Beworteling van houtige gewassen in vitro : een modelstudie bij Malus

r

v.,

"•-""EK ^> bloembollen r ww '^ usse ->>-•-. ;<?i2i

Nadruk of vertaling, ook van gedeelten, is alleen geoorloofd na schriftelijke toestemming van de directie van het proefstation en de auteur. Het Ministerie van Landbouw, Natuurbeheer en Visserij, de Stichting Proefstation voor de Boomkwekerij, de Stichting Boomteeltproeftuin voor Noord-Brabant, Limburg en Zeeland (Horst), de Stichting Boomteeltproeftuin "De Boutenburg" (Lienden) en de Stichting Boomteeltproeftuin Noord-Nederland (Noordbroek) stellen zich niet aansprakelijk voor eventuele schadelijke gevolgen, ontstaan door het gebruik van de gegevens die in deze uitgave zijn gepubliceerd.

PizS

CENTRALE

INHOUD

pag. WOORD VOORAF SAMENVATTING WOORDENLIJST 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 Uitgangsmateriaal Ontsmetting Initiatie Standaard vermeerdering Standaard beworteling Afharden Plantmateriaal 7 9 SUMMARY 1 1 13 1 INLEIDING 1 5 1.1 Weefselkweekvermeerdering 15 1.2 Centraal Onderzoeklaboratorium voor de Weefselkweek van

Tuinbouwgewassen (COWT) 15 1.3 Voorgeschiedenis en doel van het bewortelingsonderzoek 15

1.4 Opzet van het bewortelingsonderzoek 17

2 MATERIAAL EN METHODEN BIJ BEWORTELINGSONDERZOEK MALUS 18 18 18 18 18 19 22 22

3 DE INVLOED VAN VERMEERDERINGSCONDITIES OP DE

BEWORTELINGSCAPACITEIT 2 4

3.1 Inleiding 2 4

3.2 Voedingsfactoren 24 3.3 Hormonale factoren 28 3.4 Fysische factoren 31

4 OPTIMALISERING VAN DE BEWORTELINGSBEHANDELING 38

4.1 Inleiding 38 4.2 Fasen in het bewortelingsproces 38

4.3 Keuze van auxine 39 4.4 Effecten van verschillende andere mediumfactoren 40

4.5 Positie-effect 4 0

n

Rapport 35 Boomteeltpraktijkonderzoek

DE EFFECTEN VAN VERMEERDERINGS-, BEWORTELINGS- EN

AFHARDCONDITIES OP DE UITGROEI NA UITPLANTEN 48

5.1 Inleiding

5.2 Na-effect van vermeerderingscondities 5.3 Na-effect van bewortelingscondities 5.4 Afhardcondities 5.5 Droogtestress 48 48 50 52 55 ALGEMENE CONCLUSIES ₅₉

6.1 De invloed van vermeerderingscondities op de bewortelingscapaciteit 6.2 Optimalisering van de bewortelingsbehandeling

6.3 De effecten van vermeerderings-, bewortelings- en afhardcondities op de uitgroei na uitplanten

6.4 Toekomst voor bewortelingsonderzoek boomkwekerijgewassen

59 60

60 61

WOORD VOORAF

Bij de in vitro en in vivo vermeerdering van houtige gewassen levert de beworteling vaak problemen op. De scheuten of stekken bewortelen niet of het bewortelingspercentage wisselt sterk. Hierbij kunnen vele factoren een rol spelen. Om een duidelijk beeld te krijgen van de belangrijke factoren, de interacties en hun gevolgen was meer achtergrondkennis nodig van alle opeenvolgende fasen van het bewortelingsproces. Besloten werd het bewortelingsproces fundamenteel en breed te onderzoeken in vitro.

Dit onderzoek werd uitgevoerd op het Centraal Onderzoeklaboratorium voor de Weefselkweek van Tuinbouwgewassen (COWT) in Lisse. Aan het onderzoek werd gewerkt door verschillende personen van het COWT en door verschillende personen die hier werden gedetacheerd vanuit het Proefstation voor de Boomkwekerij (PB): Ir C.J.M. Denissen (PB/COWT), Dr. G.-J. De Klerk (COWT), Ir B.P.A.M. Kunneman (PB/COWT), Ir M. Benschop (CABO/COWT), ing M.R.J. Albers (PB/COWT) en ing J . ter Brugge (COWT).

In het rapport dat hier voor u ligt, worden de resultaten uit het in vitro bewortelingsonderzoek besproken.

Ir. A. van der Schaaf directeur

SAMENVATTING

Bij de slechte beworteling, die optreedt bij weefselkweekvermeerdering en stekken van veel houtige gewassen, kunnen verschillende factoren een rol spelen. Om een beeld te krijgen van de belangrijkste factoren, hun interacties en gevolgen is inzicht nodig in het bewortelingsproces. Het bewortelingsprobleem werd in vitro onderzocht aan het modelgewas Malus. Gedurende de onderzoeksperiode werd op het COWT een protocol ontwikkeld voor de initiatie, vermeerdering en beworteling van Malus, beschreven in hoofdstuk 2.

Oe strategie die gevolgd werd in het bewortelingsonderzoek was de factoren te bepalen die positief dan wel negatief werken bij de goed bewortelbare appelonderstammen of -cultivars. Hierna zullen de belangrijkste factoren getest worden bij slechte cultivars. Het onderzoek bestond uit drie delen: (1) de invloed van vermeerderingscondities op de bewortelingscapaciteit; (2) het optimaliseren van de bewortelingsbehandeling; (3) het effect van de verschillende vermeerderings-, bewortelings- en afhardcondities op overleving en groei na uitplanten.

In het eerste deel, beschreven in hoofdstuk 3, werd onderzocht hoe veranderingen in voedings-, hormonale of fysische factoren tijdens de vermeerderingsfase de bewortelingscapaciteit beïnvloeden.

Vermeerdering op MS-medium en minimaal 30 g/l suiker leidde tot een goede vermeerdering en strekking van de scheuten. Het type suiker in het vermeerderings-medium (sorbitol of saccharose) had weinig invloed op de beworteling. Bij onvoldoende bewortelingsresultaten door onvoldoende strekking van de scheuten bood het dubbele-laag vermeerderingssysteem uitkomst. Door hogere concentraties BAP of IBA of door hormonen die niet standaard aan het voedingsmedium worden toegevoegd, bijvoorbeeld GA3 of ABA, nam over het geheel de directe bewortelingscapaciteit af. ABA had bij een lage concentratie in het vermeerderings-medium enig positief effect op de directe bewortelingscapaciteit. Er waren geen 'carry-over'-effecten op de vermeerderings- of indirecte bewortelingscapaciteit (na een standaard tussen vermeerdering). De bewortelingscapaciteit nam toe met het aantal cycli en was afhankelijk van de lengte van de vermeerderingscyclus.

Aangetoond werd dat er rust ontstaat in vitro onder standaard omstandigheden. Gekeken werd of een aantal voedings-, hormonale of fysische factoren tijdens de vermeerderingsfase de ontwikkeling van rust beïnvloed. Met name de temperatuur tijdens de vermeerdering speelde een rol bij het ontwikkelen en doorbreken van rust in vitro. Bij temperaturen boven 12,5°C werd rust geïnduceerd en bij 5 tot 10°C werd rust doorbroken. Suiker en het hormoon ABA hadden geen duidelijke invloed. Daglengte, lichtintensiteit, lengte van de vermeerderingscyclus en het hormoon GA3 hadden geheel geen invloed.

De timing van de verschillende fasen in het bewortelingsproces wordt beschreven in hoofdstuk 4 (dedifferentiate, inductie en differentiatie). Deze timing bood de mogelijkheid om eenvoudig de werking van stoffen vast te stellen.

Voor de aanleg van wortelmeristemen was gebruik van auxine noodzakelijk. Op de uitgroei van wortelprimordia werkten auxines remmend. De beste auxines voor beworteling waren IAA en IBA. Polyamines en fenolen bevorderden de beworteling sterk. Geteste anti-cytokinines bleken niet te werken als anti-cytokinines. Het anti-auxine PCIB werkte redelijk als anti-auxine.

Korte scheuten bewortelden over het algemeen slechter dan lange, scheuten. Het midden van een scheut bewortelde beter dan de onder- en bovenkant.

De fluctuaties in de bewortelingscapaciteit waren niet te verklaren door toevallige factoren als de nauwkeurigheid van medium bereiden, het lang bewaren van medium, de persoon die de experimenten inzet of de plaats in de klimaatcel tijdens de bewortelingsfase.

In het derde deel van het onderzoek, beschreven in hoofdstuk 5, werd het effect van de verschillende vermeerderings-, bewortelings- en afhardcondities op de overleving en groei na uitplanten onderzocht. Het succes bij afharden bleek afhankelijk van de in vitro vermeerdering en

be worteling. De afhardresultaten bleken beter na vermeerdering op MS-medium en bij een suikerconcentratie van minimaal 30 g/l.

Het aantal wortels per scheut was sterk van invloed op de groei na uitplanten. Bij vorming van drie wortels of meer tijdens de bewortelingsfase is de kans op overleven onder normale afhardcondities 100%. Bewaren in koude van weefselkweekmateriaal voor het uitplanten, gaf slechte afhardresultaten.

Goede kasklimaatcondities zijn bij af harden van weefselkweekplanten van belang. Bij standaardcondities tijdens de afhardfase groeiden de bewortelde Malus scheuten doorgaans zowel boven- als ondergronds goed. Indien extra C02 werd toegevoegd nam het overlevingspercentage toe bij vooral slecht bewortelde scheuten.

Onder standaard afhardcondities trad bij Malus 'Jork 9' geen droogtestress, gemeten als proline-accumulatie, op. Indien bij lage relatieve luchtvochtigheid, zonder plastic werd afgehard trad de eerste drie dagen in een aantal gevallen enige droogtestress op. Ook deze weefselkweekplanten konden echter, afhankelijk van het aantal wortels, met een voldoende watergift overleven. De proline die aan het bewortelingsmedium werd toegevoegd bood geen extra bescherming tegen droogtestress.

Geconcludeerd kan worden dat sommige bewortelingsproblemen zowel in vitro als in vivo opgelost kunnen worden door te zorgen voor goed uitgangsmateriaal. Naast een goed bewortelingsprotocol is een goed vermeerderingsprotocol van uitgangsmateriaal van belang. Er zijn verschillende factoren geïdentificeerd wat betreft het uitgangsmateriaal, die een betere beworteling tot gevolg hebben. Ook zijn er een aantal factoren aangereikt voor optimalisering van de bewortelingsbehandeling. De resultaten van het COWT-onderzoek bieden een aantal interessante aanknopingspunten, ook voor de in vivo beworteling van stekken. Er is echter (nog) geen 'universele' bewortelingsbehandeling voor moeilijk bewortelbare gewassen.

Verschillen in effecten van diverse medium componenten tijdens de verschillende fasen worden verder bestudeerd. De belangrijkste factoren zullen nogmaals getest worden bij slecht bewortelbare cultivars.

SUMMARY

The poor rooting which occurs in the tissue culture and cuttings of many woody crops can be attributed to various factors. Insight into the rooting process is required, in order to be able to ascertain the most important of these, and their interactions and effects. Therefore the problems of rooting were researched in vitro on the model crop Malus. During the research period a protocol was developed at COWT for the initiation, multiplication and rooting of Malus, as described in chapter 2.

The strategy followed in the rooting research was to determine the positive and negative factors which influence the readily rooting apple cultivars and rootstocks. The most important of these factors will be tested on poorly rooting cultivars at a later stage. The research had three parts: (1) ascertaining the influence of propagation conditions on rooting capacity; (2) optimizing the rooting treatment; (3) investigating the effect of the various conditions of multiplication, rooting and hardening-off on survival and growth after planting out.

In the first part of the research, described in chapter 3, the influence on rooting capacity of changes in nutrition and hormonal and physical factors during propagation was investigated. Propagation on MS medium and a minimum of 30 g/l of sugar produced good multiplication and elongation of the shoots. The type of sugar used in the multiplication medium (sorbitol or saccharose) had little influence on rooting. A double layer propagation system solved the problem of insufficient rooting caused by insufficient shoot elongation.

The rooting capacity was generally reduced by higher concentrations of BAP or IBA or by hormones such as GA3 or ABA that were not a standard addition to the nutrient medium. At a low concentration in the nutrient medium AHA slightly enhanced the direct rooting capacity. There were no carry-over effects on the propagation or indirect rooting capacities (after a standard intermediate multiplication).

The rooting capacity increased with the number of cycles and was dependent on the length of the multiplication cycle.

It was demonstrated that under standard conditions, dormancy occurs in vitro. The effect of various nutritional and physical and hormonal factors during the multiplication period on the development of dormancy was investigated. It was shown that the temperature during multiplication plays an especially important part in the induction and breaking of dormancy in vitro. Dormancy was induced at temperatures above 12.5°C , and was broken at temperatures of 5 to 10°C. Sugar and the hormone ABA did not have any clear influence. Day length, light intensity, the duration of the multiplication cycle and the hormone GA3 had no influence at all. The timing of the various phases in the rooting process is described in chapter 4 (dedifferentiate, induction and differentiation). This timing enabled the working of the substances to be determined easily.

Auxin was necessary for the initiation of root meristems. Auxins inhibited the outgrowth of root primordia. The best auxins for rooting were IAA and IBA. Polyamines and phenols greatly improved rooting. The anti-cytokinins tested proved not to function as such. PCIB functioned reasonably as an anti-auxin.

Short shoots generally rooted less well than long shoots. The middle of a shoot rooted better than the top or bottom.

The fluctuations in the rooting capacity could not be explained by chance factors such as the accuracy with which the medium was prepared, the length of time the medium was stored, the person who prepared the medium or the location in the climate chamber during the rooting phase.

In the third part of the research, described in chapter 5, the effect of the different conditions of multiplication, rooting and hardening-off on survival and growth after planting out were investigated. The success of the hardening-off proved to be dependent on the multiplication and rooting in vitro. The results of hardening-off were better after multiplication in MS medium and

with a sugar concentration of at least 30 g/l.

The number of roots per shoot greatly influenced growth after planting out. If three or more roots developed during the rooting phase, the probability of survival under normal hardening-off conditions was 100%. Cold storage of tissue culture materials for planting out gave poor hardening-off results.

Good greenhouse climate conditions are important in the hardening-off of tissue culture plants. Under standard conditions during the hardening-off phase the rooted Malus shoots generally grew well, both above and under the ground. If extra C 02 was administered, the survival

percentage — especially of poorly rooted shoots — increased.

Under standard hardening-off conditions Malus 'Jork 9' did not exhibit any drought stress, measured as accumulation of proline. When hardening-off took place without plastic covering and at low relative air humidity, several cases of drought stress occurred in the first three days. However, these tissue culture plants survived if watered sufficiently and if they had a sufficient number of roots. The proline added to the rooting medium gave no extra protection against drought stress.

In can be concluded that some rooting problems, both in vitro and in vivo, can be solved by ensuring that the starting material is of good quality. In addition to a good rooting protocol, it is important to have a good propagation protocol for starting material. Several factors that improve rooting were identified for the starting material. Factors for optimizing the rooting treatment were also discovered. The results of the COWT research have several interesting implications, for example for the in vivo rooting of cuttings. However, no 'universal' rooting treatment has yet been found for crops that are difficult to root.

Differences in the effects of diverse medium components during the various phases are being researched further. The most important factors will be tested again on cultivars that are difficult to root.

WOORDENLIJST

ABA, absicinezuur Adult Adventief orgaan Agar Auxinen BA(P) Bewortelingscapaciteit Callus Ca(0CI)2 Cytokininen Fasciatie Fenolen Foto-oxydatie GA, gibberellinen IAA IBA Infectie Initiatie 2-IP In vitro In vivo Juveniel Macro-elementen Maturatie Meristeem Micro-elementen MS-medium NAA NaOCI PCIB PG Ph Polyamine

Een plantenhormoon dat o.a. groei stilzet en mogelijk een rol speelt bij de inductie van rust.

Volwassen stadium van de plant waarin bloei plaats kan vinden; adventieve wortelvorming verloopt doorgaans moeilijk.

Orgaan (wortels, scheuten of embryo's) ontstaan uit planteweefsel dat dit orgaan nog niet bezat.

Een mengsel van stoffen (uit zeewier) die het voedingsmedium doen stollen (gelatine-achtig).

Plantehormonen die in weefselkweek o.a. wortelmeristemen induceren en de uitloop van okselknoppen remmen.

Benzyladenine ofwel benzylaminopurine; een cytokinine

Het vermogen van een scheut om tijdens de standaard telingsbehandeling adventieve wortels te vormen; uitgedrukt in bewor-telingspercentage en aantal wortels per bewortelde scheut.

Niet gestructureerd en ongedifferentieerd woekerweefsel. Calciumhypochloriet; een ontsmettingsmiddel

Plantehormonen die de uitgroei van okselknoppen bevorderen en adventieve wortelvorming remmen.

Groeistoring waardoor stengels aan elkaar groeien. Stoffen die o.a. de auxineafbraak kunnen remmen.

Oxydatie (omzetting) van stoffen door zuurstofradicalen die gevormd zijn onder invloed van licht. De auxines IAA en IBA worden gefoto-oxydeerd. Deze oxydatie wordt versneld door riboflavine.

Groep van plantehormonen, die o.a. de celstrekking en soms bloei induceren.

Indolazijnzuur; een auxine Indolboterzuur; een auxine

Het besmet raken/zijn met schimmels, bacteriën, etc. Het in weefselkweek brengen van plantmateriaal. Ne-(2-isopentenyl)adenine; een cytokinine

Letterlijk 'in glas'; weefselkweek/-teelt in een kweekbuis, kolf, etc. op of in een kunstmatig voedingsmedium onder steriele en gecondi-tioneerde omstandigheden.

Teelt in de kas, open veld, etc.

Jeugdfase; het onvolwassen, jonge en vegetatieve stadium van plantmateriaal. De plant kan nog niet bloeien; adventieve wortelvorming verloopt doorgaans makkelijk.

Groep van elementen zoals N, P, K, Ca, Mg, Fe, etc. die in grote hoeveelheden aan het voedingsmedium worden toegevoegd.

Proces dat leidt tot overgang naar de adulte fase.

Groep van (delende) cellen in de top van een wortel of spruit.

Groep van elementen zoals Bo, Zn, Mo, Mn, etc. die in kleine hoeveelheden aan het voedingsmedium worden toegevoegd.

Samenstelling van het voedingsmedium volgens Murashige en Skoog (1962).

Naftaleenazijnzuur; een auxine

Natriumhypochloriet, ontsmettingsmiddel (bleekwater) Para-chloorfenoxyisoboterzuur; een anti-auxine

Phloroglucinol; een fenol Zuurgraad

Stoffen met een hormoonachtige werking, maar die in veel hogere concentraties worden toegediend.

Rejuvenatie Sterilisatie Tween Vermeerderings-capaciteit Vermeerderingsfactor Vitrificatie

Het opnieuw juveniel worden na vegetatieve vermeerdering van adult plantmateriaal (na een aantal cycli in weefselkweek).

Doden van schimmels, bacteriën, etc.

Uitvloeier die de oppervlaktespanning verlaagt, waardoor de sterilisatie beter verloopt.

Het vermogen van een scheuttop om tijdens een standaard vermeer-dering nieuwe scheuten te vormen; uitgedrukt als aantal scheuten per ingezette scheut.

Het aantal scheuten per ingezette scheut gevormd tijdens de vermeerderingsfase.

Opname van teveel water in de plant door groeistoring, waardoor de plant glazig, waterig lijkt (succulent).

I

Rapport 35 Boomteeltpraktijkonderzoek

INLEIDING

1.1 WEEFSELKWEEKVERMEERDERING

Bij gewassen waar de veredeling langzaam verloopt, is het gewenst individuen die een aantal gunstige eigenschappen bezitten, vegetatief te vermeerderen. Dit geldt voor veel siergewassen en houtige gewassen. Vegetatieve vermeerdering kan via de klassieke methoden: stekken, enten of oculeren. Indien een snelle of ziektevrije vermeerdering gewenst is, wordt vermeerderd via weefselkweek.

De weefselkweek heeft na de Tweede Wereldoorlog een grote ontwikkeling doorgemaakt. Dit werd mogelijk door de ontdekking van de plantehormonen. Door plantehormonen kan de ontwikkeling van planten in weefselkweek (in vitro) gestuurd worden. In Nederland begon de commerciële weefselkweekvermeerdering midden jaren 70. In 1990 was het aantal geproduceerde plantjes opgelopen tot naar schatting 100 miljoen. Sindsdien is de produktie evenwel sterk gedaald omdat Nederlandse weefselkweekbedrijven hun produktie naar lage-lonen landen verleggen. In 1993 werden naar schatting nog ca. 60 miljoen weefselkweekplantjes in Nederland geproduceerd. De produktie betrof voor het grootste deel snijbloemen (m.n. Gerbera), potplanten (o.a. Nephrolepis en Ficus) en bollen {Li/ium). Van de boomkwekerijgewassen en vaste planten was Hosta het belangrijkst. Elders in Europa is de weefselkweekvermeerdering van houtige gewassen van meer belang, met name bij Rhododendron en onderstammen voor fruitgewassen. De interesse voor vaste planten uit weefselkweek neemt momenteel snel toe i.v.m de vraag naar ziektevrij uitgangsmateriaal.

1.2 CENTRAAL ONDERZOEKLABORATORIUM VOOR DE WEEFSELKWEEK

VAN TUINBOUWGEWASSEN (COWT)

Het COWT in Lisse doet onderzoek op het gebied van weefselkweekvermeerdering. In dit in 1986 opgerichte laboratorium werd het weefselkweekonderzoek ondergebracht van het Proefstation voor de Glasgroenten en Bloemisterij (PGB) in Aalsmeer, Proefstation voor de Boomkwekerij (PB) in Boskoop en het Laboratorium voor Bloembollenonderzoek (LBO) in Lisse. Dit zijn onderzoekinstellingen voor praktijkgericht onderzoek in Nederland.

Op het COWT worden voor moeilijk te vermeerderen gewassen vermeerderings-protocollen ontwikkeld. Daarnaast wordt onderzoek gedaan aan algemene problemen die het opstellen van efficiënte vermeerderingsprotocollen bij een groot aantal gewassen bemoeilijken. Eén van deze problemen is de be worteling.

1.3 VOORGESCHIEDENIS EN DOEL VAN HET BEWORTELINGSONDERZOEK

Vooral bij houtige gewassen blijkt de beworteling in vivo en in vitro vaak problemen op te leveren. De stekken of scheuten bewortelen slecht of helemaal niet of het bewortelingspercentage schommelt sterk. In Figuur 1 zijn fluctuaties weergegeven in de in vitro beworteling van Malus 'Golden Delicious' onder standaard omstandigheden op het COWT in de periode 1989-1991.

Bij slechte beworteling kunnen veel factoren een rol spelen. Deze factoren zijn te on-derscheiden in interne factoren (het ontwikkelingsstadium o.a. mate van juveniliteit; het al dan niet in rust zijn; de fysiologische condities van de moerplant, het stek of de scheut) en externe factoren (o.a. toedienen van hormonen en voedingsstoffen; het klimaat tijdens het bewortelingsproces). De vele interacties tussen de factoren veroorzaken een onvoorspelbaar eindresultaat.

100 h 80 © cd • * - »

c

<D O

£ 60 h

<D Q . CO CD _{40 h}

r

2oh

o

CD

m

" L/\JU N ^

1989

j

i-1990

1991

Figuur 1

Fluctuaties in bewortelingspercentage van Malus 'Golden Delicious' in de periode 1989-1 9 9 1989-1 .

Om een duidelijk beeld te krijgen van de belangrijke factoren, hun interacties en hun gevolgen is meer achtergrondkennis nodig van alle opeenvolgende fasen van het bewortelingsproces. Besloten werd daarom het bewortelingsprobleem fundamenteel en breed te onderzoeken in vitro. Voor een in vitro studie van de beworteling werd gekozen omdat in vitro sturing van en manipulatie in de diverse processen het best mogelijk is. Gedacht kan hier worden aan het veranderen van condities tijdens de vermeerderingsfase en/of de bewortelingsfase en het effect hiervan op de beworteling.

Gezien het algemene belang en de kennis van weefselkweek van fruitgewassen is gekozen voor het modelgewas Malus. De problemen bij de beworteling van Malus zijn representatief voor vele andere gewassen. Omdat de beworteling een vorm is van regeneratie, zijn de resultaten van het bewortelingsonderzoek ook relevant voor de recalcitrantie bij adventieve scheutvorming en somatische embryogenese.

In een Europees samenwerkingsverband gedurende 1986-1989 (COST 87) werd een standaard vermeerderings- en bewortelingsprotocol voor Malus opgesteld (beschreven in hoofdstuk 2), omdat de resultaten tussen de diverse laboratoria nogal verschilden. Daarnaast werd gekozen voor onderzoek aan een aantal dezelfde cultivars: 'Golden Delicious' en ' M 2 6 ' . Omdat met name de beworteling bij houtige gewassen problemen gaf werd hierna de werkgroep 'root regeneration' (werkgroep binnen COST 87 gedurende 1990-1993) opgericht. Afgesproken werd met dezelfde Malus cultivar te werken: 'Jork 9 ' . Dit materiaal werd op het COWT geïnitieerd en in 1990 verspreid onder de deelnemers van het project.

1 . 4 O P Z E T V A N H E T B E W O R T E L I N G S O N D E R Z O E K

De strategie die gevolgd werd was de factoren te bepalen die positief dan wel negatief werken bij de goed bewortelbare appelonderstammen of -cultivars. Het bewortelings-onderzoek op het COWT bestond uit drie delen.

Ten eerste werd de invloed van vermeerderingscondities op de bewortelingscapaciteit onderzocht. Gekeken werd naar de invloed van medium componenten of fysische factoren tijdens de vermeerdering op de conditie van de scheut. Deze conditie bepaalt de bewortelingscapaciteit en kan mogelijk gestuurd worden. De conditie van de scheut is o.a. afhankelijk van de ontwikkelingsprocessen die in de scheut plaatsvinden.

In het tweede deel van onderzoek op het COWT werd het effect van de bewortelingscondities op de bewortelingscapaciteit bekeken ter optimalisering van de bewortelingsbehandeling. Het bewortelingsproces is te onderscheiden in verschillende bewortelingsfasen. Deze fasen werden allereerst duidelijk onderscheiden. Vervolgens werden verschillen in effecten van medium componenten tijdens de verschillende fasen bestudeerd.

In het derde deel van het onderzoek werd het effect van de verschillende vermeerderings-, bewortelings- en afhardcondities op de overleving en groei na uitplanten onderzocht. Over het algemeen is het afharden van weefselkweekplanten bij houtige gewassen een probleem. Gekeken werd o.a. naar het optreden van droogtestress, gemeten als proline-accumulatie, na het uitplanten.

In de volgende hoofdstukken zullen de resultaten verkregen bij deze verschillende onderdelen besproken worden. Het eerste en laatste deel van het onderzoek zijn afgesloten eind 1994. Het deel met betrekking tot de verschillende bewortelingsfasen loopt nog een aantal jaren door. Hier zullen onder andere de belangrijkste factoren nogmaals getest worden bij slechtbewortelende cultivars.

2 MATERIAAL EN METHODEN BIJ

BEWORTELINGSONDER-ZOEK MALUS

2.1 UITGANGSMATERIAAL

Bij houtige gewassen is het gewenst om het uitgangsmateriaal tevoren onder schone omstandigheden op te kweken in verband met de hoge kans op uitwendige en inwendige infectie. Bij Malus werd uitgegaan van scheuttopjes en/of oogstekken (zonder blad), gesneden van uitgelopen éénjarige takken, of van okselknoppen, met stengelstuk losgeknipt van niet uitgelopen éénjarige takken (bij voorkeur vanaf eind januari omdat dan aan de koudebehoefte is voldaan en de knoppen uit rust komen).

2.2 ONTSMETTING

De knoppen werden stapsgewijs ontsmet (zachter materiaal moet milder ontsmet worden). De takken werden af geborsteld met leidingwater en enkele druppels vloeibare zeep (Burtan). Hierna werden de takken in stengelstukken met knoppen geknipt, gespoeld onder stromend leidingwater en vervolgens 30 sec. in 7 0 % ethanol gespoeld. Vóór de ethanol behandeling kan eventueel een warmwaterbehandeling uitgevoerd worden om interne infecties kwijt te raken (zoals bij Acer, Albers et al. 1995). Vervolgens werden de knoppen ontsmet gedurende 10 min. in 5% calciumhypochloriet (Ca(OCI)2) of gedurende

20 min. in 2 % natriumhypochloriet (NaOCI) waaraan in beide gevallen enkele druppels Tween waren toegevoegd. Tot slot werden de knoppen driemaal 10 min. gespoeld in steriel water in de entkast. Bij dubbele sterilisatie werden de knoppen na een volledige sterilisatie half uitgeprepareerd en nog eens 10 min. in 5% (of 2.5%) Ca(OCI)2 ontsmet.

2 . 3 INITIATIE

De meristemen werden uit de okselknoppen geprepareerd (eventueel kunnen de laatste bladprimordia blijven zitten) en op de schuin gestolde voedingsbodem geplaatst. Een schuin gestolde voedingsbodem had als voordeel dat het meristeem niet in het condensvocht kwam te liggen. De samenstelling van de initiatiemedia is weergegeven in Tabel 1. De macro-elementen waren samengesteld in eenvierde van de concentratie volgens het gemodificeerde Lepoivre-medium (Quoirin et al. 1977) of in een halve sterkte volgens het MS-medium (Murashige en Skoog 1962). Er was nauwelijks verschil in resultaat tussen beide media. De micro- en spore-elementen waren in beide media samengesteld volgens Lepoivre.

Infecties waren veelal binnen een week zichtbaar en konden, afhankelijk van het uitgangsmateriaal, oplopen van 40 tot 100%. De meristemen die gingen groeien, werden na een tot twee weken op vers initiatiemedium overgezet. Zeker indien bruinkleuring (fenolvorming) optrad, werden de knoppen op vers medium overgezet. De meristemen werden opgekweekt bij 2 0 ° C , 16 uur licht en 50-70 //mol.m^.sec'1.

2.4 STANDAARDVERMEERDERING

Na een aantal maal (twee- tot vijf maal) overzetten op vers initiatiemedium werd, indien de axillaire knoppen gingen uitlopen t o t scheuten, overgegaan op het vermeerderingsmedium. De macro- en micro-elementen waren samengesteld volgens MS (Tabel 1). Als suiker werd saccharose of sorbitol gebruikt. Voor het

bewortelingsonderzoek werd sorbitol gebruikt in het vermeerderingsmedium (COST-afspraak). Sorbitol is een suiker die van nature in appelscheuten voorkomt. De vermeerderingscyclus bij gebruik van sorbitol was zes weken en bij gebruik van saccharose vier weken. Daarna kan het plantmateriaal gaan 'verouderen' (bladnecrose).

Malus was erg gevoelig voor de gebruikte agar. Dit geldt voor de meeste

boomkwekerijgewassen. Een andere partij of merk agar kon vitrificatie (waterigheid) en een slechte beworteling veroorzaken. Bij vermeerdering in buizen werd 6 g/l agar 'BBL granulated' toegevoegd en bij vermeerdering in potten of containers 7 g/l.

De vermeerdering werd vooral gestimuleerd door het hormoon cytokinine. Dit hormoon bevordert de celdeling. Hierdoor lopen axillaire knoppen aan de scheut uit. Bij de vermeerdering van houtige gewassen wordt het cytokinine benzyladenine ( = benzylaminopurine; BA(P)) het meest gebruikt.

De scheutlengte was bij overenten 0,5 tot 1,5 cm (Figuur 2a). Grotere, compactere typen explantaten leverden meestal een hogere produktie (Figuur 2b). De stengel werd direct onder een blad met axillaire knop, doorgesneden. De scheut werd opgekweekt gedurende zes weken bij 2 0 ° C , 16 uur licht en 50-70 //mol. m'2. sec1. Pas geïnitieerde cultures moesten de eerste cycli vaak eerder overgezet worden vanwege vitrificatie of callus vorming.

Bij 2 5 ° C was vanwege snellere groei een cyclus van 4 weken gebruikelijk; de conditie van het materiaal werd bij deze temperatuur soms minder door vitrificatie.

Na vermeerdering werden afhankelijk van het experiment parameters gemeten als: het aantal scheuten per cluster, de vermeerderingsfactor, het percentage vitrificatie, de lengte van de scheuten per cluster, het aantal bladeren per cluster/scheut en/of het gewicht per cluster/scheut. In alle experimenten werden minstens 30 scheuten (buizen) ingezet per behandeling.

2.5 STANDAARD BEWORTELING

Indien de vermeerdering voldoende scheutjes had opgeleverd, konden de scheutjes beworteld worden. Voor de beworteling werden bij voorkeur gestrekte scheuten gebruikt (Figuur 2c). De scheutlengte lag tussen 1 tot 2 cm. Aan de onderkant van het scheutje was de stengel circa 2 mm vrij van blad en okselknoppen, zodat hier wortels aangelegd konden worden (Figuur 2d). Cultures die slechts enkele malen zijn doorvermeerderd na initiatie, bewortelden over het algemeen slecht.

De macro- en micro-elementen in het bewortelingsmedium van Malus waren samengesteld volgens de halve sterkte van het gemodificeerde Lepoivre-medium (Tabel 1). Als suiker werd saccharose toegevoegd. De bewortelingsresultaten zijn op saccharose beter dan op sorbitol. Voor de in vitro vermeerdering en beworteling van Malus werd op het COWT 'BBL-granulated agar' gebruikt (Tabel 1). Op enkele andere agars werd de beworteling sterk gereduceerd.

De wortels die in de weefselkweek ontstonden, waren adventieve wortels. Deze ontstonden op andere plaatsen dan het primaire wortelstelsel. De functie van het normale wortel-systeem en de adventieve wortels is hetzelfde: opname van water en voedingsstoffen uit een medium en stevigheid bieden aan de plant.

Bij de vorming van adventieve wortels speelt het hormoon auxine een belangrijke rol. Bij beworteling van houtige gewassen wordt meestal het auxine indolboterzuur (IBA) gebruikt. Onder invloed van auxine, vond de eerste week de aanleg van wortelprimordia plaats in het donker bij 2 0 ° C (microscopische waarnemingen, hoofdstuk 4). Daarna werden de scheuten voor uitgroei van de primordia tot wortels drie weken in het licht geplaatst bij 20°C, 16 uur licht en 50-70 //mol.m'2.sec"1. Als het auxine niet verwijderd werd, groeide een aantal primordia niet uit (zie hoofdstuk 4). Door gebruik van riboflavine werd de oxydatie van auxine door licht sterk versneld (Gorst et al. 1983, Van der Krieken et al. 1992). Het is ook mogelijk na een week de scheuten op medium zonder auxine over

te zetten. Dit betekent echter een extra handeling.

Het bewortelingsonderzoek werd uitgevoerd aan scheutjes (minimaal 1 cm) of aan stengelschijfjes (1 mm). De stengelschijfjes werden gesneden van een gestrekte stengel (m.b.v. een speciaal ontwikkeld houdertje met elf scheermesjes). Vooral bij onderzoek naar de diverse bewortelingsprocessen is het systeem met wortelschijfjes zeer bruikbaar (Van der Krieken et al. 1993, De Klerk en Caillât 1994). Bovendien is voor dit systeem weinig materiaal nodig (arbeids- en kostenbesparend).

Na beworteling werden afhankelijk van het experiment parameters gemeten als: het percentage beworteling, het aantal wortels per (bewortelde) scheut en/of het gewicht per scheut. In alle experimenten werden minstens 30 scheuten (buizen) ingezet per behandeling. Bij experimenten met schijfjes werden 90 schijfjes per behandeling (30 schijfjes per petrischaal) ingezet.

Figuur 2

Malus ' M 2 0 ' . (a) Scheut aan het begin van de vermeerderingsfase en (b) cluster van

scheuten na zes weken, (c) Scheut aan het begin van de bewortelingsfase en (d) bewortelde scheut na vier weken.

Tabel 1

Samenstelling media voor Malus (per liter)

Voedingsstoffen Macro-elementen NH4N03 KN03 MgS04.7H20 KH2P04 Ca(N03)2.4H20 CaCI2.2H20 Micro-elementen ZnS04.7H20 H3B03 MnS04.H20 FeNaEDTA Spore-« tementen CuS04.5H20 KI Na2Mo04.2H20 CoCI2.6H20 Vitaminen thiamine.HCl myo-inositol nicotinezuur pyridoxine.HCI riboflavine proline Hormonen BA IBA Suiker Saccharose Sorbitol Agar BBL granulated Initiatie-medium* 100 mg 475 mg 93 mg 67 mg 300 mg 8.6 mg 6.2 mg 0.76 mg 40 mg 0.025 mg 0.08 mg 0.25 mg 0.025 mg 1 mg 100 mg 0.5 mg 0.5 mg 1 mg 30 g 7 ' Initatie-medium** 825 mg 950 mg 185 mg 85 mg 220 mg 8.6 mg 6.2 mg 0.76 mg 40 mg 0.025 mg 0.08 mg 0.25 mg 0.025 mg 1 mg 100 mg 0.5 mg 0.5 mg 1 mg 30 g 7 g Vermeerderings-m e d i u Vermeerderings-m * * * 1650 mg 1900 mg 370 mg 170 mg 440 mg 8.6 mg 6.2 mg 16.9 mg 40 mg 0.025 mg 0.83 mg 0.25 mg 0.025 mg 1 mg 100 mg 0.5 mg 0.5 mg 1 mg 0.1 mg 30 g 6 g Bewortelings-m e d i u Bewortelings-m " * * * 200 mg 950 mg 185 mg 135 mg 600 mg 8.6 mg 6.2 mg 0.76 mg 40 mg 0.025 mg 0.08 mg 0.25 mg 0.025 mg 1 mg 100 mg 0.5 mg 0.5 mg 1 mg 100 mg 0.2 mg 30 g 6 g

PH 5.5; instellen voor toevoeging agar 15 ml/buis; 100 ml/pot

Macro-elementen volgens gemodificeerd Lepoivre (kwart concentratie)

Macro-elementen volgens MS (halve concentratie)

IBA kan weggelaten worden; i.p.v. sorbitol kan saccharose gebruikt worden

Riboflavine en proline kunnen weggelaten worden, na 1 week overzetten op auxinevrij medium. De oxydatie van auxine door riboflavine gebeurt in licht

2.6 AFHARDEN

Na vier weken beworteling in vitro werden de scheuten (Figuur 2d) in vivo uitgeplant in een medium van 5 0 % turf (Finnpeat ST400 B6) en 5 0 % perliet (fijne maat). De scheuten werden afgehard in een klimaatkas onder geconditioneerde omstandigheden bij 20 tot 2 5 ° C , met bijbelichting (SON-T) tot 16 uur licht. De planten stonden onder een tunnel van transparant plastic folie en onder een Macpenny mistsysteem bij een relatieve luchtvochtigheid van minimaal 9 6 % . Na twee weken werd gestart met luchten en na vier weken kon het plastic folie geleidelijk verwijderd worden. Indien nodig werd, enkele weken na uitplanten, een fungicide-bespuiting uitgevoerd (eenmaal per week; afwisselend met Rovral en Eupareen-M in de halve aanbevolen concentratie). De planten werden vier tot zes weken na uitplanten bijbemest met Kristalon blauw (0,5 g/l).

Vier weken na uitplanten werd het overlevingspercentage bepaald en werden de bovengrondse en ondergrondse delen gemeten. De bovengrondse parameters waren: het aantal bladeren per scheut, de scheutlengte en/of scheutklasse. De scheutklasse (Figuur 3a) liep van 0 (erg kleine, niet gegroeide scheut; kleiner dan 1,5 cm) tot 5 (zeer goed ontwikkelde scheut; groter dan 7,5 cm). De ondergrondse parameters waren: het bewortelingspercentage, het aantal wortels per bewortelde scheut, de wortellengte van de langste wortel en/of de bewortelingsklasse. De bewortelingsklasse (Figuur 3b) liep van 0 (geen beworteling) tot 5 (zeer goede beworteling). In alle experimenten werden circa 30 scheuten uitgeplant per behandeling.

2 . 7 PLANTMATERIAAL

Het COWT heeft in de jaren voor het project werd gestart diverse Malus, Pyrus en

Cydonia onderstammen en cultivars in weefselkweek gebracht, met uiteenlopende

bewortelingsresultaten. De appelonderstammen 'Lancep' en 'P16' bewortelden slecht (gemiddeld minder dan 50%). Van de onderstam ' M 9 ' werden diverse klonen gebruikt die over het algemeen matig tot redelijk bewortelden. De ' M 9 ' kloon ' T 3 3 7 ' bewortelde slecht, de kloon 'EMLA' matig en kloon 'Nicolai 2 9 ' goed. De appelonderstam 'Jork 9' heeft als ouder een ' M 9' en bewortelde goed. De onderstammen ' M 2 6 ' en ' M 2 0 ' bewortelden goed. De appelcultivar 'Golden Delicious' bewortelde redelijk. Van de appelcultivar 'Elstar' werden twee subklonen verkregen die varieerden in bewortelingscapaciteit. De sierappel 'Red Sentinel' bewortelde zeer goed (90-100%).

De onderstam Cydonia oblonga 'Leskovacz' en de cultivars van Pyrus ' Z P 0 4 ' en 'ZP05' bewortelden slecht. Pyrus ' Z P 0 1 ' bewortelde zeer goed. De genoemde Pyrus cultivars kunnen als onderstam gebruikt worden.

Naast deze onderstammen zijn diverse andere onderstammen voor Malus en Pyrus in weefselkweek gebracht.

Figuur 3

(a) Klasse-indeling scheutgroei en (b) klasse-indeling wortelgroei van weefselkweekplanten van Malus vier weken na uitplanten.

3 DE INVLOED VAN VERMEERDERINGSCONDITIES OP DE

BEWORTELINGSCAPACITEIT

3.1 INLEIDING

De eerste onderdeel in het bewortelingsonderzoek op het COWT betrof het na-effect van factoren tijdens de vermeerderingsfase op de be worteling. Deze factoren kunnen uitgesplitst worden in medium componenten (voedingselementen, suiker, agar, hormonen) of fysische factoren (tijd en klimaat). Al deze factoren bepalen de conditie van het scheutje en kunnen een positieve of negatieve invloed hebben op de bewortelings-capaciteit. De conditie van het scheutje wordt bepaald door zijn fysiologische toestand en ontwikkelingstoestand. Mogelijk worden fluctuaties gevonden in de beworteling van Malus scheuten veroorzaakt door veranderingen in ontwikkelingstoestand of fysiologische toestand van de scheuten. Wat betreft ontwikkelingstoestand wordt bijvoorbeeld gedoeld op het ontwikkelen van rust en het optreden van rejuvenatie of maturatie.

In dit hoofdstuk worden de effecten van respectievelijk voedings-, hormonale en fysische factoren tijdens de vermeerderingsfase op de bewortelingscapaciteit beschreven. Gekeken werd daarnaast bij een aantal van deze factoren of deze de vermeerderings- of bewortelingscapaciteit zodanig konden beïnvloeden dat er veranderingen in fysiologische toestand of ontwikkelingstoestand optraden. Er werd in dit gedeelte van het onderzoek met name gekeken naar het ontwikkelen of doorbreken van rust.

3.2 VOEDINGSFACTOREN

Aangezien de voedingssamenstelling van het vermeerderingsmedium, dat wil zeggen de concentratie macro-, micro- en spore-elementen, maar ook de concentratie suiker, vitaminen en agar, invloed hebben op de morfologie van de bladeren en de scheuten, mag worden aangenomen dat deze factoren ook van invloed zijn op de fysiologie van de scheut.

Voedingselementen

Zo was in zes opeenvolgende subcultures op vermeerderingsmedium samengesteld volgens MS (Murashige en Skoog 1962) de strekking van de scheuten beter dan op vermeerderingsmedium samengesteld volgens gemodificeerd Lepoivre (Quoirin et al. 1977). Met name in combinatie met 30 g/l saccharose (standaard) was de vermeerderingsfactor op MS-medium hoger dan op Lepoivre-medium (Figuur 4a). De hoge concentratie saccharose had een positieve invloed op het aantal gestrekte scheuten, de clusters waren compacter (meer blad) en het bladoppervlak was kleiner (Kunneman en Albers 1992). De concentratie saccharose en de samenstelling aan voedingszouten (MS of Lepoivre) hadden geen significant effect op de bewortelingscapaciteit (Figuur 4b).

De appelonderstam ' M 2 0 ' groeide in vitro traag en bewortelde slecht. Daarnaast trad veel vitrificatie op. De beworteling was waarschijnlijk slecht doordat de clusters in een rosetvorm groeiden en slecht strekten. Besloten werd deze onderstam te vermeerderen in een dubbele-laag medium met onderin een vaste fase (6% agar) en bovenin een vloeibare fase. De samenstelling van het vaste medium was die van het standaard vermeerderingsmedium (Tabel 1). De vloeibare fase was samengesteld volgens Ivanova [IGE, Bulgarije, persoonlijke mededeling] met als macro-elementen i.p.v 440 mg/l CaCI2.2H20 1000 mg/l Ca(N03)2.4H20, tweemaal zoveel KH2P04 en MgS047H20, anderhalf maal zoveel KN03 en 7 5 % NH4N03. Daarnaast geen KI in de spore-elementen, als vitaminen geen nicotinezuur en pyridoxine en slechts 0.4 mg thiamine.HCl, geen IBA, saccharose i.p.v sorbitol en geen agar. De vloeibare fase bevatte dus meer nitraat, fosfaat en sulfaat, meer calcium, kalium en magnesium en géén chloride. Door toevoegen

Saccharose (g/l)

Saccharose (g/l)

Figuur 4

(a) De gemiddelde vermeerderingsfactor en (b) het bewortelingspercentage van Malus ' M 2 6 ' na vermeerdering op MS-medium of gemodificeerd Lepoivre-medium bij 20» 25 en 3 0 g/l saccharose.

1 _

o

• * - •

o

CO «^» CO O )

c

"O V -CD <D

E

<D

> » rt

à£

O O) (0 • * - *

c

CD

o

CD CL CO O )

c

©

• • - • L M

o

£

<D

CD

10 8 6 4 2 — _ J u 10 100 80 60 40 20 — • - • • • I 10 I 15 I 15 O

o

o

° 8

/"\

• i •

i# i i 20 25 30

Tijd (mnd)

o o

o o

o

• • I I i 20 25 30

Tijd (mnd)

8

o

o

• I 35

o°

I 35 Figuur 5

(a) De vermeerderingsfactor en (b) het bewortelingspercentage van Malus ' M 2 0 ' na vermeerdering op standaardmedium (o) of op dubbele-laag medium (o).

van de vloeibare fase één of twee weken na inzetten gingen de scheuten beter strekken. De vermeerderings-factor ging omhoog van gemiddeld 1.2 scheuten in vijf weken naar 5.5 scheuten (Figuur 5a). Ook de bewortelingscapaciteit nam toe door deze vermeerderingswijze en medium-samenstelling. Het percentage beworteling nam toe van gemiddeld 19% naar 8 1 % (Figuur 5b).

Suiker

Zimmermann en Ziegler (1975) rapporteerden dat er grote verschillen zijn tussen plantenfamilies in de aanwezigheid van verschillende suikers. In de Rosaceae is sorbitol het meest aanwezig. Weiander et al. (1989) toonden aan dat Malus 'M 9' bij vermeerdering op sorbitol meer en langere scheuten produceerde dan op fructose, saccharose, glucose of mannitol. Sorbitol is de belangrijkste transportsuiker in Malus (Loescher et al. 1982). Een positief effect van sorbitol op de vermeerdering van verschillende Afa/c/s-variëteiten werd aangetoond door Pua en Chong (1984, 1985). Ook op het COWT was de vermeerderingsfactor van Cydonia oblonga 'Leskovacz' en van

Malus 'Jork 9' groter als de scheuten op sorbitol waren vermeerderd. Voor Malus 'Golden

Delicious' en 'Elstar' waren deze verschillen niet zo groot.

Mogelijk moet het carbohydraat metabolisme na de vermeerderingsfase omgeschakeld worden, doordat de scheuten na een standaard vermeerdering op sorbitol tijdens de standaard beworteling saccharose krijgen aangeboden. Scheuten van 'Jork 9' en 'Golden Delicious' werden daarom vermeerderd op vijf verschillende suikercombinaties (30 g/l) van sorbitol en saccharose in de gewichtsverhouding 0:4, 1:3, 2:2, 3 : 1 , of 4:0. De cultures werden gedurende drie cycli op media van dezelfde samenstelling doorvermeerderd. Er werden geen sterke verouderingsverschijnselen waargenomen bij een vermeerderingscyclus langer dan vier weken op de hoge percentages saccharose. Een cyclusduur van zes weken gaf de beste vermeerdering. Een cyclusduur van vijf of zes weken gaf de beste beworteling. Er werden geen grote verschillen tussen de vijf suikercombinaties gevonden in vermeerderingsfactor en bewortelingscapaciteit. Voor het suikermetabolisme in de scheuten is het dus geen probleem om na de vermeerderingsfase van sorbitol op saccharose over te schakelen tijdens de bewortelingsfase. De reden dat tijdens het bewortelingsonderzoek werd vermeerderd op sorbitol was dat zo twee subcultures naast elkaar vermeerderd konden worden, zodat om de drie weken een experiment kon worden uitgevoerd. Bij vermeerdering op saccharose zou dit bij aanhouden van twee subcultures om de twee weken zijn en bij een subculture pas om de vier weken.

Mogelijk worden fluctuaties in beworteling van Malus scheuten veroorzaakt door veranderingen in ontwikkelingstoestand van de scheuten, bijvoorbeeld door het ontwikkelen of doorbreken van rust. Deze rust zou dan zijn ontstaan onder standaard vermeerderingscondities. Rust werd gemeten aan de vermeerderingscapaciteit; d.w.z. de vermeerdering onder standaard omstandigheden volgend op een vermeerderingscyclus waarin een specifieke behandeling werd uitgevoerd. In rust is deze vermeerderingscapaciteit laag en bij afwezigheid van rust hoog.

Bij lelie is gebleken dat een lagere concentratie saccharose (1 g/l of minder) tot minder rust leidt (Aguettaz et al. 1990). In een oriënterend experiment leek ook bij Malus 'Jork 9' een lage concentratie sorbitol (5 g/l) rustvoorkomend of doorbrekend te werken. Het effect van sorbitol op de vermeerderingsfactor, vermeerderings- en bewortelingscapaciteit werd nader onderzocht.

Scheuten van Malus 'Jork 9' werden opgekweekt op verschillende concentraties sorbitol. De vermeerderingsfactor nam tijdens de behandeling toe met de concentratie van 1 tot 30 g/l sorbitol, daarna was deze stabiel (Figuur 6a). Bij 4 0 en 50 g/l trad veel vitrificatie op (50%). De scheuten werden overgezet op een standaard vermeerdering, al dan niet na een koudebehandeling. De vermeerderingscapaciteit van scheuttopjes was vrijwel hetzelfde voor de verschillende concentraties. Een koudebehandeling had een klein positief effect op de vermeerderingscapaciteit bij 1 en 5 g/l sorbitol. De bewortelings-capaciteit na

tussenvermeerdering was bij de lage sorbitol concentraties (1 tot 20 g/l) hoger dan bij de hoge concentraties. Dit gold zowel voor het percentage beworteling als voor het aantal wortels per bewortelde scheut (Figuur 6b en c). Door de koudebehandeling nam met name het aantal wortels toe, behalve voor de twee laagste concentraties.

Uit dit experiment blijkt dat er geen of nauwelijks rust geïnduceerd wordt als de concentratie sorbitol gewijzigd wordt, indien rust alleen gedefinieerd wordt als lage vermeerderingscapaciteit. Het effect van de koudebehandeling op de bewortelings-capaciteit bij hoge concentratie sorbitol (30 tot 50 g/l) wijst enigszins op een mogelijk rustinducerend effect bij een hoge concentratie suiker.

3.3 HORMONALE FACTOREN

Bij weefselkweekvermeerdering worden meestal alleen cytokininen en/of auxinen als hormonen toegediend. Toediening van extra hormonen kan zowel de fysiologische toestand als ontwikkelingstoestand veranderen. Op het COWT is onderzocht wat het effect was van de concentratie van hormonen tijdens de vermeerdering op de bewortelingscapaciteit.

Cytokininen

Verandering van de concentratie BAP in het vermeerderingsmedium gaf een duidelijke verandering in de beworteling. Indien een lage concentratie BAP werd toegevoegd aan het vermeerderingsmedium, nam de bewortelingscapaciteit af. Verwacht werd juist dat bij een lage concentratie cytokinine tijdens de vermeerdering door 'carry over' een lagere auxine-behoefte tijdens de beworteling zou ontstaan.

Bij Syringa werd een positieve werking aangetoond van ribosiden van de cytokininen N6 -(2-isopentenyl)adenine (2-IP) en zeatine (Z) in het vermeerderingsmedium, op de strekking van de scheuten, het aantal bladparen en de vermeerderingsfactor (Dragt et al. 1992). Zij vermoedden dat het riboside beter werkzaam is vanwege een beter transport in de plant. Op het COWT werd de invloed van BAP-riboside oriënterend onderzocht bij Malus 'Jork 9' en 'Golden Delicious'. Vanwege de hoge kosten van BAP-riboside en het relatief kleine positieve effect op de vermeerdering en beworteling van alleen Malus 'Jork 9', is het niet aan te bevelen BAP-riboside standaard aan het vermeerderingsmedium toe te voegen.

Sorbitol (g/l)

10 -• a O

75

+-> c (0 < 4 2 -_

I ,

-T l

r;

/ l ' • ^ < N \ _\ '' ' . I I I I I 10 20 30 40 50 ^ 100 <D O ) (0 c <D U © Q . W O) C © +•» O © CO kou - kou 10 20 30 40

Sorbitol (g/|)

so

A - - kOU A - + kou

Sorbitol (g/l)

Figuur 6

(a) De vermeerderingsfactor van Malus 'Jork 9' na vermeerdering op diverse concentraties sorbitol, (b) het bewortelingspercentage en (c) aantal wortels per bewortelde scheut (na tussenvermeerdering wel of niet voorafgegaan door zes weken koude).

Auxinen

In Malus scheuten wordt IBA snel opgenomen en voor 95% geconjugeerd (Van der Krieken et al. 1992). Verwacht werd dat bij een hoge concentratie auxine tijdens de vermeerdering door 'carry over' een lagere auxine-behoefte tijdens de beworteling zou ontstaan, omdat de auxine nog steeds aanwezig zou zijn.

In een eerste experiment nam bij hogere concentraties IBA (0,06, 0 , 1 , 0,2 of 0,6 mg/l) in het vermeerderingsmedium de vermeerderingsfactor, maar ook de bewortelings-capaciteit van Malus 'Golden Delicious' sterk af, in vergelijking met de lagere concentraties (0,01 en 0,02 mg/l) (De Klerk en ter Brugge 1992). In een tweede experiment met dezelfde concentraties IBA in het vermeerderingsmedium was er noch een negatief, noch een positief na-effect van de auxine op de daaropvolgende standaard beworteling bij zowel

Malus 'Golden Delicious' als Cydonia oblonga 'Leskovacz'. Alleen de hoogste concentratie

IBA gaf een slechte beworteling.

Waarschijnlijk gaat de conditie van de scheuten door teveel IBA in het vermeerderings-medium achteruit, waardoor het vermogen om wortels te vormen is afgenomen of deze scheuten zijn minder gevoelig geworden voor auxine. Er is geen sprake 'carry-over' van auxine. De auxine die nog in de scheuten aanwezig is, in de vorm van conjugaten, is inactief.

Absicinezuur

Onder natuurlijke omstandigheden nemen aan het eind van het groeiseizoen de concentratie groeistimulerende hormonen in de scheuten af (Powell 1987). Alleen de concentratie absicinezuur (ABA) in de knoppen en zaden is dan hoog. In appelknoppen neemt gedurende de winter de concentratie ABA in de meristematische zones (o.a. in de apex en bladprimordia) weer af. Powell (1987) toonde in veel gevallen deze ABA afname aan. Mogelijk kan in vitro door toedienen van ABA aan het vermeerderings-medium rust bij scheuten geïnduceerd worden.

In een experiment was het bewortelingspercentage bij de standaard (geen ABA in het vermeerderingsmedium) slechts 2 0 % en bij 0,1 mg/l ABA 6 0 % . Hogere concentraties ( > 1 mg/l) hadden een negatieve werking. ABA had bij een lage concentratie in het vermeerderingsmedium een positief effect op de directe bewortelingscapaciteit.

In een tweede experiment met ABA en fluridon (een ABA-synthese remmer) in het vermeerderingsmedium nam de uitloop van axillaire knoppen toe. Door fluridon ontstonden rosetvormige clusters met veel kleine scheuten zonder chlorofyl. Bij 0 mg/l ABA nam de vermeerderingsfactor toe met de concentratie fluridon (0, 0 , 0 1 , 0,03, 0,1 of 0,3 mg/l fluridon). Bij 0,3 mg/l ABA was de vermeerderingsfactor iets lager maar steeg weer met de oplopende concentratie fluridon. Bij 3,0 mg/l ABA bleef de vermeerderingsfactor laag (twee tot drie scheuten). In de vermeerderingscapaciteit was er geen na-effect meer van fluridon en slechts een klein (negatief) na-effect van ABA.

Directe beworteling na de behandelingen gaf een negatief na-effect voor alle concentraties fluridon en voor de hoogste concentraties ABA. Bij de hoogste concentraties was de bewortelingscapaciteit zeer laag. Bij de laagste concentraties ABA was er een positief effect op het bewortelingspercentage. Het effect op het aantal wortels was ook positief maar niet significant. Bij beworteling na een standaard tussenvermeerdering was er geen duidelijk na-effect van fluridon en ABA meer op de bewortelingcapaciteit. Alleen het aantal wortels was bij de hoogste concentratie van fluridon en ABA lager.

Geconcludeerd werd dat ABA geen rust induceert in Malus 'Jork 9'. Er is geen carry-over effect op de vermeerderingscapaciteit en indirecte bewortelingscapaciteit (na tussenvermeerdering). Er was wel een remmend effect van fluridon en een hoge ABA concentratie op de bewortelingscapaciteit direct na behandeling. Dit effect ontstond door een verslechtering van de conditie (waarschijnlijk de fysiologische toestand) van de scheuten tijdens de behandeling. ABA had bij een lage concentratie in het vermeerderingsmedium een positief effect op de directe bewortelingscapaciteit.

Gibberellinen

Van het gibberelline GA3 is bekend dat het tot een vermindering van de rust leidt (Powell 1987) maar een negatief effect heeft op de beworteling. Bij lelie werd gevonden dat een hoge concentratie GA3 (1 mg/l) tot verlaging van het rustniveau leidt (Aguettaz et al. 1990). Na toediening tijdens de vermeerdering van Cydonia oblonga 'Leskovacz' en Malus 'Golden Delicious' nam de vermeerderingsfactor en het gewicht van de scheuten af met de concentratie GA3. Er was geen na-effect op de vermeerderingscapaciteit. De directe bewortelingscapaciteit nam alleen bij 'Leskovacz' sterk af. Als gibberellinen rust zouden doorbreken bij Malus zouden ze de vermeerderings- en bewortelingscapaciteit moeten verhogen. Dit werd niet gevonden.

3.4 FYSISCHE FACTOREN

Aantal cycli

Bij houtige gewassen neemt over het algemeen het bewortelingspercentage en aantal wortels toe met het aantal vermeerderingscycli in vitro, zo ook bij Malus (Webster en Jones 1989). Dit werd op het COWT en Europese laboratoria o.a. aangetoond bij Malus ' M 2 6 ' . Direct na initiatie was de beworteling slecht. Deze nam toe van de achtste subcyclus (47%) tot de elfde subcyclus (82%) en bleef daarna redelijk stabiel. Deze verbetering werd waarschijnlijk veroorzaakt door rejuvenatie. Ook de gevoeligheid voor auxine veranderde bij Malus 'M26' met het aantal cycli (De Klerk en Ter Brugge 1992; Figuur 7a en b).

Het geïnitieerde meristeem is afkomstig uit een adulte knop. Door het doorvermeerderen wordt het plantmateriaal juveniel. Waardoor de overgang van adult naar juveniel en omgekeerd wordt veroorzaakt is onbekend (Hackett 1985). Door regelmatig vermeerderen blijft uitgangsmateriaal juveniel. Juveniele explantaten hebben een beter regeneratie vermogen, waardoor ze minder problemen geven tijdens de vermeerderings-, de bewortelings- en afhardfase. Adulte explantaten daarentegen geven vaak problemen. Zo zal een explantaat met een bloem (adult) over het algemeen slechter bewortelen dan een explantaat in de jeugdfase.

Cyclusduur

Bij vermeerdering op sorbitol was voor veel Malus onderstammen en cultivars een minimale cyclusduur van zes weken noodzakelijk voor een goede beworteling. Een voldoende lange cyclusduur leidt tot een betere strekking van de scheuten waardoor deze beter bewortelen.

De beworteling van Malus kan echter ook fluctueren. Zo werden grote verschillen gevonden in de bewortelingsresultaten van 'Elstar' in twee opeenvolgende subculturen, opgekweekt onder dezelfde omstandigheden (Figuur 8). Dergelijke fluctuaties werden ook bij 'Golden Delicious' gevonden (Figuur 1). Kennelijk lopen bepaalde 'ontwikkelings'-processen in de scheut niet parallel met de vermeerderingscyclus. Het ligt voor de hand dat de duur van een vermeerderingscyclus invloed heeft op de ontwikkelingstoestand van de scheut. Mogelijk gaat een scheut bij langere cyclusduur in rust of gaat enigszins over in adulte fase. Dit moet dan invloed hebben op de bewortelingscapaciteit van deze scheut. Van scheuten van diverse leeftijden werd de vermeerderingsfactor,

vermeerderings-capaciteit en bewortelingsvermeerderings-capaciteit bepaald. De vermeerderingsfactor nam af vanaf 12 weken doordat de conditie van het materiaal achteruit ging (bladval). De verouderde scheuten (12 tot 19 weken) waren wel beter gestrekt. De vermeerderingscapaciteit liep iets op met de leeftijd van de scheuten (Figuur 9a). De direct bewortelingscapaciteit was laag bij cultures ouder dan 12 weken en de indirecte bewortelingscapaciteit (na een standaard tussenvermeerdering) was voor de verschillende leeftijden nagenoeg gelijk (Figuur 9b).

2 0 ° C te houden. In hoeverre de scheuten overgingen in adulte fase is moeilijk te zeggen. Omdat de bewortelingscapaciteit zich na tussenvermeerdering goed herstelde mag geconcludeerd worden dat de scheuten goed rejuveneerden en waarschijnlijk nog niet ver in hun adulte ontwikkeling waren.

IBA (mg/l)

IBA (mg/l)

Figuur 7

(a) Bewortelingspercentage en (b) en aantal wortels per bewortelde scheut van Malus ' M 9 ' (kloon 'Nicolai 29') bij drie concentraties IBA. De cultures werden 15 of 25 maal doorvermeerderd.

— '

o

O) CÖ

c

o

o

<D Q . (0

o>

c

1 _

o

<D

100

80

60

40

20

0

CÛ

₆

₈

Cyclusduur (wk)

Figuur 8

Bewortelingspercentage van Malus 'Elstar', na een cyclus van vier tot acht weken, in twee opeenvolgende subculturen.

Cyclusduur (wk)

<D O )

<o

+-<

c

<D ü i — <D Q . CO O ) O <D ffl 100 80 60 40 20 0 - « ^ "-•-"

-°^-^-^

I I 6 9 , - -#v

' V'

o \ \ \ \ \ \ o ^ 1 1 12 15 ,• • ^O \ I I 18

Cyclusduur (wk)

- O - direct -••— indirect Figuur 9

(a) Vermeerderingscapaciteit en (b) beworteiingspercentage (direct na een behandeling en indirect na standaard tussenvermeerdering) bij Malus 'Jork 9' scheuten na verschillende lengten van de vermeerderingscyclus.

Temperatuur

In de literatuur wordt bij in vivo rustonderzoek veelal gevonden dat een lage temperatuur verantwoordelijk is voor de rustdoorbreking in knoppen. Er zijn zelfs modellen opgesteld om de koudebehoefte de berekenen. Het meest gebruikte model is het 'Utah' model van Richardson et al. (1974) geïntroduceerd voor perzik. Powell (1987) toonde in vivo rustdoorbreking aan in knoppen onder invloed van een lage temperatuur. Bij stek van

Abies dat in rust was, herstelde de bewortelingscapaciteit na een koudebehandeling (Wise

et al. 1985).

Als op het COWT appelscheuten in vitro bij lage temperatuur (5°C) vermeerderd werden, was de vermeerderingsfactor zeer laag en werden de bladeren rood. Deze scheuten waren in slechte conditie en vrijwel niet meer te be wortelen. De vermeerderingscapaciteit nam echter significant toe. Dit kan erop wijzen dat de scheuten in vitro rust hadden ontwikkeld die door de koudebehandeling doorbroken werd (De Klerk 1992).

Met Malus 'Golden Delicious' en 'Jork 9' werden bewortelingsexperimenten uitgevoerd direct na koudebehandelingen (nul, drie of zes weken bij 5 en/of 10°C). De vermeerderingscapaciteit nam sterk toe en was voor alle behandelingen hoger (variërend van vijf tot 13 scheuten) dan de vermeerderingsfactor (rond drie scheuten). De bewortelingscapaciteit direct na behandeling was zeer laag. Na een tussen vermeerdering was de (indirecte) bewortelingscapaciteit hoog. Na een koudebehandeling van zes weken namen zowel de vermeerderings- als de indirecte bewortelingscapaciteit toe en was er duidelijk sprake van rustdoorbreking.

Mogelijk ontstaat rust in vitro bij Malus bij de normale opkweektemperatuur. Uit oriënterend onderzoek leek dit al mogelijk bij 12,5°C. Onderzocht werd bij 'Jork 9' onder welke temperaturen rust wordt doorbroken en geïnduceerd. Scheuten werden vermeerderd in klimaatkasten bij 70 //mol.m"2.sec'1 bij temperaturen van 5 tot 20°C. De vermeerderingsfactor nam toe met de temperatuur (Figuur 10a) en was bij 2 0 ° C (standaard) zelfs 12,8. De vermeerderingscapaciteit (Figuur 10b) lag tussen de 4 en 7 scheuten. De scheuten die bij 15 of 2 0 ° C waren gekweekt hadden de laagste vermeerderingscapaciteit. Er moet hier ook gewezen worden op de grote schommeling in vermeerdering: bij één cyclus (20°C) was die 12,8 en bij de daarop volgende cyclus nog slechts 4,3. Bij een koudebehandeling (zes weken 5°C) nam de vermeerderingscapaciteit voor alle behandelingen toe, met name voor de drie hoogste temperaturen. Kennelijk was bij deze hoge temperaturen rust geïnduceerd. Het bewortelingspercentage en aantal wortels per bewortelde scheut nam toe met de temperatuur bij directe beworteling (Figuur 10c en d). Na extra koude was de directe beworteling zoals verwacht slecht. Na een tussenvermeerdering was het bewortelingspercentage tussen de 90 en 100, onafhankelijk van de voorbehandeling en wel of geen extra koude. Het aantal wortels na tussenvermeerdering was zonder koudebehandeling hoger dan met koudebehandeling, met uitzondering van de voorbehandeling bij 2 0 ° C . Er komt dus geen rustdoorbreking door koude tot uiting in de beworteling bij de hogere temperaturen.

Geconcludeerd werd dat de vermeerderingscapaciteit bij de hoge temperaturen (12,5, 15 en 20°C) afnam, en door koudebehandeling weer toenam. Zeer waarschijnlijk treedt dus rustinductie op bij een temperatuur hoger dan 12,5°C. Rustdoorbreking bij 5 ° C gaat sneller dan bij 7,5 of 10°C. Ook bij lelie werd rust doorbroken bij 5 ° C . Bij 15°C werd nauwelijks rust geïnduceerd en bij 25°C werd een hoog rustniveau bereikt (Aguettaz et al. 1990, Delvallée et al. 1990).

"o co O. cd o CO CO c o •D o <D

E

k . co > 12 9 e 3 -T Î

¥

I T J. j ^ x T -T J. ,-i .. ••••. T ' kou • • kou 10 15 20

Temperatuur (°C)

_{Temperatuur (°C)}

Temperatuur (°C)

Temperatuur (°C)

Figuur 10

Resultaten van Malus 'Jork 9 ' na vermeerdering bij diverse temperaturen. Gekeken werd naar effect op (a) de vermeerderingsfactor, (b) de vermeerderings-capaciteit (met of zonder koude), (c) het bewortelingspercentage en (d) het aantal wortels (met of zonder koude en daarna direct beworteld of indirect beworteld na een tussenvermeerdering)

Licht

Rust in knoppen van planten ontstaat onder natuurlijke omstandigheden aan het eind van het groeiseizoen, bij kortere dagen en lagere temperaturen (Powell 1987). In hoeverre de daglengte van invloed is op de rustontwikkeling is vaak onduidelijk. Bij lelie had dag-lengte geen effect op de rust in vitro en temperatuur wel (Aguettaz et al. 1990). Ook bij Malus lijkt rust in vitro met name door temperatuur geïnduceerd te worden (De Klerk en Ter Brugge 1992). Desalniettemin werd het effect van daglengte nader onderzocht.

Malus 'Golden Delicious' en 'Jork 9' en Cydonia oblonga 'Leskovacz' werden vermeerderd

bij korte dag (8 uur) of bij lange dag (16 uur). Bij vermeerdering bij korte dag was de vermeerderingsfactor lager dan bij lange dag. Dit was een direct gevolg van minder fotosynthese (groei) door minder licht. In vermeerderingscapaciteit was geen verschil. 'Golden Delicious' bewortelde direct na vermeerdering bij korte dag wat beter en 'Jork 9' gaf geen verschil. 'Leskovacz' bewortelde direct na vermeerdering bij korte dag minder goed dan bij lange dag. Er werd geen effect van een tussen vermeerdering op de indirecte bewortelingscapaciteit. Ook een koudebehandeling had geen effect op de vermeerderings-of indirecte bewortelingscapaciteit.

Uit verschillende experimenten bij Malus blijkt dat de daglengte geen invloed heeft op de ontwikkeling of doorbreking van rust in vitro. Andere houtige gewassen, bijvoorbeeld

Populus, zouden wel rust ontwikkelen bij korte dag (Douglas, ongepubliceerd).

Onderzocht werd of de vermeerderings- en bewortelingscapaciteit van Malus beïnvloed worden door lichtintensiteit. Scheuten van 'Jork 9' werden opgekweekt bij 7 (strooilicht), 50 (standaard), 100 of 150 //mol.m2.sec'1. De vermeerderingsfactor nam toe bij een toenemende lichtintensiteit tot 100 //mol.m"2.sec"1. De vermeerderings- en bewortelings-capaciteit waren voor de drie laagste intensiteiten gelijk en voor de hoogste intensiteit lager. Bij beworteling na een tussenvermeerdering was het bewortelingspercentage bij de twee lage intensiteiten hoger. Het aantal wortels was voor alle behandelingen gelijk.

Geconcludeerd kon worden dat er bij Malus geen rustinductie of -doorbreking plaatsvindt onder invloed van lichtintensiteit. Bij lelie had licht ook geen effect op de ontwikkeling van rust (Aguettaz et al. 1990). De lage vermeerderingsfactor, vermeerderings- en bewortelingscapaciteit bij de hoogste lichtintensiteit waren mogelijk een effect van een slechte conditie van de scheuten. Door instraling van het licht (kortere afstand tussen lampen en kweekbuizen) was bij deze behandeling de temperatuur in de buizen waarschijnlijk erg opgelopen.