ondanks deze teruggang in het ziekteverloop kan de uitbreiding plaatselijk zeer sterk zijn en het is dan ook duidelijk dat juist i.v.m. de toekomstige schaalvergroting van de Pinusaanplant dit wortelrotprobleem nader en meer gekoncentreerd onderzoek behoeft.

8. LITERATUUR

BASHAM, J.T., 1957. A technique for the sterilisation and inoculation of wood cut from living trees. Can. J. Bot. 35 : 31-34.

BOLLEN, G.J. & A. FUCHS, 1970. On the specificity of the in vitro and in vivo antifungal activity of benomyl. Neth. J. PI. Path. 76 : 299-312.

ETHERIDGE, D.E., 1968. Preliminary observations on the pathology of Pinus caribaea Morelet in British Honduras. Comm. For. Rev. 47(1): 72-80.

GARRET, S.D., I960. Biology of root-infecting fungi. Cambridge university press, Cambridge.

GRANT, C.& J.G. SAVORY, 1964. Methods for isolation and ' identification of fungi on wood. Int. Biodetn. Bull. 5(2): 77-94.

GURR, E., 1965. The rational use of dyes in biology and general staining methods. Gurr, London.

HOEVEN, E.P."van der, 1969. Wortelrot van Pinus caribaea Morelet. CELOS Rapporten no 27.

LEMCKERT. J.D., 1969. Wortelrot Pinus caribaea Morelet. OB LOS Rapporten no 21(4).

MARX, D.H., 1970. The influence of ectotrophic mycorrhizal fungi on the resistance of pine roots to pathogenic infection, 5. Phytopathology 60: 1472-1473.

NOBLES, M.K., 1958. A. rapid test for extracellular oxidase in cultures of wood inhabiting Hymenomycetes. Can. J. Bot. 36 : 803-926.

NOBLES, M.K., 1958. Cultural characters as a guide to the taxonomy and phylogeny of the Polyporaceae. Can. J. Bot. 36: 91-99.

NOBLES, M.K., 1964. Identification of wood inhabiting Hymenomycetes. Can. J. Bot. 43: 1097-1139.

PAWSEY, R.G., 1970. Forest diseases in'Trinidad and Tobago with some observations in Jamaica. Comm. Por. Rev,

49(1): 64-77.

SASS J.E., 1951. Botanical microtechnique. The Iowa state 'college press, Iowa, second edition.

TAMBLYN, M. & E.W.B. DA COSTA, 1958. A simple technique for producing'fruit bodies of wood destroying Basidiomycetes. Nature, 181: 578-579.

TUITE J., 1969. Plant pathological methods, fungi and bacteria. Minneapolis Burgess Publ. Comp.

VERMEULEN, H., 1968. Investigations into the cause of the phloeem necrosis disease of Coffea liberica in

Surinam, South America. Neth. J. PI. Path. 74: 202-218, ZAK B. 1964. Role of mycorrhizae in root disease. Ann.