Bevestiging van residuen van enkele tranquillizers in varkensnier met behulp van GC/MS

Project 505.0070: Ontwikkeling van methoden van onderzoek voor het verrichten van identificaties cq. confirmaties.

Projectleider: W.A. Traag

Rapport 90.40 Oktober 1990

Bevestiging van residuen van enkele tranquillizers in varkensnier met behulp van GC/MS

W.M.J. Beek en dr J.P. Hoogland

Afdeling: Diergeneesmiddelen

Goedgekeurd door: H.J. Keukens

Rijks-K\valiteitsinstituut voor land- en tuinbomvprodukten (RIKILT) Bornsesteeg 45, 6708 PD Wageningen

Postbus 230, 6700 AE Wageningen Telefoon 08370-75400

Telex 75180 RIKIL Telefax 08370 - 17717

VERZENDLIJST INTERN: directeur sectorhoofden programmabeheer en informatievoorziening (2x) afdeling Diergeneesmiddelen (6x)

afdeling Organische Contaminanten afdeling Biofarmaceutische Analyse afdeling Toxicologie

circulatie bibliotheek

EXTERN:

Dienst Landbouwkundig Onderzoek Directie Hetenschap en Technologie

Directie Voedings- en K\o~aliteitsaangelegenheden Directie Veehouderij en Zuivel

Veterinaire Dienst (2x)

Directie Rijksdienst voor de keuring van Vee en Vlees Rijkskeuringsdienst van Haren, Utrecht

Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Nilieuhygiene (dr R. Stephany) Centraal Diergeneeskundig Instituut (dr L. Jager)

Secretaris ORA - Gezondheidsdienst voor Pluimvee te Doorn (drs H. Vertommen)

Rijksdienst voor de keuring van Vee en Vlees - Kringlaboratorium Nijmegen (dr J. Nom-1s)

Rijksuniversiteit Utrecht, Vakgroep Voedingsmiddelen van Dierlijke Oorsprong (prof. A. Ruiter)

Rijksdienst voor de keuring van Vee en Vlees - Centraal Laboratori~l (dhr L.H. H. Frijns) (2x)

t-1inisterie van Hel zijn, Volksgezondheid en Cultuur, Veterinaire Hoofdinspectie (2x)

-1-ABSTRACT

Bevestiging van residuen van enkele tranquillizers in varkensnier met behulp van GC/MS.

Confirmation of residues of some tranquillizers in porcine kidney using GC/MS.

Report 90.40 October 1990

W.M.J. Beek and J.P. Hoogland

State Institute for Quality Control of Agricultura1 Products (RIKILT) P.O. Box 230, 6700 AE Wageningen, The Netherlands

3 tables, 9 annexes, 12 references

A confirmation procedure is described for control on residues of

tranquillizers in porcine kidney using a combination of gas chromato-graphy and mass selective detection in the electron impact mode. Above concentrations of 50 ~g/kg the identity of the tranquillizers acepromazine, chlorpromazine, ha1operidol, propionylpromazine, azape-rone and its main metabolite azaperol could be established via presen-ce of four adequate diagnostic ions, according to operative EC-guid e-lines.

KeYiwrds: Gas Chromatography, Mass Selective Detection, Porcine Kidney, Confirmation, Acepromazine , Chlorpromazine, Azaperone, Propionylpromazine, Azaperol, Haloperidol.

INHOUD ABSTRACT SAHENVATTING 1 INLEIDING 2 NATERIALEN EN NETHODEN 2.1 Standaardstoffen 2.2 Reagentia 2.3 Instrumenten en materialen 2.4 Nonsteropwerking 3 RESULTATEN EN DISCUSSIE 3.1 Chromatografie 3.2 Spectrale informatie 3.3 Herhaalbaarheid EI-meting 3.4 Selectie fragmentionen 3.5 Nonsteronderzoek 3.5.1 Selectie methode 3. 5. 2 Analyse nier 3.5.3 Storingsanalyse 4 CONCLUSIES LITERATUUR BIJLAGEN 1 STRUCTUURFORHULES 2 CHROHATOGRAN EN EI-SPECTRA 3 HERHAALBAARHEID FRAGHENTIONEN 4 HERHAALBAARHEID RETENTIETIJD

-

3-5 HERHAALBAARHEID ABSOLUTE INTENSITEIT

6 LINEARITEIT EI-METINGEN HONSTERS NIER

blz 1 5 7 8 8 8 9 9 10 10 11 11 12 13 13 15 16 16 17

7 CHROHATOGRAMHEN STANDAARD

8 CHROHATOGRANNEN BLANCO MONSTER NIER 9 CHROHATOGRAMHEN HONSTER NIER 50 l!g/kg

-5-SAHENVATTING

In dit rapport wordt een procedure beschreven voor bevestiging van de

aanwezigheid van residuen van enkele tranquillizers in varkensnieren

met behulp van aan gaschromatografie gekoppelde massa-selectieve de

-tectie in de EI (Electron Impact) modus.

Boven een concentratie van 50 ~g/kg kan de identiteit van de

tranquil-lizers chloorpromazine, acepromazine, azaperol, propionylpromazine,

haloperidol, azaperon en azaperol (de hoofdmetaboliet van azaperon)

worden bevestigd in overeenstemming met de EG-richtlijnen waarbij 4

-7

-1 INLEIDING

In de veterinaire praktijk 1wrden tranquillizers zo1.,el klinisch als

therapeutisch toegepast. Het gebruik ervan kan aanleiding geven tot vorming van residuen. In de praktijk wordt de nier (target-orgaan !)

op de aam1ezigheid van deze middelen onderzocht. De toegestane maximum

concentratie in de nier (MRL) bedraagt 100 ~g/kg (12).

Bij de Nederlandse keuring wordt gebruik gemaakt van een HPLC-methode (3) Haarmee enkele tranquillizers en de beta-receptor blocker

carazo-lol kunnen worden bepaald. De bepaalbaarheidsgrens ligt tussen 1 - 10

~g/kg voor de tranquillizers en is voor carazolol 0,3 ~g/kg .

Bevestiging, waarbij de identiteit van de component wordt bepaald, is met deze methode alleen mogelijk door opname van een UV-spectrum vanaf

een niveau van ca. 50 ~g/kg. Echter, de informatie-inhoud van een UV

-spectrum is vaak gering, éénduid ige identificatie kan daardoor 1o1orden bemoeilijkt.

Met een door van Ginkel et al.(5) ontwikkelde HPLC-methode kan ook een

niveau van 50 ~g/kg 1vorden bereikt. Hierbij wordt een zeer be\o~erkelij­ ke TLC-methode als bevestiging toegepast.

Het doel van dit onderzoek is een bevestigingsmethodiek op te zetten

voor de tranquillizers xylazine, chloorpromazine, azaperon, azaperol

(de hoofdmetaboliet van azaperon), acepromazine, propionylpromazine en haloperidol (zie bijlage 1).

In de literatuur zijn enkele methoden beschreven voor de gaschromato-grafische bepaling van tranquillizers. Rauws et al. (6) beschrijven de

scheiding van azaperol en azaperon op een OV-17 kolom. Zij maakten

ge-bruik van massaspectrametrische detektie. Turcant (4) geeft een over-zicht van de schelding van neutrale en basische geneesmiddelen

(\.,aar-onder enkele tranquillizers) op fused-silica capillaire kolommen • Laitem et al. (7) beschrijven de scheiding van propionylpromazine,

chloorpromazine, promethazine en xylazine op een OV-1 kolom. In alle beschreven artikelen worden de tranquillizers direkt (dat 1o1il zeggen:

zonder derivatisering) op de kolom gebracht .

In dit rapport wordt het onderzoek beschreven dat is verricht naar de

mogelijke toepassing van gaschromatografie met een hieraan gekoppelde

massaspectrometer met Electron Impact (EI) ionisatie, voor bevestiging van de aanwezigheid van tranquillizers in varkensnier. Het doel van het onderzoek 1vas om na te gaan of het mogelijk 1o1as, de aam1ezigheid van alle componenten, in overeenstemming met de vigerende

EG-richtlij-nen (8, 9), middels één analyse te bevestigen. Tevens \.,erd onderzocht in hoeverre de methode van Keukens et al. (3) toepasbaar is als mon-stervoorbereid ing.

2 HATERTALEN EN ~1ETHODEN

2.1 Standaardstoffen

Chloorpromazine, xylazine, azaperon, acepromazine, azaperol, propio-nylpromazine, haloperidol en carazolol \.,erden opgelost in methanol en daarna verdund met ethylacetaat of (afhankelijk van de toepassing) in interne standaardoplossing PCB 138 (2 ng/~1 in ethylacetaat) tot de gewenste concentratie.

2.2 Reagentia

Alle toegepaste chemicaliën Haren van p.a. hmliteit (Herck), tenzij anders aangegeven. Het water wordt bedoeld gedemineraliseerd water

(gezuiverd met behulp van een Hilli-Q zuiverings-systeem, specifieke 6

minimale weerstand: 10 Ohm.cm.

Acetonitril n-Hexaan Nethanol

Natriumchlorideoplossing, 10% in water Zwavelzuuroplossing, 0,01 H in water

Zure acetonitril-oplossing (1 ml 0,05 H zwavelzuuroplossing in 100 rul acetonitril)

Ethylacetaat (Uvasol kwaliteit) Natronloogoplossing, 0,5 H in water tert-Butyl-methylether (TBME)

2,3,4,2',4',5'-hexachlorobiphenyl (PCB 138), 2 ng/~1 in ethylacetaat (Promochem)

-9 -2.3 Instrumenten en materialen Gaschromatograaf: Kolom Draaggas Split CP Sil 5 CB: 1

=

25 m; ID

=

0, 22 mm; filmdikte 0,12 pm (fused silica kolom, Chrompack)

helium; lineaire snelheid 30 cm/sec

20 ml/min, geopend 4 min. na injectie

Septurn flush 3 ml/min; geopend 4 min. na injectie Temperatuur injector: 260 °C

Injectievolume 5 pl splitless

0

Temperatuurprogramma: initial hold: 2 min 80 C

opwarm snelheid oven: 10 °C/min final hold: 2 min 260 °C

Massa selectieve detector:

Hassabereik m/z 40-800

Ionisatiebron: Electron Impact (EI) (70 eV)

MS interface : direkt gekoppeld aan fused silica kolom

0

temperatuur interface

=

260 C

2. 4 Hansteropwerking

Homogeniseer de gehele nier na verwijdering van overmatig vet in een

keukenmachine (Moulinette) .

Heeg 10 g homogenast af in een polypropyleen centrifugebuis van 80 ml. Pipetteer onder voortdurend mengen met een vibrofix (IKA vibrofix, ca.

750 rpm) 20 ml acetonitril in de centrifugebuis. Sluit de buis af en

meng 45 sec. bij 1500 rpm. Plaats de buis gedurende 2 min. in een

ultrasoonbad en centrifugeer hierna 5 min. bij 4000 g (HSE-Goolspin). Activeer een Seppak C-18 cartridge met achtereenvolgens 5 ml methanol

en 5 ml Hater. Sluit de Seppak aan op een weg\verpspuit ()50 ml). Breng in de spuit 50 ml natriumchlorideoplossing 10% en 7, 5 ml van het mon -sterextract. Meng de inhoud van de injectiespuit en pers het geheel geleidelijk door de cartridge. Spoel vervolgens de cartridge met 1 ml

zHavelzuur 0,01 M, blaas door met 2 ml lucht en elueer de componenten met 2 ml aangezuurde acetonitril.

Vang het eluaat op in een gecalibreerde puntbuis welke vooraf gespoeld

is met geconcentreerde ammonia, \va ter en aceton. Venvarm het eluaat

tot 70 °C en damp in tot een volmue van ca. 300 ~1 via overleiden van

een stikstofstroom. Meng het residu en voeg direct 1 ml hexaan toe.

Meng 30 sec. op de vibrofix (700 rpm), centrifugeer 5 min. bij 2000 g

(MSE-coolspin) en verwerp zoveel mogelijk van de bovenstaande

hexaan-fase. Herhaal de extractie met hexaan nogmaals en venverp deze

even-eens.

Breng hierna 150 ~1 0,5 M natronloogoplossing bij de waterige fase,

meng en voeg hierna 1 ml tert-butyl-methylether (TBME) toe. Meng 30

sec. op de vibrofix (700 rpm), centrifugeer 2 min. bij 1000 g

(MSE-Coolspin) en isoleer de bovenstaande fase in een 4 ml

monsterpot-je.

Herhaal de extractie met TBME nog twee maal en verzamel de etherfasen.

Damp met behulp van een stikstofstroom in tot droog, onder verwarming

( t

=

30 °C).

Neem het verkregen residu op in 25 ~1 interne standaardoplossing PCB

138 (2 ng/~1) in ethylacetaat. Breng hiervan zoveel mogelijk over in

een met een septurn af te sluiten monsterpotje dat geschikt is voor de

autoinjector van de gaschromatograaf.

Injecteer 5 ~1 van deze oplossing in de GC-,."1S en injecteer eveneens standaardoplossingen in interne standaardoplossing (PCB 138: 2 ng/~1 in ethylacetaat) met concentraties van 0,5; 1; 2; 5; 7,5 en 10 ng/~1.

3 RESULTATEN EN DISCUSSIE

3.1 Chromatografie

Alle genoemde componenten werden meestal niet in één analysegang

geme-ten. De eerste experimenten waren er mede op gericht, de mogelijkheden

hiertoe te onderzoeken. Een standaardmengsel van xylazine,

chloorpro-mazine, azaperon, acepromazine, azaperol, propionylpromazine,

halope-ridol en carazolol '~rd opgenomen in een oplossing van PCB 138 (2

ng/~1 in ethylacetaat). De concentratie van de componenten bedroeg 10

ng/~1. Het standaardmengsel 1verd geanalyseerd op de HP-NSD onder de

condities beschreven in 2.3. De detectie vond plaats in de "full scan

-11-Uit het verkregen chromatagram (bijlage 2, figuur 1) bleek dat alle

tranquillizers met het systeem ,.,aren te scheiden. De beta-receptor blocker carazolol daarentegen bleek namo~elijks respons op te leveren

zodat geen praktisch bruikbare informatie ,.,erd verkregen. Voor deze

component zal gezocht worden naar een geschikte derivatisering,

bij-voorbeeld zoals is voorgesteld door Petzen Desager (1,2). In het ka

-der van dit onderzoek is het gedrag van carazolol niet verder bestu-deerd.

3.2 Spectrale informatie

Van de te onderzoeken tranquillizers zijn standaardoplossingen gemaakt

met een concentratie van 10 ng/~1. Van deze oplossingen werd 3 ~1

ge-ïnjecteerd voor het verkrijgen van EI spectra. Het scanbereik van de MS werd ingesteld van m/z 40 tot m/z 800. De op deze wijze verkregen

spectra zijn weergegeven in bijlage 2, figuren 2 tm. 8.

3.3 Herhaalbaarheid EI-meting

De massaspectrometer werd ingesteld op "selected ion monitoring" (SIH)

analyse. Vervolgens ,.,erden voor elke component 5 tot 6 onafhankelijke

diagnostische ionen geselekteerd. De herhaalbaarheid van de

fragmenta-tie \o~erd bepaald door tien maal een standaardoplossing met een

concen-tratie van 5 ng/~1 te injecteren. De resultaten zijn weergegeven in

bijlage 3. Tevens werd de herhaalbaarheid van de retentietijd en

abso-lute intensiteit bepaald. Hierbij werd voor elke component, van de

re-tentietijd en intensiteit van de "basepeak" (hoofdmassa) gebruik

ge-maakt. De resultaten van de herhaalbaarheid van de retentietijd zijn

vermeld in bijlage 4; de resultaten van de herhaalbaarheid van de

absolute intensiteit in bijlage 5.

Door de EG (9) zijn onder andere de volgende bevestigingacriteria voor

lage resolutie MS vastgesteld:

-De relatieve retentietijd van de component, gedefinilerd als de ver

-houding van de absolute retentietijd in seconden van de te meten component ten opzichte van de absolute retentietijd in seconden van de interne standaard (A), dient gelijk te zijn aan de relatieve re-tentietijd van de overeenkomstige standaard, met een maximale

- De relatieve intensiteit van 3 fragmentionen van een monsterspec-trum, uitgedrukt als percentage van de intensiteit van het meest intense ion (basepeak), moet gelijk zijn aan de relatieve intensi-teit van de overeenkomende fragmentionen van de standaard met een

maximale ahlijldng van

+

10% (EI-mode).

Uit de verkregen resultaten blijkt, dat voor alle componenten de her

-haalbaarheid van de retentietijd zodanig is dat aan bovenstaande eis

\•lOrd t voldaan.

De herhaalbaarheid van de absolute intensiteit, van geselecteerde ionen, van de onderzochte verbindingen en de interne standaard PCB 138 vertonen een grote variatiecoëfficiënt. Vergelijkbare resultaten, waarbij de variatie in intensiteit, na correctie met behulp van de interne standaard, ook aanzienlijk was, werden reeds eerder waargeno

-men bij de analyse van beta-agonisten (11). Voor geselecteerde

frag-mentionen is de herhaalbaarheid van fragmentatie bekeken. Voor beves

-tigingadoeleinden is een reproduceerbaar fragmentatiepatroon belang

-rijk. Daarom \•lorden binnen ons laboratorium ionen waarvan de pieken

een grotere variatiecoëfficiënt dan 10% vertonen niet beschomo1d als geschikte diagnostische ionen.

Uitgaande van dit criterium blijkt uit de resultaten voor standaarden

dat voor de componenten chloorpromazine, azaperon, acepromazine, azaperol en propionylpromazine vier fragmenten beschikbaar zijn waarvan de herhaalbaarheid voldoet aan deze eis; de herhaalbaarheid van de fragmentatie van xylazine voldoet niet. Naar de bepaling van

xylazine is geen verder onderzoek verricht.

Haloperidol voldeed in dit experiment niet aan het criteriwu maar

bleek in andere experimenten wèl aan de eisen te voldoen.

3.4 Selectie fragmentionen

Bij analyse van monsters, waarbij wordt voldaan aan de door de EG

ge-stelde criteria voor retentie- en massaspectrametrische eisen, 1o1erden voor elke component vier ionen geselecteerd. Deze SIM-analyse is

ge-voeliger en selectiever dan een Full Scan-analyse waarbij alle massa' s

\>lorden gemeten. Bij de selectie van vier geschikte fragmentionen voor

SIM analyse werden de navolgende parameters aangehouden:

-13-bij voorkeur meer dan 10% van de intensiteit van de basepeak bedra-gen (hierbij dient echter ook de absolute intensiteit in obedra-genschouw te worden genomen). De detectiegrens van een component wordt bepaald door de intensiteit van het minst intensieve fragmention.

- de herhaalbaarheid van een fragmention (maximaal 2:_ 10%).

- de aamvezigheid van voldoende ionen die voldoen aan bovenstaande

ei-sen, waarbij de keuze van isotoopionen moet worden uitgesloten.

De geselecteerde fragmentionen zijn ~veergegeven in tabel 1.

Tabel 1: Geselecteerde fragmentionen voor analyse van tranquillizers.

Component ionen ( m/ z) chloorpromazine 318* 272 86 233 azaperon 107* 233 165 309 acepromazine 326* 280 241 197 azaperol 107* 235 121 222 propionylpromazine 340* 294 255 197 haloperidol 224* 237 123 206

(het met

*

gemerkte fragmention is de basepeak; de intensiteit van de

geselecteerde fragmentionen loopt af van links naar rechts)

3.5 Monsteronderzoek

3.5.1 Selectie methode

Een monstervoorbereiding waarbij de minimale concentratie aan tran-quillizers, die in het GC-MS (D) systeem worden gebracht, ligt in de range van 2-10 ng/)ll kan geschikt zijn voor bevestiging van deze

com-ponenten. Voor de monsteropwerking ~verd gekozen voor de relatief korte

en eenvoudige methode van Keukens et al. (3), welke reeds in de prak-tijk werd getest in een surveillance programma (10). De methode berust

op extraktie met acetonitril, een eenvoudige zuivering over een Seppak

C18 kolonunetje, elutie met zure acetonitril, afdampen en zuiveren van

de resterende waterige fase met hexaan. De waterige fase is geschikt

Voor de GC-HS (D) analyse dient men zoveel mogelijk van de te bepalen

component uit de ,.,aterige fase in een voor GC geschikt organische fase

over te brengen. Voor dit doel zijn verschillende extraktiemiddelen

getest. Omdat de tranquillizers basische componenten zijn is extraktie

vanuit een alkalische oplossing noodzakelijk. Een oplossing van 2,5

~g/ml aan tranquillizers in 0,01 H zwavelzuur ,.,erd alkalisch gemaakt

met behulp van 0,5 M natronloog. Hierna volgde extraktie met 3 maal 1

ml organisch oplosmiddel. De verzamelde organische fase '"erd ingedampt

en het residu werd opgenomen in 0,01 M zwavelzuur. De oplossing \rerd

geanalyseerd met behulp van HPLC.

Getest werden cyclohexaan, iso-octaan, petroleumether, diethylether,

ethylacetaat, hexaan en tertiaire butylmethylether (TBME).

De resultaten van de gevonden extraktierendementen staan weergegeven

in tabel 2.

Tabel 2: Resultaten extraktierendement tranquillizers vanuit

alkali-sche oplossing met diverse organische oplosmiddelen (% t.o.v.

de standaardoplossing). 1 2 3 4 5 6 7 chloorpromazine 75 22 11 11 88 93 azaperon 87 74 65 71 13 75 88 acepromazine 100 29 8 21 76 83 azaperol 73 72 56 35 85 82 propionylpromazine 75 11 7 26 72 85 haloperidol 94 98 53 96 23 78 100

----

---1: cyclohexaan, 2: iso-octaan, 3: petroleumether, 4: diethylether,

5: ethylacetaat, 6: hexaan, 7: tertiaire butyl methylether (TBME).

Op basis van de gevonden resultaten werd gekozen voor het

-15

-3.5.2 Analyse nier

De bestaande op1·1erkingsmethode van Keukens et al. 1verd getest. Hon-sters nier 1verden gespiked met enkele tranquillizers. Uit de gevonden resultaten bleek dat, met behulp van de EG-criteria voor LRHS, de aamvezigheid van residuen vanaf een niveau van 100 J,lg/kg kon 1o10rden

bevestigd.

Het de gevolgde \verkl</ijze 1vas bevestiging op een lager niveau niet mogelijk.

Door uit te gaan van meer monstermateriaal kon niet op een lager ni

-veau worden bevestigd. De achtergrond bij de meting was dan te hoog. Dit \verd veroorzaakt door resten vervuilde hexaan die in de TilHE-fase geraken. Door een extra extractiestap met hexaan in de opl>lerkingsme

-thode op te nemen kon het resultaat worden verbeterd.

De resultaten van dit in duplo uitgevoerde experiment staan samengevat in tabel 3.

Tabel 3: Resultaten onderzoek monsters.

component chloorpromazine azaperon acepromazine azaperol propionylpromazine haloperidol

nier nier nier nier nier nier

bl. bl. 10 20 50 100 J,lg/kg J,lg/kg J,lg/kg J,lg/kg a b a b a b a b a b a b 4 4 4 4 ll _{4 4 4} 4 4 4 3 4 4 4 4 4 2 4 4 4 4 4 ll 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 4 3 4 4 4 4 4 2 4 3 ll _{4 4} 4

-

---

-

---

-

---a: gevonden aantal geselecteerde fragment ionen.

b: aantal fragmentionen waarbij de relatieve intensiteit ten opzichte van de basepeak overeenkomt met de standaard

(±_

10%).

Uit deze tabel blijkt duidelijk dat de monsters dusdanig zijn

gezui-verd dat bij blanco nieren geen storingen worden waargenomen voor de

geselecteerde ionen. Voor de tranquillizers blijkt dat vanaf een

niveau van 50 l.lg/kg bevestiging mogelijk is met GC/HS Haarbij voldaan

\•mrdt aan de EG criteria voor "loH resolution" MS. Het experiment \o7erd

op een niveau van 20 pg/kg nog eens in vijfvoud herhaald. De

resulta-ten kwamen overeen met de resultaten uit tabel 3.

Over het gebied 10 - 100 ppb \o7as de intensiteit van de basepeak van

iedere component redelijk lineair (Bijlage 6, figuren A en B). De

meet\o7aarden in de figuren zijn gecorrigeerd voor variaties in het injectievolume.

In bijlage 7, 8 en 9 \o7orden de chromatagrammen van een standaard (2 ng/JJl), blanco nier en een op 50 l.lg/kg gespikete nier \o7eergegeven.

Hierbij staat een totaal ionen chromatagram (TIC) en van elke indivi -duele component het chromatagram van de bijbehorende basepeak

afge-beeld.

Extra opzuivering van monsters door niet t\o7ee maal maar drie maal met

hexaan te extraheren bracht geen verdere verbetering. Het niveau

waar-op kon \mrden bevestigd kon hierdoor niet verder \mrden verlaagd.

3.5.3 Storingsanalyse

De SU1-analyse van de tranquillizers \olOrd t niet gestoord door

aamo7e-zigheid van promazine, nitrazepam, diazepam, carbamazepine, oxazepam,

amitriptyline, lorazepam, prochlorperazine, nefopam, cyclizine, pe

r-phenazine en hydroxizine.

4 CONCLUS lES

Het de beschreven procedure is het mogelijk een bevestiging uit te

voeren voor tranquillizers in monsters varkensnier met behulp van aan

gaschromatografie gekoppelde massa selectieve detectie in de EI mode.

Boven een concentratie van 50 l.lg/kg kan de identiteit van de

tranquil-lizers chloorpromazine, azaperon, acepromazine, propionylpromazine,

haloperidol, azaperon en azaperol \o7orden bevestigd, in overeenstemming

met de EG-richtlijnen voor LRMS (Lo\>1 Resolution Hass Spectrometry)

-17-Het de beschreven procedure is het niet mogelijk de aamo1ezigheid van

residuen van xylazine en de beta-receptor blocker carazolol te be

-vestigen.

LITERATUUR

1. Petz, N., 1984, Chemische Analyse von TierarzneimittelrUckständen

in Lebensmittel,

z.

Lebensm. Unters. Forsch. 180, 267-279. 2. Desager, J. P., 1980, Gas Liquid Chromatophic determination of

No prolol in human plasma and urine, Journal of HRG & CC. 3,

129-132.

3. Keukens, H.J. and Aerts, N.H.L., 1989, Determination of residues

of carazolol and a number of tranquillizers in swine kidney by high-performance liquid chromatography 1o1ith ultraviolet and fluo-rescence detection, J. Chrom. 464, 149-161

4. Torcant, A., Premel-Cabic, A., Cailleux, A. and Allain, P. , 1988, Screening for Neutral and Basic Drugs in Blood by Dual Fused-Sili-ca Column Chromatography 1o1ith Nitrogen-Phosphorus Detection, Cl in.

Chem. 34, 1492-1497

5. van Ginkel , L.A. ; Swinkels, P.L.W.J. and Olling, N., 1989, Liquid

Chromatographic Hethad with on-line UV-spectrum identification and

off-line thin-layer chromatographic confirmation for the detection

of tranquillizers and carazolol in pig kidneys, Anal. Chim. Acta

225, 137-146

6. Rauws, A.G. , Olling H., Freudenthal, J. and ten Ham, H., 1976,

Azaperol, a Ne1o1 Netabolite of the Veterinary Butyrophenone

Tranquillizer azaperone, Toxicol. Appl. Pharmacol. 35, 333-339

7. Laitem, L., Bello, I . and Gaspar, P., 1978, Gas chromatographic

determination of tranquillizer residues in body fluids and in the

8. de Ruig, W.G., Stephany, R.W. and Dijkstra, G., 1989, Criteria for the Detection of Analytes in Test Samples, J. Ass. Off. Anal. Chem. 72, 487-490

9. Publikatieblad van de Europese Gemeenschappen; 32ste jaargang, nr. L 351 d.d. 2 december 1989 (Richtlijn 89/610/EEG)

10. Aerts, H.H.L. and Keukens, H.J., 1988, Overzicht van de

analysere-sultaten van het VKA surveillance programma tranquillizers en

be-ta-blockers in varkensnieren. Periode juni t/m september 1987, RIKILT Rapport 88.50

11. Traag, lv.A., Kienhuis, P.G.H., Tuinstra, L.G.N.Th., 1990, Hassa-spectrometrische analyse van enkele beta-antagonisten, RIKILT Rap-port 90.08

12. Vleeskeuringmo1et; Besluit nr. 3518 - Uitvoeringsvoorschriften

C11-4, art. 25 h.

Naam BrutofornY.Jle Molecuulgewicht Naam BrutofornY.Jle Molecuulgewicht Naam BrutofornY.Jle Molecuulgewicht Naam BrutofornY.Jle Molecuulgewicht Naam BrutofornY.Jle Molecuulgewicht Xylazine C12 H16 N2 S 220 Chloorpromazine C17 H19 Cl N2 S 318 Azaperon C19 H22 F N3 0 327 Acepromazine C19 H22 N2 0 S 326 Azaperol C19 H24 F N3 0 329 BIJLPfE 1

-

c~CH3fîl

)lN~

I

CH

H

3

F~CH(OH)CHCHCH-N~

_~

_n

2 2

2\.._/~

Naam Haloperidol Brutoforrrul e C21 H23 Cl F N 02

F'~COCHCHCH

-N

~

2z--2 Molecuulgewicht 375 Naam Carazolol Brutoforrrule C18 H22 N2 02 Molecuulgewicht 298

(l) u 2. 5 E +6 2. 0E +6 ~ 1.5E+6 ""0 c ::::l ...c a: QJ u c

,.,

"tl c ::::l ...0 a: I. 0E+6 5. 0E +5

6

.

OE +5

5. 0E +5

4.0E+S

3.

OE +5

2.0E+5

I

.

OE+S

0.0E+0

figuur 2: EI BIJLFG:: 2 Acepromaz1ne Chlorpromazina Propionylproma z 1ne Xylazine PCB 138 HaleperldOI 1 12

14

16

18

20

Ti me (min. ) figuur 1: EI - chromatagram

(249)

Scan

12.

721

min. of

OATA:W823A16A

.

O

"""

205

177 I

₅₀₁

278

356 404

_4J5

_/

I I I

100

150

200

250

300

350

400

450

s00 ss0

Hass/Charge - spectrum xylazine

l(l ' _I "'Ij

4 . 0

E

+

5

c:

2

14

:::l

₁₅

₃

2

32

....0

\

I a:

₂

_.0

_E

₊

_S

139

/

lJ.

340

0

.

0

E+

0

ll I ~ H.. ~J.

l

I

100

I 50

200

250

300

350

Hass/Charge

figuur 3: EI - spectrum chloorpromazine

( 9

68)

Scan

20.032

min. of

DATA:WBTRA

2

6A

.

D

8

.

0E

+5

07

0

6.

0E

+

S

u c:

233

..,

₁₆₅

-o

_{4. 0E}

₊₅

/

_"'"'

c:

309 32

7

:::l ....0

2. 0

E +

5

1

/

a:

₂₅₈

383

0

.

0

E+

0

I I .

1

0

0

150

2

00

.

250

300

350

400

Ha ss/Charge

figuur 4: EI - spectrum azaperon

(

9 7 5

)

Scan

20.121

min. of

DATA

:

WBTRA26A.D

I\

8

.

0

E

+5

₂

₈₀

~26 0 u

_{6. 0}

_E

₊

₅

₈

₆

/

c:

/

l(l

197

-o / ~

255

c:

4.

0E

+5

₁₉₆

_/

:::l

153

_~/

I

354

....0

ll

~

~

a:

₂

_{. 0E +5}

~

_.

_{. 1}

_{~ ~}

_k.

k

/

0.0E+

0

100

150

2

00

250

300

350

Hass/Charge

CO!POMIMT ITLUIU !ONIM 130 W 177 205 220 11111111 U 11111111111111111 IIU lUl UI 111. 1 !U U lU 100.0 79.5 10 a.o 11.2 16.4 100.0 60.9 13.2 15.2 13.2 100.0 69.3 6.9 15.4 18.4 100.0 86.3 11.6 12.0 15.2 100.0 56.6 11.3 11.7 16.3 100.0 51.5 11.8 12.9 15.3 100.0 58.1 9.5 12.2 15.1 100.0 SU 10.1 13.7 11.6 100.0 56.2 10.3 !U 11.6 100.0 54.6 GI!IDmD 10.3 12.6 15.2 100.0 62.6 ST. OU. 1.85 2.01 2.10 11.90 11.0 Y.C.Itl 18.0 16.0 !U ACIPIOIUIU IONEN _{86 197 241}

m m

IIIIIIIIIIUIIIIIIIIIUIIIUIItUUUIII I 26.1 15.0 !U U.S 100.0 8 27.0 15.0 20.4 44.2 100.0 25.2 lU lU 43.4 100.0 28.2 16.3 20.4 H.O 100.0 26.3 16.0 20.4 43.6 100.0 27.0 13.2 18.4 43.8 100.0 26.6 16.2 !U 43.4 !00.0 21.5 16.8 20.4 43.7 100.0 10 27.5 15.1 20.1 43.4 100.0 25.8 15.3 !U 42.1 100.0 GE". 26.7 15.3 19.6 43.6 100.0 ST.DEY. .90 1.01 .82 .38 Y.C.Ill U 1.0 4.2 .9

mmm

IITUSITIIT !SI CBLOOIPIOBUIII 86 233 272 318 320 lltUt uttlllllltlltlllllllltlll 34.2 14.1 40.6 100.0 40.4 34.7 !U 40.8 !00.0 40.5 34.6 15.3 40.6 100.0 3U 3U !U 40.8 100.0 41.1 33.1 14.3 JU 100.0 JU J4.0 15.0 41.0 100.0 JU 35.5 !U 40.0 100.0 38.6 36.4 15.4 40.1 100.0 40.1 35.5 15.1 40.7 100.0 4U JU lU 40.5 100.0 3U JU 14.8 40.5 100.0 38.1 1.15 .38 .46 3.l 2.6 1.1 AUPIIOL .93 2.3 101 121 165 222

m m

... u •• UlllllllllllltiiiiiiiU u 111: 100.0 18.7

u

13.9 21.7 10.7 100.0 lU 11.4 16.8 27.2 14.6 100.0 20.7 12.5 16.4 25.6 13.2 100.0 18.0 12.2 15.8 24.1 !U 100.0 18.1 11.7 lU 22.1 11.6 100.0 lU lU lU 23.1 12.6 100.0 18.2 11.3 15.3 24.5 11.9 100.0 !U 11.5 !U 2U IG.I 100.0 !U 12.7 lU 2U 11.5 100.0 lU 12.4 14.1 22.4 10.8 100.0 lU lU 15.2 24.0 lU .80 .93 .88 LU 1.38 4.2 8.1

u

7.0 11.5 AUPIIOR

t

or

165 208 2JJ

m

lillil U 111111111111111111 I 11111 100.0 21.9 19.5 36.1 21.2 !00.0 21.4 19.5 36.9 21.3 100.0 21.4 18.0 JU 19.8 100.0 29.5 19.4 J5.3 20.3 100.0 21.6 16.1 32.7 19.4 100.0 26.4 19.4 36.0 19.7

too.o

21

.

a u

.

o

34.5

t

s.o

100.0 2U 19.2 JU 20.1 100.0 2U 18.3 34.6 20.1 100.0 26.6 18.7 JU 18.3 100.0 21.6 18.6 35.0 19.9 1.00 I. 07 1.27 '92 3.6 5.8 3.6 4.6 PJOP!ORTLPIOBUIU 86 197

m

269 294 HO 1111111111 u 111111111111111111111111111 28.6 15.6 22.5 19.0 32.3 100.0 28.0 16.3 23. I 2U 33.6 100.0 26.0 !U 22.1 19.4 34.1 100.0 29.4 16.3 22.2 21.2 32.5 100.0 28.2 15.7 22.2 lU 33.6 100.0 25.5 16.4 22.2 11.9 34.1 100.0 26.6 11.9 23.8 19.5 33.8 100.0 27.5 16.5 22.9 19.4 33.9 100.0 25.1 14.9 22.0 !U 31.3 100.0 25.9 16.7 21.0 18.7 30.5 100.0 27.1 16.3 22.4 19.4 33.0 100.0 1.46 .81 .TS 1.10 1.27 5.4 5.0 3.3 5.7

u

cmomt

m

o

m

I DOL

t

e

m

123 206 224

m

m

1111 UIU 11111111111 u 111111111111111111111111 I lU 2U 100.0 103.1 H.l 30. T JU 100.0 tU )2.4 25.1 20.3 100.0 lU lt.S 30. T lU 100.0 U.l 21. T 2U 2U 100.0

,..,

)1.1 21.1 2U !Ot.O lU 2U 27.1 21.0 IOo.t !OU )1.1 lU lU 100.0 u.) lU 32.5 21.1 101.0 ltU )5.1 10 20.' 21.3 !OU lU

zu

QIIIDDILD 2a.T 21.4 100.0 tT .0

u.s

ST. Dit. UI 3.20 UT 2. 41

~rrhulburhud Vin df rrtrntirtiid v•n df ondrrzochtt vrrbindinqrn rn dr 1ntrrnr stindurd PCB 138

RETENTIETIJD IN liJNUIEN PER WAARNEm6

CO"PONENI IYLAIINE PCB 138 CHLOOR AIAPERON ACE AIAPEROL PROPIOHYL HALOPERIDOL

PROllAl INE PROllAl !NE PROllAl INE

lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll I IZ. 73ó ló.l24 11.m 19.m 19.239 IVobOB 19.914

zo

.

990 12.737 ló.l23 IUBB I 9 .14b 19.m J9.m 19.910 20.987 12.737 ló.l23 17.590 19.147 lUl~ 19.596 19.9ll 20.99) 12. 7lb ló.l23 17.590 19.148 19.237 19.596 19.918 20.987 12.724 lb.l23 17.589 19.m t9.m 19.596 19.912

zo.

988 12.m lb.l24 11.m 19.m 19.237 J9.m 19.920 20.995 12.726 lb.l25 17.)94 19.150 19.239 19.598 19.919 20.998 12.732 16.125 11.m 19.1~6 I 9.240 19.599 19.920 20.99ó 12.732 16.126 11.m 19.156 19.240 19.b09 19.920 20.988 10 12. 72b 16.131 17.600 19.159 19.242 19.b00 19.921 21.002 GEil. 12.731 16.125 11.m 19.m 19.238 19.)99 19.917 20.993 Sl.OEY. .005 .002 .004 .004 .002 .00~ .004 .00~ v.c. lil .042

.

m

.020 .023 .013 .026 .020 .025

CO"PONENT

ION

Htrhu1burhtid Vin dt ibso1utt inttnsi ttit vin dt ondtrzochtt

vrrbJndinqrn rn dt inttrnt slindurd PCB 138

IYLAIINE PCB 138 CHLOOR A lAPEROM ACE AIAPEAOl

PRO"AIINE PAO"AIIIIE 205 360 318 107 m 107 PROPIOIIYL HALOPERIDOL PRO"AIIN( 340 224 llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllUillllllllllllllllllllllllllllllll I 6 10 6E". ST .DEY. Y.C.IXI Y.C.ftl n• l.S. corr. 1071735 13um

mem

2114227 1614l54 2331246 7119472

mmJ

mms

4522747 3956363 1m244 44.31 2UO nm11 9BOJm 6601834 11451799 684101)

mem

8895496 1117679~ 9~49319 6060989

emm

20~6414 24.01 8927172 7~23689 9226383

emm

5697712 4543116 10811869 10398012 6173382 HmOI 5143749

mam

7982749 7117483 10788488 10024184 8669901 798~183

mom

4026466 7876310 6943303 2165763 mms 27.50 34.07 4. 26 11.~2 103U041 7098830 m~m 3836511 10961720 6363345 10321~77 4818027 ~mm 77~6503 mmo 2077631 13607754 ~mm umm 632~197 68171U 6890261 6346994 mm1 507)565 7782272 5041214 1726104 9101736 m2m

mom

3348169 nm84B 8321770 124m&9 5639079 10298878 6088101 10356211 3971082 m2607 ~451186 5061691 1537371 9071979 676623~ 862907~ m1m 3208090 1027309 m11o8 1651631 35.36 15.18 35.36 46.11 12.72 10.30 12.69 24.47 BIJL.Pt"E 5

~ 0.40 ... ~ ... c (j} 0.30 u 1: -0 r u ... t::: (j} _0.20 ... üi c (j} ... ç 0.10 0.00 0.50 ~ 0.40 ... ~ ... c <11 0.30 u c 0 u ... '= _(j} 0.20 .... üi c (j} .... ç 0.10 0.00 ---~---0 o... ... "€}- __ _

---~·~:================~

0 20 40 60 80 100 concentratie (ug/kg)

figuur A: Lineairiteit EI - meting monsters nier

A, 0 ' ' _{'6 - - - A} -20 40 60 80 100 concentratie (ug/kg)

TIC of DATA:WB39AB3A.D Ion 326. 1S amu. from DATA:WB39AB3A.D 1. BE+6 So"plo No"c: ST TR 2.0

~ 8. 0E+5 ~ 6. BE+5 ~ 3. BE +5 Aceprcmaz i ne 2. SE +S 0,) u _{2. BE+S} c "' l. SE+S ~ ; 4. 0E+5

~l

..0 a: 2.0E+5

A

c :J _{1 .0E+S} ..0

~

a: S.0E+4 B.BE+B 12 14 16 18 2B 22 Ti me ( mt n. ) l7.B 17.5 Ti me ( m 18.B 1 n. l 18.

s

19. B

Ion 205.10 amu. from DATA:WB39AB3A.D I _{Ion Hl7.}

1Bamu. from DATA:WB39AB3A.D

2.5E+5 11

A

., 2.0E+5 Xylazi,.,., 2.BE+5 Azaperon

" <J c _{I. 5E+5} "' <J I. SE+5 c "' ~ c _{I. 0E+5} :J ..0 a: 5. BE +4

₍

~ I. BE+5 c

f\:"'

:J ..0 a: 5.BE+4 B.BE+B J 11.5 12.0 12.5 13.0 Ti me (min. ) 17. B 17.

s

Ti me (mi18. B n. l 18.

s

19.0

Ion 318.05 amu. from DATA:WB39AB3A.D Ion 224. BS amu. from DATA:WB39A03A.D

2.5E+5 Chloorprcnazi,.,., I . BE +S ~

A

Halopeddol

~ 2. BE +5 ., u 8. BE +4 c "' I. 5E+5 ~ ~ 6. BE+4 ~ c I. 0E+5 :J ..0 ; 4. BE+4 ..0 a: 5. BE +4

J

\

a: 2_B.BE+0 . BE +4

A

) IS. S 16.0 16.S 18.0 18.S 19.0 19.

s

Ti me ( m 1 n. l Ti me (min. )

Ion 3S9.85 amu. from DATA:WB39A03A.D Ion 340. 1S amu. from DATA:WB39AB3A.D

6. BE +5 ~ PCB 138 u 5.0E+5 2.5E+S 2. BE+5 PropionylprCNzine 0,) u ~ 4.BE+5 <J c I. SE+S

..

~ 3. BE +5 c ~ 2. BE+5 a: I.BE+S ~ 14.0 14.5 IS .B 15.5 Ttme (mtn.l ~ c _{I. BE+S} :J

~

..0 a: 5. BE +4 B.BE+B I 18.0 18.5 19.0 19. 5 Ti me ( mt n. ) CD

....

~

-....!

~ 4. BE +5 ~ 1000

~

2. OE •S • •

~

• '

~

~

I

~

soo

l

l

r

B1 i

12 14 16 18 2B 17.0 17.5 18.0 18.5 19.0

Ti me ( mi n . ) Ti me (min. )

Ion 205.10 amu. from DATA:WB39A10A.D Ion 107.10 amu. from DATA:WB39AI0A.D

1. SE +5 ~ l.BE+5 ~ .

..

1

I

\

..

10008

j

s

oE

••

j

saool

I

I

0 11.5 12.0 12.5 13.B

I

17.B 17.5 18.B 18.5 19.B Ti me (min. ) Ti me (min. )

Ion 318.B5 amu. from DATA:WB39AIBA.D

I

Ion 224.BS amu. from DATA:WB39A1BA.D

4 B00 j

fl

8 BBB

~ 35BBrV~

.~

\

A~N\rv~

1

60BB ~ 3 BBB '

•r

\('!

~.

.,.

c: H!B0

~

2590

l

~

2000

1

I

r

0 i ' i 15.5 16.0 16.5 18.5 19.B 19.5 Ti me (min. ) Ti me (min. l

Ion 359.85 amu. from DATA:WB39A10A.D Ion 340.15 amu. from DATA:WB39A10A.D

1 • 5.0E+S PCB 138 12000 ., 4. 0E+5 ., 10000 ~ ~ 8 0B0 _; 3 . BE +5

i

6 0BB ; 2. BE +5 ~ 4 000

&

1 . BE +5 a: 2 000 B

I

CD 14.8 14.5 15.0 15.5

I

I

18.5 19.8 19.5

c::

Ti me (min. l Ti me (min. l ~ CD

" u 1.130E+6 B.13iaE+S ; 6.BI3E+S -c c: ;;) ~ cc

..

4. BBE+S 2.B13E+S I.SE+S ~ I. BE+S ., -c c: _.; S. BE +4 cc

..

I. 2E+S LBE+S ~ 8. BE+4

..

-c 6. BE +4 c: ;;) ~ cc 4. BE+4 2. BE+4 IS.B S. BE+5 6. BE+5

l

~

4.13E+S -o 3. BE +5 c: ~ 2. BE+S cc I. BE+S 14. B 12 TIC of DRTA:WB39AI3A.D

S4"plo No,.,e: NIER 511l PPB

14 16 18

T 1 me ( m1 n. )

20 Ion 2135. IB amu. from DATA:WB39Al3A.D

11.5 12.0 12.5

Ti me (min. )

Ion 318.BS amu. from DATA:WB39AI3A.D

15.5 16.0

T 1 me ( m1 n. )

Clll oorpr.-z i.,.

16 0 5

Ion 359.85

.

amu. from DATA:WB39A13A.D

PCB 139

14.5 IS. B I 5. 5

T 1 me ( m1 n. )

13.B

Ion 326. IS amu. from DATA:WB39AI3A.D

I. 2E +5 Aceprc.zine IJ I. BE +5 u ; B.BE+4 ~ 6. BE+4 ..; 4. BE +4 cc 2. BE+4 B. BE+B 17.13 17 .'5 18.13 18 0 5 19.0 T1me (min.)

Ion 107.113amu. from DATA:WB39AI3A.D

I. 5E+5 _Az-ron

..

u c: 1. BE+S

.,

-c c: _.; 5. BE +4 cc B.BE+B 17.0 17.5 18

.a

18 0

s

19.13 Ti me (min.)

Ion 224. BS amu. from DATA:WB39AI3A.D

6BBI3B _{H•l_.-idol} IJ SBBBB u 4B88B c: ., -o _313881:! c: ;;) 213808 ~ cc 188BB B 18.5 19.0 19 0 5 Ti me (min. )

Ion 348. IS amu . from DATA:WB39AI3A.D 8B8BB Propiatr"flpr.-zine

"

6eeee u c:

.,

-c _4BB8B c: ;;) ~ 2BBBB cc 0::

e

18.5 19.13 19.5 T 1 me ( m1 n. )

-~

-o