UvA-DARE (Digital Academic Repository)
Exploring the fungal wall proteome by mass spectrometry
Yin, Q.Y.
Publication date
2008
Link to publication
Citation for published version (APA):
Yin, Q. Y. (2008). Exploring the fungal wall proteome by mass spectrometry. Digital Printing
Partners.
General rights
It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Disclaimer/Complaints regulations
101
SUMMARY
Fungal cell wall glycoproteins are instrumental in many aspects of the physiology and behavior of the fungus, including cross-linking and protecting skeletal polysaccharides, adhesion, mating, host cell recognition, biofilm formation, coping with oxidative stress and iron deficiency, and
pathogenicity. Transcriptome analysis in the baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae and the human pathogen Candida albicans have made it clear that transcript levels of cell wall protein-encoding genes may vary widely depending on the phase of the cell cycle in which the cell occurs, and on growth conditions such as nutrient availability, temperature, pH, and oxygen levels. These results indicate that the cell may adapt the protein composition of the newly formed walls to better cope with environmental conditions. It is therefore important to explore the cell wall proteome and its dynamics both qualitatively and quantitatively. However, due to the complex and variable glycosylation they may have, cell wall proteins are difficult to analyze using traditional electrophoretic methods.
Recent advances in mass spectrometry offer new options for identification of fungal cell wall proteins and for studying their dynamics. Using Saccharomyces cerevisiae as a model fungus, we establish a method involving protease digestion and liquid chromatography in combination with tandem mass spectrometry to identify the cell wall proteins. The method has been validated and found to be effective in many different fungal species including Candida albicans and the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Furthermore, with the help of the isobaric relative and absolute quantitative labeling, the absolute cellular quantities of cell wall proteins in Saccharomyces
cerevisiae have been determined. This quantitative method has also been extended to monitor cell
wall proteins that are differentially expressed in the mutant of Saccharomyces cerevisiae and to investigate the dynamics of the cell wall proteome upon transferring Candida albicans cells to different hypha-inducing growth media. The methods developed in this study will not only facilitate the research in fungal cell wall biology by providing reliable, sensitive and quantitative analytical tools to characterize the cell wall proteins, but also will find their applications in identifying new targets for antifungal agents, development of novel vaccines and diagnostic tools, cell surface engineering, and in mathematical modeling of regulatory circuits.
103
SAMENVATTING
Glycoproteinen in de celwanden van schimmels spelen een belangrijke rol in het leven van schimmels. Zo zijn ze bij voorbeeld betrokken bij verknoping van skeletvormende polysacchariden in de celwand, waardoor deze aanzienlijk wordt versterkt, Ze beschermen deze skeletelementen ook tegen polysaccharide-afbrekende enzymen uitgescheiden door andere organismen. Ze spelen verder een sleutelrol bij adhesie en paring, bij herkenning van gastheercellen, bij weefselafbraak en bij biofilmvorming. Tot slot bieden ze ook bescherming tegen oxidatieve stress en helpen ijzergebrek te voorkomen. Transcriptoom-analyses in de bakkersgist Saccharomyces cerevisiae en in de ziekteverwekkende schimmel Candida albicans laten zien, dat de transcriptniveaus van celwandeiwit-coderende genen sterk kunnen variëren afhankelijk van de fase van de celcyclus, waarin de cel verkeert, en van de groeiomstandigheden zoals de beschikbaarheid van
voedingsstoffen, de temperatuur, de pH en de zuurstofspanning. Deze waarnemingen wijzen er op, dat de cel de eiwitsamenstelling van de nieuwgevormde wanden kan aanpassen om beter te kunnen inspelen op veranderende omstandigheden. Het is daarom belangrijk om het
celwandproteoom en de daarin optredende veranderingen te onderzoeken, zowel kwalitatief als kwantitatief. Vanwege de complexe en variabele glycosylering van celwandglycoproteinen in schimmels, zijn deze moeilijk ter analyseren met behulp van traditionele, electroforetische methoden. Nieuwe ontwikkelingen in de massaspectrometrie bieden nieuwe mogelijkheden om celwandeiwitten te identificeren en te kwantificeren. Gebruikmakend van S. cerevisiae als modelschimmel hebben we een methode ontwikkeld om celwandeiwitten te identificeren. Deze methode is gebaseerd op proteolytische klieving van celwandeiwitten en scheiding van de verkregen eiwitfragmenten met behulp van vloeistofchromatografie, direct gevolgd door analyse van de eiwitfragmenten met behulp van tandem massaspectrometrie. Deze methode is ook bruikbaar gebleken in verscheidene andere schimmels zoals C. albicans en de splijtgist
Schizosaccharomyces pombe. Door gebruik te maken van isobarische merking van de verkregen
eiwitfragmenten zijn we er in geslaagd om deze methode te kwantificeren, zodat we nu in staat zijn om zowel absolute aantallen van celwandeiwitten te bepalen als ook relatieve concentraties. Deze benadering is voor het eerst toegepast in een celwandmutant van S. cerevisiae en is vervolgens gebruikt om de veranderingen in het celwandproteoom te bepalen van C. albicans cellen, nadat deze zijn overgebracht naar verschillende hyfegroei-inducerende media. De in deze studie ontwikkelde methoden zijn betrouwbaar en bovendien uitermate gevoelig en zijn daarom van groot belang om de celwandbiologie van schimmels te bestuderen. Daarnaast bieden ze ongekende nieuwe mogelijkheden om nieuwe doelwitten voor antischimmelmiddelen te identificeren en om nieuwe vaccins en diagnostica te ontwikkelen. Onze methoden zullen het verder mogelijk maken om genetische modificering van het celoppervlak van schimmels te kwantificeren en gericht te veranderen, en om mathematische modellen te ontwikkelen van de regelcircuits, die de expressie van celwandeiwitten controleren.
