Paracetamol in neonaten
Validatie van de analyse van paracetamol en
metabolieten met behulp van UPLC-MS/MS
Nuria Slijkhuis
en Bart van der Nagel
Uitvoeringsgegevens
Documentgegevens
Afstudeerverslag periode 4.4 Versie 1Auteur
Nuria Slijkhuis n.slijkhuis@erasmusmc.nl
Begeleiding
Marieke van Deursen mm.vandeursen@avans.nl
Bart van der Nagel b.vandernagel@erasmusmc.nl
Robert Flint r.flint@erasmusmc.nl
Birgit Koch b.koch@erasmusmc.nl
Opleidingsgegevens
Avans HogeschoolLovensdijkstraat 61-63 4818 AJ Breda
Academie voor de Technologie van Gezondheid en Milieu Forensisch Laboratorium Onderzoek, afstudeerrichting Chemie
Stagegegevens
Erasmus MC Apotheeklaboratorium Nc-219 Wytemaweg 80 3015 CN Rotterdam 010-7033672 labapotheek@erasmusmc.nlVoorwoord
Voor u ligt het eindverslag ‘Paracetamol in neonaten: Validatie van de analyse van paracetamol en metabolieten met behulp van UPLC-MS/MS’. Dit eindverslag is het eindproduct van mijn 20 weken durende onderzoek op het apotheeklaboratorium van het Erasmus MC Rotterdam. Dit onderzoek is uitgevoerd in het kader van mijn afstuderen aan de opleiding Forensisch Laboratorium Onderzoek , richting Chemie, aan
Avans Hogeschool Breda. Voorafgaand aan deze 20 weken afstuderen, heb ik al 20 weken stage mogen lopen in het apotheeklaboratorium van het Erasmus MC. In deze periode heb ik de methode ontwikkeling van de analyse van paracetamol en metabolieten mogen uitvoeren (zie eindverslag ‘Paracetamol in neonaten: De analyse van paracetamol en metabolieten met behulp van UPLC-MS/MS’, 03/01/2016). Tijdens mijn onderzoek heb ik veel hulp gekregen van mijn bedrijfsbegeleider Bart van der Nagel, hoofdapotheker Birgit Koch, apotheker Robert Flint en mijn collega’s van het apotheeklaboratorium. Ook kon ik met mijn vragen terecht bij mijn begeleidster vanuit mijn opleiding, Marieke van Deursen.
Bij deze wil ik graag mijn begeleiders bedanken voor goede begeleiding en ondersteuning tijdens mijn onderzoek. Mijn collega’s wil ik bedanken voor alle hulp wanneer dat nodig was en de gezelligheid tijdens mijn stage- en afstudeerperiode. Ook wil ik de vrijwilligers bedanken die paracetamol-vrij bloed hebben gedoneerd.
Tot slot dank ik mijn ouders, familie, vrienden en vriend voor de ondersteuning en nodige ontspanning in mijn vrije tijd tijdens het afstuderen. Dit heeft mij zeker ook geholpen om mijn onderzoek tot een goed einde te kunnen brengen.
Ik wens u veel leesplezier toe. Nuria Slijkhuis
Samenvatting/Summary
Dit verslag beschrijft de validatie van een methode om paracetamol (APAP) en vijf metabolieten te kunnen identificeren en kwantificeren in kleine volumina plasma van neonaten. Door de recente beschikbaarheid van paracetamol voor neonaten is er nog weinig bekend over dosering, efficiëntie en veiligheid. Uit onderzoek is gebleken dat het paracetamol metabolisme onderontwikkeld is in premature neonaten. Dit geeft een verhoogd risico op overdosering waarbij er een overmatige vorming van het hepatotoxische metaboliet NAPQI ontstaat.
Het doel van dit project was om de ontwikkelde UPLC-MS/MS methode voor de kwantificering van APAP en metabolieten verder te optimaliseren en te valideren. Met de gevalideerde methode kunnen 10 µl
de mogelijk hepatotoxische route wordt afgebroken. Aan de hand van deze kennis kan door artsen een veilige dosering worden bepaald. Ook kan deze methode gebruikt worden voor het in kaart brengen van het APAP metabolisme in andere speciale patiënten populaties, zoals kinderen met het syndroom van Down of anorexia patiënten.
De methode is ontwikkeld voor de analyse van APAP, APAP-sulfaat, APAP-glucuronide, APAP-glutathion, APAP-cysteïne en APAP-mercapto. Als interne standaarden zijn APAP-D4 en APAP-D3-sulfaat gebruikt. De monstervoorbewerking bestond uit eiwitprecipitatie met methanol en verdunning met 0,1% waterig mierenzuur. Er is gebruik gemaakt van een Dionex Ultimate UPLC-systeem gekoppeld aan een Thermo TSQ Vantage MS met ESI-probe en een Acquity UPLC HSS T3 kolom. De totale runtijd bedroeg 5.3 minuten. Het injectievolume voor paracetamol was 4 µL en voor de overige componenten 10 µL.
Voor de validatie van de methode zijn de volgende parameters getest: lineariteit, LLOQ, ULOQ, juistheid, herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid, stabiliteit, indampeffect en matrixeffect/recovery. Voor het testen van de lineariteit is er gebruik gemaakt van calibratie standaarden van 0,05 mg/L tot en met 50 mg/L. De methode heeft een lineaire calibratie curve voor elk component met r ≥ 0.9950 en r2 ≥ 0.9900 in een gepast concentratiegebied. Voor alle componenten is er een LLOQ behaald tussen de 0,01 en 0,05 mg/L. Kwaliteitscontroles (QC’s) zijn bereid op drie concentratie levels: QC Laag [0.20 mg/L], QC Midden [1.5 mg/L] en QC Hoog [15 mg/L]. De juistheid voor deze QC concentraties was voor alle componenten binnen de eis van <15%, behalve voor QC Hoog van APAP-Cysteïne. De methode heeft een goede herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid voor alle componenten. De monsters zijn 48 uur stabiel in de autosampler en blijven 24 uur stabiel wanneer deze voor de opwerking bij 6 °C worden bewaard. De korte stabiliteit is te wijten aan APAP-glut welke snel wordt gehydrolyseerd in plasma. Er is geen indampeffect geconstateerd. Tot slot is het matrixeffect en de recovery getest. Er was geen matrixeffect waargenomen voor APAP, APAP-cys en APAP-sulf. Bij APAP-gluc vond ion enhancement plaats en bij APAP-merc en APAP-glut ion suppressie. De methode had voor alle componenten een goede recovery, behalve voor APAP-glut. Dit is mogelijk te wijten aan de instabiliteit van APAP-glut.
This report describes the validation of a method to identify and quantify acetaminophen (APAP) and five acetaminophen-metabolites in small volumes of plasma from neonates. Due to the recent availability of paracetamol for neonates there is limited information about safe and efficient dosing. Research has shown that the acetaminophen metabolism is not fully developed in premature neonates. This indicates an increased risk of overdose where there is an excessive formation of the hepatotoxic metabolite NAPQI. The aim of this project was to further optimize and validate the developed UPLC-MS/MS method for quantifying APAP and APAP-metabolites. With the validated method, 10 µL plasma samples from neonates can be analyzed to see the extent to which APAP is metabolized via the hepatotoxic route. On the basis of this knowledge, doctors can determine a safe dosage. Furthermore, this method can be used to analyze the APAP metabolism in other special patient populations, like children with Down syndrome or anorexia patients.
This method is developed to analyze APAP, APAP-sulfate, APAP-glucuronide, APAP-glutathione, APAP-cystein and APAP-mercapturate. As internal standards APAP-D4 and APAP-D3-sulfate were used. The sample preparation consisted of protein precipitation with methanol and dilution with 0,1% aqueous formic acid. There has been made use of a Dionex Ultimate UPLC-system linked to a Thermo TSQ Vantage MS with
ESI-probe and an Acquity UPLC HSS T3 column. The total runtime was 5.3 minutes. The injection volume was 4 µL for APAP and 10 µL for the other components.
The following parameters were investigated for the method validation: linearity, LLOQ, ULOQ, accuracy, repeatability, reproducibility, stability, effect of the evaporation of standards/QC’s and matrix effect/recovery. For the linearity, calibration standards with a concentration of 0.05 mg/L up to and concluding 50 mg/L were used. The method has a linear calibration curve for every component with r ≥ 0.9950 and r2 ≥ 0.9900 in a relevant concentration range. For all components, a LLOQ is measured between
0,01 mg/L and 0,05 mg/L. Quality Control samples (QC’s) were made at three concentration levels: QC Low, [0.20 mg/L], QC Medium [1.5 mg/L] and QC High [15 mg/L]. The accuracy for the QC concentrations were within the requirement of <15% for all components, except for QC High for APAP-cys. The method had a good repeatability and reproducibility for all components. The samples are stable for 48 hours in the auto sampler at 15 °C and 24 hours when stored at 6 °C prior to preparation. The short stability is due to APAP-glut, which is rapidly hydrolyzed in plasma. There has been no significant difference found between standards who were evaporated under nitrogen flow and samples who were not. Finally matrix effects and recovery were tested. There was no matrix effect observed for APAP, APAP-cys and APAP-sulf. For APAP-gluc ion enhancement took place and for APAP-merc and APAP-glut ion suppression. The method had a good recovery for all components, except for APAP-glut. This is possibly due to the instability of this component.
Inhoudsopgave
Uitvoeringsgegevens...1 Voorwoord...2 Samenvatting/Summary...3 Afkortingenlijst...7 1. Inleiding...8 2. Theoretische Achtergrond...9 2.1 Pijn...9 2.2 Analgetica...10 2.2.1 Opioïden...10 2.2.2 Niet-opioïden...10 2.3 Paracetamol...11 2.3.1 Chemie en distributie...11 2.3.2 Toepassing...112.3.3 Werkingsmechanisme...11
2.3.4 Metabolisme van paracetamol...12
2.3.5 Metabolisme van paracetamol in neonaten...13
2.3.6 Bijwerkingen en toxiciteit...13
2.4 Analysetechnieken...14
2.4.1 HPLC/UPLC...14
2.4.2 Acquity UPLC HSS T3 kolom...15
2.4.3 Massaspectrometrie...15
3. Materiaal en Methoden...20
3.1 Chemicalien en reagentia...20
3.2 Stockstandaarden, calibratie standaarden, QC’s en interne standaard...20
3.3 Matrix...20 3.4 Monstervoorbewerking...21 3.5 Apparatuur...21 3.6 UPLC instellingen...21 3.7 MS/MS instellingen...21 3.8 Validatie...22 3.8.1 Lineariteit...22
3.8.2 LLOQ and ULOQ...23
3.8.3 Juistheid...23 3.8.4 Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid...23 3.8.5 Stabiliteit...23 3.8.6 Indampeffect...23 3.8.7 Matrixeffect...24 3.9 Patiëntmonsters...24 4. Resultaten...25 4.1 Lineariteit...25 4.2 LLOQ en ULOQ...25 4.3 Juistheid...25 4.4 Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid...26 4.5 Stabiliteit...27 4.6 Indampeffect...27 4.7 Matrixeffect...28 5. Discussie...29
6. Conclusie...32
7. Aanbevelingen...33
9. Bijlagen...37
Bijlage 1: Instrument methode...38
Bijlage 2: Concentratie calibratiestandaarden & QC’s per component...41
Bijlage 3: Calibratie curve van elk component...42
Bijlage 4: Veiligheid...45
Afkortingenlijst
Afkorting Betekenis
APAP Paracetamol, N-acetyl-p-aminofenol
APAP-D4 Paracetamol-D4 APAP-D3-Sulf Paracetamol-D3-Sulfaat APAP-Gluc Paracetamol-Glucuronide APAP-Glut Paracetamol-Glutathion APAP-Cys Paracetamol-Cysteine APAP-Merc Paracetamol-Mercapto APAP-Sulf Paracetamol-Sulfaat
APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization
API Atmospheric Pressure Ionization
COX Cyclo-oxygenase
CRM Geladen residu model
DC Gelijkspanning
ESI Elektrospray Ionization
FDA US Food and Drug Administration
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HSS High Strength Silica
IEM Ion evaporatie model
KKGT Stichting Kwaliteitsbewaking Klinische Geneesmiddelanalyse en Toxicologie LC-MS/MS UPLC of HPLC gekoppeld aan een tandem massa spectrometer
LLOQ Lower Limit of Quantification
MS Massaspectrometer
mTorr millitorr
m/z Massa-ladingsverhouding (mass to charge ratio)
NAPQI N-acetyl-p-benzoquinone imine
NP Normal Phase
NSAID Non-Steroidal Anti- Inflammatory Drugs
PG Prostaglandine
psi Pounds per square inch
Q1 Eerste quadrupool, massa analysator
q2 Tweede quadrupool , botsingscel
Q3 Derde quadrupool, massa analysator
QC Quality Control
QqQ Triple quadrupool
RF Radio-frequente Wisselspanning
RP Reversed Phase
RSD Relative Standard Deviation
SIM Selected Ion Monitoring
SRM Selected Reaction Monitoring
T3 Trifunctional C18 alkyl
ULOQ Upper Limit of Quantification
UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography
1. Inleiding
Premature neonaten hebben vaak te maken met herhalende langdurige pijn door de medische behandelingen die zij moeten ondergaan. Het gebruik van analgetica tijdens deze behandelingen om de pijn te verlichten is slechts zeer beperkt. Na onderzoek naar de toepassing van opioïden en NSAID’s in neonaten is geconcludeerd dat deze analgetica veel schadelijke bijwerkingen hebben. Het wereldwijd veel gebruikte analgeticum paracetamol (N-acetyl-p-aminofenol) was lange tijd niet beschikbaar voor neonaten doordat rectale en orale toediening niet mogelijk was in de kleine lichamen. Na de introductie van intraveneuze paracetamol werd pijnbehandeling ook bij neonaten mogelijk. Door de recente beschikbaarheid van paracetamol voor neonaten is er nog weinig bekend over dosering, efficiëntie en veiligheid. Uit onderzoek is gebleken dat het paracetamol metabolisme onderontwikkeld is in premature neonaten. Dit geeft een verhoogd risico op overdosering waarbij er een overmatige vorming van het hepatotoxische metaboliet van paracetamol ontstaat.[ CITATION Dan1 \l 1043 ]
Het doel van dit project is om de ontwikkelde UPLC-MS/MS methode voor de kwantificering van paracetamol (APAP) en de metabolieten (APAP-Sulfaat, APAP-Glucuronide, APAP-Glutathion, APAP-Cysteïne en APAP-Mercapto) verder te optimaliseren en te valideren zodat deze toegepast kan worden op een neonatale studie. Met deze methode moest een LLOQ worden bereikt van 0,05 mg/L (voor APAP, APAP-Sulf, APAP-gluc), 0,025 mg/L (voor APAP-Glut) en 0,01 mg/L (voor APAP-Cys, APAP-Merc). Met de gevalideerde methode kunnen 10 µl plasmamonsters van neonaten worden geanalyseerd waardoor bekend wordt in hoeverre paracetamol via de mogelijk hepatotoxische route wordt afgebroken. Aan de hand van deze kennis kan door artsen een veilige dosering worden bepaald. Ook kan deze methode gebruikt worden voor het in kaart brengen van het paracetamol metabolisme in andere speciale patiënten populaties, zoals kinderen met het syndroom van Down of anorexia patiënten.
In hoofdstuk 2 wordt de theoretische achtergrond van dit onderzoek behandeld. In hoofdstuk 3 worden de gebruikte materialen en methoden besproken en in hoofdstuk 4 staan de resultaten van deze methoden
beschreven. Vervolgens is de discussie te vinden in hoofdstuk 5 gevolgd door de conclusie in hoofdstuk 6. De aanbevelingen zijn te lezen in hoofdstuk 7. Tot slot staat de literatuurlijst in hoofdstuk 8 en kunnen de bijlagen gevonden worden in hoofdstuk 9.
2. Theoretische Achtergrond
2.1 Pijn
Pijn wordt gedefinieerd als een onaangename sensorische en emotionele ervaring die in verband wordt gebracht met bestaande of dreigende weefselbeschadiging. Het kan worden onderverdeeld in twee soorten pijn: acute en chronische pijn. Acute pijn duurt korter dan een maand en gaat vaak gepaard met angst en een overmatige gevoeligheid van het centraal zenuwstelsel. Er wordt gesproken van chronische pijn wanneer de pijn langer dan een maand aanhoudt na weefselherstel of pijn die blijft door onomkeerbare weefselbeschadiging. [CITATION Pro \l 1043 ]
Pijn ontstaat door pijnprikkels die door de vrije uiteinden van de sensibele zenuwen, nociceptoren, worden geleid, zie figuur 1. Nociceptoren zijn gevoelig voor prikkels van mechanische, thermische en chemische aard (polymodaal) en zijn in alle perifere organen aanwezig. De receptoren op de sensor,
bestaande uit ionenkanalen, detecteren de prikkel en zetten deze middels transductie om in een elektrisch signaal.
De drempelwaarde voor een prikkel is hoog, waardoor alleen potentieel schadelijke prikkels worden waargenomen. Bij weefselbeschadiging komen stoffen vrij die de prikkeldrempel van de nociceptoren verlagen, dit wordt sensitisatie genoemd. Voorbeelden van deze stoffen zijn interleukinen, histamine, serotonine, prostaglandine (zie 1.2.2) en bradykinine. Wanneer het centraal zenuwstelsel pijn waarneemt, worden de receptoren en synapsen gevoeliger voor nociceptieve prikkels. Door dit mechanisme kan chronische pijn ontstaan.
Naast de nociceptoren zijn er ook andere sensoren aanwezig in de vorm van eindorgaantjes van de sensorische zenuw (unimodaal). Voorbeelden hiervan zijn de lichaampjes van Krause, van Meisner en van Pacini. Deze sensoren tonen in tegenstelling tot nociceptoren adaptatie; na een langdurige of blijvende prikkeling verdwijnt de reactie op de prikkel. [CITATION Boo \l 1043 ]
De nociceptieve pijnprikkels worden doorgegeven door een netwerk van axonen en synapsen naar de achterhoorn van het ruggenmerg. Vervolgens worden de prikkels
overgedragen aan de ascenderende banen in de tractus
spinothalamicus. Vanuit daar bereiken de prikkels via het verlengde merg, de thalamus en de pericentriculaire grijze massa uiteindelijk de cortex. Vanuit de hersenen lopen twee verschillende zenuwen
Figuur 1: Nociceptoren, v.l.n.r. merkelse schijf, vrije zenuwuiteinde en haarreceptoren[ CITATION Boo \l 1043 ]
thermische prikkels en de niet-gemyeliniseerde C-vezels voor trage geleiding van alle soorten prikkels. Prikkeling van de A-δ-vezels geeft een scherpe pijn en prikkeling van een C-vezel geeft een minder intense, zeurderige of brandende pijn.[ CITATION Zor15 \l 1043 ]
Op de gehele weg die een prikkel aflegt vindt bewerking van de nociceptieve informatie plaats. Deze bewerking wordt ook wel pijnmodulatie genoemd en bepaalt hoe de pijn ervaren wordt. Neurotransmitters en andere chemische stoffen zijn hiervoor verantwoordelijk, zij hebben een exciterende of inhiberende werking op de pijnprikkel. Voorbeelden zijn acetylcholine, noradrenaline, dopamine, serotonine en de pijn remmende opioïde peptiden enkefaline en endorfine.[ CITATION LBo13 \l 1043 ]
2.2 Analgetica
Analgetica (pijnstillers) zijn medicijnen voor het onderdrukken of wegnemen van pijn. Analgetica kunnen in twee verschillende groepen worden ingedeeld: opioïden en niet-opioïden analgetica.
2.2.1 Opioïden
De opioïden beïnvloeden de receptoren in het centraal zenuwstelsel waardoor de pijnperceptie verandert. De belangrijkste receptoren zijn de kappa-, mu-, sigma- en delta-receptoren. De werking van opioïde analgetica is nog niet volledig bekend, waarschijnlijk treedt pijnstilling op door de activatie van de kappa- en mu-receptoren. De activatie van de sigma-receptor veroorzaakt de hallucinaties en dysforie die vaak als bijwerkingen bij behandeling met opioïden optreden.
Naast deze bijwerkingen hebben opioïde analgetica vaak nog meer ongewenste effecten, zoals: slaperigheid, stemmingswisselingen, misselijkheid, verlaagde perifere weerstand, obstipatie en ademhalingsdepressie. Door de vele bijwerkingen worden opioïde analgetica alleen ingezet wanneer behandeling met niet-opioïde analgetica onvoldoende werkzaam is. De meest gebruikte opioïde pijnstiller is morfine. [ CITATION Max15 \l 1043 ]
2.2.2 Niet-opioïden
De niet-opioïden analgetica zijn in tegenstelling tot de opioïden wel in staat om pijn te verlichten of weg te nemen zonder daarbij het centraal zenuwstelsel ernstig te beïnvloeden. Zij zijn onder te verdelen in ‘Non Steroidal Anti- Inflammatory Drugs’ (NSAID’s) en paracetamol. De analgetische werking is vergeleken met opioïden minder krachtig, zij worden daarom alleen maar ingezet bij lichte tot matige pijn. De NSAID’s zijn prostaglandinesynthetaseremmers. Prostaglandinen komen vrij bij weefselbeschadiging en veroorzaken:
Gevoeligere sensibele zenuwen
Koorts door het activeren van de hersenstam
Bot- en/of kraakbeenbeschadiging door het stimuleren van processen die dit veroorzaken
Lokale vasodilatatie en verhoogde doorlaatbaarheid van de vaten waardoor eiwitten gemakkelijk kunnen passeren met oedeemvorming als gevolg[ CITATION Max15 \l 1043 ]
De NSAID’s remmen de prostaglandinesynthese via het prostaglandine-vormende enzym cyclo-oxygenase (COX). Er bestaan twee vormen van dit enzym, COX-1 in normale cellen en COX-2 in ontstekingscellen. De remming van de COX-2 enzymen zorgt voor de anti-inflammatoire werking van NSAID’s. Echter heeft de remming van COX-1 een schadelijk effect op de maag.[ CITATION JNC96 \l 1043 ]
NSAID’s worden vooral toegepast bij acute pijn om de werking van prostaglandinen tegen te gaan. Als plaatselijke medicatie werken ze analgetisch, antiflogistisch (ontstekingsremmend) en antipyretisch (koortswerend). De bekendste NSAID’s zijn ibuprofen en diclofenac.
2.3 Paracetamol
Paracetamol, N-acetyl-p-aminofenol (figuur 2), ook wel acetaminophen of APAP genoemd, is een wereldwijd veelgebruikt medicijn met een pijnstillende en koortswerende werking. Het is een goedkoop analgeticum en overal zonder recept te verkrijgen. In de jaren ’80 verloor aspirine zijn
populariteit doordat het in verband gebracht werd met het syndroom van Reye. Paracetamol werd toen de meest gebruikte pijnstiller voor alle leeftijdsgroepen.[ CITATION EDB99 \l
1043 ]
2.3.1 Chemie en distributie
Paracetamol heeft een lage moleculaire massa van 151,16 amu. Het is een zwak zuur met een pKa van 9.7 en is daarom hoofdzakelijk geïoniseerd bij fysiologische pH-waarden. Paracetamol kan passief diffunderen door celwanden en de mate van eiwitbinding is verwaarloosbaar. Het distribueert snel door het lichaam en heeft een volume van distributie van 0,9 L/kg, er is geen sprake van binding aan weefsels. De maximale plasma concentratie na een therapeutische dosis van 1 g is na ongeveer 30 minuten 20 mg/L tot 30 mg/L bij intraveneuze toediening of snelle orale absorptie. Concentraties tot 30 mg/L vallen in het therapeutische gebied. De eliminatiehalfwaardetijd van een therapeutische dosis is ongeveer twee uur.
2.3.2 Toepassing
Paracetamol wordt toegepast bij milde acute en chronische pijn, bijvoorbeeld acute hoofdpijn of chronische pijn in de onderrug. Bij zwaardere pijn wordt paracetamol vaak gecombineerd met een NSAID. Deze combinatie zorgt voor een sterker analgetische werking en wordt vaak toegepast bij acute pijn na kaakchirurgie en orthopedische en gynaecologische operaties. Ook voor chronische pijn door reumatoïde artritis is bewezen dat pijnbestrijding met paracetamol en een NSAID effectiever is dan een NSAID alleen. Voor pijnbestrijding bij kanker wordt paracetamol vaak ingezet in combinatie met een opioïd analgeticum. In eerste instantie wordt er gekozen voor paracetamol in combinatie met een zwakke opioïd, zoals codeïne, hydrocodon of oxycodon. Wanneer dit niet voldoende effectief blijkt wordt er overgegaan op een combinatie met sterkere opioïden, zoals morfine of fentanyl. Door de opioïde analgetica te combineren met
intraveneuze paracetamol is er doorgaans minder opioïd nodig.
Paracetamol in combinatie met cafeïne zorgt mogelijk voor een lichte verhoging van het analgetische effect. Dit komt doordat de cafeïne de absorptie snelheid verhoogd en zo het werkingsmechanisme versnelt. Deze combinatie is vrij te verkrijgen en naast de gewone paracetamol overal te koop.[CITATION Gar13 \l 1043 ] Neonaten op de afdeling IC-neonatologie krijgen gemiddeld 11 pijnlijke behandelingen per dag. Het is daarom van belang deze pijn te bestrijden, paracetamol is hier het gekozen analgeticum. Echter is er over de juiste dosering nog weinig bekend en wordt het nog niet voldoende toegepast. [ CITATION Dan \l 1043 ] 2.3.3 Werkingsmechanisme
Het werkingsmechanisme van paracetamol bestaat uit meerdere factoren. Ten eerste beïnvloed paracetamol het centrale zenuwstelsel door de prostaglandinen synthese te remmen. De prostaglandinen(PGs) synthese start met het hydrolyseren van fosfolipiden tot arachidonzuur door cytosolische fosfolipase A2. De enzymen COX-1 en COX-2 oxideren arichidonzuur in het hydroperoxide prostaglandine G2 (PGG2), wat vervolgens weer wordt gemetaboliseerd door peroxidase tot prostaglandine H2 (PGH2). Deze twee precursors worden vervolgens omgezet door specifieke enzymen tot PGs. Paracetamol inhibeert deze synthese door te functioneren als substraat van de peroxidase synthese van COX-1 en COX-2. Paracetamol wordt door COX-1 en COX-2 geoxideerd tot het vrije radicaal van paracetamol (P*). Dit proces Figuur 2: Structuurformule N-acetyl-aminofenol
concurreert met de oxidatie van een tyrosine residu op het enzym tot een tyrosine fenoxy groep; welke essentieel is voor de oxiderende functie van COX-1 en COX-2. Hierdoor remt paracetamol de oxiderende functie van COX-1 en COX-2 en daarmee de productie van PGG2 en dus PGH2 en PGs. Door het remmen van de PG synthese worden de nociceptoren niet geprikkeld en wordt er geen pijnprikkel doorgegeven aan de hersenen (of in mindere mate).
Ten tweede werkt paracetamol ook perifeer doordat het metaboliet, N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI) van paracetamol het eiwit TRPA1 (Transient Receptor Potential Ankyrin 1) stimuleert. TRPA1 is een eiwit dat zich op de oppervlakte van zenuwcellen bevindt. Wanneer het eiwit wordt geactiveerd verminderd het de pijnperceptie door te interfereren in de overdracht van informatie tussen nociceptoren en de hersenen. Dit gebeurd doordat het eiwit de calcium en natrium stromingen in de nociceptoren verminderd, waardoor er geen prikkelgeleiding mogelijk is. [ CITATION Gar13 \l 1043 ][ CITATION Dan \l 1043 ][CITATION DAA11 \l 1043 ]
2.3.4 Metabolisme van paracetamol
Paracetamol (APAP) wordt vooral in de lever gemetaboliseerd via drie verschillende routes: glucuronidering (±60%), sulfonatie (±35%) en oxidatie(± 4%). Slechts minder dan 5% van een paracetamoldosis wordt onveranderd geëxcreteerd.
De glucuronidatie route wordt gekatalyseerd door uridine 5'-difosfo-glucuronosyl transferases (UDP-glucuronosyl transferases, UGT). UGTs maken paracetamol meer wateroplosbaar door het te laten binden aan een glucuronosylgroep van UDP-glucuronzuur, dit geeft het paracetamol-glucuronide molecuul (p-acetamidophenyl-β-D-glucuronide).
Sulfonatie van paracetamol vindt plaats door cytosolische enzymen, genaamd sulfotransferases. Deze enzymen binden een sulfonzuurgroep van een substraat aan paracetamol. Door deze binding ontstaat het meer polaire en makkelijker te elimineren molecuul paracetamol-sulfaat (APAP-sulfaat). Naast glucuronidering en sulfonatie wordt bij therapeutische doseringen een klein deel van paracetamol geoxideerd door het cytochroom P450 enzymsysteem, vooral door het CYP2E1 enzym, tot het reactieve metaboliet N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI). NAPQI wordt geïnactiveerd door bindingvorming met de thiolgroep van tripeptide glutathion, welke in hoge concentratie aanwezig is in de levercellen. Deze binding ontstaat via een spontaan proces en door een enzymatische reactie gekatalyseerd door glutathion-S-transferases. Het ontstane metaboliet paracetamol-glutathion (APAP-glutathion) wordt in de nieren geconjugeerd tot cysteïne (APAP-cysteïne) wat weer wordt gemetaboliseerd tot paracetamol-mercapto (APAP-N-acetyl-cysteïne). Glutathion is een tripeptide bestaande uit de aminozuren cysteïne, glutaminezuur en glycine. Paracetamol-cysteïne wordt dus gemakkelijk gevormd door de sequentiële splitsing van glutaminezuur en glycine van het glutathion. Vervolgens wordt een gedeelte van paracetamol-cysteïne N-geacetyleerd tot paracetamol-mercapto. In figuur 3 is het afbraakproces schematisch weergegeven.
Figuur 3: Schematische weergave van de metabolisatie van paracetamol
Paracetamol-glucuronide, paracetamol-sulfaat, paracetamol-cysteïne, paracetamol-mercapto en een klein percentage onveranderd paracetamol worden vervolgens geëxcreteerd via de urine.[ CITATION Maz15 \l 1043 ][ CITATION For02 \l 1043 ]
2.3.5 Metabolisme van paracetamol in neonaten
In neonaten wordt paracetamol vooral gemetaboliseerd tot paracetamol-sulfaat en in mindere mate tot paracetamol-glucuronide, dit in tegenstelling tot het metabolisme van oudere kinderen en volwassenen. Dit komt doordat het glucuronide conjugaat systeem bij neonaten nog niet volledig ontwikkeld is. Een nog kleiner deel wordt via het cytochroom P450 enzymsysteem geoxideerd tot het NAPQI metaboliet, wat vervolgens ook weer wordt gemetaboliseerd tot paracetamol-cysteïne en paracetamol-mercapto. Echter is de activiteit van het CYP2E1 enzym nog niet gekwantificeerd in neonaten. [ CITATION Dan \l 1043 ]
2.3.6 Bijwerkingen en toxiciteit
Paracetamol heeft bij therapeutische dosering weinig bijwerkingen. De bijwerkingen die zelden voorkomen zijn:
Medicijnafhankelijke hoofdpijn: dit kan voorkomen wanneer paracetamol langer dan 15 dagen achter elkaar geslikt wordt al dan niet voor hoofdpijn. Wanneer het medicijn niet of later geslikt wordt dan gewend, kan er hoofdpijn ontstaan.
Overgevoeligheid: wanneer er sprake is van overgevoeligheid voor paracetamol ontstaat er mogelijk huiduitslag, galbulten of benauwdheid
G6PD-deficiëntie: in sommige gevallen hebben mensen met een negroïde afkomst of uit het Middellandse Zee gebied een aangeboren enzymgebrek, het enzym G6PD ontbreekt. Paracetamol
kan dan een ernstige bloedafwijking veroorzaken. De symptomen zijn vermoeidheid en duizeligheid. [ CITATION Apo15 \l 1043 ]
Paracetamol is toxisch bij doseringen groter dan 70 mg/kg. Doseringen hoger dan 140 mg/kg kunnen leiden tot ernstige leverschade en in sommige gevallen nierbeschadiging. Fatale leverschade door paracetamol werd gerapporteerd in 1966. Hierna is veel onderzoek verricht naar de hepatotoxiciteit van de populaire pijnstiller. Uit onderzoek is gebleken dat niet paracetamol, maar het reactieve metaboliet N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI) de lever beschadigt. Bij therapeutische doseringen wordt ongeveer 4 tot 10% van paracetamol omgezet in dit toxische metaboliet, waarna het vervolgens ontgift door de reactie met tripeptide glutathion. Echter bij overdoseringen raken de afbraakroutes naar sulfaat- en glucuronideconjugaten verzadigd en wordt er meer NAPQI gevormd. Het ontgiftende glutathion wordt verbruikt en het reactieve metaboliet gaat een covalente binding aan met thiolgroepen van eiwitten in de levercel. De binding van NAPQI heeft vooral invloed op de mitochondrische eiwitten en ion kanalen, wat zorgt voor een verlies in energieproductie, het uit balansraken van de ion verhouding en uiteindelijk levercelnecrose. [ CITATION Str96 \l 1043 ]
In de neonaten is er sneller kans op overdosering door het onderontwikkelde glucuronidering proces. Hierdoor kunnen de sulfonatie en glucuronidering route sneller verzadigd raken, met als gevolg een stijging in het metaboliseren via de oxidatie route waarbij het toxische NAPQI metaboliet ontstaat. Hierdoor kan er sneller sprake zijn van verzadiging van de glutathiongroepen en binding van NAPQI aan de eiwitten in de levercellen.[ CITATION Dan \l 1043 ]
Wanneer er sprake is van overdosering is onmiddellijke ziekenhuisopname vereist. Binnen 1 a 2 uur kan de maag worden gespoeld, gevolgd door toediening van geactiveerde kool en natriumsulfaat. Indien maagspoeling niet meer mogelijk is kan er N-acetylcysteïne toegediend worden als antidotum. Wanneer de paracetamolspiegel nog aantoonbaar is kan dit de prognose verbeteren tot 36 uur na de paracetamol inname. N-acetylcysteïne gaat de schadelijke werking van het NAPQI metaboliet tegen door de glutathionvorming te versnellen door op te treden als glutathionprecursor. Ook kan het antidotum het toxische metaboliet inactiveren doordat een binding wordt gevormd tussen de thiolgroep van N-acetylcysteïne en NAPQI.[ CITATION Str96 \l 1043 ][ CITATION Ned13 \l 1043 ][ CITATION Zorg15 \l 1043 ]
2.4 Analysetechnieken
2.4.1 HPLC/UPLC
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is een veelgebruikte techniek om stoffen te identificeren en te kwantificeren, door gebruik te maken van verschil in affiniteit. Hierbij wordt er gebruik gemaakt van een hoge druk om een eluens (de mobiele fase) door een gecoate kolom (de stationaire fase) te leiden. Stoffen met een hoge affiniteit met de kolom zullen laat gedetecteerd worden, stoffen met een lage affiniteit met de kolom zullen vroeg gedetecteerd worden. Dit wordt zichtbaar op het chromatogram. Er is sprake van normal phase (NP) en reversed phase (RP) chromatografie. Voor de analyse van paracetamol is gekozen voor RP. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een apolaire stationaire fase en een polair eluens. Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) verschilt van HPLC in pakkingsmateriaal van de kolom. Het pakkingsmateriaal is bij UPLC is kleiner dan bij HPLC, kleinere pakkingsdeeltjes hebben relatief meer oppervlak ten opzichte van de inhoud. Meer oppervlak betekend meer scheidend vermogen. Door de kleine pakkingsdeeltjes ontstaat er een hogere tegendruk in vergelijking met HPLC-kolommen. UPLC heeft de volgende voordelen ten opzichte van HPLC:
Betere resolutie Smallere pieken
Economisch voordeel: kortere retentietijden en door de kleinere kolommen minder verbruik van eluens[ CITATION Chr05 \l 1043 ]
2.4.2 Acquity UPLC HSS T3 kolom
De Acquity HSS T3 kolom is een reversed phase kolom voor de UPLC. De afkorting HSS staat voor High Strength Silica, aan de silica zit T3 gebonden wat staat voor Trifunctional C18 alkyl fase. Deze stationaire fase geeft goede retentie voor polaire componenten. Ook is de kolom dicht gepakt, dit heeft als voordeel een grotere capaciteit. Deze kolom kan tegen 100% waterig eluens. [ CITATION Wat07 \l 1043 ]
2.4.3 Massaspectrometrie
Een veelgebruikte en gevoelige analytische detectietechniek is massapectrometrie (MS). Het principe van massaspectrometrie is scheiding van gasvormige ionen van een monster volgens hun massa-ladingsverhouding (mass to charge ratio, m/z waarde). Na de scheiding kunnen de ionen gedetecteerd en gekwantificeerd worden. Het resultaat is een massaspectrum waarin de intensiteit van de geproduceerde ionen wordt uitgezet tegen de m/z waarden. Het massaspectrum geeft informatie over de moleculaire massa van het analyt en structurele informatie uit het fragmentatiepatroon. Een massaspectrometer bestaat op z’n minst uit de volgende onderdelen:
Ionisatiesysteem (interface): zorgt voor de overgang van atmosferische druk naar hoog vacuüm Ionenbron: productie van de gasvormige ionen van het monster
Massa analysator: analyseert en scheidt de ionen volgens de m/z waarde Detectiesysteem: zet de ionen om in een meetbaar signaal
Dataverwerkingssysteem
Er kan onderscheid gemaakt worden tussen lage- (LRMS) en hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS). De lage resolutie massaspectrometers zijn ion trap-, single quadrupool- of tandem quadrupool systemen. Bij ion trap systemen worden de elektronen gevangen in een systeem met een rf spanning bestaande uit drie elektroden met een hyperbool oppervlak, een centrale ring elektrode en twee aangrenzende end-cap elektroden. In een single quadrupool MS wordt de ionaire vorm van elk analyt, het geprotoneerde moleculaire ion, gedetecteerd. Bij tandem quadrupool MS worden ionen twee keer geanalyseerd, na de eerste massaselectie wordt het geprotoneerde moleculaire ion (parent ion) gefragmenteerd tot product ionen (daughter ions) welke ook gemeten worden.
Voorbeelden van hoge resolutie massaspectrometers zijn (quadrupool) time-of-flight ((Q-)TOF), Fourier-transform ion cyclotron resonance (FTICR) en Orbitrap. Het verschil tussen LRMS en HRMS is dat bij HRMS de massa zo precies kan worden gemeten dat de kleinste verschillen in massa tussen twee componenten gedetecteerd worden, waar de LRMS deze als identiek zal beschouwen. HRMS kent dus een groot onderscheidend vermogen, massa-accuraatheid en gevoeligheid. Deze systemen worden veel gebruikt in het onderzoeksveld waar nog onbekende componenten geanalyseerd moeten worden. Echter kent HRMS ook nadelen, de systemen zijn 2 à 3 keer duurder dan LRMS en moeilijker te bedienen en onderhouden. [ CITATION DHR97 \l 1043 ] [ CITATION The16 \l 1043 ]
Omdat een MS detector functioneert onder hoog vacuüm moeten de analytmoleculen in geïoniseerde gasvormige toestand komen. Dit gebeurt in de ionisatiebron, de meest gebruikte ionisatiebronnen werken bij atmosferische druk (atmospheric pressure ionization, API). Er wordt veelal gebruik gemaakt van elektrospray ionisatie (ESI) en atmosferische druk chemische ionisatie (APCI). In dit onderzoek wordt gebruik gemaakt van ESI, deze vorm van ionisatie zal daarom verder worden besproken. ESI is een zachte
ionisatietechniek waarbij nauwelijks fragmentatie ontstaat. Het heeft van alle technieken de hoogste ionisatie-efficiëntie en daarmee de grootste gevoeligheid.
Werking ESI
Het eluens afkomstig uit het LC-systeem gaat naar de ionenbron onder atmosferische druk. De ionisatie van de analyten vindt plaats in vijf stappen, namelijk:
1. Ionisatie in oplossing
De beste gevoeligheid ontstaat wanneer er al in oplossing in het eluens ionen gevormd worden. Dit kan worden verkregen door voor een optimale pH te kiezen van het eluens zodat de analyten al ioniseren. Het voordeel van ionaire analyt moleculen is dat ze makkelijker verdampen uit de geladen druppels dan neutrale moleculen.
2. Verneveling
Wanneer de analytoplossing in de interface terecht komt ontstaat er verneveling van de oplossing. Door een sterk elektrisch veld op het uiteinde van het capillair en spanning van een verstuivergas ontstaan geladen solventdruppeltjes. De positief of negatief geladen solventdruppels trekken ionen van tegengestelde polariteit aan. Het resultaat van deze aantrekking is een fijne nevel van geladen druppeltjes.
3. Coulomb fission
Voor de gevormde ionen de massa analysator ingaan worden de omringende solventmoleculen verwijderd. Dit gebeurd door een tegenstroom van verwarmd stikstofgas wat de solventmoleculen verdampt. Ook zorgt het stikstofgas voor een grotere lading/volume-ratio binnenin de druppeltjes. De druppeltjes worden kleiner tot de elektrostatische coulombkracht groot genoeg is om de oppervlaktespanning te doorbreken. Dit wordt het Rayleigh limiet genoemd, de maximum lading dat een druppel kan hebben bij constant volume. Wanneer deze limiet wordt overschreden explodeert de druppel in kleinere druppeltjes. Dit proces herhaalt zich
tot steeds kleinere druppeltjes gevormd worden en wordt Coulomb fission genoemd. 4. Vormen van ionen
Er zijn twee theorieën over het ontstaan van de uiteindelijk ionen in gasfase, het ion evaporatie model (IEM) en het geladen residu model (CRM). Volgens het IEM komen de ionen direct vrij uit de druppeltjes in gasfase. De theorie hierachter is dat er steeds kleinere druppeltjes ontstaan waardoor er een moment komt dat de veldsterkte aan het oppervlak veroorzaakt door de ionen de oppervlaktespanning overschrijdt. Het gevolg is desorptie van de ionen waardoor er analytionen in gasfase ontstaan. Volgens het CRM model ondergaan de druppels cycli van verdamping en kernsplijting tot de druppels gemiddeld één analytion bevatten. De gasfase ionen ontstaan wanneer de overgebleven solvent moleculen verdampen, zo blijft alleen het analyt over met de lading die de druppel had.
5. Gasfasereacties
Bij het transport door de ionisatiekamer vinden proton-transfer-reacties en ladinguitwisselingsreacties plaats als gevolg van botsingen van de analytmoleculen in de API (Atmospheric Pressure Ionization) bron.
Figuur 1: Schematische voorstelling van de verneveling en coulomb fission van analytoplossing [ CITATION Pie10 \l 1043 ]
Vervolgens komen de analytionen in een vacuüm ruimte, waarna ze via de skimmer (een kegel met een opening op de punt die het centrale deel van de spray van ionen opvangt) in het hoog-vacuüm gedeelte van de massa analysator komen.
De quadrupool massa analysator
De quadrupool bestaat uit vier parallel lopende staven. Deze staven zijn elektroden met een elektrisch veld rondom. De staven die direct tegenover elkaar liggen hebben elektrodeparen met een tegengestelde maar gelijke potentiaal waardoor ze in verbinding staan. Deze potentialen bestaan uit een radio-frequente wisselspanning (RF) en een gelijkspanning (DC), de verhouding RF/DC blijft gelijk. De ionenbundel beweegt tussen de staven door naar de detector. De weg die de ionenbundel aflegt wordt door de spanning van de staven beïnvloedt. Wanneer DC positief geladen is komen alle ionen door de staven, tenzij de m/z ratio te klein is. Bij een negatieve DC spanning komen alle ionen met een kleine m/z waarde door de staven en vallen de ionen met een grote m/z ratio af. De ionen die niet door de quadrupool komen leggen een onstabiel traject af en botsen met één van de staven. Op deze manier kunnen alleen ionenbundels met een bepaalde m/z ratio de detector bereiken.
Omdat een scan van een quadrupool ongeveer 0,1 tot 0,5 seconden duurt kan een massaspectrum met een relatief hoge snelheid geconstrueerd worden. Andere voordelen van de quadrupool zijn dat er kan worden gewerkt onder hoge druk en het een relatief eenvoudig instrument is wat zorgt voor een lage kostprijs.
Tandem Massaspectrometrie (MS/MS)
De meest gebruikte tandem massaspectrometer is een triple quadrupool, QqQ. Deze massaspectrometer bestaat uit twee massa analysatoren, Q1 en Q3, en een botsingscel, q2. Na de analyse van de monsterionen in Q1 kunnen specifieke ionen geselecteerd worden om door te gaan naar de botsingscel q2. In deze cel wordt het monster ion gefragmenteerd tot dochterionen, de fragmentatie vindt plaats door botsingen van de ionen met gasmoleculen, meestal argongas. Vervolgens worden de dochterionen geanalyseerd en geselecteerd in de massa analysator Q3. Het analyseren van de fragmentionen kan structurele informatie over het analyt geven. Door de twee analysatoren en botsingscel heeft een tandem massaspectrometer een grotere selectiviteit en gevoeligheid ten opzichte van een massaspectrometer met slechts een enkele quadrupool. Vaak wordt deze techniek gebruikt bij kwantitatieve analyses van componenten in complexe matrix, zoals volbloed, plasma of urine. In figuur 2 is een schematische voorstelling te zien van een tandem MS gekoppeld aan de HPLC.
De detector
Na de massa analysator(en) komen de geselecteerde ionen in de detector. De detector is meestal een
electron multiplier. Een electron multiplier bestaat uit meerdere dynode, dit zijn elektroden in een vacuüm
buis die tussen de anode en kathode van de electron multiplier liggen. Op elke dynode wordt een steeds groter potentiaal aangebracht. Wanneer een ion de kathode van de detector raakt wordt er een elektrisch signaal doorgegeven en komen er secundaire elektronen vrij. Door de elektrische spanning van de dynode worden deze elektronen versneld naar de volgende dynode waar ze opnieuw botsen. Door deze botsing komen er weer nieuwe elektronen vrij die weer zullen botsen met de volgende dynode. Door dit proces wordt het signaal van het ene ion dat de detector binnen kwam versterkt tot een bruikbaar signaal voor het dataverwerkingssysteem.
Instellingen van de tandem MS
De MS/MS kent verschillende analyse instellingen. De Q1 en Q3 quadrupolen kunnen beide apart ingesteld worden op Full-scan of Selected Ion Monitoring (SIM) modus. Full-scan modus wil zeggen dat elke massa wordt geanalyseerd en geselecteerd om door te gaan naar de botsingscel, in SIM modus kunnen de componenten binnen een klein massagebied of met een specifieke massa worden geanalyseerd. Er zijn vier verschillende analyse mogelijkheden, namelijk: Q1 scan/Q3 SIM, genaamd daughter mode of precursor
scanning; Q1 SIM/Q3 scan, genaamd parent mode of product scan; Q1 scan/Q3 scan, genaamd neutral loss scanning mode; en Q1 SIM/Q3 SIM, genaamd selected reaction monitoring (SRM) mode.
In daughter mode / precursor scanning mode kan worden bepaald welke primaire fragmenten met elkaar
gelinkt zijn. De eerste quadrupool scant alle massa’s en alle ionen komen in de botsingscel, daar worden zij gefragmenteerd tot secundaire fragmenten. De derde quardrupool staat ingesteld op een specifieke mass-to-charge (m/z) waarde, alleen de primaire fragmenten die specifiek tot deze m/z waarde fragmenteren worden gedetecteerd. Door deze specifieke daughter ions kan worden achterhaald welke fragmenten worden gevormd wanneer een groot primair fragment wordt gefragmenteerd. In parent mode / product scan mode analyseert de eerste quadrupool alleen een specifieke massa. Hierdoor
gaat enkel één primair fragment de collisie cel binnen om tot secundaire ionen te worden gefragmenteerd. De derde quadrupool detecteert alle secundaire fragmenten gevormd door het single primary parent ion. Deze modus geeft informatie over de structuur door alle afbraakfragmenten te tonen en wordt vaak gebruikt voor structurele identificatie.
Neutral loss scanning mode wordt gebruikt om verschillende componenten te screenen op
overeenkomstige neutrale groepen. In deze modus scant Q1 een groot massagebied en Q3 scant hetzelfde massagebied min de massa van een neutraal fragment. Het spectrum geeft nu alle parent ionen weer die het geselecteerde neutrale fragment hebben verloren.
In selected reaction monitoring mode (SRM) selecteert Q1 een specifieke parent massa. Na de fragmentatie in q2, selecteert Q3 een specifieke fragment massa. Het massa chromatogram geeft nu de intensiteit van de product ionen weer. Deze modus wordt gebruikt voor kwantitatieve analyses. [CITATION EHo07 \l 1043 ] [ CITATION Mar \l 1043 ] [ CITATION Pha15 \l 1043 ][ CITATION Pie10 \l 1043 ]
3. Materiaal en Methoden
3.1 Chemicalien en reagentia
Acetaminophen, acetaminophen-sulfaat, acetaminophen-mercapto, acetamidophenyl-glucuronide, cysteinylacetaminophen en acetaminophen-D3-sulfaat oplossing zijn verkregen van Santa Cruz Biotechnology (Huissen, Nederland). Acetaminophen-glutathion is verkregen van Toronto Research Chemicals (Eching, Duitsland) en acetaminophen-D4 oplossing is verkregen van Sigma Aldrich Cerriliant (Zwijndrecht, Nederland). Methanol en mierenzuur zijn verkregen van Biosolve BV (Valkenswaard, Nederland). Alle reagentia waren LC-kwaliteit. Water werd gezuiverd met behulp van een MilliPore Advantage A10 systeem. Externe kwaliteits controles voor paracetamol zijn verkregen van Stichting Kwaliteitsbewaking Klinische Geneesmiddelanalyse en Toxicologie (KKGT, Den Haag, Nederland) en Bioconnect Life Sciences (Huissen, Nederland)
3.2 Stockstandaarden, calibratie standaarden, QC’s en interne standaard
Stockstandaarden van APAP, APAP-sulf, APAP-gluc en APAP-cys zijn gemaakt met een concentratie van 500 mg/L in methanol. Stockstandaarden van APAP-merc en APAP-glut zijn gemaakt met een concentratie van 100 mg/L in methanol. Voor elk component werden er twee aparte stockstandaarden gemaakt met dezelfde concentratie. De ene werd gebruikt voor het maken van calibratiestandaarden en de andere voor het maken van kwaliteitscontroles (quality control samples, QC’s). De stockstandaarden werden bewaard bij -20°C.
De werkstandaard, calibratie standaard 8 [50 mg/L], is gemaakt door 500 µl van APAP, APAP-sulf, APAP-gluc en APAP-cys en 2500 µl van APAP-merc en APAP-glut stockstandaard in te dampen in een reageerbuisje onder stikstofstroom bij 40 °C tot alle methanol verdampt was. Vervolgens zijn de componenten her opgelost in 5 mL humaan plasma en gemixt op een vortex voor 30 seconden. Calibratie standaard 1 [0,05 mg/L] tot en met 7 [25 mg/L] en het LLOQ monster [0,01 mg/L] zijn gemaakt door calibratie standaard 8 te
verdunnen met humaan plasma. De precieze concentratie van de calibratie standaarden per component staan weergegeven in bijlage 2.
De kwaliteitscontroles (QC’s) zijn op dezelfde manier bereid als de standaarden met de andere stockoplossingen. De werkoplossing werd verdund met humaan plasma tot drie levels: QC Laag [0.20 mg/L], QC Midden [1.5 mg/L] en QC Hoog [15 mg/L]. De precieze concentratie van de QC’s per component staan weergegeven in bijlage 2. De calibratie standaarden en QC’s werden per 10 µl uitgevuld in 1,5 mL epjes (Eppendorf) en bewaard bij -80°C tot analyse.
De gebruikte interne standaarden waren APAP-D4 voor APAP en APAP-D3-sulfaat voor de andere componenten. Een werkoplossing van de twee interne standaarden werd gemaakt in methanol met een concentratie van 100 µg/L voor APAP-D4 en 500 µg/L voor APAP-D3-sulfaat.
3.3 Matrix
Humaan blanco plasma (10 µL) werd verkregen van het bloedtransfusielaboratorium van het Erasmus MC Rotterdam. Omdat paracetamol een vaak gebruikt medicijn is, was het ook nodig om paracetamol-vrij bloed van vrijwilligers af te nemen. Het bloed werd gecentrifugeerd om de plasma te scheiden van de rode bloedcellen. Vervolgens werd het plasma samengevoegd en overgebracht in kleinere buizen. De buizen werden bewaard bij -20 °C tot de analyse.
3.4 Monstervoorbewerking
Alle calibratie standaarden, QC’s, blanco’s en patiëntmonsters, elk 10 µL, werden minstens een half uur voor opwerking ontdooid. Vervolgens werd 40 µL interne standaard oplossing toegevoegd om de eiwitten te precipiteren. De monsters werden 15 seconden gemixt op een Vortex en daarna 5 minuten gecentrifugeerd op 14680 rpm. Twee lagen werden van elkaar gescheiden en 30 µL supernatant werd van elk monster overgebracht in lichtwerende autosampler insert vials (VWR). Aan de vials werd 140 µL 0,1% waterig mierenzuur toegevoegd. Tot slot werden de monsters 20 seconden gemixt op een Vortex en waren ze klaar voor analyse. De conditie in de vial kwam overeen met de startconditie van de mobiele fase van de UPLC om chromatografische verschillen voor vroeg eluerende componenten tegen te gaan. Het compleet blanco monster zonder interne standaard werd gemaakt door 40 µL methanol toe te voegen in plaats van interne standaard oplossing.
Voor APAP en APAP-D4 werd 4 µL geïnjecteerd in de UPLC-MS/MS. Voor alle andere componenten werd 10 µL geïnjecteerd vanwege de lagere gevoeligheid voor deze componenten.
3.5 Apparatuur
De gebruikte apparatuur was een Dionex Ultimate UPLC system, bestaande uit een Ultimate 3000 RS UPLC pomp, een Ultimate 3000 RS autosampler en een Ultimate 3000 RS kolom compartiment. De UPLC was gekoppeld aan een triple quadrupole Thermo TSQ Vantage MS met ESI probe (Thermo Scientific). De gebruikte software programma’s om het systeem te bedienen en de geproduceerde data te analyseren waren Chromeleon (versie 6.8, Dionex, Thermo Scientific),TSQ Tune, Xcalibur (versie 2.1, Thermo Scientific) en LCquan (versie 2.6, Thermo Scientific).
3.6 UPLC instellingen
Chromatografische scheiding, gebaseerd op de affiniteit van de componenten met de non-polaire stationaire fase, werd behaald met een reversed phase Acquity UPLC HSS T3 kolom (1.8 µm, 2.1x100 mm; High Strength Silica met een gebonden trifunctional C18 alkyl fase). Gradiënt elutie werd uitgevoerd met een mobiele fase bestaande uit 1 mL van een 154 mg/L oplossing van ammoniumacetaat in mierenzuur
(99%) in 1 L Milli-Q ultrapure water (eluens A) en 1 mL van dezelfde oplossing in 1 L methanol (eluens B). Voorafgaand aan de analyse werd het systeem geëquilibreerd op de startcondities van 86% eluens A en 14% eluens B tot de druk stabiel was. Het gradiëntverloop was als volgt; van 0 tot 0.8 minuten werd eluens B verhoogd van 14% naar 28%; van 0.8 tot 1.0 minuut werd eluens B verhoogd naar 95%; van 1.0 tot 2,0 minuten werd eluens B stabiel gehouden op 95%; van 2.0 tot 2.2 minuten werd eluens B verlaagd naar 5%; van 2.2 tot 3.0 minuten werd eluens B stabiel gehouden op 5%; van 3.0 tot 5.0 minuten werd eluens B verhoogd naar 14%. De run eindigde bij 5.3 minuten met startcondities. De flow werd de gehele run stabiel gehouden op 0.400 mL/min, de kolomoven werd ingesteld op 40 °C en de autosampler temperatuur werd ingesteld op 15 °C. De UPLC instellingen staan ook weergegeven in bijlage 1.
3.7 MS/MS instellingen
Voor de detectie en kwantificatie van paracetamol en metabolieten werden de volgende MS/MS instellingen gebruikt: MS runtijd, 4.5 min; experiment type, selected reaction monitoring (SRM); ionisatie, ESI+; spray voltage, 4000 V; vaporizer temperature, 375°C; sheath gas pressure, stikstof, 50 psi; auxiliary gas
pressure, stikstof, 20 psi; capillary temperature, 250 °C; collision gas pressure, 1.5 mTorr. Alle andere
instellingen waren specifiek per component. Deze instellingen zijn bepaald door infusie experimenten met individuele academische oplossingen van elk component van 1 mg/L in methanol. De oplossingen werden direct geïnfuseerd in de MS om de meest aanwezige SRM transities te bepalen. De gekozen transities en instellingen staan weergegeven in tabel 1. De MS/MS instellingen staan ook weergegeven in bijlage 1. Tabel 1: Specifieke instellingen per component, de roodgedrukte product ionen zijn gekozen voor de analyse
Analyte Parent ion (m/z) Product ion (m/z) ESI mode Collision Energy (v) S-Lens APAP 152.169 110.16 93.13 65.13 + 15 23 29 77 APAP-D4 (IS) 156.191 114.19 97.16 69.17 + 15 22 30 77 APAP-D3-Sulf 233.017 153.120 109.100 107.080 - 26 37 31 77 APAP-Sulf 232.046 152.06 110.10 65.10 + 13 22 39 77 APAP-Gluc 328.202 152.14 110.07 93.03 + 15 35 55 80 APAP-Cys 271.155 182.08 140.07 96.07 + 12 26 37 76 APAP-Merc 313.176 208.10 166.10 140.050 + 16 27 31 77 APAP-Glut 457.245 328.18 181.89 140.01 + 13 22 40 110
3.8 Validatie
Voor dat een methode gebruikt kan worden moet deze gevalideerd worden om aan te tonen dat de methode betrouwbaar resultaat geeft. De validatie werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de US Food
and Drug Administration (FDA) voor bio-analytische methoden. De volgende validatie parameters werden
onderzocht. 3.8.1 Lineariteit
De relatie tussen de concentratie van de calibratie standaarden en de respons (ratio van de piek oppervlakten van de analieten en de interne standaard) is getest met een calibratie curve. Deze curve moest idealiter lineair zijn over een concentratiegebied van 0,05 mg/L tot en met 50 mg/L. Om de calibratie curve te maken waren er 8 calibratie standaarden bereid en geanalyseerd in duplo. De kleinste kwadraten methode is toegepast om de data te analyseren. De oorsprong werd uitgesloten en wegingsfactor 1/x werd toegepast. De relatieve standaarddeviatie (RSD) moest kleiner dan 15% zijn en de correlatie coëfficiënt (r) en determinatie coëfficiënt (r2) moesten respectievelijk minstens 0.9950 en 0.9900 zijn.
3.8.2 LLOQ and ULOQ
De LLOQ (Lower Limit of Quantification) werd bepaald door de LLOQ standaard (variërend van 0.01 tot 0.05 mg/L) zes keer achter elkaar te analyseren. Het gemiddelde en de standaard deviatie van de respons van de zes standaarden werden bepaald. Precisie en juistheid werden berekend en moesten respectievelijk ≤20% en tussen de 80-120% zijn. De hoogste standaard van de calibratie curve werd gebruikt als ULOQ (Upper Limit of Quantification).
3.8.3 Juistheid
De juistheid werd bepaald door de drie QC levels te analyseren (n=6 voor elk level). De percentuele afwijking tussen de gemeten concentratie en de theoretische concentratie werd berekend (de relatieve standaarddeviatie, RSD). De RSD moest lager zijn dan 15%.
3.8.4 Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid
De herhaalbaarheid is getest door de drie QC levels in zesvoud te analyseren op dezelfde dag. Voor elk level werd het gemiddelde en de RSD berekend. De reproduceerbaarheid werd getest door elk QC level in duplo te analyseren op zes verschillende dagen. De gemiddelde respons van de 12 QC’s per level en de RSD werden berekend. Voor beide testen moest de RSD lager zijn dan 15%.
3.8.5 Stabiliteit
De in-proces stabiliteit is bepaald door de drie QC levels (n=2 per level) te bewaren voor 24, 48, 72 en 96 uur bij 6°C tot de monsters voorbewerkt werden voor analyse. Autosampler stabiliteit is bepaald door de drie QC levels (n=2 per level) na voorbewerking te bewaren in de autosampler voor 24, 48, 72 en 96 uur. De respons ratio werd berekend en vergeleken met de respons ratio van QC’s die bij -80°C werden bewaard tot de opwerking en analyse en met monsters die direct werden geanalyseerd na de opwerking. De recovery moest tussen de 90% en 110% zijn.
3.8.6 Indampeffect
Standaarden en QC’s zijn bereid door de stockoplossingen in methanol met stikstofgas te drogen bij 40°C tot alle methanol verdampt was. Vervolgens konden de componenten her opgelost worden in plasma. Door deze stap is het noodzakelijk het effect van het indampen op de componenten te testen. Het indampeffect is getest door standaard 5 [2,5 mg/L] ook te bereiden zonder indampen en te vergelijken met een
gezuiverd water en verder te verdunnen met humaan blanco plasma. Een gepaarde t-toets is uitgevoerd om te bepalen of het verschil tussen de ingedampte- en niet ingedampte standaarden significant is bij P=0,05. Dit is berekend met de volgende formule:
t = dgem* √n/sd
Het aantal vrijheidsgraden voor t is n-1. 3.8.7 Matrixeffect
Het matrixeffect is de storende invloed van de aanwezigheid van matrixcomponenten op precisie, reproduceerbaarheid en stabiliteit van de concentratie-signaalverhouding. Het matrixeffect werd bepaald volgens de methode van Matuszewski.[CITATION BMa03 \l 1043 ] Met deze methode werden academische standaarden van bekend gehalte (L, H en blanco) gemaakt in gezuiverd water, deze werden in duplo opgewerkt (A).
Ook werden er 5 batches blanco plasma in zesvoud opgewerkt zodat er in totaal 18 blanco eindextracten werden verkregen. Per batch werden in duplo de standaarden L en H gespiket aan 4 van de 6 eindextracten (B), deze standaarden hadden dezelfde eindconcentratie als de L en H standaarden die eerder academisch zijn gemaakt.
Vervolgens werden met dezelfde 5 batches blanco plasma als onder B, standaarden bereid met dezelfde concentratie als onder A (L, H en blanco). Per batch werd op elke standaard in duplo de opwerkingsmethode uitgevoerd (C).
Het piekoppervlak van alle monsters werd bepaald door het gemiddelde van de duplo-waarden te nemen. Vervolgens werden voor iedere concentratie de parameters Matrixeffect (ME), Recovery* (RE) en Proces Efficiëntie (PE) berekend over alle matrixbatches. Er werd gebruik gemaakt van de volgende formules: ME= B/A*100% (Bereken het gemiddelde en de RSD waarde)
RE= C/B*100% (Bereken het gemiddelde en de RSD waarde) PE= (ME*RE)/100
De RSD waarde van de ME en RE moesten kleiner of gelijk zijn aan 15%. De gemiddelde ME en RE lagen bij voorkeur tussen de 80 en 120%.
*Het vermogen om reproduceerbaar de analyten met behoud van precisie en juistheid te kunnen kwantificeren, ongeacht eventueel verlies van de analyt als gevolg van de opwerkingsmethode.
3.9 Patiëntmonsters
Voor een studie naar het verschil in paracetamol metabolisme tussen kinderen met- en kinderen zonder het syndroom van Down zijn 164 patiëntmonsters geanalyseerd. De monsters zijn ontdooid waarna er 10 µL werd af gepipetteerd en opgewerkt volgens de methode beschreven in sectie 3.4. De monsters zijn gedraaid in batches van 30 stuks. Voor elke batch werd een blanco; twee standaarden, standaard 3 [0.25 mg/L] en standaard 5 [2.5 mg/L]; QC L, M , H en nog een blanco gemeten. Aan het einde van elke batch werd nogmaals een blanco, standaard 3 en standaard 5 gemeten. Door het verdelen van de monsters in batches van 30 stuks bleef er controle op de kwaliteit van de analyse.
4. Resultaten
4.1 Lineariteit
De lineariteit is getest door het maken van een calibratie curve van 8 calibratie standaarden in duplo met een concentratiegebied van 0,05 tot 50 mg/L. Hierbij moest de RSD <15%, r ≥ 0.9950 en r2 ≥ 0.9900 zijn. In tabel 2 zijn de resultaten betreffende de lineariteit weergegeven. Niet alle componenten zijn lineair van standaard 1 tot en met 8, het lineaire gebied per component staat ook in tabel 2. In bijlage 2 zijn de gebruikte concentraties per component per standaard weergegeven. In bijlage 3 staan de calibratie curven per component.
Tabel 2: Lineair gebied per component, RSD waarden, correlatie- en determinatie coëfficiënten
*APAP-Merc is nog lineair tot QC H met een concentratie van 14.74 mg/L)
Component Lineair gebied (mg/L) RSD r
r
2APAP 0.050 - 25.02 <15% 0,9997 0,9994 APAP-Cys 0.036 - 1.80 <15% 0,9989 0,9977 APAP-Gluc 0.047 - 46.76 <15% 0,9994 0,9988 APAP-Glut 0.043 - 43.33 <15% 0,9996 0,9991 APAP-Merc 0.048 - 9.67 (14.74)* <15% 0,9996 0,9992 APAP-Sulf 0.087 - 43.30 <15% 0,9996 0,9992
4.2 LLOQ en ULOQ
Er is bepaald of de beoogde LLOQ behaald kan worden door de LLOQ standaard per component zes keer achter elkaar te meten en de juistheid (<20%) en precisie (<20%) te berekenen. De hoogste standaard van de calibratie reeks is gebruikt als ULOQ. De resultaten zijn te zien in tabel 3.
Tabel 3: Behaalde LLOQ per component met bijbehorende juistheid en precisie en de ULOQ per component Componen
t
LLOQ (mg/L)
Juistheid Precisie ULOQ (mg/L) APAP 0.020 5% 5.2% 25.02 APAP-Cys 0.020 10% 7.0% 1.80 APAP-Gluc 0.047 - - -APAP-Glut 0.025 43.3 APAP-Merc 0.0097 12% 14,8% 14.74 APAP-Sulf 0.043 -2% 4.1% 43.3
APAP-gluc is wegens een latere aanpassing in de methode voor deze component niet getest voor LLOQ. Echter is het voor deze component niet nodig om lager te kunnen meten dan 0,050 mg/L, dus wordt standaard 1 van de calibratie reeks beschouwd als LLOQ concentratie. Voor APAP-glut is er nog geen LLOQ behaald, dit moet nog verder worden getest.
4.3 Juistheid
De juistheid is bepaald door de drie QC levels in zesvoud achter elkaar te meten. Van deze meting is de RSD berekend van de gemeten concentratie ten opzichte van de theoretische concentratie. Bij QC H voor het component APAP-cys werd de eis van een RSD < 15% niet behaald. Bij alle overige componenten was de RSD waarde kleiner dan 15% voor elk level. De resultaten staan weergegeven in tabel 4.
Tabel 4: Juistheid RSD van de gemeten concentraties (n=6) t.o.v. de theoretische concentratie van de QC samples, eis <15% Component RSD (%) QC L RSD (%) QC M RSD (%) QC H APAP -2.6 4.7 1.9 APAP-Cys -4.9 -0.4 30.9 APAP-Gluc 1.5 -6.4 4.6 APAP-Glut -4.0 7.2 -0.6 APAP-Merc 2.2 1.8 -2.3 APAP-Sulf -0.6 0.8 2.2
4.4 Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid
De herhaalbaarheid werd getest door de drie QC levels in zesvoud achter elkaar te meten. De RSD over de zes monsters per QC level staan weergegeven in tabel 5. De eis van een RSD < 15% is behaald voor alle componenten.
Tabel 5: Herhaalbaarheid RSD over 6 achter elkaar gemeten QC samples van elk level, eis <15% Component RSD (%) QC L RSD (%) QC M RSD (%) QC H APAP 2.2 2.4 2.0 APAP-Cys 5.9 3.7 4.1 APAP-Gluc 5.1 10.8 3.4 APAP-Glut 6.6 3.4 3.6 APAP-Merc 3.6 2.5 3.4 APAP-Sulf 3.1 3.4 3.1
De reproduceerbaarheid is getest door op 6 verschillende dagen QC samples van elk level in duplo te meten. De eis was een RSD over de 12 samples onder de 15% en een gemiddelde duplovariatie onder de 10%. De resultaten staan weergegeven in tabel 6 en 7.
Tabel 6: Reproduceerbaarheid RSD over 6 metingen in duplo op verschillende dagen, eis < 15% Component RSD (%) QC L RSD (%) QC M RSD (%) QC H APAP 5.0 5.4 6.1 APAP-Cys 8.6 6.9 11.7 APAP-Gluc - - -* APAP-Glut 13.7 6.4 7.0 APAP-Merc 4.8 4.7 5.2 APAP-Sulf 6.4 4.4 6.2
Tabel 7: Duplo variatie gemeten over 6 duplo’s per QC level, eis <10%
Duplo variatie (%) APAP APAP-Cys APAP-Gluc APAP-Glut APAP-Merc APAP-Sulf
QC L 4.4 7.3 - 8.2 3.6 5.4
QC M 3.2 2.7 - 4.4 2.5 2.9
QC H 1.7 2.8 -* 8.8 3.0 1.6
* De reproduceerbaarheid en duplovariatie voor APAP-gluc moet nog worden uitgevoerd wegens latere verandering in de methode voor APAP-gluc
4.5 Stabiliteit
De autosampler stabiliteit van de samples is getest door opgewerkte samples in de autosampler te bewaren en te analyseren na 24, 48, 72 en 96 uur. De in-proces stabiliteit is getest door niet opgewerkte samples te bewaren bij 6°C en te analyseren na 24, 48, 72 en 96 uur. De gemeten concentraties werden vergeleken met de concentratie van een vers monster, het component wordt stabiel geacht wanneer de recovery tussen de 90 en 110% ligt. Alle componenten waren voor tenminste 48 uur stabiel in de autosampler. De in-proces stabiliteit bleef voor alle componenten ten minste 48 uur goed, behalve voor APAP-glut. Deze component is 24 uur stabiel wanneer het sample bewaard werd bij 6°C.
4.6 Indampeffect
Omdat de gebruikte standaarden worden gemaakt door de stockoplossingen in methanol in te dampen om vervolgens te kunnen her oplossen in plasma, is het indampeffect getest. Dit is getest door standaard 5 ingedampt en niet ingedampt in duplo te meten. In tabel 8 staat de gemiddelde respons van de ingedampte- en niet ingedampte standaard en het verschil (d) tussen de twee standaarden.
Tabel 8: Resultaat indampeffect
Component Gemiddelde respons ingedampte standaard
Gemiddelde respons niet ingedampte standaard Verschil (d) APAP 5,986 6,022 -0,036 APAP-Cys 4,432 4,184 0,249 APAP-Gluc 2,718 3,033 -0,316 APAP-Glut 1,694 1,835 -0,142 APAP-Merc 6,916 7,254 -0,338 APAP-Sulf 6,941 6,761 0,180
Er is een gepaarde t-toets uitgevoerd om te testen of de standaarden significant verschillen bij P=0,05. Het gemiddelde verschil is -0,0671, de standaarddeviatie van het verschil is 0,246 en n is 6. Ingevuld in de formule:
|t| = -0,0671*√6/0,246 |t| = 0,668
De kritische waarde is t5= 2,57 (P=0,05). De berekende waarde voor |t| is kleiner dan de kritische waarde voor t5. Dit betekend dat de standaarden niet significant verschillen bij P=0,05.
4.7 Matrixeffect
Het matrixeffect is getest met de methode van Matuszwewski.[ CITATION BMa03 \l 1043 ]Uit deze test bleek dat APAP, APAP-cys en APAP-sulf geen effect ondervonden van de matrix en opwerking. Bij deze componenten was de RSD onder de 15% voor matrixeffect (ME), recovery (RE) en proces efficiëntie (PE). Voor APAP-gluc was de RSD voor de RE onder de eis van 15%, maar werd de eis niet behaald voor ME en PE. Uit de test bleek dat er ion enhancement plaatsvond met als gevolg een RSD van respectievelijk 19,5% en 26,3% voor ME en PE. Voor APAP-merc was de RSD voor PE onder de eis van 15%, dit betekend dat de ME en RE elkaar corrigeren. De ME had een RSD van 33,4 % als gevolg van ion suppressie en de RE had een RSD van 27,0% door een hogere opbrengst in het opgewerkte monster. Voor APAP-glut werd er een zeer slecht resultaat behaald. De RSD voor ME was 26,6% als gevolg van ion suppressie. De RSD voor RE en PE waren
respectievelijk 52,9% en 74,3% door een zeer lage opbrengst na opwerking. Dit is mogelijk te wijten aan de instabiliteit van APAP-glut en moet verder onderzocht worden. In tabel 9 staan de resultaten voor alle componenten.
Tabel 9: Gemiddelde (van QC L en QC H) en RSD van ME, RE en PE per component, eis RSD <15%
Component ME gemiddeld ME RSD RE gemiddeld RE RSD PE gemiddeld PE RSD
APAP 90,3% 4,7% 108,2% 0,0% 97,7% 4,6% APAP-Cys 104,5% 3,9% 122,2% 6,3% 127,6% 2,4% APAP-Gluc 191,2% 19,5% 105,9% 7,0% 204,0% 26,3% APAP-Glut 81,4% 26,6% 18,6% 52,9% 16,2% 74,3% APAP-Merc 72,0% 33,4% 140,3% 27,0% 96,4% 6,7% APAP-Sulf 95,8% 2,2% 104,5% 0,5% 100,2% 2,7%
5. Discussie
Het doel van dit project was om de methode voor de analyse van paracetamol en vijf paracetamol metabolieten waar nodig verder te optimaliseren en te valideren zodat deze toegepast kan worden op een neonatale studie. Door deze analyse kan worden achterhaald hoe paracetamol in neonaten wordt afgebroken en in welke mate het toxische metaboliet hierbij gevormd wordt. Aan de hand van deze kennis kan door artsen een veilige dosering worden bepaald. Ook kan deze methode gebruikt worden voor het in kaart brengen van het paracetamol metabolisme in andere speciale patiënten populaties, zoals kinderen met het syndroom van Down of anorexia patiënten.
Voor de analyse van alle componenten was het nodig te werken met twee injectievolumina. Voor APAP en APAP-D4 werd 4 µL van de samples geïnjecteerd en voor de overige componenten werd 10 µL geïnjecteerd in de UPLC-MS/MS. Er is hiervoor gekozen omdat APAP een veel hogere gevoeligheid had in vergelijking met de andere componenten. Bij de analyse van samples met een hoge concentratie APAP raakt het systeem
