RNA splicing in the heart: Changing parts and performance - Summary and future perspectives; Nederlandse samenvatting; Appendix; About the author; List of publications; Portfolio; Acknowledgements/dankwoord

(1)

UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (https://dare.uva.nl)

UvA-DARE (Digital Academic Repository)

RNA splicing in the heart

Changing parts and performance

van den Hoogenhof, M.M.G.

Publication date

2018

Document Version

Other version

License

Other

Link to publication

Citation for published version (APA):

van den Hoogenhof, M. M. G. (2018). RNA splicing in the heart: Changing parts and

performance.

General rights

It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s)

and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open

content license (like Creative Commons).

Disclaimer/Complaints regulations

If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please

let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material

inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: https://uba.uva.nl/en/contact, or a letter

to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You

will be contacted as soon as possible.

(2)

516079-L-bw-hoogenhof 516079-L-bw-hoogenhof 516079-L-bw-hoogenhof 516079-L-bw-hoogenhof Processed on: 9-2-2018 Processed on: 9-2-2018 Processed on: 9-2-2018

Processed on: 9-2-2018 PDF page: 189PDF page: 189PDF page: 189PDF page: 189

changing parts and performance

RNA splicing in the heart

M.M.G. van den Hoogenhof

(3)

190

General summary and discussion

Proper RNA splicing is increasingly recognized as an important contributor to normal cardiac function, and abnormal splicing emerges as a major factor in (cardiac) disease. We focused on alternative splicing, a process in which different exons of a single gene can be in- or excluded in different ways in the mature mRNA transcript, giving rise to a much greater transcriptomic and proteomic diversity. How (differential) alternative splicing affects the heart is the main focus of this thesis.

In Chapter 1, we summarize the current knowledge on RNA splicing, with a particular focus on the heart. We discuss the major and the less well-known minor spliceosome, factors controlling and regulating RNA splicing, the role of (alternative) splicing in cardiac development and disease, and the therapeutic potential of altering alternative splicing in the heart. Although there has been enormous progress in our understanding of RNA splicing in the last decades, it is clear that our understanding is still limited. We speculate that, driven by advances in next-generation sequencing, we will unravel the complexity of alternative splicing in the decades to come.

In Chapter 2, we describe why RBM20 mutation carriers have an increased arrhythmia burden. We first compared clinical characteristics of dilated cardiomyopathy (DCM) patients with RBM20 mutations and titin (TTN) mutations, and show that RBM20 mutation carriers are at greater risk of malignant ventricular arrhythmias. We generated an Rbm20 knockout mouse model, and characterized their cardiac, transcriptomic, and electrophysiological phenotype. Rbm20 knockout mice phenocopy the DCM seen in human RBM20 mutation carriers, and display similar splicing abnormalities in known RBM20 targets like TTN. However, aberrant TTN splicing is only part of the puzzle, and not likely to explain the increased arrhythmia burden in RBM20 mutation carriers. Therefore, we employed next-generation RNA-sequencing to uncover additional Rbm20 splicing targets, and found an enrichment of differentially spliced genes that are involved in Ca2+ _{and ion handling. We validated the}

Rbm20-dependent splicing of multiple genes, such as CamkIIδ and Ryr2, in mouse, rat, and human. Aberrant splicing of CamkIIδ resulted in a remarkable shift of CamkIIδ towards the δ-A isoform which is known to activate the L-type Ca2+_{current. Therefore, we hypothesized that aberrant splicing of these genes}

could underlie the arrhythmic phenotype of RBM20 mutation carriers, potentially through disturbed Ca2+ _{handling. Using patch-clamping, we found increased action potential duration, and increased}

L-type Ca2+ _{current density. In addition, we found intracellular Ca2+ overload, increased sarcoplasmic}

reticulum (SR) Ca2+ content, and more pro-arrhythmic Ca2+ releases from the SR in Rbm20 knockout cardiomyocytes, which could be attenuated with the L-type calcium channel blocker verapamil.

In Chapter 3 and 4, we provide new insight into a novel class of RNA molecules, namely circular RNAs (circRNAs). In Chapter 3, we performed circRNA profiling of human hearts, and identified thousands of circRNAs. We found that a large number of circRNAs arise from the TTN gene, a gene known to undergo complex alternative splicing. Alternative splicing of TTN is, for a large part, regulated

(4)

191 by RBM20, and we hypothesized that RBM20-dependent splicing of TTN could underlie the formation of these circRNAs. We show that a subset of TTN-circRNAs, specifically those that arise from the I-band, are dependent on RBM20 function. We propose a model that RBM20-mediated exon skipping in TTN provides the substrate to form circRNAs from these exons. In Chapter 4, we further investigate whether alternative splicing is a major driver of circRNA production. We performed RNA-sequencing on human and mouse (wildtype and Rbm20 knockout) hearts, analyzed alternative splicing, and overlaid this with expressed circRNAs at exon level resolution. Surprisingly, even though we find that circRNAs arising from the TTN gene are driven by alternative splicing, we find that cardiac circRNAs are generally formed from constitutive (~90%) rather than alternatively spliced (~10%) exons.

In Chapter 5, we study the role of Rbm24, a pivotal splicing factor during cardiac development1_,

in the early postnatal an adult mouse heart. We used AAV9-mediated overexpression to investigate the effect of increased Rbm24 expression in the mouse heart, and found numerous genes to be differentially expressed and/or differentially spliced. Interestingly, we show that specifically extracellular matrix genes were upregulated after overexpression of Rbm24. In addition, Rbm24 overexpression increased the expression of several Tgfβ-signaling genes, like TgfβR1 and TgfβR2. Ultimately, this increased activation of cardiac fibroblasts, and led to extensive cardiac fibrosis. The exact molecular mechanism through which Rbm24 induces cardiac fibrosis remains to be determined. However, we hypothesize that Rbm24 overexpression increases the expression of several pivotal Tgfβ-pathway genes, and thereby enhances Tgfβ-signaling.

In Chapter 6, we describe the function of Rbm38 in the normal and pressure-overloaded mouse heart. Rbm38 is an RNA-binding protein and splicing factor that is closely related to Rbm24, and like Rbm24, it is expressed in the heart. Its role in the heart, however, was unknown. We generated an Rbm38 knockout mouse model, and characterized cardiac function at baseline and after pressure overload-induced cardiac remodeling. We found that Rbm38 null hearts were mildly hypertrophic at baseline, but this did not affect cardiac function. Furthermore, cardiac remodeling and performance did not differ between wildtype and Rbm38 null mice. While the hearts of Rbm38 null mice were unaffected, we did find that Rbm38 null mice present with hematopoietic defects, such as anemia and enlarged spleens with extramedullary hematopoiesis. Next, we investigated molecular consequences of Rbm38 deficiency, and examined previously identified stability, translation, and splicing targets of Rbm38. Surprisingly, we found that the majority of previously identified Rbm38 targets were not altered in the hearts of Rbm38 null mice. As most of the previously identified targets of Rbm38 were identified in different cells or tissues, it could be that these targets are cell- or tissue-specific. Alternatively, the loss of Rbm38 could be counteracted by a redundancy mechanism, for example by Rbm24, which we found upregulated in Rbm38 null hearts.

In Chapter 7, we investigate how hypoxia can influence alternative splicing in cardiomyocytes. It was already known that hypoxia can drive alternative splicing of a number of pivotal genes, like the switch in ketohexokinase by the hypoxia-driven splicing factor SF3B12_{, but the extent at which}

(5)

192

hypoxia induces alternative splicing changes is yet unknown. Therefore, we cultured neonatal rat cardiomyocytes, and subjected them to normoxia or hypoxia for 24 hours, after which we isolated RNA and performed RNA-sequencing. Although we were able to recapitulate specific (known) gene expression and alternative splicing differences as a response to hypoxia, we were hampered by limitations in RNA-sequencing analysis. Specifically, the incomplete annotation of the rat transcriptome prevented us from examining the full extent of alternative splicing changes in hypoxic cardiomyocytes. Despite incomplete rat transcriptome annotations we were able to identify splicing changes in cardiac genes, such as Ttn, CamkIIδ and Ldb3 in response to hypoxia.

(6)

193

Future perspectives

The results described in this thesis add to our understanding of alternative splicing in the heart, but at the same time raise new questions. It is clear that developments in next-generation sequencing technologies have been a driving force for the advancement of our understanding of the transcriptome. These developments have made it clear that splicing is enormously more complex than initially thought, and even with current sequencing technologies it is hard to unravel this complexity. A disadvantage of current RNA-sequencing technologies is the (small) read length of usually 50-100 basepairs, which allows for full mRNA transcript prediction but not full mRNA transcript identification. In that regard, the development of RNA-sequencing with long, or even full transcript, read length is awaited with great interest. Similarly, the bioinformatic tools to analyze RNA-sequencing datasets also need considerable improvement (chapter 7). However, enormous progress has been made in the evolution of RNA-sequencing analysis tools in the last years, and we speculate that these developments will only continue. Therefore, it would be interesting to re-analyze RNA-sequencing experiments in a few years. New bioinformatic tools and increased understanding of transcriptomes could lead to new insight into old experiments. Eventually, this will allow for the exact identification of the entire transcriptome, with all the splice isoforms of a gene including full circular RNA sequences. Likewise, identification of all RNA-binding proteins or splicing factors is needed to eventually unravel the (cardiac) splicing code3_.

We identified a novel molecular mechanism in RBM20 mutation carriers that underlies their increased arrhythmia burden (chapter 2). Most of the current research on RBM20-induced cardiomyopathy has focused on aberrant TTN splicing, and we show that missplicing of calcium handling genes is a parallel arm in the disease phenotype of RBM20 mutation carriers. This demonstrates that cardiomyopathies caused by dysfunctional splicing factors are much more complex than cardiomyopathies caused by for example mutations in sarcomeric genes. Moreover, the molecular mechanism described in chapter 2 leads to additional questions; for example, it would be interesting to examine the cardiac phenotype of the Rbm20 null mouse in a CamkIIδ null background. Reintroducing the different CamkIIδ-isoforms, for example using AAV9 viruses, would be interesting to investigate the contribution of the different isoforms to the disease phenotype.

The observation that RBM20 mutation carriers may benefit from treatment with verapamil, a drug that is currently contraindicated in heart failure patients, suggests that investigating specific treatment options for subgroups of DCM patients shows promise. It would be interesting to test additional compounds, for example other calcium lowering drugs or CamkII inhibitors, in the Rbm20 knockout mouse to examine phenotypic improvement. Additionally, the use of human induced pluripotent stem cells provides an excellent model to test specific compounds in subgroups of patients. We also investigated the closely related RNA-binding proteins Rbm24 and Rbm38. Even though it was initially thought that Rbm38 was, like Rbm34, heart- and skeletal muscle enriched9_{, we}

(7)

194

found it to be much more broadly expressed, with enriched expression in hematopoietic tissues. In that sense, it is not surprising that, while Rbm24 knockout mice are embryonically lethal due to cardiac malformations1_{, Rbm38 knockout mice do not have a clear cardiac phenotype. However, due to their}

sequence similarity and overlap in mRNA targets, it could be that Rbm24 and Rbm38 are, to some extent, redundant. An Rbm24/Rbm38 double knockout model could be used to tease out the relative contributions of both RNA-binding proteins to the regulation of their targets, which again could be a small piece of the cardiac splicing code.

We have investigated the circRNA expression profile in the human and mouse heart, and provided new insight into the biogenesis of circRNAs. The question that is wide open at the moment, is what the function of specific circRNAs are. Recent publications show that circRNAs can act as microRNA sponges4, 5_{, protein docking sites}6_{, transcription regulators}7_{, and can potentially be translated}8_{. The first}

knockout model has recently been published, and shows in vivo functionality and necessity of circRNA

Cdras15_{. Unravelling the biogenesis, regulation, and function of circRNAs will likely become a major new}

(8)

195

References

1. Yang J, Hung LH, Licht T, Kostin S, Looso M, Khrameeva E, Bindereif A, Schneider A and Braun T. RBM24 is a major regulator of muscle-specific alternative splicing. Dev Cell. 2014;31:87-99.

2. Mirtschink P, Krishnan J, Grimm F, Sarre A, Horl M, Kayikci M, Fankhauser N, Christinat Y, Cortijo C, Feehan O, Vukolic A, Sossalla S, Stehr SN, Ule J, Zamboni N, Pedrazzini T and Krek W. HIF-driven SF3B1 induces KHK-C to enforce fructolysis and heart disease. Nature. 2015;522:444-449.

3. Barash Y, Calarco JA, Gao W, Pan Q, Wang X, Shai O, Blencowe BJ and Frey BJ. Deciphering the splicing code. Nature. 2010;465:53-9.

4. Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, Torti F, Krueger J, Rybak A, Maier L, Mackowiak SD, Gregersen LH, Munschauer M, Loewer A, Ziebold U, Landthaler M, Kocks C, le Noble F and Rajewsky N. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 2013;495:333-8.

5. Piwecka M, Glazar P, Hernandez-Miranda LR, Memczak S, Wolf SA, Rybak-Wolf A, Filipchyk A, Klironomos F, Cerda Jara CA, Fenske P, Trimbuch T, Zywitza V, Plass M, Schreyer L, Ayoub S, Kocks C, Kuhn R, Rosenmund C, Birchmeier C and Rajewsky N. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science. 2017;357.

6. Du WW, Yang W, Liu E, Yang Z, Dhaliwal P and Yang BB. Foxo3 circular RNA retards cell cycle progression via forming ternary complexes with p21 and CDK2. Nucleic Acids Res. 2016;44:2846-58.

7. Zhang Y, Zhang XO, Chen T, Xiang JF, Yin QF, Xing YH, Zhu S, Yang L and Chen LL. Circular intronic long noncoding RNAs. Mol Cell. 2013;51:792-806.

8. Legnini I, Di Timoteo G, Rossi F, Morlando M, Briganti F, Sthandier O, Fatica A, Santini T, Andronache A, Wade M, Laneve P, Rajewsky N and Bozzoni I. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Mol Cell. 2017;66:22-37 e9.

9. Miyamoto S, Hidaka K, Jin D and Morisaki T. RNA-binding proteins Rbm38 and Rbm24 regulate myogenic differentiation via p21-dependent and -independent regulatory pathways. Genes Cells. 2009;14:1241-52.

(9)

196

Nederlandse samenvatting

De laatste jaren is het steeds duidelijker geworden hoe belangrijk RNA splicing is voor het functioneren van het hart, en dat veranderde (of foute) splicing een reden voor (hart)ziekte kan zijn. Wij hebben ons gericht op alternatieve splicing, het process dat ervoor zorgt dat verschillende exonen van één gen op meerdere manieren geincludeerd of geexcludeerd kunnen worden in het uiteindelijke RNA transcript, waardoor er meerdere verschillende RNA transcripten van één gen gemaakt kunnen worden. Hierdoor wordt het transcriptoom vele malen groter en diverser, dan wanneer er van elk gen maar één RNA transcript gemaakt zou kunnen worden. Hoe alternatieve splicing de functie van het hart beinvloedt, is het voornaamste onderwerp van dit proefschrift.

In Hoofdstuk 1 vatten we samen wat er bekend is over RNA splicing, en daarbij richten we ons voornamelijk op RNA splicing in het hart. We bediscusiërren het belang van het major, en het iets minder bekende minor, spliceosoom, verschillende factoren die RNA splicing beinvloeden en reguleren, de rol van (alternatieve) splicing in de ontwikkeling van het hart en in het ontstaan van hartziekte, en wat daar eventueel aan therapeutische mogelijkheden te behalen zijn. Ondanks dat er in de laatste jaren enorm veel onderzoek naar RNA splicing is gedaan, is het duidelijk dat er nog veel onbekend is. De komende jaren zal er nog veel meer bekend gaan worden over alternatieve splicing, voornamelijk door ontwikkelingen in technieken die gebruikt worden om alternatieve splicing te onderzoeken (zoals RNA-sequencing).

In Hoofdstuk 2 beschrijven we waarom patienten met een mutatie in het RBM20 gen een grote(re) kans op hartritmestoornissen hebben. We zijn begonnen met het vergelijken van klinische kenmerken van patienten met gedilateerde cardiomyopathie door ofwel een mutatie in het RBM20 gen, ofwel een mutatie in het titine (TTN) gen. We laten zien dat patienten met een mutatie in het RBM20 gen een vele malen groter risico hebben op maligne ventriculaire arrhythmiën. Vervolgens hebben we een muismodel gemaakt, waarin het gen voor Rbm20 inactief is gemaakt, om te onderzoeken waarom patienten met een RBM20 mutatie dit grotere risico hebben. We hebben gevonden dat muizen zonder Rbm20, net als patienten met een RBM20 mutatie, gedilateerde cardiomyopathie ontwikkelen, en dat zij splicing veranderingen hebben in genen zoals TTN, waarvan bekend is dat ze door Rbm20 gereguleerd worden. Echter, veranderde splicing van TTN is maar een klein stukje van de puzzel, en het is niet waarschijnlijk dat dit ten grondslag ligt aan de verhoogde kans op arrhythmiën. Daarom hebben wij next-generation RNA-sequencing gebruikt om nieuwe targets van Rbm20 te vinden, en we vonden dat voornamelijk genen die belangrijk zijn in de calcium huishouding door Rbm20 gereguleerd worden. Vervolgens hebben we deze Rbm20-afhankelijke splicing veranderingen in genen zoals CamkIIδ en Ryr2 gevalideerd in de mens, de muis, en de rat. De splicing verandering in CamkIIδ resulteert in de CamkIIδ-A isovorm, waarvan bekend is dat deze het L-type calcium kanaal kan activeren. Hierna hebben we hartspiercellen zonder Rbm20 electrophysiologisch gekarakteriseerd, en we vonden daarbij actie potentiaal prolongatie en een verhoogde calciumstroom door het L-type calcium kanaal. Ook hadden

(10)

197 deze cellen een calcium overschot, een verhoogde hoeveelheid calcium in het sarcoplasmatisch reticulum (SR), en meer lekkend calcium uit het SR. Calcium dat uit het SR lekt is pro-arrhythmisch, en kan ten grondslag liggen aan de verhoogde kans op arrhythmiën van patienten met RBM20 mutaties. Wanneer wij het L-type calcium kanaal inhibeerden met verapamil, konden wij het calcium lek uit het SR terugbrengen naar normale waarden, dus ook patienten met RBM20 mutaties zouden eventueel met verapamil behandeld kunnen worden om het risico op arrhythmiën te verkleinen.

In Hoofdstuk 3 en 4 hebben we nieuw inzicht verkregen in een nieuwe klasse van RNA moleculen, genaamd circulaire RNAs (circRNAs). In Hoofdstuk 3 hebben we in humane harten de circRNAs geprofileerd, en daarbij hebben we duizenden circRNAs geidentificeerd. Een groot aantal circRNAs kwam van het TTN gen, een gen waarvan bekend is dat de alternatieve splicing enorm complex is. De altenatieve splicing van TTN wordt voor een groot deel gereguleerd door RBM20, waardoor we dachten dat RBM20-afhankelijke alternatieve splicing van TTN nodig zou zijn voor de formatie van deze circRNAs. Vervolgens laten we zien dat voor een subset van de circRNAs die van het TTN gen komen, specifiek de circRNAs uit de I-band, dit inderdaad het geval is. We eindigen met een model waarin we beschrijven dat de exonen die door RBM20 uit TTN worden gespliced als substraat dienen voor de circRNAs die van het TTN gen gemaakt worden. In Hoofdstuk 4 gaan we dieper in op de vraag of alternatieve splicing nodig is voor de productie van circRNAs. We hebben gebruikt gemaakt van RNA-sequencing op humane harten en muizenharten (wildtype en Rbm20 knockout), hebben de alternatieve splicing geanalyzeerd, en dit, op exon niveau, vergeleken met de expressie van circRNAs. Ondanks dat we wederom vonden dat voor de vorming van circRNAs van het TTN gen alternatieve splicing nodig was, was dit voor het overgrote deel van de circRNAs in het hart niet het geval. Ongeveer 90% van de exonen waarvan circRNAs worden gemaakt zijn exonen die niet onderhevig zijn aan alternatieve splicing, en maar 10% van de exonen waarvan circRNAs worden gemaakt zijn wel alternatief gespliced.

In Hoofdstuk 5 bestuderen we de rol van Rbm24, een cruciale splicing factor tijdens de ontwikkeling van het hart1_{, in het postnatale en volwassen muizenhart. We hebben gebruik gemaakt van}

AAV9-gemedieerde overexpressie van Rbm24 in het muizenhart, en vonden dat van een groot aantal genen de expressie en/of splicing was veranderd. We laten zien dat voornamelijk extra cellulaire matrix genen verhoogd tot expressie komen na overexpressie van Rbm24. Daarnaast hebben we gevonden dat een aantal genen uit de Tgfβ-signalering, zoals TgfβR1 en TgfβR2, verhoogd tot expressie komen. Ook vonden activatie van fibroblasten en fibrose in de harten met overexpressie van Rbm24. Hoe Rbm24 exact tot de fibrose leidt, is nog niet bekend, maar we denken dat Rbm24 de Tgfβ-signalering, waarvan bekend is dat het belangrijk is voor fibrose in het hart, versterkt.

In Hoofdstuk 6 beschrijven we de rol van Rbm38 in het gezonde en zieke muizenhart.Rbm38 is een RNA-bindend eiwit en splicing factor, en is een familielid van Rbm24. Rbm38 komt, net als Rbm24, tot expressie in het hart, maar de rol van Rbm38 in het hart was nog niet bekend. We hebben een muismodel gemaakt, waarin we het gen voor Rbm38 inactief hebben gemaakt, en hebben vervolgens naar de functie van het hart gekeken. We hebben gevonden dat de harten van muizen zonder Rbm38

(11)

198

geen verslechterde hartfunctie hadden, en dat de wanden van het hart enigszins verdikt waren. Vervolgens hebben we gekeken of de harten van deze muizen minder goed bestand zouden zijn tegen drukbelasting (door het afbinden van de aorta), maar ook hier zagen wij geen verschil tussen normale muizenharten en muizenharten zonder Rbm38. Ondanks dat de harten van deze muizen niet waren aangedaan, vonden we dat muizen zonder Rbm38 bloedarmoede, vergrote milten, en een hogere aanmaak van rode bloedcellen hadden. Daarna hebben we gekeken wat de moleculaire consequenties van het verlies van Rbm38 is, door naar eerder gepubliceerde targets (zowel stabiliteits-, translatie-, als splicing-targets) van Rbm38 te kijken. We vonden dat de meerderheid van deze targets niet veranderd was door het verlies van Rbm38. Dit zou kunnen komen doordat vrijwel al deze targets eerder geidentificeerd waren in andere cel- of weefseltypes; wellicht zijn deze targets cel- of weefsel-specifiek. Het zou ook kunnen dat het verlies van Rbm38 wordt gecompenseerd door een ander eiwit, zoals Rbm24, waarvan we hebben gevonden dat deze hoger tot expressie komt in de harten zonder Rbm38.

In Hoofdstuk 7 onderzoeken we hoe een lage zuurstofspanning (hypoxia) alternatieve splicing in hartspiercellen beinvloedt. Het was al bekend dat de alternatieve splicing van een aantal cruciale genen in het hart wordt veranderd door hypoxia2_{, maar de schaal waarop dit gebeurt was nog onbekend.}

We hebben neonatal hartspiercellen van de rat gebruikt, en deze aan een normale zuurstofspanning of een lage zuurstofspanning onderworpen. Vervolgens hebben het RNA geisoleerd, en RNA-sequencing gebruikt om de alternatieve splicing te onderzoeken. Ondanks dat we een aantal bekende gevolgen van hypoxia, zowel qua gen expressie als alternative splicing van genen, waren we gelimiteerd in de analyze van de RNA-sequencing data. Voornamelijk de incomplete annotatie van het rat transcriptoom heeft ons ervan weerhouden om de splicing verandering door hypoxia volledig in kaart te brengen. Ondanks dit, hebben we nieuwe splicing veranderingen geidentificeerd in belangrijke cardiale genen zoals Ttn, CamkIIδ, en Ldb3.

Toekomst perspectieven

De resultaten in dit proefschrift hebben nieuw inzicht gebracht in de rol van alternatieve splicing in het hart, en tegelijkertijd leiden zij tot nieuwe vragen. Het is duidelijk dat nieuwe ontwikkelingen in next-generation sequencing technologiën ten grondslag liggen aan de kennis van alternatieve splicing en het transcriptoom. Tegelijkertijd heeft dit ertoe geleidt dat we nu weten dat alternatieve splicing veel complexer is dan ooit werd gedacht, en dat zelfs met hedendaagse technieken deze complexiteit moeilijk te doorgronden is. Een nadeel van hedendaagse RNA-sequencing technologie, is dat de lengte van de gelezen (RNA-)fragmenten maar 50-100 basenparen is. Hierdoor kunnen we de volledige transcripten die er zijn niet identificeren, maar enkel voorspellen. Om deze reden wordt er hard gewerkt aan nieuwe RNA-sequencing technieken waarbij langere, of zelfs volledige, RNA-fragmenten gelezen kunnen worden. Ook de programmas die gebruikt worden om RNA-sequencing data te analyzeren zullen nog verder ontwikkeld moeten worden (hoofdstuk 7). Gelukkig is daar in de laatste jaren al enorm veel progressie geboekt, en wij denken dat deze ontwikkelingen alleen maar door zullen gaan. Het zou

(12)

199 interessant zijn om over een aantal jaren oude(re) RNA-sequencing data opnieuw te analyzeren, want deze nieuwe programmas zouden nieuw inzicht in oude experimenten kunnen verschaffen. Uiteindelijk zal dit kunnen leiden tot de identificatie van het volledige transcriptoom, met alle splice isovormen en volledige circulaire RNA sequenties die daarbij horen. Tegelijkertijd zal de identificatie van alle RNA-bindende eiwitten en splicing factoren belangrijk zijn voor het doorgronden van de (hartspecifieke) splicing code3_.

We hebben een nieuw moleculair mechanisme in patienten met RBM20 mutaties ontdekt, wat verantwoordelijk is voor het verhoogd risico op hartritmestoornissen (hoofdstuk 2). Vrijwel al het onderzoek wat naar RBM20-geinduceerde cardiomyopathiën is gedaan, heeft zich gericht op veranderde splicing van TTN, maar wij laten zien dat veranderde splicing van genen in de calcium huishouding een parallele arm in het ziekteproces is. Dit laat zien dat hartziekte veroorzaakt door splicing factoren vele malen complexer zijn, dan hartziekte veroorzaakt door bijvoorbeeld sarcomeergenen. Daarnaast vraagt de idenficatie van dit moleculaire mechanisme om additioneel onderzoek; het zou bijvoorbeeld interessant zijn om de hartfunctie te onderzoeken van een muis zonder Rbm20 én zonder CamkIIδ. Als we vervolgens de verschillende CamkIIδ isovormen één voor één herintroduceren, zouden we moeten kunnen herleiden welke isovorm het belangrijkste is in deze ziekte.

Daarnaast hebben wij gevonden dat patienten met RBM20 mutaties zouden kunnen profiteren van behandeling met verapamil, een medicijn wat op dit moment gecontra-indiceerd is in hartfaalpatienten. Dit resultaat suggereert dat het onderzoeken van specifieke medicijnen, voor specifieke subgroepen patienten, tot betere resultaten zou kunnen leiden in de kliniek. Voor patienten met RBM20 mutaties zou het nog interessant zijn om andere medicijnen die calcium verlagen of medicijnen die CamkIIδ inhiberen te testen, bijvoorbeeld in de Rbm20 knockout muis. Ook zouden humane geinduceerde pluripotente stam cellen gebruikt kunnen worden als model om deze medicijnen te testen.

Naast Rbm20, hebben wij ook de RNA-bindende eiwitten Rbm24 en Rbm38 onderzocht. Rbm24 en Rbm38 zijn twee eiwitten die erg op elkaar lijken (ze zijn verwant aan elkaar), en er werd initieel gedacht dat Rbm24 en Rbm38 voornamelijk in het hart (en in de skeletspieren) tot expressie kwamen9_{. Wij hebben echter gevonden dat Rbm38 in veel meer weefsels tot expressie komt, met de}

hoogste expressie in hematopoëtische weefsels, en dat alleen Rbm24 voornamelijk in het hart tot expressie komt. Het is daarom niet verwonderlijk dat muizen zonder Rbm24 niet levensvatbaar zijn (vanwege hartafwijkingen)1_{, maar dat muizen zonder Rbm38 geen hartproblemen hebben. Het zou}

echter kunnen dat Rbm24 en Rbm38 (enigszins) voor elkaar kunnen compenseren (en elkaars functie kunnen overnemen), omdat ze voor een grote mate dezelfde structuur hebben en overlappende RNA targets. We zouden gebruik kunnen maken van een dubbel knockout muismodel (een muis zonder Rbm24 en zonder Rbm38) om te onderzoeken wat de relatieve contributie is van Rbm24 en Rbm38 aan de regulatie van hun targets. Daarmee zou weer een klein stukje van de splicing code doorgrondt kunnen worden.

(13)

200

We hebben ook onderzoek gedaan naar de expressive van circRNAs in het humane en muizenhart, en hebben nieuw inzicht verschaft in de biogenese van circRNAs. Er zijn echter nog vele vragen te beantwoorden; bijvoorbeeld wat de functie van specifieke circRNAs is. Recente publicaties hebben al laten zien dat circRNAs kunnen functioneren als ‘spons’ voor microRNAs4, 5_{, als binding}

partner voor eiwitten6_{, als regulator van transcriptie}7_{, en sommigen lijken zelfs te worden getransleerd}8_.

Het eerste knockout muismodel voor een circRNA is zeer recent gepubliceerd, en dit laat zien dat ook in

vivo circRNAs, in dit geval de circRNA Cdras1, belangrijk zijn en een rol hebben5_{. Het ontcijferen van de}

biogenese, regulatie, en functie van circRNAs wordt waarschijnlijk een belangrijk nieuw onderzoeksveld in de moleculaire cardiologie.

(14)

201

Referenties

1. Yang J, Hung LH, Licht T, Kostin S, Looso M, Khrameeva E, Bindereif A, Schneider A and Braun T. RBM24 is a major regulator of muscle-specific alternative splicing. Dev Cell. 2014;31:87-99.

2. Mirtschink P, Krishnan J, Grimm F, Sarre A, Horl M, Kayikci M, Fankhauser N, Christinat Y, Cortijo C, Feehan O, Vukolic A, Sossalla S, Stehr SN, Ule J, Zamboni N, Pedrazzini T and Krek W. HIF-driven SF3B1 induces KHK-C to enforce fructolysis and heart disease. Nature. 2015;522:444-449.

3. Barash Y, Calarco JA, Gao W, Pan Q, Wang X, Shai O, Blencowe BJ and Frey BJ. Deciphering the splicing code. Nature. 2010;465:53-9.

4. Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, Torti F, Krueger J, Rybak A, Maier L, Mackowiak SD, Gregersen LH, Munschauer M, Loewer A, Ziebold U, Landthaler M, Kocks C, le Noble F and Rajewsky N. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 2013;495:333-8.

5. Piwecka M, Glazar P, Hernandez-Miranda LR, Memczak S, Wolf SA, Rybak-Wolf A, Filipchyk A, Klironomos F, Cerda Jara CA, Fenske P, Trimbuch T, Zywitza V, Plass M, Schreyer L, Ayoub S, Kocks C, Kuhn R, Rosenmund C, Birchmeier C and Rajewsky N. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science. 2017;357.

6. Du WW, Yang W, Liu E, Yang Z, Dhaliwal P and Yang BB. Foxo3 circular RNA retards cell cycle progression via forming ternary complexes with p21 and CDK2. Nucleic Acids Res. 2016;44:2846-58.

7. Zhang Y, Zhang XO, Chen T, Xiang JF, Yin QF, Xing YH, Zhu S, Yang L and Chen LL. Circular intronic long noncoding RNAs. Mol Cell. 2013;51:792-806.

8. Legnini I, Di Timoteo G, Rossi F, Morlando M, Briganti F, Sthandier O, Fatica A, Santini T, Andronache A, Wade M, Laneve P, Rajewsky N and Bozzoni I. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Mol Cell. 2017;66:22-37 e9.

9. Miyamoto S, Hidaka K, Jin D and Morisaki T. RNA-binding proteins Rbm38 and Rbm24 regulate myogenic differentiation via p21-dependent and -independent regulatory pathways. Genes Cells. 2009;14:1241-52.

(15)

APPENDIX

About the author List of Publications

Portfolio

(16)

changing parts and performance

RNA splicing in the heart

M.M.G. van den Hoogenhof

About the author List of Publications

Portfolio

(17)

(18)

205

About the author

Maarten was born on August 24th_{1984 in Sint-oedenrode and was raised in the neighboring town}

Schijndel, the Netherlands. He attended Gymnasium Bernrode in Heeswijk-Dinther, from which he graduated in 2002. After spending a year to study Hotel Management in Maastricht, he switched to study Biomedical Sciences in Nijmegen in 2004. In 2008 he obtained his Bachelor’s degree, after spending 6 months in the lab of Prof. dr. J.D. Molkentin at the Cincinnati Children’s Hospital in Cincinnati, Ohio, USA, under the supervision of dr. J.H. van Berlo to work on the transcription factor GATA6 in cardiac development. This is when he decided he wanted to pursue an academic career, and upon return in the Netherlands he contacted Prof. dr. L.J. de Windt and Prof. dr. Y.M. Pinto to apply for internships to finish his Master’s Degree, and for a PhD position. Maarten then spent 6 months in the lab of Prof. dr. L.J. de Windt under supervision of dr. H. el Azzouzi, working on microRNAs in cardiac metabolism, for which he was supported by a dr. Dekker Student Fellowship from the Dutch Heart Foundation. He then moved to the lab of Prof. dr. Y.M. Pinto to finish his Master’s Degree, which he obtained in 2011. Simultaneously, he started his PhD to investigate RNA-binding proteins in the heart under the supervision of Prof. dr. Y.M. Pinto and dr. E.E. Creemers, for which he was supported by an AMC PhD fellowship. The results of this work are presented in this thesis. Maarten currently works as a postdoctoral fellow in the lab of Prof. dr. J. Backs in Heidelberg, Germany, following up on findings of his PhD and studying additional RNA-binding proteins and splicing mechanisms.

(19)

206

List of Publications

1. van den Hoogenhof, M.M.G., I. van der Made, A. Beqqali, N.E. de Groot, A. Damanafshan, R.J. van Oort, Y.M.

Pinto, and E.E. Creemers, The RNA-binding protein Rbm38 is dispensable during pressure overload-induced cardiac remodeling in mice. PLoS ONE, 2017. 12(8): p. e0184093.

2. Khan, M.A., Y.J. Reckman, S. Aufiero, M.M. van den Hoogenhof, I. van der Made, A. Beqqali, D.R. Koolbergen, T.B. Rasmussen, J. van der Velden, E.E. Creemers, and Y.M. Pinto, RBM20 Regulates Circular RNA Production From the Titin Gene. Circulation Research, 2016. 119(9): p. 996-1003.

3. Beqqali, A., I.A. Bollen, T.B. Rasmussen, M.M. van den Hoogenhof, H.W. van Deutekom, S. Schafer, J. Haas, B. Meder, K.E. Sorensen, R.J. van Oort, J. Mogensen, N. Hubner, E.E. Creemers, J. van der Velden, and Y.M. Pinto, A mutation in the glutamate-rich region of RNA-binding motif protein 20 causes dilated cardiomyopathy through missplicing of titin and impaired Frank-Starling mechanism. Cardiovascular Research, 2016. 112(1): p. 452-63.

4. van den Hoogenhof, M.M., Y.M. Pinto, and E.E. Creemers, RNA Splicing: Regulation and Dysregulation in the Heart. Circulation Research, 2016. 118(3): p. 454-68.

5. Medzikovic, L., C.A. Schumacher, A.O. Verkerk, E.D. van Deel, R. Wolswinkel, I. van der Made, N. Bleeker, D. Cakici, M.M. van den Hoogenhof, F. Meggouh, E.E. Creemers, C.A. Remme, A. Baartscheer, R.J. de Winter, C.J. de Vries, E.K. Arkenbout, and V. de Waard, Orphan nuclear receptor Nur77 affects cardiomyocyte calcium homeostasis and adverse cardiac remodelling. Scientific Reports, 2015. 5: p. 15404.

6. Weeland, C.J., M.M. van den Hoogenhof, A. Beqqali, and E.E. Creemers, Insights into alternative splicing of sarcomeric genes in the heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 2015. 81: p. 107-13.

7. Tijsen, A.J., I. van der Made, M.M. van den Hoogenhof, W.J. Wijnen, E.D. van Deel, N.E. de Groot, S. Alekseev, K. Fluiter, B. Schroen, M.J. Goumans, J. van der Velden, D.J. Duncker, Y.M. Pinto, and E.E. Creemers, The microRNA-15 family inhibits the TGFbeta-pathway in the heart. Cardiovascular Research, 2014. 104(1): p. 61-71.

8. el Azzouzi, H., S. Leptidis, E. Dirkx, J. Hoeks, B. van Bree, K. Brand, E.A. McClellan, E. Poels, J.C. Sluimer, M.M.

van den Hoogenhof, A.S. Armand, X. Yin, S. Langley, M. Bourajjaj, S. Olieslagers, J. Krishnan, M. Vooijs, H.

Kurihara, A. Stubbs, Y.M. Pinto, W. Krek, M. Mayr, P.A. da Costa Martins, P. Schrauwen, and L.J. De Windt, The hypoxia-inducible microRNA cluster miR-199a approximately 214 targets myocardial PPARdelta and impairs mitochondrial fatty acid oxidation. Cell Metabolism, 2013. 18(3): p. 341-54.

9. Kubben, N., J.W. Voncken, G. Konings, M. van Weeghel, M.M. van den Hoogenhof, M. Gijbels, A. van Erk, K. Schoonderwoerd, B. van den Bosch, V. Dahlmans, C. Calis, S.M. Houten, T. Misteli, and Y.M. Pinto, Post-natal myogenic and adipogenic developmental: defects and metabolic impairment upon loss of A-type lamins. Nucleus, 2011. 2(3): p. 195-207.

10. van Berlo, J.H., J.W. Elrod, M.M. van den Hoogenhof, A.J. York, B.J. Aronow, S.A. Duncan, and J.D. Molkentin, The transcription factor GATA-6 regulates pathological cardiac hypertrophy. Circulation Research, 2010.

(20)

207

In Revision:

RBM20 mutations induce an arrhythmogenic cardiomyopathy related to disturbed calcium handling.

MMG van den Hoogenhof, A Beqqali, A Amin, I van der Made, S Aufiero, MAF Khan, JA Jansweijer,

KY van Spaendonk-Zwarts, CA Schumacher, CA Remme, AO Verkerk, A Baartscheer, YM Pinto*, EE Creemers*.

Cardiac circRNAs arise mainly from constitutive exons rather than alternatively spliced exons. S Aufiero,

MMG van den Hoogenhof, YJ Reckman, Beqqali A, I van der Made, Kluin J, MAF Khan, YM Pinto, EE

Creemers.

The Mef2 transcriptional target DMPK induces loss of sarcomere structure and cardiomyopathy. A

Damanafshan*, I Elzenaar*, B Samson-Couterie, I van der Made, M Bourajjaj, MMG van den Hoogenhof, HA van Veen, DI Picavet, A Beqqali, E Ehler, LJ de Windt, YM Pinto, RJ van Oort.

Submitted:

AAV-mediated Rbm24 overexpression induces fibrosis in the mouse heart. MMG van den Hoogenhof, I

van der Made, NE de Groot, SCM van Amersfoort, L Zentilin, M Giacca, YM Pinto, EE Creemers

In Preparation:

Heterozygous loss of Rbm24 lowers cardiomyocyte calcium sensitivity but does not affect cardiac function. NE de Groot*, MMG van den Hoogenhof*, A Najafi, I van der Made, A Beqqali, J van der

Velden, YM Pinto, EE Creemers.

(21)

208

Portfolio

PhD student: Maarten M.G. van den Hoogenhof

PhD period: 2010 - 2017

Name PhD supervisor: Prof. dr. Yigal M. Pinto, dr. Esther E. Creemers

1. PhD training Year Workload (ECTS) General courses • Scientific Writing 2012 1 Specific courses

• Introduction to Python for Biologists • Advanced Python for Biologists

2016 2016

1.4 1.4

Seminars, workshops and master classes

• Weekly departmental seminars • Weekly Progress Reports • Master class by Yibin Wang

2010 - 2017 2010 - 2017 2015 6 6 0.2 Presentations

• Poster presentation ‘The cardiac specific splicing regulator Rbm20 decreases in specific forms of acquired heart disease’, Dutch-German Cardiology meeting, Heidelberg, Dutch-Germany

• Poster presentation ‘The cardiac specific splicing regulator Rbm20 decreases in specific forms of acquired heart disease’, AHA BCVS meeting, Las Vegas, USA

• Oral presentations at CVON meetings

• Poster presentation “Hypoxia induces alternative splicing changes in cardiomyocytes’, Dutch-German Cardiology meeting, Leiden • Oral presentation ‘RNA splicing in the heart; changing parts and

performance, ACS Center of Excellence Symposium, Amsterdam

2013 2013 2013-2017 2016 2017 0.5 0.5 2 0.5 0.5 (Inter)national conferences

• Weinstein meeting on Cardiovascular Development, Cincinnati, USA

• German-Dutch Cardiology meeting, Ulm, Germany

2011 2011 0.25 0.25 Other • Journal club 2010-2017 6

(22)

209 2. Teaching Year Workload (Hours/ ECTS) Lecturing

• Blok 2.2, Cardiovasculaire aandoeningen • Module 1004, Embryologie 2010 2011-2012 1 2 Supervising

• Cees Weeland, Cloning and characterization of mouse Rbpms isoforms, Experimental Cardiology

• Cees Weeland, Mechanism and regulation of splicing and its role in heart disease, Experimental Cardiology

• Lona Kroese, Examining the utility of a minigene model for identification and validation of alternative splicing events regulated by RBM20, Experimental Cardiology 2012 2014 2014 1 1 1 3. Parameters of Esteem Year Grants • AMC PhD Scholarship • Heartcenter Stimulans voucher

2011 2016

Awards and Prizes

(23)

210

Dankwoord/Acknowledgements

De resultaten in dit proefschrift hadden niet tot stand kunnen komen zonder de steun en medewerking van vele anderen. Al deze mensen wil ik hartelijk bedanken, en een aantal in het bijzonder.

Mijn promotor Prof. dr. Y.M. Pinto. Beste Yigal, ondanks dat je je tijd moet verdelen tussen de kliniek en het lab, heb je geen enkel cruciaal moment gemist. Je vermogen om van elk project de juiste invalshoek te kiezen is bewonderenswaardig. Dank voor je motiverende woorden, je talent om zo’n groep ongeleide projectielen te managen, en voor je (uiterst snelle) feedback op alle stukken. Ik heb genoten van de samenwerking, en hoop dat we deze samenwerking ooit nog kunnen voortzetten. Je weet wat daarvoor nodig is. Mijn co-promotor dr. E.E. Creemers. Beste Esther, ik begon ooit als jonge naïeve onderzoeker, die dacht dat hij alles al wist. En wat had ik het mis. Dankjewel voor al je begeleiding, sturing, en wijze lessen. Ik heb genoten van het samen schrijven van alle artikelen (waarbij ik het natuurlijk nooit eens was met je commentaar; weet je nog dat je me een keertje een uur nadat je je commentaar had opgestuurd me in het lab kwam zoeken omdat ik nog niet bij je was geweest om te zeggen dat ik het er allemaal niet mee eens was?), het discussieren over de projecten, en van je Brabantse gezelligheid. Dank voor alles.

Verder wil ik graag Prof. dr. J.D. Molkentin, Prof. dr. J. Backs, Prof. dr. L.J. de Windt, Prof. dr. V.M. Christoffels, dr. R. Coronel, en Prof. dr. C.J.M. van Noorden hartelijk danken voor het zitting nemen in de promotiecommissie.

Dear Jeff, it was in your lab that I took my first steps in the world of molecular biology. I admire your vast knowledge of basically every molecular pathway in the heart, and the determination with which you lead your lab (and life). Also, I’m not sure if I have seen any other professor chug a beer that fast, or settle arguments with arm wrestling. It is an honor and great pleasure to have you here in Amsterdam. Dear Johannes, we met in december 2016 (although this wasn’t really the first time, but the time before resulted in foodpoisoning), and as the world’s foremost expert on CamkII, I had a lot of questions to ask you. To me, it was an exciting meeting, and I am glad we decided I should come to Heidelberg to work with you. Exciting times ahead! Beste Leon, ook in jouw lab heb ik een tijdje rond mogen lopen. Ik bewonder je enthousiasme voor de wetenschap, en ik ben dankbaar voor alle steun die ik van je heb ontvangen. Ik kijk uit naar de filosofische vragen die je me ongetwijfeld gaat stellen. Beste Vincent, dank voor al je kritische vragen bij de vele presentaties. Alleen al de gedachte dat jij bij het progress report aanwezig zou zijn, heeft me een betere presentator en wetenschapper gemaakt. Beste Ruben, weinig mensen benaderen de wetenschap zoals jij. Je enorm scherpe en tegelijkertijd laidback houding is bewonderenswaardig. Beste Ron, mijn hartelijke dank voor het beoordelen van mijn thesis, en ik kijk uit naar je vragen (maar dat wist je al).

(24)

211

Jop, jij was mijn eerste echte begeleider in de wetenschap. In de tijd dat ik jouw student mocht zijn, heb

ik enorm veel van je geleerd. Ik kijk op naar de manier waarop je wetenschap benaderd, maar ben nog veel verheugder dat ik je familie mag noemen. Hamid(ski), nadat ik terugkwam naar Nederland ben ik jouw student geworden. Ik ben enorm dankbaar voor alles (everything? EVERYTHING!!) wat je voor me hebt gedaan; zij het je begeleiding, zij het je vriendschap. Ons jaarlijkse koffiemoment om even goed bij te praten is nu even wat lastiger, maar ik kijk ernaar uit om onze traditie te hervatten wanneer ik wederom terugkom naar Nederland.

During my time in Cincinnati, I met a lot of people who helped me as a starting ‘scientist’. Dear Brad, dear Sanje, you’ve become such good friends that I consider you to be family. Thanks for all the dinners, good times, chats about cars or science, and support throughout the years. John, you’re doing great in Philly, and I wouldn’t have expected anything less from you. Sorry I couldn’t come to work with you. I’m looking forward to the next time we meet! And how could I forget Marjorie, Jen K, Jen D, Izhak, Fede, and all the others who’ve helped me in- and outside of the lab; thanks for everything.

Stefanos, Monika, Paula, and Kanita, thanks for a great time in Leon’s lab! And Monika, thanks for

always reminding me I once owned a ‘pink’ motorcycle.

Ook in Amsterdam heb ik veel mensen leren kennen die mijn (wetenschappelijke) leven rijker hebben gemaak, en velen van hen zie ik als (goede) vriend.

Ik wil graag alle leden van de Pinto groep bedanken voor hun bijdrage. Inge, zonder jouw hulp was mijn eindsprint nog niet half zo snel geweest. Dank voor je tomeloze inzet, de lekkerste IPA uit monnickendam, en de vriendschap. Appie, dankjewel voor je lessen en samenwerking in het lab. Ik wens je het allerbeste in Edinburgh. Anke, dank voor al je kritische bijdragen. Heel veel succes met het opzetten van je eigen groep. Ralph, als er iemand veel tegenslag heeft gekend, dan ben jij het wel. Ik hoop van harte dat het je snel wat meer voor de wind gaat. Amin (zonder baard), dank voor je bijdrage aan het RBM20 stuk. Ook dankjewel voor alle leuke momenten buiten het lab. Thanks also to the real geeks in our group; Mohsin, we started working together soon after you arrived in Amsterdam. Thanks for fueling my interest in bio-informatics, and being a friend. Simona, I can honestly say I really enjoyed working with you. Hopefully, someday I can afford to hire you as my personal bio-informatician. Thanks for all the nice work, the coffee breaks, the friendship, and the cornicello (which now hangs on my door in Heidelberg). Lucia, thanks for all the good times, and good luck with finishing your PhD. Ook alle voormalige leden van de groep: Wino, Joost, Amira, Ingrid, Monika, Joeri, Bing, Amalia, Sergey,

Stephanie, Benoit, Mischa, thanks for everything. Hanneke, Hoi! Mijn interesse in de bio-informatica

is eigenlijk door jou aangestoken. Dankjewel voor alles. M. Ies, al een tijdje weg van de afdeling, maar niet uit mijn leven. Wie had gedacht dat zo’n viezerik uit Volendam zo’n goede vriend zou worden. Mijn studenten, Cees en Lona, ik hoop dat jullie iets van me hebben opgestoken. Carlos, bedankt voor de revolutie. Maar eerst een slaapje.

(25)

212

De electrophysiologen: Ton en Cees, dank voor de gezellige calciummetingen. Wat mij betreft is er zowel weten- als vriendschappelijk iets moois uitgekomen. Jan, bedankt voor het altijd even komen bediscussieren van de resultaten. Arie, dankjewel voor je bijdrage aan het RBM20 stuk, en je open-deur beleid voor al mijn vragen over wat je nu eigenlijk gedaan had. Ook alle andere collega’s van de afdeling, waaronder Connie, Carol Ann, Elisabeth, Rianne, Gerard, Vincent P, Svitlana, Marieke,

Isabella, Leander en Shirley wil ik hartelijk bedanken.

Our collaborators in Trieste: Prof. dr. Mauro Giacca and dr. Lorena Zentilin, thanks for your help with the AAVs.

Jarenlang werkten we nauw samen met de afdeling Anatomie (en soms stiekem nog steeds wel), en ook aan hen ben ik mijn dank verschuldigd. In het bijzonder: Quinn, kwimmetje, mijn oma is nog steeds fan van je. BJ, thanks for all the talks, beers, jokes, advice, support, and hugs. Rajivke, mede-brabander. Misschien zie ik je nog in Heidelberg? Henk, Hiz, eigenlijk snap ik wel dat je Judith zo lang voor jezelf hield. Phil, wanneer komt die Aston Martin er nu? Bas, als je net zo goed gitaar kon spelen, als dat je wetenschap kan bedrijven, dan speelde je de sterren van de hemel. Vincent W, met wie moet ik het nu over de MotoGP hebben? Stuti, thanks for the best vegetarian curry. Andrea, thanks for all the hugs. Ook Aho, Antoon, Ingeborg, Alex, Corrie, Maurice, Karel, Roelof-Jan, Jaco, en Jan, dank voor alles.

Jettie, voor jou ook even een speciaal regeltje. Eigenlijk werkten we niet eens op dezelfde afdeling,

maar ik kon altijd met alles bij je terecht. Dank voor alles.

And some people who have already left: Sonia, Ileana, Julien, Irina, and Malou, I had some really great times with you, thanks for everything. Adrian, duuuudeeee, thanks for your support, and more importantly, your friendship. Let’s try to meet more often. Sameer, helaas moest je naar de VS verhuizen om je geluk te vinden. Ik kom je snel opzoeken! Marc, Meester, wat heb ik van jou veel geleerd. Zij het in de keuken, zij het in het lab, zij het in zijn algemeenheid. Dank.

De mensen van de leukste kamer; wat heb ik veel plezier met jullie gehad. Dankjewel voor alle uitjes, lunches, adviezen, bootcamp, koffiepauzes, en een telefoon die altijd berichtjes binnenkrijgt. Nina, het enige echte zonnetje in huis. Ik kan geen roze eenhoorn voorbij lopen, zonder aan jou te denken. Yolan, een arts die óók verstand van moleculaire biologie heeft. Respect. Amin (met baard), op het feestje zal ik eindelijk weer eens een biertje met je drinken. Nico, buurvrouw en bootcampmaatje. Wat was het makkelijk dat ik met alle promotievragen bij je terecht kon. Zou ik expres op je gewacht hebben? Krys, prototype meisje uit Naarden. Sommige van mijn stellingen zijn o.a. voor jou. Doris, ooit vinden we het youtube-filmpje weer terug. Mathilde, the only person I ever visited in NY. Thanks for your friendship. Ook mijn familie heeft jarenlang moeten aanhoren hoe goed of slecht het ging in mijn onderzoek; dank voor het luisteren en de steun. Vader, misschien wel degene die het meest content én het meest discontent is met mijn carrierekeuze. Moleculaire biologie geeft nu eenmaal niet de zwart-wit antwoorden die je van wiskunde gewend bent. Maar dat is nu net het mooie eraan. Dankjewel voor

(26)

213 je steun, en het altijd scherp houden. Suus, dankjewel voor je liefde en steun, al moet dat vaak via Facetime of Skype. Tom, werk eens wat minder hard. Dat zouden Mattie en Selah wel fijn vinden. En ik ook. Loes, van klein zusje naar de vrouw die je nu bent. Ik ben trots op je. Bart, ik hoop dat jij ook inziet dat de wetenschap eigenlijk heel erg leuk is. Moeder, dank voor alle gezelligheid, goede zorgen, en worstenbroodjes.

Rick, Juul, Tom, Bart, Lau, Elmar, Mike, Lonnie, Leo, Claus, Sanne, Rosa, en Jorien. Dankjewel voor alle

vriendschap en interesse. En Rosa, ik ben nu eindelijk klaar. Nathalie, inderdaad de meest bijzondere eerste ontmoeting ooit. Bobby, Mo, Timmetje, Miep, Ans, Le, Mark, Son, Gerbie, Sabrina, dankjewel voor alle steun, de relaxende momenten, en de interesse in mijn werk. Henk, Sari, Leon, Dewi, Enno, en alle anderen, dank voor elk jaar weer een prachtig TT weekend. Ans en Peter, dankjewel voor jullie interesse en goede zorgen. Danny, mijn vreetmaatje pur sang, en Sab, dankjulliewel voor alle steun, alle heerlijke momenten (vaak ook letterlijk), en de ontspanning. Maarten, het is snel weer tijd om de crossmotoren te pakken en het bos in te gaan. Schijnt hier in Heidelberg ook te moeten kunnen. Tijn, dankjewel voor de yoga en de biertjes. Sieta en Ali, bedankt voor de gezelligheid en de support. Sanne en Tom, dankjulliewel voor jullie vriendschap, en voor het delen.

Ook alle andere vrienden en familie die direct of indirect hebben bijgedragen aan dit proefschrift, enorm bedankt voor alles.

Mijn paranimfen, dankjewel voor jullie steun op deze voor mij zo belangrijke dag. Rick, van al mijn broers hou ik evenveel, maar toch wist ik al jaren dat ik jou graag naast me wilde hebben op deze dag. Dankjewel dat je er altijd voor me bent. Eddy, ik denk dat wij binnen tien minuten nadat we elkaar ontmoet hadden, al flink aan het praten waren over amerikaanse V8en, pks, en alles wat gemotoriseerd is of kan worden. Ondanks dat we toen een maand met elkaar opgescheept zaten, zijn we er nog steeds niet over uitgepraat. En nadat we al jaren vrienden waren, bleek je ook nog eens het allerleukste zusje te hebben (maar dat vermoedde ik al). Dank voor je steun, ook met onze verhuizing naar Duitsland, je vriendschap, en het opnemen in je familie.

Judith, lieffie, het mooiste van dit boekje komt van jou. Dankjewel voor alle liefde, steun, het maken van de cover, en jouw vermogen om wanneer ik echt gestresst was om alles af te ronden, me toch weer even goed te laten voelen. Dankjewel dat je met me mee bent gegaan naar Duitsland om daar een nieuw avontuur te beleven. Ik hou van je.