De bepaling van chlooramphenicolresiduen met behulp van HPLC

(1)

Afd. Diergeneesmiddelen 1983-03-16 VERSLAG 83.25 Pr.nr. 505.0600 Onderwerp: De bepaling van chloor

-amphenicolresiduen met behulp van HPLC.

Bijlagen: 3.

Verzendlijst: direkteur, sektorhoofd (2x), direktie VKA, afd.

8325

Normalisatie (Humme), Projektbeheer, afd. Diergeneesmiddelen (4x), afd. Additieven, afd. Contaminanten, dr Kan (Spelderholt), dr Ellen (RIV-Bilthoven).

(2)

Afdeling Diergeneesmiddelen 1983-03-16

VERSLAG 83.25 Pr.nr. 505.0600

Projekt: Ontwikkeling methoden voor het aantonen en bepalen van diverse diergeneesmiddelen op niet-microbiologische wijze Onderwerp: De bepaling van chlooramphenicolresiduen met behulp van

HPLC

Bijlagen: 3

Doel:

Het onderzoek had een tweeledig doel namelijk:

- het testen van HPLC-analysemethodieken voor de bepaling van chloor-amphenicolresiduen in vlees, eieren etc.

- een indruk te verkrijgen van het te verwachten residuniveau van chlooramphenicol in diverse organen etc.

Samenvatting:

Na eenmalige injectie van vijf kippen met chlooramphenicol werden deze na drie dagen geslacht en onderzocht op chlooramphenicolresiduen in diverse organen etc. waarbij geen rekening is gehouden met de moge-lijkheid van chlooramphenicolglucorinide enz.

Er zijn analysemethodieken met behulp van HPLC getest en er ts een indruk verkregen van het residuniveau in de diverse organen etc. van de kippen.

Conclusie:

De analysemethodieken voor de bepaling van chlooramphenicol voldeden voor vlees, eieren en bloed maar waren minder geschikt voor lever en nier. Er konden alleen residuen chlooramphenicol in eieren worden aangetoond (ppm niveau). Verder onderzoek op dit gebied zal nood-zakelijk zijn.

Verantwoordelijk: drs F.G. Buizer

~

Samenstellers: H.H.J.

Bee~·~n

G.D. van

Bruchem~

Projektleider: drs F.G. Buizer ~

/

(3)

Inleiding

Chloo~amphenicol is van oo~sp~ong een natuu~lijk, nu een synthetisch ve~vaa~digd antibioticum. Het heeft een b~eed we~kingsspect~um voo~ zowel g~amnegatieve als grampositieve bacte~i~n. Het wo~dt toegepast bij de behandeling van zieke die~en via injecties, drinkwate~the~apie en gemedicinee~de voeders. Om een uitsp~aak te kunnen doen ove~ de residutoestand in die~lijke levensmiddelen, zijn specifieke en gevoelige analysemethoden noodzakelijk.

In de literatuu~ zijn tot nu toe fotomet~ische, mic~obiologische, gasch~omatog~afische en ande~e methodieken besch~even.

De vloeistofch~omatog~afische techniek is eenvoudige~ dan de boven genoemde omdat geen de~ivatise~ings- of kleurreacties noodzakelijk zijn, te~wijl de mic~obiologische methoden zee~ ongevoelig is. Voor de bepaling van ~esiduen van chloo~amphenicol in bloed, vlees en eieren zijn methodieken ontwikkeld, ,.,aarbij HPLC als analysetechniek wordt gebt·uikt.

Om een uitspraak te kunnen doen over b~uikbaa~heid van de methoden en een indruk te verkrijgen van het ~esiduniveau zijn vijf kippen gein-jecteet"d met chlooramphenicol en na drie dagen geslacht.

Verzameld zijn eieren, vlees, leve~s, nieren, bloed en ovaria lY"aa~na deze zijn onderzocht en geanalyseerd.

Expe~imenteel

Er werden vijf kippen geinjecteerd op het Spelderholt te Beekbergen op 25 feb~ua~i 1983 om 12.00 uur met 75 rug chlooramphenicol per diet" (ca. 50 mg/kg lichaamsgewicht) in 0,3 ml. De dieren werden gedood op 28 februari 1983 om 11.30 uur.

Tussentijds werden de eieren verzameld en na de slacht bloed, poot- en bot"stvlees, levers, nieren en ovaria (eieren in wording). De ve

r-zamelde organen, eieren etc. werden met de beschikbat"e methodieken onderzocht op het gehalte aan chloot"amphenicol (zonde~ hyd~olyse van eventueel aanwezig glucut"onide of sulfaat).

Analyse

Bij de analyse werd gebruik gemaakt van d~ie analysevoo~schriften namelijk:

(4)

-- 2

-- Bepaling van chloo~amphenicol in bloed, plasma, se~um etc. doo~ mid-del van IIPLC.

Voorlopig intern analysevoorschrift n~. DGM 26 1e oplage (1982-09-01).

-Bepaling van chlooramphenicol in vlees (HPLC methode).

Voo~lopig inte~n analysevoo~schrift n~. DG~1 25

1e oplage (1982-08-18).

- Bepaling van chlooramphenicol in kippe-eieren doo~ middel van HPLC. Voorlopig intern analysevoorschrift nr. DGM 30

1e oplage (1982-11-25).

Bloed werd onderzocht met het desbetreffende voorschrift.

Vlees, nieren en levers {<Terden onderzocht met de bepalingsmethode voo~

vlees.

Eieren en ovaria werden geanalysee~d met het voorschrift voor eieren

(bijlagen).

Resultaten

In bloed, levers en nieren kan geen chlooramphenicol met de bovenge-noemde analysemethoden -ç.1orden aangetoond (< 20 ppb). Uit

li.teratuut·on-de~zoek bleek dat het niveau van chlooramphenicol in bloed snel daalt

en verder gemakkelijk metaboliseert tot chlooramphentcolglucuronide dit gebeurt voornamelijk in lever en nier.

In de eieren en ovaria kon duidelijk chlooramphenicol worden

aangetoond. De resultaten van dit onderzoek staan hieronder vermeld.

kip 1 kip 2 kip 3 kip 4 kip 5 Recovery analyse-methodiek ei 1 1, 11 ppm 2,59 ppm 2, 6ll ppm 3,75 ppm 668 ppb 61% op 60 ppb ei 2

₁

_-

_I

_-

_I

_-

_I

1,28 ppm

I

3oo rrb

I

72% op 165 ppb ei 3

,

_

I

470 ppb

,

_

₁₃₄₄_ppb₁₇₂_%op 960 ppb 81% op 1,65 ppm ovarium 0,573 _PPI~

_I

0,817 ppm

I

1, 21 ppm l1,71ppn:j ovarium

I

3,26 ppm

I

3, Ol1 ppm

I

1, 58 rPn:l ovarium _{3' 14} ppm

I

2, 79 ppm

_I

I

8325.2 - 3

(5)

-- 3

-De recoveryproeven Herden gedaan op eieren, waarvan ven-1acht werd dat deze geen chlooramphenciol zouden bevatten (wat ook bevestigd is). De ovaria zijn in verschillende stadia betrokken. Sommigen hadden al wat eiwit, de meeste waren alleen dooiers van verschillende grootte.

Bespreking

Uit de gevonden resultaten blijkt dat chlooramphenicol alleen is

aangetoond i.n eieren en ovaria. In organen etc. werd niets aangetoond, waarschijnlijk omdat hierin zich de gemetaboliseerde vorm bevindt, \-lelke met de vermelde methoden niet kan worden geanalyseerd. (De glu-curonide-vorm moet namelijk eerst omgezet worden tot chlooramphenicol). Levers en nieren bleken moeilijk te analyseren met de vermelde methode omdat er zeer sterke emulsievorming bij de beginextraktie optrad. Het beschikbare supernatant \-las dusdanig \-leinig dat de detektiegrens hoger werd (50 ppb) hierintegen \-las de recovery goed (> 90%).

Conclusie:

De analysemetl1odieken voor de bepaling van chlooramphenicol voldeden voor vlees, eieren en bloed maar waren minder geschikt voor lever en nier. Er konden alleen residuen chlooramphenicol in eieren \-lorden aangetoond (ppm niveau) . Verder onderzoek op dit gebied zal

nood-zakelijk zijn. Ook dient hydrolyse met glucuronidase/sulfatase bij de

bepaling betrokken te worden.

(6)

· .

, ..

i

VOORLOPIG INTERN ANALYSEVOORSCHRIFT NR. DGH 25' le oplage (1982-08-18)

Bepaling van chlooramphenicol in vlees (HPLC-methode)

1. Doel en toepassingsgebied

Met de methode kunnen residuen van "vrij" chlooramphenicol in vlees

worden bepaald. De onderste grens van aantoonbaarheid bedraagt ca. 10

ppb. Het terugvindingspercentage bedraagt 807.. Het niveau ligt tussen

20-200-ppb. 2. Principe

Chlooramphenicol wordt met ethylacetaat uit het monster geextraheerd.

Het extra~t wordt gezuiverd door vloeistof-vloeistof extrakties.

Aansluitend wordt een waterig extrakt op pH = 10,4 gebracht waarna een

vloeistof-vloeistof extrakt!~ met diethylether volgt waarbij de

chlooramphenicol in d~ etherfase overgaat.

Na verdampen van ~e etherfase wordt chlooramphenicol in het residu

bepaald door, na oplossen in water, 'te analyseren met behulp van

!socratische ''reversed phase" hogedrukvloeistofchromatografie met een

UV-detektie •.

·3. Reagentia

Alle !eagentia· dienen minstens van· ''pro analyse" kwaliteit te zijn of

van een hogere kwaliteit indien vermeld.

3.1 Natriumsulfaat, droog (Merck art. 6649).

3 •. 2 Ethylacetaat, Uvasol kwaliteit (Merck art. 863).

' _'·

3.3 Mi~lipore water.

3.4 Ac~tonitril, Uvasol kwaliteit (Merck art. 16). 3.5 Isooctaa~ (Merck.art. 4727).

DG~125 .1 - 2

(7)

2

-3.6 Methanol, Lichrosorb kwaliteit (Merck art. 6007).

3.~ Natriumchloride (Merck art. 6404).

3.8 Hex~an (Merck art. 4367).

3.9 Kaliumchloride (Merck art. 4936).

· 3.10 Ammoniumchloride (Merck art. 1145).

3.11 Ammonia gec. (BDH art. 10011).

3.12 Diethylether, Uvasol kwaliteit (Merck art. 930).

' 3.13 Tolueen (Merck art. 8325).

3.14 IJsazijn (BDH art. 10001).

3 .15 Glaswol.

3.16 Millipore filters (0,45 ~m) (Acrodisc 4184).

3.17 Chlooramphenicol standaard (Sigma art. C-0378).

3.18 4% N~triumchloride opl~ssing·

·.

~

Los 40 g natriumchloride (3.7) op in millipare water (3.3) en vul dan

aan tot 1000 ml en meng.

3.19 Ver.zadigde kaliumchloride oplossing

Los kaliumchloride (3.9) op in 100 ml water (3.3) tot verzadiging

' .. (> 34 g).

3.20 Waterige buffer pH= 10,4.

Los 54 g ammoniumchloride (3.10) op in ca. 300 ml water (3.3) en voeg.

350 ml ammqnia (3.11) toe en controleer de pH met een meter (4.7) (pH

=

10,4), vul aan tot 1000 ml en meng.

(8)

-.

i

r

i

i. I. I•, I '

·I

i

' I

.

I

! I

'

.I

I I

I

. I ' .' ( \i ( \t - 3 -3.21 Standaardstamoplossing (oplossing A)

\~eeg ca. 50 mg chlooramphenicol (3.17) nauwkeurig op 0,1 mg af in een

100 ml maatkolf.

Los op in methanol (3.6), vul aan en meng.

3.21.1 Standaardoplossing

Pipetteer 10,0 ml van de standaardstamoplossing in een maatkolf van

100 ml en vul aan met water (3.3) en meng (oplossing B). Pipetteer van

deze oplossing 10,0 ml in een 100 ml maatkolf en vul aan met water

(3.3) en meng (oplossing C).

Pipetteer 10,0; 20,0 en 40,0 ml van deze oplossing in afzonderlijke

maatkolven van 100 ml. Vul deze aan met water (3.3) en meng. Deze

"

oplossingen hebben een concentratie van resp. 0,5; 1,0 en 2,0 ~g/ml

(oplossingen D; Een F).

4. Apparatuur

4.1 Ultra Turrax met 18N staaf.

4.2 Vlees~olen (bv. Moulinette).

4.3 Mechan.ische roerder.

4. 5 Centrifuge.

4. 6 Ho~edrukvloeistofchromatogr:a.fi~che apparatuur met UV-detectie .•

4.7 pH meter.

4.8 Normaal laboratorium glaswerk.

5. Werkwijze

5.1 Extraktie.

Maal het vleeé in een vleesmolen (4.2) fijn.

DGM25.3 - 4

(9)

- 4

-Weeg SO,O g monster af in een erlenmeyer van 300-rnl met ingeslepen

stop en voeg 100 ml water (3.3) toe. Voeg met een pipet 100,0 ml

ethy-lacetaat (3.2) toe. Macereer gedurende 2 minuten met een ultra-turrax (4.1) en sluit de erlenemyer af. Schud de substantie gedurende 20 minuten op een mechanische roerder

(4.3).

Centrifugeer de substantie gedurende 5 minuten in glazen

centrifuge-buizen.

Pipetteer 50,0 ml van de bovenstaande ethylacetaatfase in een

indampkolf van. 100 ml. Damp de ethylacetaatfase af op een rotatiever-damper (4.4).

5.2 Zuivering

Neem het residu op in ca. 10 ml acet~nitril

(3.4)

en breng het met behulp van 25 ml isooctaan (3.5) in een 100 ml scheitrechter. Schud de

afgesloten .scheitrechter gedurende 1 minuut en laat de fasen scheiden. Laat de onderstaande acetonitrilfase af in een 100 ml indampkolf en spoel na met 2 ml acetonitril.

Schud de isooctaanfase nogmaals gedurende 1 minuut met 10 ml

aceto-nitril.

.

;

Laat de fasen scheiden en laat de onderstaaóde acetonitrilfase af in de indampkolf. Spoel na met ca. 2 ml acetonitril.

Damp de verzamelde acetonitxilfasen op een rotatieverdamper af tot er een droog residu wordt verkregen.

Los het residu op in 1 ml methanol (3 .6) en voeg 10 ml 4%·

natrium-chlorideoplossing (3.18) toe.

/".-

-Breng het mengsel met 15 mi hexaan kwantitatief over in een 100 ml scheitrechter.

Schud, na afsluiten van de scheitrechter, het gèheel gedur~nde 1 minuut en laat de fasen scheiden •

.

La~t de onderstaande waterige fase af in de indampkolf van 100 ml en spoel na met 1 ml wat~i

(3.3)

.

Voeg· 2 ml water (3.3) toe aan de.

hexaanfase .en

~chud

gedurende

io

.seconde.ne0

.s

poel

f\t\

""e{

1 ,..,.{

l

-

h..

Ó

{3.~

.

)

Laat de waterige fase af in de indampkolf en verwerp de hexaanfase.

Breng de verzamelde waterige zoutoplossing in de 100 ml scheitrechter

met 15 ml hexaai en schud de scheitrechter nogmaals gedurende 1 minuut

en handel als bovenstaande.

(10)

-' '

'({1

-

s

-Voeg hierna aan de waterige fase 2,0 ml kaliumchloride oplossing

(3.19) en 3,0 ml buffer (3.20) en breng het geheel kwantitatief met 30 ml diethylether (3.12) over in de 100 ml scheitrechter.

Schud de fasen gedurende 1 minuut en laat ze scheiden.

Laat de onderstaande waterige fase af in de reeds gebruikte 100 ml indampkolf.

Filtreer de bovenstaande etherfase (welke chlooramphenicol bevat) in

een indampkolf van 100 ml waarop zich een trechter met glaswol (3.15) en droog natriumsulfaat (3.1) (ca. 10-12 g) bevindt. Spoel de

scheitrechter na met ca. 2 ml diethylether (3.12).

Breng de waterige_fase opnieuw in de scheitrechter met behulp van 30 ml diethylether en schud nogmaals gedurende 1 minuut en handel dan

nogmaals zoals bovenstaand.

~

Spoel, nadat beide etherfracties zijn verzameld in de indampkolf, de

natriumsulfaat met 3 maal 5 rol diethylether.

Verdamp de ether op een rotatieverdamper tot droog.

Los het residu op in 2,0 ml millipore water (3.3) en voeg 4,0 ml. tolueen (3.13) toe.

Schud het geheel 'gedurende 30 seconden en centrifugeer het mengsel

gedurende 3 minuten in 25 ml centrifugebuizen.

Verwerp de bovenstaande tolueenfase (met pipet) en filtreer de

onderstaande waterlaag voorzichtig door een millipore filter (0,45

~m). Injecteer van deze monsteroplossing 50 ~1 in het HPLC-systeem.

6. HPLC-instelling

6.1 HPLC

6.1.1 Kolommen

.. a. ~ Bondapak C 18 (3, 9 · mm ID x 30 cm lengte) 10 micron.

Waters art.-27324.

b. ~ichrosorb RP 18 (4,6 mm ID x 15 cm lengte) 5 micron.

Chrompack art. 28810.

c) Voorkolom: Bondapak C 18 (3,9 mm ID x 2 cm lengte) 37-50 micron. Waters art. 27248.

Dç;M25 .5 - 6

(11)

..:...:-..

.

..

' I - 6 -6.1.2 Eluentia a. Water-methanol-ijsazijn 65-35-1 v/v/v.

Meng 650 ml millipare water (3.3) met 350 ml methanol (3.6) en 10

ml ijsazijn (3.14) en filtreer door een millipare filter.

b. Water-methanol ijsazijn 70-30-1.

Meng 700 ml millipare water (3.3) met 300 ml methanol (3.6) en 10

ml ijsazijn (3.14) en filtreer door een millipare filter.

6.1.3 Detectie

Detector Ultraviolet absorptie.

Gevoeligheid: 0,01-0,005 A.

Golflengte 278 nm.

6.1.4 Injectie

Injectievolume: 50 ~1.

6.2 Omstandigheden

Men kan een keuze maken uit de kolommen. Bij een ~ Bondapak C 18 kolom

gebruikt men het eluens water-methanol-ijsazijn 65-35-1 met een

eluenssnelheid van 1,0 ml/min.

Bij een Lichrosorb RP 18 kolom gebruikt men het e1uens

water-methanol-ijsazijn 70-30-1 met een eluenssnelheid van 1,5 ml/min.

Een voorkolom is gewenst ter voorkoming van beschadiging van de

hoofd-kolomvulling.

''_\L( _{7. Uitvoering}

Breng 50 ~1 van de verkregen monsterop~ossing in het HPLC systeem en

vergelijk de chlooramphenicolpiek met die, die met een v~n de

stan-daard.oplossingen (3. 2 .1.1 oplossing D, E en F) .. wordt verkregen.

Bereken het·gehalte i~ ~g/ml ~an chlooramphenicoi in het monst~r.

8. Opmerkingen

8.1 Alle chemieallen dienen voor de analyse gecontroleerd te worden op

bruikbaarheid.

(12)

-.-...

.

_'

_.

- 7

-8.2 Bij toevoegingen van chlooramphenicol aan blanco vlees werden

tcrug-vindingspercentages (recovery) tussen 78 en 94% gevonden. De hoogte

, van de terugvindingspercentages bleek afhankelijk te zijn van de

vleessoort. Hoe hoger het vetgehalte hoe lager het

terugvindingsper-centage.

8.3 Bij analyse van een vleessoort dient een "blanco" vlees

geanaly-seerd te worden ter vergelijking voor eventuele storingen en

terugvin-dingspercentage.

Voor analyse van het terugvindingspercentage dient men bij 50 gram

blanco vlees zoveel toe te voegen dat gehaltes ontstaan van 20-50-150

,

ppb.

9. Literatuur

9.1 Uber die Bestimmung von Chloramphenicol in tierischen Geweben

durch HPLC. H.A. RUssel.

Chromatographia, Vol. 11, no. 6, June 1978, pp. 341-343.

9.2 High ~erformance Liquid Chromatographic Assay for Chloramphenicol

in Biologica! Fluids.

R.L. Thies and L.J. Fischer.

Clinical Ch~mistry vol. 24 no. 5 1978 ~p; 778-781.

9.3 A new pathway of metabolism of chloramphenicol which influences the

interpretation of its irreversible binding to protein in vivo.

L.R. Pohl, G.B. Reddy and G. Krishna.

. .

Biochemica! Phannacology.' vol. 28 pp. 24'33-2440.

9.4 A fluorametrie method. to assay chloramphenicol.

R. Clarenburg and

v.

Rao.

Drug Metabolisin and Disposition Vol. 5 pp •. 246-252.

(13)

-~· _{- 8} -' I

r

'

,

9.5 Studies on analysis of chloramphenicol in livestock products. Aihawa K.; Chikuma G.

Bulletin of National Institute of Animal Industry no. 36, 135-144

(1979).

,9.6 Determination of chloramphenicol and its applications to residues

in milk and dairy cows. Proefschrift: J.J. v.d. Lee.

9.7 Gaschromatografische Bestimmung von Chloramphenicol- Rückständen in tierischen Material.

E.

Hollstein,

W.

Lane und G. Zapff.

Die Nahrung 25, 2, 1981, 143-149.

9.8 Nachw~is und Bestimmung von Chloramphenicol mit ~PLC und GC/MS.

R. Kutter, D. Jahr und H. Stritzinger. Fleischwirtschaft 62 (4) 1982 pp. 515-516.

'

9.9 Chloramphenicol Gas Chromatographi~ Mass Spectrometer Confirmatory · Procedure.

Chemistry Division Labaratory Branch.

Food Safety and Inspection ·service; Draft 12/30/81.

Verantwoordelijk: drs F.G. Buizèr

~

<(

Samensteller/medewerker: W.M.J. Beek

tJ./.3.

DGM25.8

'·

(14)

'

.

J

f'

I I I I; J:

,

---·

-i

~'::::::-.~

:

-=-:=--_I -. - - N .0..::•·· t..: -·- -·

·-

----

-

J

-

.

-

.

--

-

--

. - - - -. =-=--:-~:-::-: ---·-· _-_·_·_,

__

_

. . . .

----

-

-:::.

_

· ·ç · -- - --....-·- ( _.,

i

l

4

-m-•- --, .

-

:-· ·- -

(15)

----

-

-- -- -- -- -- -- ---t- -- -· - - - · -·

-./

--- - ---,-:---- - - ·--.

--

-

--

-

~-~_{____}~

--==-=

_---,

r

=

_-

r

=-=-=-

_{- - -}

-

=

_-

_--

=-

~

·:-

-:~cc:

:

'~~

:~

--:--

_-=-

l

~===

;:'-'

:-;~

-

--:-

-~

___

_

---~~~~=-=-___:_~:....=....:~~=-==-==-~=-

=,:±

...

:::

...;

-::.==-=-=-

=-

=-=--=-

~

---=-=-=-====-=

-1

- - -- - - _j ========~=

- - - -

---.

-

_-

--. c-·

-=t

I

·

_ _ I .' ---f

1 :

li

:i

:!

-oi ~ ---~-~ -~--' _ : j

-~r

-,

·---~. --::::::;-:- -- - - _oI ... _{- -..L.}_-i

_--+---,-:

_I

.

r

-r--

11 -- - - -- ----!- ~---~-

---

-L.>: - . ·-:~· J..

--f,

<

J

r•_ J\ -;- ' . -r, J --r, ~.- -\. \ : ~·· ~-1

,

.

~--'

-

_-

-\.

i

i!

I =-::::1 I I. I

-.

I

-,

~-__j_ -

-1-+

J __ I

=E

---:· •

-

~

' ' J _ j _

I

.... -'

-e

· ;

'-'_•

,

... ,

...

_, I ( ... I =vtee~~!3~jf ___l . _jj _ _ _ _ _ • o:

i

I

_\

!

i

I I

,,

(16)

I · I· --- -.-.. · -- --· ' I -- ~-•• - - -. - . - -

.

- --·

d

~;

,

.

_

_J _ __ v\l;~J__:ls~· -~

1:

· .

:

-

=-=--=

c

_

Ij

·

· -

.

-

--

'=ff

_

___

_

.

:

c~

~

~1i;:i~ ~-~ ~:~~=~===c===:=

~J

=

_

__

-

_

-

:

-·

~_:._

· _-

-

.

:~---

· _:::

----

-~-··_

-~

1

· -

-

- ·

-

·-

--

-

· ---·

.

- - -- -1-

t=+:

---

-.

.

··-~...:-.,__-_:_-=--==-:.-:.-=--=--..::.:..:.:-=::~- ~=-=C --~ ~:.:

_{1---tn::. _}

_{_}

_{____}

_{__}

_{_}

-.

,

-~

-

--

- · - -cr:--

-

è - - - -

--1 - _

·=

~a==-=:.========= I ( { ' I \

(

(17)

-VOORLOPIG INTERN ANALYSEVOORSCHRIFT NR. DGM 26 1e oplage (1982-09-01)

Bepaling van chlooramphenicol in bloed, plasma, serum etc. door middel

van HPLC

~let de methode kunnen residuen van chlooramphenicol in biologische

vloeistoffen (bloed etc.) worden bepaald.

De onderste grens van aantoonbaarheid bedraagt 0,5 ~g/ml.

Het terugvindingspercentage bedraagt meer dan 95%.

Het niveau ligt tussen.1-20 ~g/ml.

2. Principe

Chlooramphenicol wordt uit bv. bloed geextraheerd met diethylether

nadat eerst het bloed op pH = 10,4 is gebracht. De etherfase wordt

ingedampt tot droqg en. het residu wordt opgenomen in HPLC eluens.

Hierna volgt een analyse met behulp van "reversed phase" hogedruk

-vloeistofchromatografie met een UV-detektie.

3. Reagentia

Alle reagentia dienen minstens van ''pro analyse" kwaliteit te zijn of

van een hogere kwaliteit indien vermeld.

3.1 Natriumsulfaat, droog (Merck art. 6649).

3.2 Millipare water.

3.3 Methanol, Lichrosolv kwaliteit (Merck art. 6007).

3.4 Ammoniumchloride (Merck art. 1145).

3.5 Ammonia (BDH art. 10011).

3.6 Diethylether, Uvasol kwaliteit (Merck art. 930).

DGl-126 .1 - 2

(18)

\

'I

(.

2

-3.7 IJsazijn (BDH art. 10001).

3.8 Chlooramphenicol standaardstof (Sigma art. C-0378).

3.9 Waterige buffer pH~ 10,4.

Los 54 g ammoniumchloride (3.4) op in ca. 300 ml water (3.2) en voeg 350 ml ammonia (3.5) toe en controleer de pH met een meter (4.7) (pH= 10,4), vul aan tot 1000 ml en meng.

3.10 Standaardstamoplossing (oplossing A)

Weeg ca. 50 mg ch~ooramphenicol (3.8) nauwkeurig op 0,1 mg af in een 100 ml maatkolf.

Los op in methanol (3.3), vul aan en ~eng.

3.10.1 standaardoplossingen

Pipetteer 10,0 ml van de standaardstamoplossing in een maatkolf van 100 ml en vul aan met water (3.2) en meng (oplossing B). Pipetteer van deze oplossing 10,0 ml in een 100 ml maatkolf en vul aan met water (3.2) en meng (oplossing C).

Pipetteer 10,0; 20,0 en 40,0 ml van deze oplossing in afzonderlijke maatkolven van 100 ml. Vul deze aan met water (3~2) en meng. Deze oplossingen hebben een concentratie van resp. 0,5; 1,0 en 2,0 ~g/ml

(oplossingen D; Een F).

Oplossing C heeft een concentratie van 5,0 ~g/ml.

3.11 HPLC eluens

Meng 650 ml water (3.2) met 350 rol methanol (3.3) en 10 ml ijsazijn (3.7) en filtreer het geheel door een millipore filter (0,45 ~m).

4. Apparatuur

4.1 Hogedrukvloeistofchromatografische apparatuur met UV-detector en

als kolom~ Bondapak Cl8 10 micron 3,9 mm ID x 300 mm lengte. Waters art. 27324.

4.2 pH meter •.

(19)

-11 I

· '

1 I

I

_! I I

I

(

I " 11 3 -4.3 Vibro-fix.

5. Herkwijze

Voeg bij 0,2 ml bloed.welke zich in een centrifugebuis, met ingeslepen

f'H ao1 -.

stop van 25 ml bevindt, 0,8 ml buffer (3.9). Pipetteer hierbij 10,0 ml

diethylether (3.6) en sluit de buis af. Schud het geheel gedurende 1

minuut en laat de centrifugebuis hierna 5 minuten staan zodat de

waterige fase en etherfase goed scheiden. Breng ca. 8 ml van de

ether-fase in een centrifugebuis van 25 ml met ingeslepen stop. Voeg hieraan

toe natriumsulfaat (3.1) en sluit de buis af.

Schud het geheel 1 minuut en la·aL hierna de natriumsulfaat bezinken.

Pipetteer 5,0 ml van de etherfase in een 10 ml cultuurbuis met

schroef-dop en damp het geheel in met stikstof. Voeg nadat het geheel is

drooggedampt 0,3 ml eluens HPLC (3.11) toe en los op met behulp van

een vitro-fix. Van deze oplossing wordt 50 ~1 op het HPLC systeem

geinjecteerd.

6. Hogedrukvloeistofchromatografie

Eluens water-methanol-ijsazijn 65-35-1:

Injectievolume: 50 ~1.

Eluenssnelheid: 1,5 ml/min.

Golflengte UV-278 nm.

Gevoel~gheid :·0,01 A.

Recorder 10 mV. Papiersnelheid: 10 mm/min.

7. Uitvoering

Breng 50 ~1 van de verkregen monsteroplossing in het HPLC systeem en vergelijk de chlooramphenicolpiek met die, die met een van de

standaar-doplossingen (3.10.1 oplossing C, D, E en F) wordt verkregen.

Bereken het gehalte in ~g/ml aan chloora~phenicol in het monster.

8. Opmerkingen

8.1 Alle chemicalien dienen voor de analyse gecontroleerd te worden op

bruikbaarheid.

(20)

-·/

i

l _,

.-, I

4

-8.2 Bij analyse van bloed etc. dient een "blanco" bloed geanalyseerd

te worden ter vergelijking voor eventuele storingen.

8.3 Voor aralyse van het terugvindingspercentage dient men bij blanco bloed een zodanige hoeveelheid van de standaardoplossingen toe te voegen dat een gehalte tussen de 1 en 20 ~g/ml wordt verkregen.

9. Literatuur

9.1 High Performance Liquid Chromatographic Assay for Chloramphenicol in Biologica! Fluids.

R.L. Thies and L.J. Fischer.

Clinical Chemistry vol. _24 no. 5 1978'pp. 778-781.

9.2 The determination of chloramphenicol in serum using liquid

chroma-tography.

M. Najoli~.

Chromatographic Newsletter vol. 7, no. 2, 1979 PP! 7-8.

9.3 Serum chloramphenicol levels and the intramu_pcular bioavailability of several parenteral formulations of chloramphenicol in ruminants. J.F.M. Nouws and G. Ziv.

The Veterinary Quaterly vol. 1, no. 1, Jan. 1979, PP• 47-58.

Verantwoordelijk: drs F.G.

Buizer~

Samensteller W.M.J. Beek

tJ,/J.

(21)

---

-

---

·-

I

...

- -

·- ·--- --a·-·f -.. ~· fl I c . ----1 .

-

r

I ·i I I j •. 1-. I

.

:

· _

j

_

· :

-

··--

j

_·.-.::

:

-~-- :.--~-. • J

t

· ;_:

_

.

-

i

·

· ·-·

-

~·

jl

~~=~

I • . . •. . : ... ..,"_ .. ··~ I . •. ·C"t- -- . :2-- --~

-:-.

-:

-_-.-

- -.Z- --· é ~ -.

t

··

· r

E I -· ---··---1'

!

--~---·=:~:-=-~=-~.:-.!; L . . j. ·--~--_;:::::_ -. ' ' .. .

:

.:~

-

~~-- -~-

.;

~

j

(

.

·-____ j_ --.-. j --- - 1-"I •

~

r

. .

i

.. _{__}_ji

:

~

l

---.

-

---····----. -·-·-.. -- -·

-i

.

-~~

:·_:_

:

-~~~~-.

!l

. '•

\

.

·:-.:

:

::~=

-

-=

li

~.

__

_

·_ .::..

:

..

-

-:-

~

-

~

-

=-~,

· -:

:

~

!

:-:

.

:=

=:~;=--

-

=l

_

i

~===~-::._::

__

~_..:.:._

____::

_:_

__

---:---:-:----_~1;

..

··---=-.·-~

,

:·.--

.'

..

~.J..

-

!

_

j

:

_·

r

-

..

--·-

-

_

:-_

:

·I ·

i

! . H .. .. j . I • I

-

~

~~

~

~-~E

{

.

:-:

..

-

--:·

-

· _

··

-

~

--:

--

-:-~"=-~

-~·-

!_·

· -~

:_~-

-:J:-::

=

=-~

--=-f-::

__

~

+~

-

·_-

_

-

~~:~

~=: ·_

:..:.

·.-:..

~:..::

· :.:.

_:-:_

_

.::...:.:

· :..:·

-

~~-) . ' I _1.:. i. : ! I I . I i. ;

I

!

f I • /" •: !

/

· .

· ·-·

· "..--..

·.

_

_,..,

-

-,!

.

. , " .. . .. .~--· ,. __;._~

""",_---y-·--'- - '·.r--·' ···, ... ·-- ! . . ,:

-

- ·

l

-

--"---

-- I -. ·-,l -· -· • -. - - • -1 l

(22)

VOORLOPIG INTERN ANALYSEVOORSCHRIFT NR. DGM. 30

le oplage (1982-11-25)

BEPALING VAN CHLOORA}fPHENICOL IN KIPPE-EIEREN DOOR MIDDEL VAN HPLC

Verzendlijst: afd. Normalisatie/harmonisatie, sektorhoofd, afd. Diergeneesmiddelen (6x), Bibliotheek (5x).

(23)

... ~.

...

VOORLOPIG INTERN ANALYSEVOORSCHRIFT NR. DGM. 30

1e oplage (1982-11-25)

Bepaling van chlooramphenicol in kippe-eieren door middel van HPLC

De methode is geschikt voor de bepaling van chlooramphenicol residuen

in kippe-eieren. De onderste grens van aantoonbaarheid bedraagt 5

~g/kg. De recovery is op 10 ~g/kg (ppb)

>

90%, op 100 ~g/kg

>

80% en op

100-500 ~g/kg

>

70%. Het niveau ligt tussen 5-500 ~g/kg.

2. Principe

Chlooramphenicol wordt met ethylacetaat uit het monster geextraheerd

in aanwezigheid van natriumsulfaat.

Het extrakt wordt gezuiverd door vloeistof-vloeistofextrakties. Een

waterig extrakt. wordt dan op pH

=

10,4 gebracht, waarna een

vloeistof-vloeistofextraktie met d:Lëthylether volgt waarbij chlooramphenicol in

de etherfase overgaat. De etherfase wordt verdampt en chlooramphenicol

wordt in het residu bepaald door het, na oplossen in water, te bepalen

met behulp van !socratische "reversed phase"

hogedrukvloeistofchroma-tografie met UV-detektie.

3. Reagentia

Alle reagentia dienen van "pro analyse" kwaliteit te zijn of van een

hogere kwaliteit indien vermeld.

3.1 Millipore-water.

3.2 Methanol, Lichrosolv kwaliteit (b.v. Merck art. 6007).

3.3 Ammonia gec. (b.v. BDH 10011).

3.4 Ethylacetaat, Uvasol kwaliteit (b.v. Merck art. 863).

3.5 Acetonitril, Uvasol kwaliteit (b.v. Merck art. 16).

(24)

..

,

- 2

-3.6 Iso-oktaan (b.v. Merck art. 4727).

3.7 n-Hexaan (b.v. Merck art. 4367).

3.8 Diëthylether, Uvasol kwaliteit (b.v. Merck art. 930).

3.9 Natriumsulfaat, droog (b.v. Merck art. 6649).

I

3.10 Natriumchloride (b.v. Merck art. 6404).

3.11 Kaliumchloride (b.v. Merck art. 4936).

3.12 Ammoniumchloride (b.v. Merck art. 1145).

,

3.13 Kaliumdihydrogeenfosfaat (b.v. Merck art. 4873).

3.14 Dinatriumhydrogeenfosfaat .2 hydraat (b.v. Merck art. 6580).

3.15 Chlooramphenic?l standaard voorlopig gebruikt Sigma art. C-0378.

3.16 Natriumchloride oplossing 4%

Los 40 g natriumchloride (3.10) op in millipore water (3.1), vul aan tot 1000 ml en meng.

3.17 Verzadigde kaliumchloride oplossing

Los kaliumchloride (3.11) op in 100 m1 millipore water (3.1) tot ver-zadiging

(

>

34 g).

3.18 Waterige buffer pH

=

10,4.

Los 54 g ammoniumchloride (3.12) op in ca. 300 m1 millipore water (3.1) en voeg 350 m1 ammonia (3.3) toe en kontroleer de pH met behulp van een pH-meter (4.5) (pH

=

10,4), vul aan tot 1000 m1 en meng.

3.19 Eluens vloeistofchromatografie, water (gebufferd)-methanol 75-25. Los 0,68 g kaliumdihydrogeenfosfaat (3.13) en 0,89 g dina triumhydro-geenfosfaat .2 hydraät (3.14) op in 750 m1 millipore water (3.1). Voeg hierna 250 ml methanol (3.2) toe, meng en filtreer het mengsel door

een millipore filter (0,45 ~m).

DGM30.2 - 3

(25)

(

- 3

-3.20 Chlooramphenicol standaardoplossing

Weeg ca. 50 mg chlooramphen~col (3.15) nauwkeurig op 0,1 mg af in een

100 ml maatkolf.

Los op in methanol (3.2), vul aan en meng.

3.20.1 Breng 10,0 ml van de standaardoplossing in een 100 m1 maatkolf,

vul aan met millipore water (3.1) en meng (oplossing B).

3.20.2 Breng 10,0 m1 van oplossing B (3.20.1) in een 100 m1 maatkolf,

vul aan met millipore water ( 3.1) en meng (oplossing C

=

5 ~g/ml).

3.20.3 Breng 10,0 ml van oplossing C (3.20.2) in een 100 m1 maatkolf,

vul aan met millipore water (3.1) en meng (oplossing D _,.

=

500 ng/ml)

(chromatogram 1).

4. Apparatuur

4.1 Omni-mixer, model 17106 (Dupont Instruments, Sorvall).

4.2 Rotatieverdamper (waterbad temp. 4o"0

-50°C).

4.3 Centrifuge (MSE coolspin temp. l0°C 6000 rpm).

4.4 Hogedrukvloeistofchromatografische apparatuur met UV-detectie.

11(( 4. 5 pH meter.

5. Werkwijze

5.1 Extraktie.

Breng in een 800 ml bekerglas (gewicht bekend) het struif van een ei

en bepaal het gewicht. Meng het eiwit en eigeel goed (voeg hierna

eventueel standaard (3.20) toe). Voeg 150 g natriumsulfaat (3.9) toe

en homogeniseer het mengsel met behulp van een glasstaaf.

(26)

-··.

.'t

-

4

-Breng 300,0 ml ethylacetaat (3.4) in het bekerglas en meng met behulp van de omni-mixer (4.1) 5 minuten. Centrifugeer het mengsel gedurende 5 min bij 6000 rpm (4.3). Breng 150,0 ml van het supernatant in een 250 ml indampkolf en damp het supernatant in met behulp van de rota-tieverdamper (4.2) tot er een olieachtig residu overblijft.

5.2 Zuivering

Neem het residu op in ca. 10 ml acetonit~il (3.5) en breng het met behulp van 25 ml isooctaan (3.6) in een 100 ml scheitrechter. Schud de afgesloten scheitrechter gedurende 1 minuut en laat de fasen scheiden. Laat de onderstaande acetonitrilfase af in een 100 ml indampkolf en spoel na met 2 ml acetonitril.

Schud de isooctaanfase nogmaals gedurende 1 minuut met 10 ml

aceto-,

nitril.

Laat de ·fasen scheiden en laat de onderstaande acetonitrilfase af in de indampkolf. Spoel na met ca. 2 ml acetonitril.

Damp de verzamelde acetonitrilfasen op een rotatieverdamper af tot er een droog residu wordt verkregen.

Los het residu op in 1 ml methanol (3.2) en voeg 10 ml 4% natrium-chlorideoplossing (3.16) toe.

Breng het mengsel met 15 ml hexaan (3.7) kwantitatief over in een 100 ml scheitrechter.

Schud, na afsluiten van de scheitrechter, het geheel gedurende 1 minuut en laat de fasen scheiden.

Laat de onderstaande waterige fase af in de indampkolf van 100 ml en spoel na met 1 ml water (3.1). Voeg 2 ml water (3.1) toe aan de hexaanfase en schud gedurende 10 seconden en spoel na met 1 ml water

(3.i).

Laat de waterige fase af in de indampkolf en verwerp de hexaanfase. Breng de verzamelde waterige zoutoplossing in de 100 ml scheitrechter met 15 ml hexaan (3.7) en schud de scheitrechter nogmaals gedurende 1 minuut en handel als bovenstaande.

Voeg hierna aan de waterige fase 2,0 ml kaliumchloride oplossing

(3.17) en 3,0 ml buffer (3.18) en breng het geheel kwantitatief met 30 ml diethylether (3.8) over in de 100 ml scheitrechter.

Schud de fasen gedurende 1 minuut en laat ze scheiden.

DGM30.4 5

(27)

-:-:--·

..

(

5

-Laat de onderstaande waterige fase af in de reeds gebruikte 100 ml indampkolf.

Filtreer de bovenstaande etherfase (welke chlooramphenicol bevat) in

een indampkolf van 100 m1 waarop zich een trechter met· glaswol (3.15)

en droog natriumsulfaat (3.9) (ca. 10-12 g) bevindt. Spoel de

scheitrechter na met ca. 2 ml diethylether (3.8).

Breng de waterige fase opnieuw in de scheitrechter met behulp van 30

ml diethylether (3.8) en schud nogmaals gedurende 1 minuut en handel dan nogmaals zoals bovenstaand.

Spoel, nadat beide etherfracties zijn verzameld in de indampkolf, de

natriumsulfaat met -3 maal 5 ml diethylether (3.8).

Verdamp de ether op een rotatieverdamper tot droog.

Los het residu op in 1,0 ml millipore ~ater (3.1). Filtreer het residu

over een filter (Gelman acrodisc 0,45 ~m, art. 4184).

Injekteer van het filtraat 50 ~1 in het HPLC-systeem (4.4)

(chromatogram 2 en 3).

6. HPLC-instelling

6.1 Kolommen

Analytische kolom: Lichrosorb 5 RP 18 (4,6 mm ID x 15 cm lengte) 5 ~m

Chrompack art. 28810.

Voorkolom Bondapak C 18 (3,9 mm ID x 2 cm lengte) 37-50 ~m

Waters art. 27248.

6.2 Eluens

Water (gebufferd)-methanol 75-25 (3.19) 1,5 ml/min.

6.3 Detectie Golflengte 278 nm. Gevoeligheid: 0,005-0,04 aufs. 6.4 Injectie Injectievolume: 50 ~1. DGM30.5 - 6 -\ J

(28)

...

6

-7. Uitvoering

Breng 50 ~1 van de verkregep monsteroplossing (5.2) in het HPLC

systeem en vergelijk de chlooramphenicolpiek met die, die met één van de standaardoplossingen (3.20 B, C of D) wordt verkregen.

Bereken het gehalte in ~g/kg aan chlooramphenicol in het monster.

8. Opmerkingen

8.1 Alle chemicalien dienen voor de analyse gekontroleerd te worden op bruikbaarheid.

8.2 Bij toevoegingen van chlooramphenicol aan blanco ei werden reeo-verles tussen 74 en lOOi. gevonden. De hoogte van de recovery bleek

~

afhankelijk te zijn van hoeveelheid toegevoegd. Hoe hoger het gehalte toegevoegd hoe lager de recovery.

8.3 Bij analyse van een ei dient een "blanco" ei geanalyseerd te wor-den ter vergelijking voor eventuele storingen en recoveries.

Voor analyse van het recovery dient men bij een "blanco ei" zoveel chlooramphenicol toe te voegen dat gehaltes van 50-100-150-200-250

~g/kg (ppb) ontstaan.

9.

Literatuur

9.1 Studies on analysis of chloramphenicol in livestock products. Aihawa

K.;

Chikuma G.

Bulletin of National Institute of Animal Industry no. 36, 135-144

(1979).

9.2

Determination of chloramphenicol and its applications to residues in milk and dairy cows.

Proefschrift:

J.J.

v.d. Lee.

9.3 Bepaling van chlooramphenicol in vlees. Voorlopig intern analyse-voorschrift nr. Dgm. 25 le oplage (1982-08-18) F.G. Buizer;

W.M.J.

Beek. Verantwoordelijk: drs F.G. Buizer Samenstell~r/medewerker: G.D. van .DGM30.6

~

Bruchem

W

vBr/W

(29)

~

--

.. ·

c

·, ·; ; W I (JCJZ. ·or,: J ~VH:> •1 -. 1,_ 1-J.-l----li- Î 1- - 1

--

+-

-

~---

~

1---- +-1-=1- - 1- 1- --- 1---1-,_ ,_ 1-·- ·- . 1--11- - - t - 1-

-

~-1-

L -

---+-

--<-- ;

r

--t--

- - - - r - --1 - --1-1-1- ·--f--1- --, -,_ -4 .-c-0 r-_.J=-1 1- 1- 1- 09 - r - 1..:._1---,_ - - 1-

_

--

--~

~---

-t--

1-

-

1-t=::

l

--1-~

----r- I.:__ 1 - - _ -1---- - - I - - I--j -

1 =

~

-

,

rj'

_

--+- 1---L-1- -- ! - -

:

=

,

-

t--, - t--,- ,- ,, . L _ ,_ _ t---- ~ -1- 1 I- I T - I- 1- --f-· :

El

c._L.-f--+-l--11 - -i-- - _ _J 1-- i_- --

-1

-

l

=

t·

-

1 - ' ,_ · - - -

-+

-

· '3(~~

'

_{, -}

-=

_...1

-

'

_Ol r -_- ₁_- -

-

-1

-

1~

1 -,

-1--- · -l-f--1---1- --t--, __ f--

--=

~

-·1 - f--- - · -- 1- 1- - - 1- 1 - 1- :--1--+--41 I,- 06

b

o

:r t ,~ [I. IA ~

\~~".-=

0...__.__

(30)

··_,.,

.

-0 . . . ..

j

1

~JIIOOl ·uN HNH::> t-l. "JlS-F·..,.::·c· 1J··=-i 'è:: .

j

·1- i- --'

-

-1

-

.

1

· j-

-

· .. _

~--~~ ---·

_

1_ . ~ ...

!oo

I •

i

=:L~-j.:; I --,1- .. - ··- - ---'-· -- - __ J__.__

-J-

· ;

~ 1 - ! · : , ... ' ·.

--

1 -

-

I

~~

~-=t=

;

--=

=

· =-

1

· =-

~=

I

=

.:..

· =

,

·_

j

~

=l

=-

-

~

r

· ~:

::..

_

;

·

· i

: _ -

:

. ;

l

-

· -

~

--

'

-

~it=

·-

1 -l=

.

-

· ·'-J~

· -

--

'

_ --

-

i

,~

_

!

=-:-:---

~-

.

-~_:.._

_

·

· _

.

-1

--

_ 1_

--;-

- ; 1--·₁--·_ _ -....---. . . !~- · _ - -~-=-1--=-~=-,-I , -~-I

-·

·j

·

·-

--

~ i- ' -_-_j--;_.. • . _.. _. _{; .}

oT~---;.-~-+t..:·~r_...-1-

1·- .. --

·

1

· ~

-

~

-

~

-~-

=l

=

F

-

!

:..

l

:

-·

-

!

·=

.:.:.

1

-.!- -:.: -- · ·- 1- ~~---~- :- 1_: • ·- -- 1- - - f - - . ,90 : I I I • '

"'ll=

I=

1 ~--

~

=

~

:._

1 =

l= l- - ·

-,

c~

..

I_

·

1 :

-=i

··

-i.--

j=li·

=--~

·- i - .

~

.. 1-1- 1 - 1-

-

~-···

1 =-1--

··

i=J~

_J

--

~

t--+--+--1~~--1- ! - ..l

F-!:

1- 1-

--

-

~

·;;~.;_1-:::::l-=

... . • .. . . . . I....,...

=r=

=-

L

=1

B=i-

~

..

1 1-;· ; 1 - :- 1-

==f-=

_

...

~ I~ ... . . .... ---~ l'W'N~lv~ ~ Ov

-iéo-1

- , -

-

1 -

--l-

=l

-

I

=-_t=!-

!

-,1=

1 =

1 :

=

:=~-r=-~l-

-

- - - - 1

_l-j--~1--j-· --~~-=]-i--·i-l

_

,

-

.

-

~

-

.

I-

:

=

i

=

1 =

1 -

1 -1

-

1 - -

-

1 - l

· -.=:1-

--

-

l

-

=1

~

1·-=1

=

_

=

=r

=- -

,

-

.

--t--+-~-....Jrl.

··

--11- · 1 _ - - I- 1 .. __ - l-ï--J---1 i ·

=t=.

· -·F

:

_..:...

:

=·

;l=l

=

l

· -

1 - -

i

=

l

=

i

=---=-

=-

-

=-=

· ---:-

-

·

1 --j

!

-

!

---

· 1·

--

-J-

j

·

· -l

--

1 · -;-

-- - 1 - . :I- I-1- ___ I- __ 1- -- ,-- - ___ ,_ , - -·1 --- -, - 1- - ; ·

--

1--.

' I -

1 -

-·

·1-.l-~

=

· _

-

· -,

-

1- "1-

· -l

· -

·

· ---,

-

,

·

· - ·-·

'

.

oe

.

1- 1- · ' --~.:,· :--··· - -

-

1 ----;-

T'-

· ~

-. ··-1- . i+- 1- - -- --+-_J-··1-j I

,,o

.

I I

::.

i

I I tj=

I

=

11 =

=-

1 -

-

1 -==.:.=J=::.-:-I

:

-::.l_-r-

-=f:J::...·E-;·-~ ~=:..J-1=-:.F:-:(::..

· ;

-~·--+1---1-1---1-1

:=

I

=

:

=

1-l _, , -.- ~

t

~

.

-=J

, :

r

.-

,

.-r-,~-

!

=

1 =

1-1-1-

1- J=~---1-j-l---+-~F..J_,

__

___

J_

~=ot..f--1=

·

..-i---1-

r

~

• =

:

~

i

=

=i=l=

=

-

J

=--

· _

~

=-

-

J-.~

~

-

~1-

:..-=-

-.-~--1~

-

:-:--::1--~~

-

~

-

1-

~

=-

~+~

-=l=t=:t==t=l=il=l=i..J=-i==l==fi=i~~

I

!~

-;-- -

-

~

--1-

:

=

1

· -

i=

1-

~

1 -

--l-j-

~-:::=i

_c:_:J_-::

.~

- - -

-

11 -

I

=

-

- 1-

_j-~

-

J

=-

f- :

~

-

+

· fF-

·-

-.,.-

-. ;· .

·-

! ..

,

-

·-

-·

- -

·- 1- ·

·

j

-

1

1 -

-

1

1 -

-

-,

$

=t='

I _ _ '· .

· -

----

!-

!- 1- " I- I I_ )

os

-- - - I !- . 1 I-~ ( • - - - , I . I~•

I:(

-·

1·

··

··-..J

-

l

-

! -1- 1- · 1 - __j

:

so

I I - j i

~

·f·.

r

·· ·

· -

:-

1--1- - 1- 1- 1---t---r~-~

- ,

-

-t-

~

.

- - ·- . j - +-

1 -

-

1 -

1 --1--

-1--t---J--j- --,- - 1

-;=,_:~1

-

~

:=

=-

~

=

~

=

,

-

· -

1 -

· -

,

•

I

--::;~=J

.=

· ----:r-:

i -

-1-

;

-• 51· - . ~r- 1-

i

=

!

=

-=--~~- -~=~

_-

:

-1~--+--

_

_j_J_~----:-

-+

-·

~

· 1-1

!-

1--

1 -

- -

-

+

-

l-

I

=._

--1-=J.

.-::-:--~-

==J=:L-+

-

+

· - ·-

-,

-09 ~- ._: I-j.=.. ~- - !- ---j-1- 1-~- - j - ,,..0

----=1-

=t=J=t=+

· :-.:.

~::-j.:::. F l- i- 1-: -- ~ -1-1-~1-. I~ • l I

"=I-

1 - 1- 1:- 1 - -~- - 1- -~ -- 1 --- -j- ~- _ .:=)_1_- r - - --,-..,-- ;-- f-· ·-1

+

'=1~ft=~l~-lr-=l=t=+=l~=~·.:::_j_ =-±J- - ·1- - !-- 1- --~-~ 1

c.=

-1 ••

..,-

_j

--1 - •• J ,___ I- 1- ·-1- l- 1- 1 ~ - î·-, - ,-· ·- -- · -- ---jl- ·

-1-

~

-le.---

-- •

~~#

-

1-v.

_

\l

·-t

__

-_-_1----+:_---!H'-1-·

-+-

-~,-'l__:--;- -~

·-

;

..

,

.. :

-1--0lr-

l=

-1-

1 -

:

.

=

f-

-

:=[

~

-

n.

-_

·r-,

t-..

~

1 ~~

,:::.

--l=-

0]

~~'

]

__

::-

.

·~~~ :

_

--::

_

~

:.

~

-

~

:

· .

:

1-ii--t-H-+-l-+--+--1-~t-+-tl'-\.-t-11-/-tl~ ,,t-f.J.J\J'-' --1--\.-i:-!'--l--..!..::=l

;1--.

· - -

· · ·

·

· .. ,

·

-~-

-

!

Et=!=

I

=

1 -- ··-

· -

-

~

=

~1/

-

-j

~

-

14 1-

1 ~3

·

..J I : : : 1- 1 -

1 -

-I-

1--1

-

~

---=

~f-

~

-=-

=~~_j

~~

~

j

__

-

L:

_-

,

-~

-j

:

~J=F~

I

-

~

-

~~""-'-

1- --- --- -- - --;

R

·

· -

IIi'-'l-=

-

~

-·

j

:

·

1- 1 -

f

-

1-

f-:=

.

-1- - i -

=

~=

-.k

-

..

.

~

-

~1

· ~~

---

i-

·

OB - , 20

---l

+-1··· . -

·!

1 - 1- 1 -

+

I

· \J-l4""A:

:!>LIJ~

~~d'-...11

~

-+-06 10 I

~

I

1 -1-

-

=F

I j -I I

--

_- _·

-

,

_·--

--I I

(31)

---

1---~---r---~~_- _,_..._!_'_- _. ₁_-_-

_i

_&J

---

_.

---r--~~oo ! I . - •·- ' - J .. - ~-~----1-- _,J

jj_

J

_

'

l -I - -- __J_ _ ; .. - !·--·-- - --, I I' - -- - _ _ ,

-+

-.

:

--

;

-

--!- _ _j_ j----1- --

!

.

! i . --:- 1-- --1_{- - · -} _~_-₁ _-- _- _- _· _· _... _- _-- 1_-·_,_- _-_- _~_---_•_-- _{_ J}_{__}_- _-~_-r

---

_I _-_~ _- _-· --~ _ _ , --J--- ·--i·--1~ - -.- ·---~-~---=--1=-1--r--

-

,

-

1 --

-1--- ~=-!-=-,__.,.:..:._j~~ -- I ---1- ___ ,_. -

J

-

· -; -

-

j

---

I· ~-- - - ~-~-- -

!

-

:

t

-- --

-

--

---

-

i

-

--

-

1 - ~ -' - J.- -.:-

-r--:=J

· -

--- --

- -

-

__,-

--

-

--

-~ -

-

- I- - -j·- --- ·-

1 --

--

-

----

---

--

---~--·

-• !-1-- ··--·--- ---· -

1

· --

--

-- - ~- ---- -

-

1 -

t

-

1 -

1 ---

-

--

-

1 --

· -

- ~--1 ----I·-~-- :-: -~ :- , -

-1---

--1-.- • ·- ·- _,_,. -- -· gö

l

---

I - - :--~---

-

f-

--

1 -

- ..

·

· +

-

---,-.

FF-

=J

=1

-

.

'~3

t- -

::__ =

-

_:_

I

-

====-=

-

--

1 ==

---

-

~=

--1

-

1 =

- -

=-

· ~

=-

-

=J

-:J$1-- --

-

1 -

:

=t--

-

1-1

=

1 :_

---

--

1 - -

1 =

11 ~.:

·-

_:_ __

~

I ~ ~-

-

f--

.

--

--,

.

§_

:

=i.

..

~

__

_

F

:-:-r-

i

-

:- ..

~

:-:-

~

-

:-

'7

1 -1

--:- -- .

..

_,.1-:::--c . - - . ... __; .a. . . . ~ ... *""'~~~ .. -~ ~:... . . - 1- ·1- . . ~....:._; ,_ ~__J - ----; I , ,! o I I 80 1 1 I I I I

~

-=·-=-

~

-j-

~

m

~ =-

:

=

~

-=-

----

1-

-

--

~==

--~

-=

=

~

=t=~

· --

:--

1- 1- - , -- -

-

~

-

-~

:::-j

1 -

--

,

-

L

..

.

--

-

1 ---

1 -

'

-

--

.-

-

.

-

·--

:.=J

--

1 -·

· -

-

~

i

..

.

-- .

--! . --- ·- - -I- 1-- -

1 -

-

--

-

'

1 ---

J

-I~·+ 1

-1

-T-

-·

- -

----

-

·f-

1 -'--

1 - -

-

· -

----

-

·-

·- - -

·

1 --- -

-1

----

~-- -~-~ - .. -· ~~-.. ~ ·t- · - -1- -- - -- _ ., - --·- -- - - --- - - ~- - - 1- - - - -

=1---

-

--; _ __ ,1 ___ ~+-

,..,!_

_

-- .J- - - -·- - -- - ---··· ·-.. --·-- - --- ---- ---,--- - -- -- --~ ' - ·1 - lt 'f -~- - · --j-- -- · ·- · -I- :- -,- - -- - --- -

--

1 --

-

I -- - - · · - - __,-- - ---I- - -- - - : ! - - !_ . ~~ -:--1, i~-

-

1 -

j

-

-c--

r--

-

--

- -

_ _

,

?

_

Q

__

,

_

--l---1- _ , ____ --1- · - - - -

--

1

· -

-

__j __ ! :

1 -

1 --

• -

,

....,....

-

- --t

---

-

--

-

--~--

--

- -

---

:=1

-

_

₁

-

r

--

-

- -

-

--

-

-- -

~--J---·1-

· ~

-

_:_(-

~

-

;

.

l

· i-~

~-=-~

=

1 -

=

=-

-

:..:-

~

=-

~

=

==-

~-=:

=

~

=i-=

:-

-

T

-

-=J

__-

-=

=--

ï

=J~

~

---= =-~

~=-:

~

:=-

,

-=-

·-=-

~

_,

=-

-

l

~

1 ~

__

j j:.-=-·

"

±

_!

+:-_:_

--_:-·-r--

1 -

f--

-

---

1 -

·

~- .

_-r-

1--

1-@~- ~-:l- _·.-: ---- -j-

j

-=l ;- r- -

I

-

..

l

-1--

1 -

---

1 -- -- -

_

-

c

-

:

--.: .. i- ; --!--'--

-

,

-

1 -

60r--·

l

-1-

1 -

-

-r-l-~-

..,

!

=I=

· :

:t

:

1 .

~

=

--

~

-

~

-

=

1 -

~

==

:

=

=!

=~=

~

-=

~

=

~

1 -

--

___

_

J

=t=

i~

=

I-i

H

-:--J

,_

-

=l

=

r-

1 -

-

=J= - -

-

-·-. -

(==-

-:-

~___,

~;IJ

,_

=t_

-:-l_-ti...,jH

II

$Ë

=-

-

:

=

-

~

=

:_

-

~-

~

.

-

.

1

-

c-

l

H=

I -t-.- - - --- ,-,__. -1- - -.---· / • 1 ~-+- 1

+.L

_

·-

1 - -_ ___ I- _ _ -- - _1__ _ 50

l

=?i= 1

-

_--1

+-

_-

~

_I _-j--j+ i -_- _-

-~

_- _{- - -}- I- _-_{- -}- -

~--

,-_-_-- _-

--

l

-

-+-

_-

=-~f-

=-

~r=-

-=-

=t-=:

_-

l=

::

=t

~=E=t

::=1!

:=

f-

=t=

~

---, -l! -- ---- -- 1- - - - -- -- 1- -·

-

i

--+--t

-

+-

-11

-

-=ttt

:+

=t

=:J=

+=l

=

+==t==

~

;

--

~

-

~

'

~

t

-

- i-

1 -f--

+

~=--

~r--=

t

~

~Ë

=

~

==

t

=

~

t=

_

=

_

~,=-t

_

=

t~=:j

l-

-

=t

=

__

+

l-

~j

l=

-

~

JI-

I

-

=

--1t

+t\

-+-_

-

+

-t-

--t-

-

1 -l--

--- I lo

+J--

1 -

-t--J-

-

j--

-j

--

,

_

----

-

-~--f--+~~-+--1--J--j---j--j--J

~=~~

-

~~

~~t

+~~

-

tt~

Ê~~~~~~~~~

~

~î

~~

-

~~~~~r:

~

~~

~~~

1l

4

~

-

0

~

J~

-

~r

-

~

-

~~-

-

}

:

=

_

-

~t~

-~~~~~~

=

~

-~~-

f

=

~

~~

=~=~+.~

-

~=

~

· -t!~:~fi

~

~:

!~

:=

~-

~

---

~

F-

=-

~

=-

1 _-

_~~

_~

_-

_<t

_~~~F=

_î

_{_}

_~~

_~

₎

i - - -,-1 - - - r--- -- - -

-l----1

-

--+

--1

1 - -

- -

1 -

- ·-

--

-

1 - --

-1

'-

--

+

-t-

+--+--11---1--1-

--

H

--1

1 +-

_

-l

+·

---l- - 1 --· ~-__:_ -==-~=

-

+

- - - --

=

~ :~

.

~I= _ ___ =:.:_1 ·_

E

r-

§'§

-

~3r-~Mê~i~~fl§êi~

~

êJ~~

~

~1~1

-

ê~1~1

-~

00 _~--

_r-

_~---

_- _- _{- -} _-_-

1

-r-

1 -

-

~

-

---

i

-

-+--l

--

1 -

~·

1 -

1-

t-

--t--

-11

- ·--

-

- f - - - _,__

--

-1

-

-+-t--

1-4--1

-l

-

-1

~~~~"-11~~~-::~::~~--t-.-~---~---~---~--+--~~._--t ~-,_

-

_

++ -_ -~-~ - - ---- ,: - - - _

'=

r

- _

_

-

I

-_.:::

~:=i !-" _,_.:::r-- _-f:=-_t1₌_t==f==t~~-. -~ii!J· ·

-

'- -1- - 1- - - .. - . ..l - -' - - . 1- -\- - - - --- --

:::-

J

-r-

-

t--

1-\

1--

---

1 -

~r-;---- -

--1

=

~

--t-

~

--:-

!\-

~

1 -H

1 - -

~

l -- t -l---1

-

t---1-

--+--IH

-+--+-_}-\-A - -

-~

l\

-=-

l

H--:----+

-

,t-+t=

_

+il

-

=!=

t--

=+

_

=

_

=-l

_

~

_

~;J

~

~r-~

-

=:p_r\~~--j~,_:~~-~=!

-

'f'J

=l-_f~~~

-i

=J~_32-~J

.~o.~Jlr

+-t-4

"'

-+--

+

-l--

-f

-

--t

-

-l

---l

• -ll-

:

-

~

-1

---/HI:=

- - -1-- .~

_

,..

_

.

+-

. -+-t-~----ll'il'o. ... -,I,r--+--+___.•_-+--!--ll---l·-+--+--t--H--I--t---1-+~"'"·· --, 1\_

-::-- - - t=1- - - - .._ V _,...-.. IY" .,... .. j · . .._ -. : I

"'==

-

----+--- - - - -- -\- r-t---t.- 11---1

-

1--

- -

1--

-

-l

+f-

fi

.:..___

l

/'I I 1--tr,: - l- 1 · - - 10 U l :)!~""" Lm

rf-i--- - - I --- -I- - l---t--f---l- - + - t l --+--+-11--+--+--f--t--+ - t --l----t-·-+"--I·- +--L<----II--11+--+ - : f --t--!--l---+--+

~--r- 1- ....

pp:

I.