In-vitro calcificatie van polyetherurethanen
Citation for published version (APA):
Wouters, H. F., & van Steenhoven, A. A. (1985). In-vitro calcificatie van polyetherurethanen. Technische Hogeschool Eindhoven.
Document status and date: Gepubliceerd: 01/01/1985
Document Version:
Uitgevers PDF, ook bekend als Version of Record
Please check the document version of this publication:
• A submitted manuscript is the version of the article upon submission and before peer-review. There can be important differences between the submitted version and the official published version of record. People interested in the research are advised to contact the author for the final version of the publication, or visit the DOI to the publisher's website.
• The final author version and the galley proof are versions of the publication after peer review.
• The final published version features the final layout of the paper including the volume, issue and page numbers.
Link to publication
General rights
Copyright and moral rights for the publications made accessible in the public portal are retained by the authors and/or other copyright owners and it is a condition of accessing publications that users recognise and abide by the legal requirements associated with these rights. • Users may download and print one copy of any publication from the public portal for the purpose of private study or research. • You may not further distribute the material or use it for any profit-making activity or commercial gain
• You may freely distribute the URL identifying the publication in the public portal.
If the publication is distributed under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license above, please follow below link for the End User Agreement:
www.tue.nl/taverne Take down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us at: openaccess@tue.nl
providing details and we will investigate your claim.
IN-VITRO CALCIFICATIE VAN POLYETHERURETHANEN
Afstudeerverslag van
H.F. Wouters
Afstudeermentoren : Ing. L.H.G. Wouters Ir. F. Driessen
Projectleider : Dr. ir. A. A . van Steenhoven
April 1985
Op de Technische Hogeschool Eindhoven in men bezig een volledige vliesklepprothese te ontwikkelen als vervanger voor een aortaklep.
Elastische polyetherurethanen zijn in principe de meest geschikte materialen om de vliezen van te maken. Zij kunnen op relatief eenvoudige wijze gemaakt worden.
calcificatie vertonen. Dit probleem doet zich vooral voor bij buigende of op andere wijze elastisch bewegende delen. Er wordt onderscheid gemaakt tussen twee typen calcificatie. Metastatische calcificatie is een gevolg van een algehele afwijking van de calcium- of fosfaat gehaltes in het lichaam. Dystrophische calcificatie wordt veroorzaakt door locale afwijkingen van deze gehaltes. Er wordt aangenomen dat calcificatie van kunststofimplantaten dystrophisch van aard is. Er zijn een groot aantal invloedsfactoren, die calcificatie bevorderen dan wel de kans erop verminderen. Bijvoorbeeld de diersoort, de leeftijd en materiaaleigensehappen spelen een rol.
Beschadiging van weefsels en celversterf kunnen calcificatie hitieren, doordat er bij celversterf calcium en fosfaat vrijkomt. Er wordt aangenomen dat er allereerst een amorf calciumfosfaat neerslaat dat langzaam omgezet wordt in hydroxyapatiet. Daar bloed en andere lichaamvloeistoffen meta- stabiel zijn ten opzichte van deze verbinding zullen aldus eenmaal gevormde kristallen verder uit kunnen groeien. Dit is bovendien onder fysiologische omstandigheden het meest stabiele calciumfosfaat.
Bij de experimenten is uitgegaan van de theorie dat er geen bloedcomponenten of andere deeltjes uit het lichaam nodig zijn om
calcificatie te kunnen veroorzaken. Calcificatie wordt verodersteld een fysisch-chemisch proces te zijn. Een aantal stroken Biomer (Ethicon) werden in een speciaal daarvoor ontwikkeld apparaat op buiging belast in een medium dat meta-stabiel is ten opzicht van hydroxyapatiet. De stroken werden in verschillende mate belast.
relatie tussen de mate van verkalking en de grootte van de buigrekken is niet gevonden. De blanco's vertonen nauwelijks of geen verkaiking, de belaste vliezen in de range van buigrekken wel.
Een probleem bij kunststofimplantaten is dat ze na verloop van tijd
Daar dit afstudeerverslag in feite een afsluiting betekent voor een vierjarige beroepsopleiding wil ik dit voorwoord gebruiken om die mensen t e bedanken die voor mij een steun waren in die vier jaren.
Met name wil ik noemen Leo Wouters, mijn afstudeermentor en ex-
stagebegeleider voor de vele hulp op theoretisch en practisch gebied en voor de vele lol. The0 van Duppen, de beheerder van het laboratorium waar ik afstudeer, onder andere voor de heerlijke koffie. Cor van der Vliet, mijn stagebegeleider bij de Hoogovens. Evelien Hobeyn voor haar morele steun. Verder mijn huisgenoten voor een plezierig wonen. Al die leraren die hun lessen wel leuk en interessant konden brengen.
Niet op de laatste plaats mijn ouders en alle anderen die veel voor mij gedaan hebben.
Mijn afstudeerwerk werd verricht in het kader van het interafdelingsproject "Hartklepprothesen' van de Technische Hogeschool Eindhoven.
Eric Wouters April 1985
1 1 . 1 1 . 2 1 . 3 2 2 . 1 2 . 2 3 3 . 1 3 . 2 3 . 3 3 . 4 3 . 5 3 . 5 . 1 3 . 5 . 2 3 . 5 . 3 3 . 5 . 4 3 . 5 . 5 3 . 5 . 6 3 . 5 . 7 4 4 . 1 4 . 2 4 . 3 4 . 4 4 . 5 4 . 6 4 . 6 . 1 4 . 0 . 2 4 . 5 . 3 4 . 0 . 4 4 . 6 . 5 Titel Samenvatting Voorwoord Inhoud
L i j s t van illustraties en tabellen
1 inleidins Algemeen 1 Probleemstelling 2 Indeling verslag 3 4 4 4 Polvurethanen Materiaalkeuze Chemie en bereiding 6 6 6 7 7 8 8 10 l i 1 2 1 3 1 3
i s
Calcificatie Geschiedenis Algemeen Netastatische calcificatie Dys trophische calcificatieMechanismen van Dystrophische calcificatie Inleiding(opi0sbaarheid van fosfaten) De rol van mitochondria en celversterf De rol van matrix-vesicles
Calcium en fosfaat concentrerende mechanismen Het verwijderen van Calcificatie inhibitoren Thermische effecten
F y s i c li
-
chem i s c he pro c 2 s 5 en41 0 r Invloedsfactoren bij calcificatie
Di e I: so0 r t
Leef tijd
Hormonale invloed An t, i c 0a.g u 1 ant i a
Locale hemodynamica en schuifspanning Invloed van materiaal eigenschappen Inleiding Oppervlaktestructuur Oppervlaktelading Chemische samenstelling Me c han i s c he be 1 as t i ng 1 6 1 6 17 1 7 1 7 17 1 7 18 I 8 1 9 19
5.2 5 . 3 5.4 5.5 5.5.1 5.5.2 6 6 . 1 6.2 6 . 2 . 1 6.2.2 6 . 2 . 3 6.2.4 6.2.5 6.3 6.4 Bijlagen I I1 22 Kwantitatieve bepaling van fosfaat
23 Diktemeting van het vlies
24 Buigapparaat Buigexperimenten 26 26 Algemeen 26 Dimensionering van de instelgrootheden
Experimenteel 28
28 Bet maken van vliezen
Buigexperimenten 31 3 1 Experiment I 31 Experiment II 33 Experiment 111 37 Experiment V 38 Conclusies 39 Voortgang Experiment IV 36 Resultaten röntgenfluorescentie Resultaten röntgendiffractie
Illustraties
Nr. Titel
1
2
Een Xenocraftklep(Hancock)
Enkele mechanische kleppen A Starr-Edwards
5 St.Jude Medical C Bjork-Shiley 3 Allophanaat en Biureet bruggen
4 Activiteitsproducten versus pH 5
6
7 Doorsnede van een mitochondrion
8 Adenosine trifosfaat (ATP) 9 Omzetting van ATP tot ADP
10 Algemene structuur van zure fosfolipiden 1 1 Gamma-car boxyg lutaminezuur r es t
12 Basisstructuur van collageen
13 Geschematiseerde opbouw van collageenvezels 14 A Coumarine en B Vitamine K
15 Schema diktemeting vlies
16 Delen van het buigapparaat A Aandrijving Activiteitsproduct van H3P04 versus Ca(OHI2 Schematische voorstelling van een dierlijke cel
B Plaats van platen, tandwielen en tandheugels.
C Inklemming stroken 17 Parameters bij buigen van stroken
18 Beweging van de platen
19 Afzetting op de stroken. Vergroting 200x en 40x.
20 Opnamen van de kalkafzettingen op de stroken gemaakt inet behulp van een electronenmicroscoop (vergroting 5 1 0 0 ~ ) .
Blz. 2 2 5 9 9 10 10 TO 11 12 12 14 14 17 24 24 25 26 33 37 Tabellen 1 2 3 4 5 6 7 8 9
-Oplosbaarheden van calciumfosfaat verbindingen 8
Calcium- en fosfaatgehaltes in serum van verschillende 16 zoogdieren
Druppeloppervlakken van polyurethanen van 21-12-1983 29
Fosfaatgehaltes van media (exp.
11)
32Tijdsduur van cafcificatieverschijselen 21
Instelparameters en fosfaatgehaltes voor exp II 33
Fosfaatgehaltes in media (Exp. III) 3 4
Parameters en fosfaatgehaltes bij experiment IV 35
Hoofdstuk
1
Inleidinq1 . 9 Alqemeen
Een van de belangrijkste oorzaken van sterfte in onze huidige
maatschappij zijn de hart- en vaatziekten. Om onvoldoende functionerende hartkleppen te vervangen zijn er een aantal hartklepprothesen op de markt gebracht
.
Bij xenograft vliesklepprothesen zijn de vliezen opgehangen in een polypropeenframe, waaraan een hechtrand is bevestigd.
Het frame is bedekt net polyester. De vliezen kunnen onder andere zijn gemaakt van dura- mater (hersenvlies) of pericardweefsel (hartzakje). Ook kan een metglutaraldehyde behandelde aortaklep van een varken gebruikt worden fRancockf (Zie figuur 1 ) . Een nadeel van deze kleppen is de korte levensduur.
Bovendien treedt bij dit type kleppen regelnatig calcificatie op.
Bij gebruik van mechanische kleppen (Zie figuur 2 ) worden bloedcellen en plaatjes beschadigd, zodat antistoflingsmiddelen noodzakelijk zijn. Deze middelen hebben op den duur schadelijke bijwerkingen. Een tweede nadeel is de psychische befasting, veroorzaakt door het duidelijk hoorbare tikken van de klep.
Aan de T.H.Eindhoven afdelinç werktuigbouwkunde probeert men een volledige vliesklepprothese te ontwikkelen met kunststofvliezen. De ontwerpeisen komen voort uit studies aan de natuurlijke aortaklep en
bestaande vliesklepprothesen. De resultaten van deze studies worden verwerkt met behulp van een rekenmodel. Als materiaalsoort voor deze te ontwikkelen klep is voorlopig gekozen voor de polyetherurethanen.
Figuur i Een Xenograftklep Figuur 2 Enkele mechanische kleppen
(Rancock) A Starr-Edwards B St. Judr medical
C Bjork-Shiley
4 . 2 Probleemstellinq
Een belangrijk probleem bij het gebruik van kunststoffen voor implantatie is calcificatie. Calcificatie is het afzetten van vaste verbindingen van calcium en fosfaat op het materiaal. Dit is vooral een probleem bij
toepassing voor langere tijdsduur, omdat calcificatie pas op treedt na weken
vf mandan. !has bet verkalkingsproces worden de materialen stijver en de
vaak scherpe kristallen beschadigen bovendien het materiaal. Calcificatie treedt meestal op
in
gebieden die aan grote wisselende buigingen of rekken blootgesteld worden. Verder spelen fysiche en chemische eigenschappen van het materiaal een grate rol. Een deel van het onderzoek betreft:-Het effect van wisselende buigbelasting op A ~ateriaal(scheurvorming)
3 Verkalking -De ruwheid van het oppervlak in verband met de verkalking.
1.3 Indelincr verslaq
In het tweede hoofdstuk wordt iets verteld over polyurethanen
De hoofdstukken drie en vier gaan over calcificatie en de invloedsfactoren
op dit verschijnsel. Hoofdstuk vijf beschrijft de gebruikte technieken en apparatuur. Het laatste hoofdstuk behanàeidt de experimenten en omvat de conclusies en aanbevelingen.
Hoofdstuk 2 Polvurethanen
2 . 1 Materiaalkeuze
Men probeert de vliezen van de te ontwerpen klep te maken van polyetherurethanen. Er zijn verschillende redenen voor de keuze van dit soort materialen: (Wouters 1983)
--Polyetherurethanen worden reeds op vrij grote schaal toegepast in
biomedische apparatuur. Zij worden vooral gebruikt indien er sprake is van bloed-materiaal contact.
polyetherurethanen in de handel. Van deze materialen zijn de eigenschappen uitvoerig onderzocht en in de literatuur beschreven.
--Zij zijn op relatief eenvoudige wijze te maken. Er zijn geen hoge drukken of temperaturen nodig, hoogstens 80 OC en atmosferische druk. Bovendien is
het mogelijk ze in een zeer breed scala van fysische eigenschappen te maken. Men kan dus de eigenschappen aanpassen aan de gestelde eisen. --Zij zijn
h
het algemeen goed bestand tegen wisselende buigbelasting enhebben een hoge weerstand tegen inscheuren.
--Het is daarnaast misschien mogelijk om vezelversterking met polyurethaan vezels toe te passen. Dit hangt sareen met de structuur. Of dit inderdaad mogelijk is en welke vezels geschikt zijn dient nog onderzocht te worden. --Er zijn een aantal speciaal voor biomedische toepassingen ontwikkelde
2 . 2 Chemie en bereiding
Polyurethanen worden bereid uit een diisocyanaat en een diol [Bayer 1937):
O=C=N-R-N=C=O f H-O-R'-O-H -P t-O-R'-O-C-N-R-N-C-I,
O #
4 8
Diisocyanaat Diol Polyurethaan
Voor biomedische toepassingen zijn vooral de gesegmenteerde
pofyurethainrubbers geschikt. Daarbij wordt bij de bereiding uitgegaan van lineaire polyesters of pofyethers met eindstandige hydroxyl groepen. Vanwege de hydrolyseerbaarheid van de esterbindingen vallen polyesterurethanen a f . Vanaf 1966 gebruikt men de poìyetherurethanen (Boretos 1 9 8 1 ) .
uit van een dubbele hoeveelheid diisocyanaat en een polyether, voorgesteld doos 8-û-Peth-O-H, die reageren tot een prepolymeer met isocyanaat
einägroepen.
Het prepolymeer f a a t men vervolgens reageren met een diol o f een diamine ('chain-extension"). De reacties zijn dan als volgt:
HO-Peth-OH +2 O=C=N-R-N=C=O + O=C=N-R-N-C-û-Peth-O-C-N-R-N=C=O +i 4
HZt
O H Overmaat O=C=N-&N=C=O+
H ~ N - R I i - N H ~ + Prepolymeer Diamine DiisocyanaatNadeel van deze methode is dat
Prepolymeer diisocyanaat
Polyetherureumurethaan
er
reactieve waterstofgroepenontstaan in zowel prepolymeer als eindproduct. Deze groepen kunnen reageren met overmaat isocyanaat.
Er
treedt dan chemische vernetting op.Er worden allophanaat en bimeet bruggen gevormdlfig 3 ) .
9
B
?=O
c=o
R-N-C-û-R 1 'n/s- -A&- R-#-C-$-C-CAP
.-H
w
k
Tiguur 3 Ailophanaat en biureet bruggen.
De vernetting is nadelig, omdat de weerstand tegen buigvermoeing afneemt en de oplosbaarheid sterk wordt verminderd,waardoor het onmogelijk wordt het materiaal uit oplossing te verwerken. Door de
reactieomstandigheden gunstig te kiezen kan het optreden van deze chemische "crosslinking" bijna geheel worden voorkomen(Stenzenberger 39793.
Hoofdstuk 3 Calcificatie
3 . 1 Geschiedenis
Het probleem van calcificatie van geimplanteerde kunststoffen is pas vrij recent naar voren Gekomen, aangezien pas sinds een vijftiental jaren experimenten kunnen worden gedaan met kunststofprothesen over een vrij lange termijn. Er is gebleken dat calcificatie van kunststofimplantaten pas een rol speelt als het geimplanteerde object voor langere tijd in het lichaam verblijft. Een van de eerste toepassingen van kunststofprothesen, waarbij het probleem van verkalking kwam kijken, was de vervanging van zachte weefsels door
poly(2-hydroxyethyl methacrylaat)-spons. Deze zachte kunststof bleek al vrij snel te verharden door kalkafzetting in de spuns(Winter 1 9 7 3 ) . Er is daarna wel onderzoek gedaan naar de toepassing van dit materiaal als
botgroeistimUPator(Hol1inger 1982, Woodward 1 9 8 1 ) .
Toen het mogelijk werd om kunstharten en andere bloedpompen gedurende langere tijd te laten functioneren, bleek dat de bewegende delen verkalkten. Pas sinds die tijd is het onderzoek naar verkalking van kunststoffen
op gang gekomenlloleman a 1981, Anderson 1981, Lian 1981, Whalen 1980). Ook vliesklepprothesen, zoals de pericard en de dura materklep, bleken gevoelig voor kalkafzetting. De vliezen wesden stijver, de levensduur werd verkort doos de hogere belastingen en beschadigingen door de kristallen
fiulaciver 1974, Bruck 2981, Hennig 1981, Harasaki 1979, Wisman 1 9 8 2 ) .
goed
3 . 2 Alcremeen
Calcificatie is het verschijnsel dat in of op zachte weefsels een vaste verbinding van calcium en fosfaat wordt afgezet. In alle gevallen is het eindproduct hydroxyapatiet, eventueel in combinatie met andere ionen. Hydroxyapatiet is een kristallijne verbinding van calcium, fosfaat en hydroxide. Calcium en fosfaat zijn aanwezig in bloed en andere
lichaamsvloeistoffen. Beiden zijn nodig voor de botvorming. Calcium speelt verder een rol bij de bloedstolling en allerlei enzymatische reacties. Fosfaat dient als buffer en komt voor in een aantal verbindingen, zoals D.N.A., A.T.P. en fosfolipiden. Onder normale omstandigheden zal
calcificatie alleen optreden op plaatsen waar dit nodig is voor botvorming. Als gevolg van ouderdom of ziekte treedt echter ook verkalking op waar dit normaal niet gebeurt, zoals op slagaderwanden(atherosclerose1 en op
natuurlijke hartkleppenflong 19813. De dikte van de afzetting kan oplopen tot
zo'n
3 millimeter(Pierce 1980). Op geimplanteerde kunststoffen wordt ook vaak kalk afgezet. Er wordt onderscheid gemaakt tussen twee soorten3 . 3 Metastatische calcificatie
Deze vorm van verkalking het gevo,g van een te hoog calcium- of fosfaatgehafte in de lichaamsvloeistoffen door het gehele lichaam. Een te hoog calciumgehalte kan veroorzaakt worden door een afwijkende werking van de schildklier of de bijschildklier. Ook vitamine D vergiftiging en de ziekte van Addison(afbraak van het bijnierschors) kunnen dit effect hebben. Een te hoog fosfaatgehalte kan veroorzaakt worden door slechte werking van de bijschildklier of de nieren(Woodward 1 9 8 1 ) . Alhoewel er sprake is van verhoogde gehaltes door het gehele lichaam, treedt verkalking niet overal op. Halk wordt voornamelijk afgezet in longen, maagwand en nieren. Bij kunststofimplantaten is er over het algemeen geen sprake van algemene
verhoging van het calcium- of fosfaatgehalte.
Er
wordt daarom aangenomen dat verkalking van kunststoffen niet metastatisch van aard is.3 . 4 Dvstroohische calcificatie
Dystrofisch verkalking is een gevolg van locale verhogingen van het calcium- of fosfaatgehalte. Dit soort verkalking wordt meestal aangetroffen
op plaatsen waar weefselbeschadiging is opgetreden en daarmee gepaard gaande celsterfte. Bijvoorbeeld beschadigingen aan de aorta, kransslagaders en de aortaklep. Brandwonden en injectieplaatsen, waar bloedingen of
weefselversterf zijn opgetreden kunnen op deze manier verkalken. Ook de aanwezigheid van lichaamsvreemde deeltjes, zoals wormen, wormeieren of asbestdeeltjes, kunnen aanleiding geven tot dystrophische verkalking. Er wordt aangenomen dat calcificatie van kunststoffen dystrophisch van aard is, daarom worden alleen mechanismen die tot dit soort calcificatie leiden
verder beschreven (Woodward 1981, Nose 1 9 8 1 ) . In tabel 3 aan het einde van hoofdstuk 4 op bladzijde 21 worden een aantal gevallen van dystrophische calcificatie genoemd
om
een indruk te geven van de tijdsfactor.3 . 5 Mechanismen van dvstrowhische calcificatie 3.5.1 Oplosbaarheid van fosfaten
In het bloed voorkomend calcium bestaat voor 50% uit vrije ionen, de rest is gebonden aan eiwitten en fosfolipiden. Fosfaat komt bij normale zuurgraad (pH=7,4) voor 80% voor als monowaterstoffosfaat en voor ongeveer 20% als diwaterstoffosfaat. Slechts een zeer klein gedeelte komt voor als fosfaatfCRC 1 9 6 8 ) . Er zijn een aantal slecht oplosbare verbindingen
tussen de in het bloed aanwezige ionen (Zie tabel
1 ) .
verbinding oplosbaarheid (g/i)
Calciumfosfaat (Whitlockite) Calciummonowaterstoffosfaat (Brushite) ûctafosfaat Calciumdiwaterstoffosfaat Hydroxyapatiet 0,02 (25 OC) 0,32 ( 2 5 OC 7 , 10-3 ~ 18,O (30 OC) formule mogelijk
Tabel 1 Oplosbaarheden van Calcium-fosfaatverbindingen (Lange 1973)
Mineralisatie van skeletweefsels gaat gepaard met de afzetting van amorf materiaal. Dit wordt vervolgens omgezet in hydroxyapatiet. De brutoforxuule is CaiO(P04)6(OH)2.
hoeveelheden in het hydroxyapatiet aanwezig te zijn. Onder fysiologische omstandigheden(pM=7,4) is dit thermodynamisch de meest stabiele
fosfaatverbinding (Robertson 1973).De oplosbaarheid van hydroxyapatiet in water is zeer gering(Woodward 1 9 8 1 , Anderson 1981, Clincher 1959). Onderzoek wees uit dat het in eerste instantie gevormde neerslag de stoichiometrie van ostafosfaat heeft(Robertson 1 9 7 3 1 . Voor de verschillende fosfaten werd het activiteitenproduct bepaald bij liet begin van spontane precipitatie als functie van de pH. Het activiteitenproduct van octafosfaat is in het pH gebied 6,5-8,s het stabielst(Zie figuur 4 ) . De grafiek van het
activiteitenproduct van H3Pû4 versus dat van Ca(OH)2 blijkt overeen te stemmen met een molaire CaJP verhouding van 7,94/6(Zie figuur 51, die van octafosfaat is 8/6.
De waarden voor deze grafiek worden berekend aan de hand van pH metingen ten tijde van beginnende precipitatie en de brutosamenstellingen van het systeem
(Robertson 1 9 7 3 ) . Op grond van deze feiten concludeert Robertson dat octafosfaat in eerste instantie neerslaat.
lagere pH's (pH(5) instabiel is en weer gaat oplossen. Dit komt in bloed niet vooor. Het apatiet zal echter niet geheel oplossen omdat er
monowaterstoffosfaat neerslaat en een diffusiebarriere vormt voor de ionen (Francis 1 9 6 5 ) . Eveneens blijkt dat hydroxyapatiet met hoge gehaltes aan organisch materiaal, zoals in botten en tanden, beter oplossen dan
synthetische apatiet. Vermoedelijk wordt dit veroorzaakt door complexvorming.
zijn ten opzichte van deze verbinding. Het onderzoek naar calcificatie richt zich dan ook voornamelijk op de initiatiemechanismen van het
kristallisatieproces. Alle beschreven mechanismen gaan uit van
gebeurtenissen waaarbij plaatselijk de gehaltes van calcium o f fosfaat dusdanig worden verhoogd dat een amorf calciumfosfaat kan neerslaan en vervolgens worden omgezet in hydroxyapatiet.
Verdere onderzoekingen brachten aan het licht dat hydroxyapatiet bij
Er is gebleken dat de extracellulaire vloeistof en bloed metastabiel
'% c. -. [r-C 97) --%% s-.: , 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 Figuur 4 Activiteitsproducten Verschi 1 lende fosfaten versus pH (Robertson 19731
Figuur 5 Activiteitsproducten
H3Pü4 tegen Ca(OH12
3 . 5 . 2 De rol van mitochondria en celversterf
Waar sprake is van celversterf of beschadiging van cellen kan dystrophische verkalking optreden. Mitochondria blijken hierbij een belangrijke rol te spelen. Mitochondria zijn celorganellen met als
voornaamste functie de energieproductie. Daartoe wordt glucose enzymatisch afgebroken. De vrijkomende energie wordt opgeslagen in de verbinding ATP
(Adenosine trifosfaat). Zie de figuren 6 t/m 8
I
,-
Fig. 0 sfhrmstwhc vrnolei- ling van een typssh dteriijke cel. Oe oaydatiertact~u. die de cel van
energie voorzen, veriopn in Je mi~uchonúrrï .
ch: homhpx op hcr endoplavrna-
iiwh reticuiurn ztjn ác ribowmert waar dc crwitsvnthew plaatsvindt
f i g . ? SchematiEche doorsnede door een nitochondrion
Daarnaast zijn de mitochondria nauw betrokken bij fysiologische functies, die geregeld worden door calcium transport. Verscheidene enzymreacties in de cel worden geregeld met calciumionen uit de mitochondria.
Ook fosfaat is in ruime mate in de mitochondria aanwezig, het wordt onder andere gebrukt voor de productie van ATP en fosfolipiden. Treedt er nu beschadiging van de cel op dan nemen de mitochondria zeer snel calcium en fosfaat op. De concentraties kunnen hierbij tot zes maal de gebruikelijke waarde oplopen. Door deze hoge concentraties kan amorf calciumfosfaat neerslaan en overgaan in hydroxyapatiet. Na afbraak van het omgevende membraan kan hierdoor verkalking geïnitieerd worden.
3 . 5 . 3 De rol van matrix-vesicles (blaasjes)
Matrix-vesicles zijn submicroscopische, extracellulaire deeltjes, omgeven door een membraan. Zij spelen een belangrijke rol. bij de vorming van bot, tanden en kraakbeen. Deze deeltjes worden echter ook aangetroffen in verkalkingen in de aorta en de aortaklep. Het membraan schijnt nauw
betrokken te zijn bij de initiatie van verkalking. Daarvoor zijn een aantal hypothesen opgesteld. De eerste is dat er in het membraan enzymen aanwezig zijn die:
1 Fosfaat vrijmaken door hydrolyse van fosfaatesters en daardoor de 2 Pyrofosfaten zoals ATP hydrolyseren (fig. 9 1 Deze verbindingen worden 3
fosfaatconcentratie verhogen.
over het algemeen beschouwd als inhibitoren van calcificatie.
Een naar binnen gericht calcium of fosfaat katalyseren waardoor binnen in de deeltjes de concentraties stijgen. In de matrix-vesicles zijn
inderdaad enzymen, zoals fosfatases en ATP-ases aangetoond, die boven genoemde reacties kunnen katalyseren.
ATP
ÒH OH
Figuur 9 Omzetting van ATP tot ADP
0 1 1 ÒH
0-
i
3. HC-?-OH
8
Een tweede mogelijkheid is dat calcium wordt geconcentreerd doordat er verbindingen op het membraan aanwezig zijn, die een grote affiniteit voor calcium vertonen, zoals zure fosfolipiden (zie figuur 1 0 ) . Tenslotte kan het
membraan ook voorkomen dat gevormde kiemen weer oplossen. De eerste kalkafzetting wordt binnen in de deeltjes aangetroffen en groeit uit tot buiten het membraan, daar komen ze dan in een metastabiel medium en kunnen verder uitgroeien (Anderson 1981).
3 . 5 . 4 Calcium- of fosfaatconcentrerende mechanismen
Kristallisatie kan optreden als plaatselijk de calcium- of fosfaat concentratie verhoogd wordt. Kunststofimplantaten zouden een dergelijke verhoging kunnen bewerkstelligen door aan het oppervlak geadsorbeerde verbindingen of door de chemische structuur van het materiaaal zelf. Zo kunnen geadsorbeerde zure fosfolipiden, vanwege hun grote affiniteit voor calcium, de concentratie ervan plaatselijk verhogen. Ook eiwitten die gamma- carboxyglutaminezuurrestgroepen bevatten, zouden zo de concentratie kunnen verhogen (figuur ll)(Lian 1981). Echter uit in-vitro experimenten is
gebleken dat deze verbindingen kristallisatie uit metastabiele oplossingen juist tegenwerken (Lentz 1982 a).
CiT*-O-K R,R’ : v e t z u r e n B
CE
-8-R’ t,OR
c:~-o-”-o-R
’
“o
Figuur 10Algemene structuur Figuur 3 1 Gamma-carboxyglutaminezuurrest van zure fosfolipiden
Collageen is een duidelijk voorbeeld van een materiaal dat door zijn chemische structuur calcificatie kan initieren. Collageen is een
vezelvormend eiwit, dat een versterkend netwerk vormt in de huid en het belangrijkste bestanddeel is van pezen en bindweefsel. Verder bestaat bot voor 30% uit collageen. De basisstructuur van collageen is een drievoudige spiraal. De spiralen zijn verbonden door waterstofbruggen en zeer sterke covalente bindingen. Hierdoor ontstaan sterke starre vezels (Zie figuur 12). Vrijliggende vezels zoals die voorkomen in botten blijken verkalking zeer effectief t e Ini%ieren. Veel collageenvezels vertonen een bandenpatroon met een periodiciteit van 640
8 ,
deze periodiciteit is bij verkalking zeer belangrijk (zie figuur 1 3 ) . Als deze periodiciteit veranderd wordt door bijvoorbeeld herkristallisatie, dan wordt ook de initierende werking opgeheven(G1imcher 1959). Ook door reacties met verbindingen alsformaldehyde of glutaaraldehyde kan de neiging tot verkalking onderdrukt worden(Urist 1966, Lentz 1982 a en b). Ook elastine, een belangrijk
bestanddeel van zachte elastische weefsels, blijkt groepen te bevatten die specifiek calcium kunnen binden. Normaal zijn zowel collageen als elastine bedekt met een laag endotheelcellen. Verkalking zal dus alleen optreden als dit laagje plaatselijke beschadigd of afwezig i s .
Ook bij kunststofimplantaten moet rekening gehouden worden met
aanwezigheid van calciumbindende functionele groepen. Een verhoging van de fosfaatconcentratie, zou veroorzaakt kunnen worden door geadsorbeerde fosfatases. Dit zijn enzymen die fosfaat vrijmaken uit fosfaathoudende verbindingen, zoals fosfaatesters, ATP en pyrofosfaten.
3 . 5 . 5 Het verwijderen van calcificatie inhibitoren
In het bloed aanwezige pyrofosfaten zouden als inhibitor van
calcificatie kunnen fungeren. Wanneer zo'n pyrofosfaat afgebroken wordt, door bij voorbeeld aan het materiaal geadsorbeerde fosfatases, zal
calcificatie minder tegengewerkt worden, bovendien komt bij de afbraak ook nog fosfaat vrij. Door de vertraging van de omzetting van amorf
calciumfosfaat naar hydroxyapatiet werkt ATP als inhibitor. Calciumfosfaat is beter oplosbaar, dan hydroxyapatiet, zodat de kans dat een gevormde kiem weer oplost groter is dan in afwezigheid van ATP. ATP wordt door ATP-ase tot ADP (Adenosinedifosfaat) en fosfaat omgezet (Anderson 1 9 8 1 ) .
3 . 5 . 6 Thermische effecten
In vitro studies wijzen uit dat amorf calciumfosfaat bij hogere temperaturen minder oplosbaar is en dat de omzetting naar hydroxyapatiet sneller verloopt. Sterke buiging van het materiaal kan plaatselijk door optreden van hysterese de temperatuur doen stijgen. Bierdoor zou
calcificatie kunnen optreden. Duidelijke bewijzen voor deze theorie zijn er echter niet(Cofeman 1 9 8 1 b). Als er sprake is van bloed-materiaal contact is het zeer onwaarschijnlijk dat de temperatuur verhoogd wordt. Het materiaal wordt immers voortdurend gekoeld door het langsstromend bloed. Dat er calcificatie optreedt op plaatsen die aan buiging of rek onderhevig zijn, kan ook het gevolg zijn van ontstane beschadigingen aan het materiaal of aan de eventuele coating. In kleine holten kunnen thermische effecten wel een rol spelen omdat de warmteafgifte naar het bloed wordt belemmerd.
Figuur
12
Basisstructuur van collageenF i g u u r 13 Geschematiseerde opbouw van collageenvezels
De b a s i s s t r u c t u u r v a n ~ G col l a q e e n i s de d r i e - @ voudiqe c o l t a g e e n s p i - r a a l . a d e
G e s c h e m a t i s e e r d e oobouw. van c o l lageenbunde I s . !Ian beneden n a a r b o v e n t r e e d t e r i n d e z e f i - g u u r e e n v o o r t s c h r i j d e n d e v e r k l e i n i n n 00 vari de d r i e v o u d i g e c o l l a g e e n s p i r a a l i n e t o t de e r u i t opgebouwde b u n d e l s d i e e e n v e r s t e r k e n d n e t w e r k vormen i n a l l e r l e i w e e f s e l s . A f b e e l d i n c a g e e f t e e n 3OOOO-voudige v e r g r o t i n g v a n c o i l geen i n k a l f r h u i d .
3.5.7 Fysisch-chemische processen
Calcificatie is karakteristiek voor buigende of op andere wijze bewegende materialen (Bruck 1 9 8 1 ) . De voornaamste gemeenschappelijke eigenschappen van deze materialen zijn porositeit en het vermogen om
verschillende bloedcomponenten te ab- of adsorberen. Waarschijnlijk wordt de ab- of adsorptie veroorzaakt door het openen en sluiten van kleine porieen. De absorptie hangt van veel factoren af, zoals de moleculaire en de
supramoleculaire structuur. Deze zijn weer afhankelijk van factoren als chemische samenstelling, molecuulgewicht
en
molecuulgewichtsverdeling, vertakking en vernetting. De opgenomen bloedcomponenten kunnen weer calcificatie initieren doordat ze specifiek calcium kdnnen binden.Aan de universiteit van Utah zijn een aantal in-vitro experimenten gedaan met Biomer (Ethicon) membranen. Er zijn statische experimenten gedaan. De hierbij ontstane afzettingen leken qua vorm en afmetingen sterk op afzettingen die op bloedpompen bij dierexperimenten zijn aangetroffen. Daarom wordt aangenomen dat e% voor calcificatie geen bloedcomponenten nodig zijn. Calcificatie wordt verklaard aan de hand van fysich-chemische
processen die zich afspelen in kleine holten. De vorm van de afzettingen wees erop dat ze inderdaad in een holte begonnen en naderhand over de rand heen verder gegroeid zijn. En de holten van het materiaal zou de
concentratie van calcium of fosfaat verhoogd kunnen worden door slechte stofuitwisseling naar de bulk van het bloed toe. Ook zou in deze holten de
pH sterk kunnen veranderen (Rousseau 1983). De mate van belasting zou natuurlijke een grote rol kunnen spelen, omdat deze de mate waarmee zich eventuele porieen zich open en sluiten beinvloed.
Hoofdstuk 4 Invloedsfactoren bii calcificatie
4.1 Diersoort
Voor het uittesten van nieuwe biomedische producten worden vaak kalveren gebruikt. Verkalking van kunststofoppervlakken treedt bij deze dieren erg gemakkelijk op. Bij gebruik van schapen of geiten treedt
verkalking relatief veel later en veel minder hevig op (Andrade 1979, Imachi 1981). Men neemt daarom aan dat dystrophische verkalking diersoort gebonden is. Sommige onderzoekers nemen aan dat het vrij hoge calcium- en
fosfaatgehalte in het bloed van kalveren van invloed is op de
verkalking (Wisman 1982, Pierce 1980, Whalen 1980, Coleman 1981b, Andrade 1979). Het verschijnsel is niet alleen afhankelijk van de concentraties, zoals blijkt uit tabel 2. Het calciumgehalte in bloed van kalveren, schapen en geiten is nagenoeg gelijk, terwijl het fosfaat gehalte bij schapen en geiten zelfs hoger is dan bij kalveren. Vermoedelijk speelt het verschil in
I
leef i j d ~ ~ een rol.
m g Ca in 100ml mg fosfaat in 100ml Diersoort Mens kalf Geit Schaap Varken Paard Muis
Tabel 2 Calcium en phosfaat gehaltes in serum van verschillende zoogdieren(Dittmer 1961).
4 . 2 Leeftijd
Over het algemeen wordt aangenomen dat jonge dieren eerder
calcificatie te zien zullen geven dan volwassen dieren. Dit vanwege de veel
hûyere ûmzettingssnelheden Y U E c a l c i m en fncfaat, nodig voor de botgroei.
3ovendien blijken de gehaltes van beide stoffen in het bloed van jonge dieren hoger te zijn dan bij volwassen dieren (Pierce 1980). Ook bij kinderen treedt eerder verkalking op dan bij volwassenen. Daarom worden bijhen geen vliesklepprothesen, zoals de HancockkPep geimplanteerd. Binnen korte tijd treedt een sterke verkalking van de vlieskleppen op. Hierdoor wordt een goed functioneren onmogelijk (Bruck 1981, Lentz 1982a, Nose 1981).
4.3 Hormonale invloed
De calcium- en fosfaatgehaltes in het bloed worden geregeld door de hormonen calcitonine, het parathyroide hormoon en vitamine D (Coleman
1981b). Afwijkingen in gehaltes van deze hormonen kunnen de oorzaak zijn van concentratieverhogingen door het hele systeem. Calcificatie die hierdoor optreedt is metastatisch van aard (Zie $ 3.2.2). Er wordt echter aangenomen dat verkalking van kunstofoppervlakken dystrofisch van aard is. Veranderde hormoonspiegeis zullen waarschijnlijk wel een ongunstige invloed uitoefenen, doordat de groei van reeds aanwezige kiemen wordt bevorderd. Zij zullen echter niet de oorzaak zijn van dystrofische verkalking van kunststoffen
(Nose 1 9 8 1 ) .
4.4 Anticoagulantia
Het gebruik van anticoagulantia (antistollingsmiddelen) zoals
eoumarine-derivaten blijkt calcificatie in sterke mate te verminderen. Deze middelen verminderen de vitamine X afhankelijke productie van eiwitten die calcium kunnen binden. Coumarine en vitamine R lijken erg veel op elkaar
(Zie figuur 14). De doses om calcificatie tegen te gaan zijn echter veel groter dan die om bloedstolling te voorkomen (Pierce 1 9 8 0 ) . Toedienen van anticoagulantia is niet wenselijk, omdat dit juist een van de mogelijke voordelen van vliesklepprothesen teniet zou doen. Bovendien blijkt deze methode niet altijd effectief (Wisman 1982 Bruck 1981).
O
A cumarine
( lactsn van
U=
hydroxy- cis- kanee Izu vr)Figuur 14 A Coumarine en B Vitamine K
4.5 Locale hemodynamica en schuifmanninq
o 1
B
phthiocol2 -methy1-3-
hydroxy-l,4- naphthoquinone
Op plaatsen waar stagnatie van de vloeistofstroom optreedt kunnen vaak bloedstolsels ontstaan. Deze zouden weer calcificatie kunnen initieren. Hoge schuifspanningen zouden eveneens een rol kunnen spelen bij de vorming van atherosclerotische plaques. Deze rol is echter totaal niet
4.6 Invloed van het materiaal
4 . 6 . 1 Inleidinq
Het aantal materialen dat bestudeerd is in verband met calcificatie is vrij beperkt. Alleen materialen met een goede biocompabiliteit kunnen
gedurende langer perioden geimplanteerd blijven. Calcificatie treedt immers pas na verloop van tijd op. Wanneer sprake is van bloed-materiaalcontact en elsaticiteit een vereiste is, worden meestal polyetherurethanen gebruikt. De meest gebruikte zoals Biomer (Ethicon), Avcothane (Avco-Everett) en
Pellethane (Upjohn chemical) vertonen na verloop van tijd alllemaal calcificatie. Ook materialen met een met glutaaraldehyde behandelde
gelatinecoating vertonen verkalking (Bruck 1981, Coleman 1981b). Een aantal materiaaleigenschappen oefent mogelijk invloed uit op het verkalkingsproces.
4 . 6 . 2 Oppervlaktestructuur
De oppervlaktestructuur van het materiaal bepaalt in sterke mate het gedrag ten opzicht van bloed. Gladde opppervlakken zullen minder celadhesie vertonen dan ruwe. glad ten opzichte van cellen houdt in dat de doorsnee en diepte van imperfecties kleiner zijn dan lgm(Merril1 1977). Calcificatie treedt meestal op op plaatsen waar celadhesie toch mogelijk is(Lian 1981, Colemanl98la). Deze onregelmatigheden kunnen het çevolg zijn van de verwerkingsmethode van het materiaal(Niet geheel gladde mallen,
stofdeeltjes). 313 het verwerken met behulp van een dipmethode kunnen bij het verdampen van het oplosmiddel belletjes ontstaan. Deze belletjes kunnen onder invloed van buig- of rekbelasting naar het oppervlak verplaatsen en daar kunnen ze gemakkelijk kapot gaan. Hierdoor wordt celadhesie en
vervolgens calcificatie mogelijk(Hennig 1981, Taguchi 1982, Coleman 1981a). Ook scheurtjes die ontstaan door mechanische belasting kunnen dit proces op gang brengen. Bij gecoate materialen kan het oppervlak beschadigen doordat de beschermende laag loslaat of afslijt.
Naast materialen met een glad oppervlak worden ook materialen met een run opperv!.uk gt-brUikt. Eartoe m r d e n bijvoorbeeld korte polyestervezeltjes op het oppervlak aangebracht. De bedoeling is dat het oppervlak bedekt wordt met een dun laagje, bestaande uit een compact geheel van fibroplasten en endotheelachtige cellen. Dit verschijnsel wordt endothelialisatie genoemd. Het laagje wordt aangeduid als PNI (pseudo-neointima). Door dit proces wordt de biocompabiliteit zo optimaal mogelijk (Whalen 1980). Op plaatsen waar het materiaal aan sterke buiging onderhevig is kan calcificatie optreden. Door buiging kan de celfaag loslaten en kunnen cellen worden beschadigd.
Calcificatie treedt hier vooral op wanneer d e cellaag een dikte van zo'n
50ûvm overschrijdt. Initiatie blijkt dan plaats te vinden onder het
in de dieper gelegen cellagen (Lian 1981, Coleman 1981b, Nose 9181, Harasaki 1 9 7 9 ) . Een andere oorzaak voor de optredende celsterfte kunnen bacteriele infecties zijn (Harasaki 1979, Bruck 1 9 8 1 ) .
4 . 6 . 3 Omervlakteladinq
De focale oppervlaktelading blijkt bij in-vitro experimenten invloed uit te kunnen oefenen op de mate waarin calcificatie optreedt. In-vivo blijkt deze invloed sterk af te hangen van de diersoort. Over het algemeen zullen enigzins negatief geladen oppervlakken minder calcificatie
vertonen (Coleman 1981b). Vooral bij gebruik van metastabiele oplossingen van calciumfosfaat als verkalkingsmedium is dit effect erg duidelijk.
4 . 6 . 4 Chemische samenstellinq
De samenstelling van het materiaal kan direct
en
indirect invloed uitoefenen op het verkalkingsproces. Direct doordat specifieke groepen calcium of fosfaat kunnen binden en daardoor de concentraties verhogen.Indirect door het beinvloeden van adsorptie van bloedcomponenten, die weer in staat zijn de calcium- of fosfaatconcentraties te verhogen o f te verlagen (Bruck 1981). Zie ook I 4.4 en I 4 . 5 .
4.6.5 Mechanische belasting
Mechanische belasting van het materiaal speelt een zeer belangrijke rol bij calcificatie van kunststofimplantaten. Verkalking treedt bij voorkeur op op plaatsen die onderhevig zijn aan wisselende buig- of rekbelastingen. In de literatuur worden een aantal verklaringen gegeven.
Bij gebruik van gladde materialen neemt men aan dat calcificatie optreedt door oppervlakte imperfecties. Deze kunnen ontstaan door: --Vermoeiing, door de wisselende belasting ontstaan haarscheurtjes.
--Luchtbellen, bij verwerking uit oplossing kunnen bij het verdampen van het oplosmiddel kleine luchtbelletjes ontstaan. Onder invloed van belasting kunnen deze naar het oppervlak verplaatsen en daar openbarsten fHennig 1981) *
Analyses tonen aan dat verkalking het vaakst optreedt op onregelmatigheden die op een van beide manieren ontstaan zijn. Vermoedelijk vindt op dergelijk ruwe plekken gemakkelijk celadhesie plaats. Afsterven van deze cellen en verkalking kunnen dan volgen (Nose1981, Colemanl98la, Harasaki 1 9 7 9 ) . Deze tussenstap hoeft echter niet plaats t e vinden (Hennig 1 9 8 1 ) .
Een andere verklaring gaat er van uit dat in de belaste delen
diffusieprocessen sneller verlopen, doordat porien in het materiaal worden geopend en gesloten. Dit heeft tot gevolg dat enerzijds calcium- of
fosfaatconcentrerende stoffen sneller uit het bloed worden opgenomen (Bruck 1 9 8 1 ) . Anderzijds kan de afgifte van schadelijke stoffen, zoals
afbraakproducten of resten oplosmiddel, naar het bloed versneld worden. Hierdoor kan weer celsterfte optreden.
Een derde mogelijkheid is dat calcificatie een gevolg is van thermische effecten. De grootte van de temperatuursstijging (hysterese) hangt af van de mate van belasting. De verkalking zou daardoor op de meest belaste plaatsen het hevigst zijn (Coleman 1 9 8 1 a ) . 3ij bloed-
materiaalcontact zal dit effect nauwelijks een rol spelen vanwege de
voortdurende koeling door het langsstromende bloed. Echter in kleine holtes zal dit effect wel een rol kunnen spelen, omdat de warmteafgifte naar het bloed belemmerd wordt.
Voor niet gladde materialen kunnen dezelfde verklaringen gehanteerd worden. Daar er zich op dit soort nateriafen een PNI laagje vormt zijn hier nog een aantal verklaringen mogelijk (Zie $ 6 . 2 ) . Ook de eventueel aanwezige coating van een materiaal kan door buigen of rekken loslaten of beschadigen. Hierdoor kan achtereenvolgens weer celadhesie, celsterfte en verkalking plaats vinden (Nose 1981, Harasaki 1 9 7 9 ) .
TABEL 3 Tijdsduur van calcificatieverschijnselen
!
vesicles Beschadigd subcutaan weef se1 Medium in vitro electrolyt in vivo in vivo in vivo in vivo in vivo in vivo in vivo in vivo in vivo in vivo in vivo in vivo in vivo in vitro serum in vivo in vivo in vivo Tijdsduur Literatuur 2 uur 3 uur 1 uur dagen dagen 3 weken 6-25 jaar jaren (9,5 jaar <1 jaar ( 100 dagen<
100 dagen weken 209 dagen 7 dagen weken-maanden ( 2 jaar < 1 5 0 dagen Hsu 1978 Woodward 1981 Woodward 1981 Woodward 1981 Woodward 1981 Woodward 1981 Woodward 1981 Woodward 1981 Anderson 1981 Lian 1981 Lian 1981 Lian/Nose 1981 Whalen 1980 Coleman 1981 b Coleman 1981 b Maciver 1974 Wisman 1982 Hennig 1981Hoofdstuk 5 Exuerimentele opzet
5 . 1 Kwalitatieve bepalins (Smith 1977).
De afzettingen op de vliezen werd kwalitatief bekeken met behulp van Van Rossa's zilverkleuring. Calciumfosfaat wordt hierbij omgezet in het lichtgevoelige zilverfosfaat, waaruit door belichten zeer fijn verdeeld zilver wordt vrij gemaakt. De kalkafzettingen worden hierdoor zwart van kleur, deze zwartkleuring kan onder een lichtmicroscoop bekeken worden. De benodigde reagentia zijn een vijf procentige zilvernitraat en een vijf procentige thiosulfaat oplossing. De verkalkte vliesjes ondergingen de volgende behandelingen:
1
Spoelen met demi-water, om medium verwijderen.2 In een vijf procentige zilvernitraat oplossing belichten onder een filmzon gedurende een uur.
3 Spoelen met demi-water, om de zilvernitraat oplossing te verwijderen. 4 Eiehandelen met vijf procentige thiosulfaat oplossing, gedurende 5 5 Spoelen met demi-water.
minuten (fixeren).
De aldus behandelde vliezen werden onder een licht microscoop (Olympus BH2) bekeken op zwartkleuring. Dit gebeurde met opvallend licht bij
vergrotingen van 4Ux en 200x. De afzettingen waren zeer duidelijk zichtbaar. De vliezen zelf waren sterk verkleurd. Dit komt door de gevoeligheid van polyurethanen voor licht, met name voor üV licht.
De behandeling met een filmzon is niet gewenst. Belichting met daglicht is vermoedelijk voldoende. De methode is niet specifiek voor calcium, maar is ook geschikt voor andere metaalverbindingen bijvoorbeeld van koper (Bancroft 1967).
5.2 Kwantitatieve bePalina van fosfaat (Xolthoff 1977) Voor de kwantitatieve bepaling werd gekozen voor een
spectrofotometrische bepaling van fosfaat met behulp van een molybdaai- vanadaatreagens. Er wordt een geel gekleurd complex gevormd met het fosfaat. Een zogenaamd "mixed heteropolyacid". Hiervoor moet de de oplossing zuur zijn ten opzichte van lakmoes. Een belangrijke piek in het absortiespectrum van het complex ligt bij 430 na. De redenen voor de keuze van deze methode waren :
--De apparatuur hiervoor was aanwezig.
--Een grote nauwkeurigheid ten opzicht van andere spectrometrische methoden. De ondergrens van het meetgebied is lpg/ml. De bovengrens is 40~g/ml. --De relatieve eenvoud van de methode. Er is maar een reagens nodig, dat
De absorpties werden gemeten op een Hilger & Watts analoge spectrofotometer type H1610.
Het reagens bevatte 1,Og ammoniumvanadaat (NHqV03) en 40g ammoniummolybdaat (NH4)6M07024.4H20 per liter salpeterzuur (verdunning 1:4). Het Vanadaat dient eerst opgelost te worden in het verdunde salpeterzuur.
De procedure om het fosfaat gehalte op de vliezen te bepalen is als volgt: 4 B 1 2 3 Monstervoorbereiding
Spoel de vliezen achtereenvolgens met demi-water en aceton Snijd van beide zijden 1 cm af. Dit om de afzettingen op het inklemgedeelte niet mee te nemen bij de bepaling.
Voeg met een pipet 7ml 0 ' 1 N zoutzuur toe aan het vlies in een monsterpotje.
Plaats een aantal van deze potjes in een grotere op een rollenbank gedurende een nacht.
Meting
Maak een aantal standaard fosfaat oplossingen met concentraties tussen 1 en 20 pg/ml. Voeg :,O00 ml reagens toe aan 2,000 ml oplossing en meng het geheel {Gebruik kuvetten met een weglengte van 1 cm).
Meet na 5-10 minuten de absorbtie bij 400 nm en maak een ijklijn. De absorptie blijft ongeveer een half UUT stabiel.
Herhaal deze procedure met de monsters.
De kaik op de vliezen werd in eerste instantie opgelost in 0,4 N EDTA oplossing, maar EDTA stoorde bij de bepaling. De absorptie van de EDTA oplossing was ongeveer 25% van die van de monsteroplossingen.
Er wordt geadviseerd standaard oplossingen te gebruiken met
concentraties tussen de 1 en 25 yg/ml [Kolthoff 1977). Er zijn een aantal ionen die storen bij de bepaling. Bijvoorbeeld koper en nikkel, zij
veranderen de kleur van de oplossing. De concentraties van ijzer, sulfide, thiosulfaat en thiocyanaat mogen niet hoger zijn dan 100ppm. Chloride vertraagd de vorming van het complex. De concentratie mag niet hoger zijn dan 500 ppm. Chloride is de voornaamste verontreiniging die in onze media voorkomt.
5 . 3 Diktemetins van het vlies
De dikte van zachte materialen kan op zeer eenvoudige wijze worden gemeten. Een micrometer wordt daartoe in U-vormig frame gezet. Op de voet wordt een vlak blok niet geleidend materiaal gelegd, daarop het monster waarvân de dikte bepaald moet worden en daarop een vlak metalen plaatje. Het plaatje is verbonden met de ene en de micrometer met de andere pool van een ohmmeter (Zie figuur
1s).
Er kan nu bepaald worden of de micrometer contact maakt met het plaatje. Een voordeel is dat er gemeten kan worden nagenoegzonder druk op het materiaal uit te oefenen. Een nadeel is dat de dikte gemiddeld wordt over het oppervlak van het plaatje. Het plaatje moet dus zo licht, vlak en klein mogelijk zijn.
iie t er
Y
5-- *r
t
!/letalen Frame
Figuur 15 Schema van de opstelling voor de diktemeting van het vlies
5 . 4 Beschriivinu van het buiqawaraat
Het apparaat bestaat uit een perspex bak met twee compartimenten.
reservoir. material strips / I U moving plates b
Figuur 16 Het buigapparaat A Aandrijving tandheugels
B Plaats van platen, tandwielen en
In beide compartimenten worden *gee platen gehangen, die een translatie ondergaan met een sinusvormige snelheid. De platen worden aangedreven door een electromoter (Engel GNM2130) met een maximum van 6000 toeren/minuut bij 24 V , een vertragingskast (Engel G4), met een vertraging van 15:l en een constructie om de roterende beweging om te zetten in een translatie (Zie figuur 16a). De twee middelste platen zitten op één staaf gemonteerd. De twee buitenste platen zijn ieder op een eigen staaf
gemonteerd. Deze stafen lopen door een drietal lagerblokken. Ter hoogte van het aandrijfgedeelte op de middelste staaf zitten twee tandheugels. Op de buitenste stafen zijn eveneens tandheugels gemonteerd. Twee tandwielen tussen deze tandheugels zorgen ervoor dat de twee platen precies in
tegenfase bewegen (Zie figuur l6b). Onderin de platen zijn sleuven gefreesd, waarin de polyurethaan strookjes geklemd worden (Zie figuur 16c). Wits er aan bepaalde voorwaarden voldaan wordt, worden de strookjes netjes afgerold tijdens de beweging van de platen en dus over de hele lengte gelijkmatig op buiging belast. Als de compartimenten nu gevuld zijn met een oplossing, die meta-stabiel is ten opzicht van hydroxyapatiet zal er vermoedelijk
calcificatie optreden. Naast het apparaat waren de volgende randapparaten aanwezig :
--
Een pH-meter--
Een warmtewisselaar verbonden aan een rondpompthermostaat. Een directe verwarming zou de temperatuur plaatselijk te hoog doen oplopen, zodat er kalk op het verwarmingselement afgezet zou worden.--
Een voeding voor de electromotor ( I A/30 V) om de frequentie te regelen.--
Een stroboscoop om de frequentie te bepalen.--
Een temperatuursregistratie.--
Een teller mei een 10 deler en een optische schakelaar.Het medium wordt als volgt aangemaakt (Wadkins 196%):
--In twee liter demi-water worden 23,385 N a C l , 0,9254g KH2P04 en 12,39g natrium(5,5 diethylbarbituraat) (buffer) opgelost.
--De oplossing wordt aangezuurd tot pH c 8 met geconcentreerd zoutzuur. --Een oplossing van 0,99989 CaC12,2H20 in 2 liter wordt langzaam onder sterk --De pH van het medium wordt op 7 , 4 gebracht. Dit is dezelfde pH als die van
roeren toegevoegd. bloed.
Het uiteindelijk medium heeft dan de volgende concentraties:
15mM natrium(5,5 diethylbarbituraat), 100mM NaCl, 1,?0mM KH2POq en 1,70mP4 CaC12 bij een pH = 7 , 4 . Voor alle chemicaliën werd een pro-analyse kwaliteit gebruikt.
5 . 5 . Buisexperimenten. 5 . 5 . 1 . Alqemeen.
Van de vliezen werden strookjes van 1 cm. breedte gesneden met een bepaalde lengte. Deze strookjes werden tussen de platen van het
belastingsapparaat geklemd en gedurende een aantal dagen op buiging belast. De buigrek is afhankelijk van de dikte van de strook en de kromtestraal. De grootte van de buigrek kan benaderd worden door:
waarbij : E b = de buigrek
d = de strookdikte (mm) r = kromtestraal ( m m )
8 = kromtehoek (rad)
Figuur 17 Parameters bij buigen van de strookjes.
In de vliezen van vlieskiepprothesen werden buigrekken bepaald van 5-
6% in dwarsrichting en 10-12% in radiale richtinq bij de aanhechting van de vliezen (Thubrikar 1 9 8 3 ) . Het is dus gewenst dat de buigrekken, te
verwezenlijken met het buigapparaat liggen tussen 5-15%. De plaatafstand is te variëren tussen 6,s eri :2,5 m. De plaatafstand is gelijk aan 2 x d e kromtestraal r. Bij een maximale buigrek van 15% is de minimale dikte 0,85 mm. Deze dikte is e r g groot, daarom werd als streefdikte 0,5 mm. genomen. De maximale buigrek is dan zo'n 8 % .
5 . 5 . 2 . Dimensionerinu van de instelarootheden.
De beide platen van het apparaat maken een translatie beweging met een faseverschil van T radialen. De bewegingen van de platen kunnen als volgt beschreven worden.
Beweging plaat 1 plaat 2
x l = x l 0
+
S sin w tx2 = x20 t S sin(wt+a) Stel dat in de neutrale stand (zie figuur 1 8 ) .
Figuur 18 Beweging van de platen
Er geldt dan x 1
-
x2 = 2 s sin ( w t ) De strooklengte L moet dan bedragenL = 2 s i
4
nD i 2 x inklemlengte (51Om het strookje in zijn geheel te buigen moet gelden dat
Bij verschillende plaat afstanden werd de slag S ongeveer gelijk genomen aan de maximale plaatafstand.
Bij de buigexperimenten is als volgt te werk gegaan.
--
De minimale en maximale te behalen buigrek voor een bepaald vlies (lees--
Voor de buigrekken werden gehele waarden genomen tussen deze uitersten.--
De plaatafstand D en de slag S werden berekend.--
Hieruit werden de strooklengtes berekend (inklemlengte i s 6 mm.).--
De stroken werden ingeklemd en belast. dikte) werd berekend.iioofdstuk 6 Experimenten en Resultaten
6.1. Het maken van vliezen
Vliezen kunnen op verschillende wijzen gemaakt worden. Gedacht kan worden aan extrusie en verwerken uit oplossing, eventueel gecombineerd met coaqulatiebaden. Extrusie is niet te gebruiken voor ingewikkelde
driedimensionale vormen en vanwege de thermische instabiliteit van
polyurethaanrubbers. Het is de bedoeling om de uiteindelijke kleppen door middel van diptechnieken te vervaardigen. De vliezen worden daarom gemaakt door een oplossing uit te gieten op een vlak liggende glasplaat. Het
oplosmiddel werd verwijderd door overleiden van lucht bij een temperatuur van 90°C. De oppervlakken van de aldus verkregen vliezen moeten zo glad mogelijk zijn, omdat ruwe materialen veel sneller calcificatie vertonen dan gladde. De gladheid aan de malzijde wordt bepaald door de ruwheid vrtn de plaats. De gladheid aan de luchtzijde wordt beïnvloed door een aantal factoren, zoals:
--
concentratie polymeer--
oplosmiddel--
droog-temperatuur--
volumestroom overgeleidde luchtOm de invloed van de concentratie te bekijken werden druppels polymeer oplossing van 2, 4 , 6 , 8 massa '% polymeer in dimethylformamide (DMF)
uitgesmeerd op een preparaat glaasje en gedroogd.
Na het drogen werden de druppels bekeken onder een microscoop (Olympus BHS). Eventueel werd Nomarski interferentie contrast toegepast. Hierdoor worden putten en dalen duidelijker zichtbaar. Diepteverschillen worden
omgezet in kleurverschillen. Voor resultaten zie tabel 4
.
Het polyurethaan was gemaakt op 21-12-1983 op basis van bis(4-isocyanatopheny1)methaan ( MDI): poly(oxytetramethy1een)gfycol met een molmassa van 650 g/mol (POTM 6501,: ethyleendiamine (EDA) in de verhouding 2:l:l met als oplosmiddel
Concentratie massa % Vergroting 400 400 6 8
I
400 Omschrijving Oppervlak-
Over het hele oppervlak zitten kleine luchtbellen. Deze concentreren zich rondom vuiltjes.-
Veel stofjes- Plaatselijk kleine luchtbellen.
-
Stofjes die putjes veroorzaken.-
glad oppervlak .-
stofjes-
fijne korrelachtige structuur-
zeer korrelig oppervlak Tabel 4 . Druppeloppervlakken van polyurethaan van 24-12-1983.*
interferentie contrast toegepast.Het experiment werd herhaald met een nieuw polyurethaan op basis van dezelfde grondstoffen gemaakt op 12-10-1384. De concentraties waren nu achtereenvolgens 4,5, 5,O en 5 , 5 massa %. In alle preparaten waren nu zeer kleine bellen zichtbaar.
Op grond van de resultaten van het eerste experiment zou de optimum gladheid liggen bij een concentratie tussen
1
en 6 % . Het tweede experiment spreekt dit tegen. Vermoedelijk heeft de volumestroom overgeleidde lucht en daasmee de verdampingssnelheid een grote invloed. Dit moet nog naderonderzocht worden. Bij hogere verdampingssnelheden is de kans op belvorming groter.
Een volgende stap was het maken van grote vliezen (20
x
20 cm.) met een streefdikte van 0,5 mm. De streefdikte is van belang voor de mate van buigbelasting, die later aan de vliezen opgelegd kan worden. Als mal werd een stuk vlakglas gebruikt waar een rand van messing strips opgeplakt was.De eerste drie pogingen werden gedaan met een polymeeroplossing van 10,6% in DMF op basis van MDI: POTM 650: EDA in de verhouding 2 : l : l
Een vlies uit ê6n laag was zondermeer te dun (û,05
-
0,1 mm). De eerste poging om vliezen te maken uit twee lagen mislukte, omdat de onderste laag oploste in de bovenste. Daardoor ontstonden plaatselijk scheuren in het materiaal vanwege ingebouwde spanningen door drogen bij 90 OC. Bij de tweede poging werd de oplossing aan de rand uitgegoten en met een metalen strip uitgesmeerd over de plaat. Dit om te voorkomen Cat bepaalde delen van de onderste laag relatief lang aan de oplossing werden blootgesteld. Devervormingen werden hierdoor minder, maar waren niet helemaal te vermijden.
EZ werd besloten om vliezen te maken uit een geconcentreerde oplossing van Biomer in dimethylacetamide (DNACI) (ca. 30%). Biomer is een polyurethaan op basis van MDI, POT# 1800 met een onbekende "chain-extender". Hierna zijn ook alle buigexperimenten gedaan met Biomer. Het eerste vlies had een dikte van 0,37 mm.
Daarom werden volgende vliezen toch uit twee lagen gemaakt. Daartoe werd de oplossing verwarmd tot ca. 80°C in verband met de hoge viscositeiten,
vervolgens uitgesmeerd over de mal en in de oven gedroogd bij 90°C, terwijl lucht overgeblazen %erd. De volgende laag werd na vier uur aangebracht. De zo verkregen vliezen waren macroscopisch glad op wat stofdeeltjes na. Microscopisch vertoonden ze een korrelige structuur. Deze structuur was wel regelmatig. De zo verkregen vliezen waren niet altijd overal even dik. Dit komt vermoedelijk doordat de stroperige oplossing niet de kans krijgt om goed uit te vloeien voor het drogen, daarom werd voortaan gewacht met lucht overblazen totdat de ruit van de oven begon te beslaan door verdanipend oplosmiddel. De procedure is uiteindelijk als volgt:
--
De oplossing verwarmen tot 80 O C om een enigszins dun vloeibare oplossing +e krijgen.--
Op de mal gieten en uitsmeren met een metalen strip.--
Horizontaal in de oven plaatsen bij een temperatuur van 90°C.--
Na een kwartier lucht door de oven blazen.--
Na vier uur een tweede laag aanbrengen.--
Na een kwartier in de oven weer lucht doorblazen.--
Minstens 96 uur laten drogen.De op deze manier verkregen vliezen hebben nog steeds een korrelige structuur, maar zijn overal even dik. De dikte van 0,s mm is zo zeker haalbaar.
6 . 2 . 1 . Experiment I .
Het eerste experiment was voornamelijk bedoeld om het apparaat uit te testen. Hierbij werd niet gelet op de grootte van buigrekken. Het experiment werd uitgevoerd net de volgende parameters
--
rubber op basis van MDI Potm 650 EDA in de verhouding 2:l:l.--
temperatuur 37 C.--
medium fysiologisch zout (99 Nacl/l).--
spanning op de aandrijfmotor 24V (maximaal).--
frequentie 8,25-
8 , 3 0 Hz, deze werd bepaald met een stroboscoop.--
Dikte vlies 0,2 mm.-- Start experiment 14.15 uur 15-11-1984.
--
Einde experiment 1 2 . 0 0 uur 20-11 1984.O
Het totaal aantal buigwisselingen bedroeg 555656. Het experiment werd ‘ s nachts en in het weekend onderbroken. Het apparaat voldeed goed. De vliesjes werden mooi afgerold. Het aantal wisselingen was echter wel beperkt a
Dit experiment werd uitgevoerd met Biomerstrookjes van ongeveer 0,4 mm dikte. De omstandigheden waren als volgt:
--
start experiment 28-11-1484 14.40 uur.--
dikte strookjes 0 , 3 7 mm.--
frequentie 7!08 Hz.--
medium compartiment 1 fysiologisch zout--
medium compartiment 2 calcificatie medium (Wadkins 1968)--
Aantal stroken per kant 3--
temperatuur 37OC.--
totaal aantal wisselingen 2275400--
slag 1 2 , 6 mm.Na 480.000 wisselingen werd het calcificatiemedium ververst. Van zowel het verse als het oude medium werd een monster getrokken en eveneens van het fysiologisch zout. De monsters werden 40
x
verdund, er werd eenfosfaatbepaling gedaan. (zie tabel 5 ) .
I
Monster fosfaatgehaite mg/ml Ca-medium vers (29-11) Ca-medium oud ( 2 9 - 1 1 ) fys zout 29-11) Ca-medium vers (13-12) Ca-medium oud (13-12) Ca-medium oud ( 4 - 1 2 ) 3 , 2 0 1'
40 0,95 4,42 3 , 9 2 3 , 9 5Tabel 5 . Fosfaatgehaìten in media.
Om 17.00 uur op 29-11 werd het experiment onderbroken en om 14.30 uur op 30-11 weer hervat. Beide compartimenten werden gevuld met Ca-medium, omdat er menging tussen 1 en 2 optrad. Zie tabel 5.
Op 3-12 om 9.15 uur is het medium ververst. Rond twaalf uur ' s nachts werd liet experiment afgebroken omdat de motor uitviel. ' s ochtends was duidelijk een neerslag op de bodem te zien. Dit neerslag werd geanalyseerd m.b.v. röntgendiffractie en röntgenfluorescentie. (Voor resultaten zie bijlagen I en Ir).
De strookjes die in eerste instantie in fysiologisch zout belast werden werden kwalitatief op afzettingen onderzocht. De afzettingen waren heel goed ke zien en deden met hun brokkelige structuur sterk denken aan de opgedroogde modder. (Zie figuur 1 9 ) .
De afzettingen concentreerden zich op en rondom het inklemgebied, maar in het midden waren ook duidelijk afzettingen te zien. De afzettingen kwamen voornamelijk voor op de buigkant. Van de strookjes uit het andere
compartiment werd kwantitatief het fosfaat gehalte bepaald. Tabel 6 geeft de instelparameters voor de stroken aan beide zijden plus de fosfaat gehalten.
Figuur 1 9 Afzettingen op strookjes, vergrotingen 200X en 40X.
1
1
Tabel 6 Instelparameters en fosfaatgehaltes voor experiment TI.
6.2.3 Experiment 111.
iit experiment werd opgestast op 12-12-1984 om 18.00 uur met
--
Temperatuur 3 7 % .--
frequentie 7,45 Hz.--
slag 1 8 , 4 mm.--
Aantal stroken per kant 5--
dikte vlies 0,54 mm.--
Beide zijden werden gevuld met Ca-medium--
p u 7 1 4Het medium werd gedurende 5 dagen dagelijks ververst. Telkens werd van zowel het verse als van het oude medium een monster getrokken. ' s Ochtends om 10.00 uur op 15-12 bleek dat het niveau van het medium zover gedaald was dat de blanco's gedeeltelijk droog stonden. Er werden darom langere klemmen gebruikt om de blanco's dieper in de bak te hangen. Na het beëindigen van het experiment werden de plaatafstanden bij de inklemmingen van de stroken gecontroleerd. Het totaal aan wisselingen was 3 . 3 0 8 . 7 6 0 .
Het kalk op de vliezen werd opgelost in 5 ml. 40 mi4 EDTA. De monsters van de media werden 7 op 40 verdund. Van zowel de verse als van de oude me- dia werd het fosfaat gehalte bepaald.
Tabel 7 Fosfaatgehaltes in media (exp.
1111.
Het fosfaat gehalte op de vliezen werd eveneens bepaald, hiervoor werd aan beide kanten van de stroken 7 cm er af gehaald. De buigrekken werden berekend aan de hand van de plaatafstanden D , die na het experiment zijn gemeten. Aangenomen is dat deze standen vrij snel na de start zijn
Strook D(mm) lengte fmm) E~ ( % I fosfaatgehalte
2
ingesteld nagemeten ingesteld gecorrigeerd (pg/mm )
*
klem verschoven* *
klem losDe stroken A komen uit het rechtercompartiment, gezien van de aandrijfkant.
Tabel 8 Parameters en fosfaatgehaltes bij experiment 111.
Strookje nummer vijf is niet ingeklemd tussen de platen omdat er geen plaats meer voor was. Na het verwijderen van de kalk werden de stroken nog op haarscheuren bekeken. Deze waren niet te zien onder de lichtmicroscoop bij de haalbare vergrotingen.
6.2.4. Experiment IV.
--
Start experiment 17-12-1984 om 13.05 uur.--
Frequentie 8 , 0 8 Hz.--
Dikte stroken 0 , 5 4 mm--
Slag 18 mm--
Tenperatuur 3 8 OC--
Medium Ca-medium--
Aantal stroken per kant 5--
Totaal aantal wisselingen 1 . 4 7 1 . 2 9 0--
Einde experiment 19-12-1984 om 16.00 UUT.--
pB 7 1 4Alle metalen delen van het apparaat waren geplastificeerd om verontreiningingen t e voorkomen. Zie hiervoor de resuìten van de
röntgenfluorescentie in bijlage 1. Van de media werden verder geen monsters getrokken.
Ook werden de plaatafstanden na afloop nagenieten. Analyses zijn alleen ver- richt met stroken uit compartiment A (zie tabel 9). De stroken u i t
compartiment 3 zijn gebruikt voor opnamen met een electronenmicroscooop Zie figuur 20. Eb ( % ) fosfaatgehalte 2 gecorrigeerd gecorrigeerd (clg/mm 1
1
Blanco InklemmingFiguur 20 Opnamen van kalkafzettingen op de stroken gemaakt met behulp van een electronenmicroscoop (Vergroting 5100).
5 . 2 . 5 Experiment V
De opzet van dit experiment was om na te gaan of de plaats van de blanco's in de bak invloed heeft op de mate van de afzettingen.
