Bachelor Thesis Scheikunde
M. Ulcerans in huidweefsel
door
04 augustus 2014
Onderzoeksinstituut FNWI Onderzoeksgroep HIMS Verantwoordelijk docent Dr. Begeleider MSc. M. Pacheco Botelho Mourão1. Abstract
Every year between 5000 and 6000 new cases of Buruli ulcer disease are reported to the World Health Organisation (2013). It is the third most encountered disease in Africa and South America behind Tuberculosis and Leprosy. Buruli ulcer disease is a bacterial infection caused by Mycobacterium ulcerans (MUC) which live in the rivers and lakes of tropical areas within Africa and South America. Cause of infection is still unknown and fast detection therefore is a pressing matter. Due to the slow growing rates of MUC the present common techniques for diagnosis of bacterial diseases aren’t adequate. This research will try to detect mycocerosates, biomarkers for MUC, in skin tissue spiked with M. ulcerans using the automated thermally assisted hydrolysis and methylation gas chromatography mass spectrometry (THM-GC-MS) method as previously described. Human skin tissue samples were spiked with MUC, homogenized and extracted with hexane/methanol/water. The extract was separated in 4 fractions by solid phase extracted (SPE) using normal phase Silica gel. Mycoserosates were eluted in the 20% diethylether-in-hexane fraction. Mycoserosates could be detected in skin tissue when high concentrations of MUC were used for spiking. Detection of the mycocerosates when low concentrations of MUC were used for spiking failed due to problems with the sensitivity and long-term stability of the Multi-Dimensional GC-MS system used.
1.1 Samenvatting
Buruli Ulcer is een ziekte die voor velen niet zo bekend is. Verwante ziekten zoals Tuberculose en Lepra spreken in veel gevallen veel meer tot de verbeelding. Helaas zijn de gevolgen van Buruli Ulcer net zo erg als die van de gerelateerde ziekten. Bij buruli ulcer ontstaan ernstige zweren op de huid. Deze zweren zullen, wanneer niet behandeld, niet genezen en zich steeds verder verspreiden. Uiteindelijk sterft de huid af en kunnen patiënten hun armen of benen niet meer bewegen door het verzamelde littekenweefsel dat ervoor in de
plaats komt.
Buruli ulcer is een bacteriële infectie en wordt veroorzaakt door
Mycobacterium ulcerans, een
bacterie die voornamelijk voorkomt in tropische gebieden van Afrika en Zuid-Amerika. Hoe iemand deze ziekte precies oploopt is nog niet bekend en daarom is infectie moeilijk te voorkomen. Een snelle diagnose is daarom belangrijk en dat is waar dit onderzoek zich op richt.
Bacteriën, net als eigenlijk alle cellen, hebben in hun cel-envelop een aantal stoffen zitten die zij produceren en waarschijnlijk nodig hebben om te overleven. Deze stoffen zijn voor iedere bacterie anders waarbij sommigen overeenkomen. M. ulcerans bevat een groep van stoffen die de mycocerosaten worden genoemd. De ziekteverwekkers van Tuberculose en Lepra bevatten deze stoffen ook en daarom zijn deze stoffen zeer bruikbaar voor het opsporen van deze ziektes. Als bepaalde stoffen bruikbaar zijn voor het opsporen van ziektes noemen wij dit “biomarkers”. Biomarkers hoeven niet perse stoffen van bacteriën te zijn. Het kan alles zijn waaraan een dokter kan herkennen wat voor ziekte een patiënt heeft. Wanneer deze mycocerosaten kunnen worden aangetoond in menselijk speeksel, huid, bloed of uitwerpselen kan de dokter, in combinatie met de symptomen, bepalen of iemand deze ziekte wel of niet heeft. In dit onderzoek wordt er daarom gekeken of mycocerosaten te onderscheiden zijn van huidweefsel om zo te bepalen of iemand met zweren op de huid misschien de Buruli ulcer ziekte heeft. Hiervoor gebruiken we een methode die ook in ontwikkeling is voor Tuberculose in longslijm. Met behulp van twee gaschromatografen en een massa spectrometer, machines met ieder hun eigen specialiteiten, wordt een stuk huid waar M. ulcerans aan toe is gevoegd gescheiden door de eerste gaschromatograaf waardoor de mycocerosaten doorgestuurd kunnen worden naar de tweede gaschromatograaf. Daar wordt dit mengsel nog een keer gescheiden waarna met de massa spectrometer bepaald kan worden of de doorgestuurd stoffen echt mycocerosaten waren. Als dit het geval is zou dat in het geval van een echte patiënt betekenen dat deze persoon Buruli ulcer heeft. Het probleem is alleen dat de massa spectrometer heel gevoelig is en daarom heel veel last heeft van de stoffen die in je huid zitten. Om de gaschromatograaf een beetje te helpen bij het scheiden wordt daarom eerst een zogenaamde vaste fase extractie gedaan waarbij de meeste stoffen uit de huid achterblijven in een filter. De resultaten laten zien dat het lastig is om mycocerosaten aan te tonen in de huid en daarom is verder onderzoek nodig waarbij gekeken wordt naar
Patiënt met M. ulcerans infectie aan de arm, de zweren zijn in een nog relatief vroeg stadium.
manieren waarmee dit wel mogelijk is. Bijvoorbeeld door een systeem te bouwen dat minder last heeft van de stoffen uit de huid.
2. Inhoud
1. Abstract...2 1.1 Samenvatting...3 2. Inhoud...4 3. Introductie...5 3.1 Algemeen...5 3.2 Aanpak...6 4. Experimenteel...9 4.1 Sample voorbereiding...9 4.1.2 Hexaan-methanol-water extractie...94.1.3 Solid Phase extractie...9
4.2 Standaarden en reagentia...10 4.3 Instrumentatie...10 4.4 Automatische THM-GC-MS procedure...10 5. Resultaten en Discussie...12 6. Conclusie...18 7. Dankwoord...18 8. Referenties...19 9. Bijlages...20
3. Introductie
3.1 AlgemeenBuruli ulcer werd als eerste beschreven door MacCallum en zijn collega’s in 1948 toen
deze ziekte werd gevonden in zes patiënten uit Australië.8,11,12 Buruli ulcer kenmerkt zich
door ernstige zweren van de huid waarbij deze loskomt van het onderliggende weefsel.12
Wanneer niet tijdig behandeld, kan de ziekte ernstige gevolgen hebben voor de patiënt zoals blijvende invaliditeit.13 Buruli ulcer wordt veroorzaakt door de Mycobacterium ulcerans bacterie, één van de drie grote pathogene mycobacteriën samen met M. tuberculosis en M.
leprae. M. ulcerans is echter wel speciaal in de zin dat het de enige van de drie is die een
toxine uitscheidt. De World Health Organisation (WHO) meldde in 2013 dat er jaarlijks tussen de 5000 en 6000 nieuwe gevallen van buruli ulcer worden gemeld, afkomstig uit 15
van de 33 landen waarin de ziekte bacterie gesignaleerd is.14 De bacterie komt voornamelijk
voor in tropische gebieden en men gelooft daardoor dat deze voornamelijk in water te vinden
is.12 Dat deze bacterie te vinden is in water blijkt ook uit het onderzoek van Morris et al
(2014) die DNA van M. ulcerans bacterie hadden geïdentificeerd in water afkomstig uit Zuid Amerika waar dit eerder al was gelukt in Australië en delen van Afrika.13
Over hoe een patiënt geïnfecteerd raakt met M. ulcerans is nog weinig bekend maar men vermoedt dat de bacterie het lichaam binnendringt via kleine wondjes die vergeten zijn tegen
de tijd dat de eerste symptomen zichtbaar worden.12,15 Mede door de onduidelijkheid over de
manier van infectie zijn preventieve maatregelen nog niet voorhanden.
Zoals al eerder vermeld is een snelle diagnose noodzakelijk om blijvend letsel te voorkomen. De M. ulcerans bacterie heeft echter een zeer lange incubatietijd en de eerste symptomen doen niet direct Buruli ulcer vermoeden waardoor patiënten pas laat een dokter opzoeken. De eerste symptomen lijken namelijk zeer veel op een normale muggenbult, het bultje is hard, pijnloos en ziet een beetje rood. Tegen de tijd dat de patiënt wel de dokter opzoekt is het bultje vaak uitgegroeid tot een zweer waarna over wordt gegaan tot diagnose door middel van bijvoorbeeld microscopisch onderzoek van wondvocht of een huidbiopt, kweek of de polymerasekettingreactie (PCR) methode. Het nadeel van microscopie is dat deze techniek onvoldoende gevoelig is. Ook kweken is niet de meest ideale methode om een
M. ulcerans infectie aan het licht te brengen. Het kweken van de bacterie duurt zo’n 6 tot 8
weken. De patient moet hiervoor speciaal terugkomen hetgeen in ontwikkelingslanden een probleem is. Ten slotte lijkt PCR dan de meest gunstige methode om besmetting aan te tonen. Bij de PCR techniek worden specifieke sequenties van M. ulcerans DNA vermenigvuldigd en kan, op deze wijze, de infectie worden vastgesteld. Met een zogeheten “DNA fingerprint” kan ook de M. ulcerans stam waarmee de patient is geinfecteerd worden bepaald. De PCR
methode is snel, diagnose kan plaatsvinden binnen 24 uur, en Chemlal en medewerkers16
beschreven een PCR methode voor de amplificatie van de IS2404 sequentie waarmee een
hoge specificiteit en sensitiviteit gehaald kan worden.17,18 Aan PCR zijn echter ook hoge
kosten verbonden en het vereist goed opgeleid personeel om de PCR uit te voeren zonder het gevaar op foutief-positieve uitslagen, twee voorwaarden die in de meeste gebieden waar M.
ulcerans voorkomt niet voorhanden zijn. Er is in ontwikkelingslanden dus grote behoefte aan
een eenvoudige test om patiënten met Buruli ulcer te diagnosticeren.
Dezelfde methoden –kweek, microscopisch onderzoek en DNA amplificatie technieken-worden ook gebruikt om tuberculose vast te stellen. In ontwikkelingslanden is er grote behoefte naar een simpele en goedkope test die bovendien ook is uit tevoeren door eenvoudig
opgeleid personeel. Op de afdeling Analytical Chemistry & Forensic Science van de UvA loopt een onderzoek om met behulp van thermisch geassisteerde hydrolyse en methylatie gevolgd door gaschromatografie-massa spectrometrie (THM-GC-MS) M. tuberculosis in sputum aan te tonen.1,2,7 Resultaat van dit onderzoek is de automatische THM-GC-MS procedure zoals beschreven door Kaal en medewerkers2 en Dang en medewerkers.1,7 De beschreven methode maakt gebruik van chromatografie om M. tuberculosis in sputum en kweken aan te tonen door middel van zogeheten biomarkers. Met biomarker wordt in dit onderzoek een voor M. tuberculosis, M. leprae en M. ulcerans specifieke stof bedoeld of een stof waarmee een onderscheid kan worden gemaakt tussen deze bacterien en niet pathogene mycobacterien. Sommige zogenaamde opportunistische mycobacteriën kunnen ook in de sputum van HIV positieve patienten worden gevonden. Voor M.tuberculosis vonden Dang en medewerkers1,7 twintig biomarkers die gebruikt kunnen worden om M. tuberculosis te onderscheiden van andere mycobacteriën die in de natuur en eventueel in het menselijk lichaam voorkomen. De belangrijkste biomarkers zijn tuberculostearic zuur (TBSA) -afkomstig van fosfolipiden-, hexacosanoic zuur (C26) -afkomstig van mycolzuren- en mycoseraten -afkomstig van phthioceroldimycoserosaat (PDIM) en phenolische glycolipide (PGL)-. TBSA alleen is echter niet specifiek genoeg om als biomarker te fungeren vanwege zijn voorkomen in een groot aantal mycobacteriën. De mycoserosaten (multi methylbranched fatty acids, Figuur 1) komen alleen voor in pathogene mycobacteriën zoals M. tuberculosis,
M. leprae en M. ulcerans waarbij C26 zeer bruikbaar is bij het bepalen van de plaats van
mycocerosaten in het chromatogram.7,9,10
Figuur 1: Algemene structuur voor mycocerosaten waarbij m en n reële variabele getallen zijn.5
In een eerdere studie hebben Dang en medewerkers aangetoond dat een klein aantal, sterk microscopisch positieve, huidbiopten van Buruli ulcer patiënten mycoserosaten
bevatten.19 De lipiden van de huid gaven echter storing in de chromatogrammen van de
GC-MS door overlappende pieken met de zelfde retentietijd als de mycoserosaten. Bovendien vervuilde de gebruikte injectorliner heel snel. In dit onderzoek is geprobeerd om deze methode te verbeteren door gebruik te maken van een combinatie van solid phase extractie (SPE) en multidimensionale gas chromatografie (MD-THM-GC-MS). Om te onderzoeken of de mycocerosaten daadwerkelijk gemakkelijker aan te tonen zijn in huidweefsel, zijn gekweekte M. ulcerans bacteriën toegevoegd aan het weefsel van een patiënt waarvan een stuk buikhuidweefsel is weggenomen. De bedoeling is om in een later stadium, met de verbeterde methode, mycoserosaten aan te tonen in huidbiopten van bewezen Buruli ulcer patiënten.
3.2 Aanpak
Multidimensionale gaschromatografie (MDGC) is een techniek die gebruikt kan worden als de matrix te veel storing geeft op de gebruikelijke THM-GC-MS procedure. De MDGC, die in dit onderzoek is gebruikt, is opgebouwd uit twee gaschromatografen (GC’s) die gekoppeld zijn waarbij de eerste is uitgerust met een vlam ionisatie detector (FID) en de tweede is voorzien van een massa spectrometer (MS). Om de lipiden te scheiden via GC moeten deze eerst vluchtiger worden gemaakt door ze te hydrolyseren en te methyleren. De meeste stoffen die voorkomen in mycobacteriën zijn zeer complexe lipiden die bestaan uit meerdere lange vetzuur ketens die in sommige gevallen met elkaar verbonden zijn. Deze
verbinding is ontstaan door een verestering met bijvoorbeeld glycerol. Deze esters kunnen worden verbroken via hydrolyse in aanwezigheid van een base. Daarnaast ontstaan breuken in de grote moleculen via pyrolyse. Hierbij worden de moleculen kleiner en daarmee ook vluchtiger. Deze zuurgroep kan vervolgens gemethyleerd worden en zodoende gemarkeerd. Dit proces wordt ook wel derivatisatie genoemd. Met het tetramethyl amonium hydroxide (TMAH) reagens worden alleen de zuurgroepen gederivatiseerd waardoor deze makkelijker gedetecteerd kunnen worden. Tevens zorgt het methyleren van de zuurgroep ervoor dat er geen onderlinge waterstofbruggen gevormd kunnen worden tussen de zuurgroepen wat de vluchtigheid verhoogd en voorkomt dat de componenten reacties aan gaan met de stationaire fase.20
Figuur 2: Reactiemechanisme van derivatisatie van een standaard vetzuur met tetramethylamine hydroxide (TMAH) als reagens tot een methylester.20 Me is een CH
3-groep.
Deze reactie wordt normaal gesproken uitgevoerd voordat het mengsel geïnjecteerd wordt maar Kaal en medewerkers2 en Dang en medewerkers1 hebben gewerkt met een methode waarbij de hydrolyse en methylatie plaatsvindt in een zogeheten injectieliner in de injector. Hiervoor wordt een zogenaamde Programmed Temperature Vaporizing injector (PTV) gebruikt. Een PTV injector maakt het mogelijk om een reactie te laten plaatsvinden in de injector door een geschikt temperatuurtraject in te stellen (zie sectie 4.4). Door de reactie in de injector plaats te laten vinden kan veel tijd bespaard worden waardoor snellere diagnose van patiënten mogelijk wordt.
In een GC worden, na injectie van een mengsel, stoffen gescheiden op basis van kookpunt. Dit is alleen mogelijk wanneer de stoffen allen affiniteit vertonen met de stationaire fase van de kolom, polaire stoffen met een polaire kolom en apolaire stoffen met
een apolaire kolom.4 Het kan hierbij voorkomen dat twee stoffen op hetzelfde moment de
kolom verlaten en gedetecteerd worden, waarbij zowel FID als de MS niet in staat zijn om onderscheid te maken tussen co-eluerende stoffen. De multidimensionale GC kan twee verschillende type kolommen, bijvoorbeeld een polaire kolom gevolgd door een apolaire, gebruiken en het mengsel zo scheiden dat er geen co-elutie van stoffen meer plaatsvindt.3 Een tweede toepassing van de MDGC heeft te maken met de detectie van de eluerende stoffen. FID, de meest gebruikte detector,4 is niet in staat om de eluerende stof te identificeren maar kan slechts aangeven dat er materiaal van de kolom afkomt. Om die reden wordt vaak een MS gebruikt, die wel in staat is de eluerende stof te identificeren door de massa per lading ratio (m/z ratio) van fragmenten die ontstaan te meten. Deze fragmenten ontstaan wanneer de stoffen de MS binnenkomen en worden beschoten met elektronen. Dit ioniseert de moleculen waardoor deze instabiel worden en in fragmenten uit elkaar vallen, om die reden wordt dit
elektron ionisatie genoemd. De manier waarop het molecuul uit elkaar valt is specifiek voor
de structuur en samenstelling van het molecuul en is dus reproduceerbaar.4 Een MS is echter
zo gevoelig dat vervuilingen snel storingen in het chromatogram veroorzaken. Om deze vervuilingen tot een minimum te beperken kan er, naast de verschillende kolommen, gekozen
worden voor de heart-cut methode, zoals in het onderzoek van Dang en medewerkers1 gedaan
is. Hierbij vindt scheiding op de eerste kolom plaats en worden alleen de interessante bestandsdelen van het sample doorgestuurd naar de tweede kolom. Vervolgens vindt op de tweede kolom opnieuw scheiding plaats waarbij de componenten die niet van belang zijn en vervuiling of overlading kunnen veroorzaken al zijn verwijderd. Zo kan de eerste kolom gezien worden als een zuiveringsstap.
Deze heartcut methode is, juist omdat huidweefsel (de matrix) zeer veel lipiden bevat, een goede manier om toch mycoserosaten in lage concentraties aan te tonen. Deze mycocerosaten zijn in dit onderzoek de belangrijkste biomarker voor het aantonen van M.
ulcerans (Figuur 1).
Mycocerosaten komen als stof niet los voor in mycobacteriën maar als kleine wasachtige bolletjes, PDIMs en PGLs genaamd, in de celenvelop (Figuur 3). In Figuur 3 is ook goed te zien waar de hydrolyse plaats moet vinden om de mycocerosaat zuren te vormen.
Figuur 3: Algemene structuur van PDIM (links) met n = 10-11 en PGL (rechts) met m = 7-8. Voor beiden geldt
dat R = ‒CH3 of ‒CH2‒CH3. De vertakkingen zijn veresterde mycocerosische zuren die met hydrolyse kunnen
worden afgebroken tot mycocerosaten.
Mycocerosaten komen niet in alle pathogene bacteriën voor met dezelfde lengtes (Figuur 1).
Volgens Minnikin en medewerkers6 zouden in M. ulcerans C27 (m = 16, n = 3), C29 (m =
18, n = 3) en C30 (m= 16, n = 4) voorkomen. Dang7 laat echter in haar onderzoek met 20
biomarkers voor M. tuberculosis zien dat een C28 variant van mycocerosaten ook bestaat. De
m- en n- waarden worden in het verslag niet vermeld maar volgens de naamgeving
(tetramethyl-) zouden m = 14 en n = 4 de meest logische waarden zijn. Gezien de gelijkenis in mycocerosaat patronen tussen M. ulcerans en M. tuberculosis die wordt aangegeven door Redman en medwerkers5 en Minnikin en medewerkers6 zou het voorkomen van C28 mycocerosaat in het M. ulcerans ook tot de mogelijkheden behoren. Het voorkomen van C28
in M. ulcerans werd later bevestigd door de ongepubliceerde resultaten van Dang.19 In dit
onderzoek zal getracht worden een methode op te zetten om de mycocerosaten C27, C28, C29 en C30 te detecteren.
4. Experimenteel
4.1 Sample voorbereiding
Met een schaartje werden zes stukjes van 150 mg formaline gefixeerd huidweefsel geknipt tot kleine stukjes. De stukjes huid werden overgebracht in Sartstedt 2 mL buisjes (Sartstedt B.V. Etten-Leur, Nederland) met 0,5 mL demi water. Het weefsel werd in een Ultra Turrax homogenisator (30.000 toeren) gehomogeniseerd (VDI 12,VWR internationaal Amsterdam, Nederland) waarbij de suspensie een volume kreeg van ongeveer 0,650 mL.
Een suspensie van, met hitte gedode, M. ulcerans (code: 063846, datum: 20-05-2012) werd verkregen zoals eerder beschreven (Kaal et al., 2009)2. Een serieverdunning van 1x1011, 1x1010, 1x109, 1x108 en 1x107 mycobacteriën/ml werd gemaakt. Aan de weefsel homogenisaten werd 6,5 µL van elke M. ulcerans suspensie toegevoegd zodat de volgende seriemonsters werden verkregen.
Code 1 niet gespiked M.ulcerans Code 2 gespiked met 1 x105/ mL Code 3 gespiked met 1 x106/ mL Code 4 gespiked met 1 x107/ mL Code 5 gespiked met 1 x108/ mL Code 6 gespiked met 1 x109/ mL
De monsters werden overgebracht naar een 50 ml Pyrex centrifugebuis (Corning Incorporated, Corning, New York, USA).
4.1.2 Hexaan-methanol-water extractie
Aan de buizen werd 1 mL water, 5 mL methanol en 5 mL hexaan toegevoegd en het geheel werd in een ultrasonisch waterbad gehouden gedurende 10 minuten. Vervolgens werden de buizen gedurende 3 uur horizontaal geschud met een Vortex shaker. Ten slotte werden de buizen 10 minuten gecentrifugeerd op 3000 rpm met een Servall super speed centrifuge.
Van elke buis werd de hexaan laag gepipetteerd waarna de overgebleven methanol-water fase opnieuw werd geëxtraheerd met hexaan. Ook deze hexaan laag werd gepipetteerd en samengevoegd aan het eerste extract om vervolgens volledig ingedampt te worden. De achtergebleven olieachtige substantie (ongeveer 100 µL) werd opgelost in 1 mL hexaan.
4.1.3 Solid Phase extractie
Het hexaan extract werd opgebracht op een Silicagel cartridge (1 g Strata SI-1 Silica (55 µm, 70 A SI-1/6mL) Phenomenex, Utrecht, Nederland). De kolom was eerst geëquilibreerd met 6 mL hexaan. Nadat het hexaan extract was opgebracht werd de eerste 1 mL opgevangen en genummerd met de code 1. De kolom werd vervolgens geëlueerd met 5 mL 20% diëthylether in hexaan (v/v), 5 mL 50% diëthylether in hexaan (v/v), 5 mL methanol en 5 mL chloroform:methanol:water (CMH) in de volumeverhouding 1:2:0,8. Deze fracties kregen de corresponderende codes 2, 3, 4 en 5. Alle fracties werden geconcentreerd tot 0,2 mL alvorens overgebracht te worden in de inserts van autosampler buisjes voor analyse.
De M. ulcerans standaard (zonder weefsel) werd bereid door 1x108 M. ulcerans in 200 µL
water te brengen en daar 1 mL methanol en 1 mL hexaan aan toe te voegen. Het mengsel werd ultrasonisch behandeld voor 15 minuten waarna het gedurende de nacht geschud werd. Het extract werd gecentrifugeerd op 4000 rpm (Universal 16 Centrifuge, Hettich, Germany) en de hexaan laag werd gepipetteerd. Waarna een tweede extractie met 1 mL hexaan plaatsvond welke werd gecombineerd met de eerste extractie. De gezamenlijke hexaan
extracten werden geconcentreerd tot 200 µL en overgebracht naar een insert in een autosampler flesje.
4.2 Standaarden en reagentia
De 25% waterige tetramethyl ammonium hydroxide (TMAH) oplossing, welke gebruikt werd voor de thermische hydrolyse en methylatie (thermally assisted hydrolysis and methylation - THM), was afkomstig van Sigma-Aldrich (Zwijndrecht, Nederland). De TMAH oplossing werd voor gebruik tien keer verdund in een autosampler buisje (150 µL TMAH (25%) en 1350 µL water).
4.3 Instrumentatie
Alle THM–GC–MS experimenten warden uitgevoerd op een Shimadzu GCMS-QP2010 (Den Bosch, Nederland). Het GC systeem was uitgerust met een ‘‘Focus’’ XYZ robotische auto sampler (ATAS GL) en een Optic 3 programmed temperature vaporizing (PTV) injector (ATAS GL, Eindhoven, Nederland). De PTV injector was gekoppeld aan een gas control unit (EGC) voor het aanleveren van het draaggas, de septum purge en de split flow. De PTV injector bevatte een liner met een gesinterd glasbed (ATAS GL) waardoor grote volumes, tot
20 µL, geinjecteerd konden worden.1
4.4 Automatische THM-GC-MS procedure
Kaal en medewerkers2 en Dang en medewerkers1 zijn de grondleggers van de automatische THM procedure, welke gebruikt werd voor de identificatie van de
mycoserosaten in de M. ulcerans extracten.1 20µL van elk extract (10 µL voor de standaard)
werd geïnjecteerd met behulp van de OPTIC 3 PTV injector op 40°C. De injector werd dan verwarmd tot 120°C in een tijdsbestek van 3 minuten om het oplosmiddel en eventueel water te verdampen terwijl het monster vastgehoudenwerd in de sintered-bed liner in de injector. Vervolgens werd de injector afgekoeld tot 40°C voordat 25 µL van het 2,5% TMAH reagens werd geïnjecteerd om het gehele sample te omvatten. Uiteindelijk werd de injector weer verwarmd tot 120°C om oplosmiddel en water te verwijderen alvorens de injector verder te verhitten tot 450°C voor de thermochemolyse. De temperatuur werd constant gehouden op 450°C voor 5 minuten en daarna afgekoeld om constant te blijven op 320°C tot het einde van de GC run. Het temperatuurprogramma van de injector is weergegeven in Figuur 4.
Figuur 4: PTV injector temperatuurtraject.
Alle GC analyses werden uitgevoerd op een TC 5MS column (GL Sciences, Tokyo, Japan) met een 30 m x 0,25 mm interne diameter, gecoat met 0.25 µm 5% phenyl methylpolysiloxane stationaire fase terwijl Helium werd gebruikt als draaggas. De instellingen voor de gebruikte GC zijn te zien in figuur 5.
Figuur 5: Instellingen multidimensionale GC.
Om alleen de mycocerosaten te analyseren werd de heart-cut methode gebruikt. De eerste GC oven startte met 3 minuten op 60°C om vervolgens verhit te worden tot 320°C met 5°C /minuut. De temperatuur van 320°C werd constant gehouden voor 10 minuten waarna het programma van de tweede GC-oven startte met 60°C en verwarmd werd tot 100°C op 20°C/minuut. Deze snelle opwarming is toegestaan omdat vroeg eluerende stoffen op dat moment al verwijderd zijn met de heart-cut methode. De oven werd constant gehouden op 100°C voor 7 minuten om vervolgens door te verwarmen naar 300°C met 5°C/minuut. Deze eindtemperatuur werd constant gehouden voor 10 minuten.
De MS was ingesteld op full scan mode en registreerde spectra met een massabereik van 60 tot 500 amu en een frequentie van 5 Hz.
5. Resultaten en Discussie
MD-GC-MS gebruikt zeer gevoelige apparatuur en daarom worden een aantal voorzorgsmaatregelen genomen die de kwaliteit en de betrouwbaarheid van de resultaten moeten waarborgen. Ten eerste wordt de injector-liner elke week gecontroleerd op vervuiling en elke ongeveer 100 uur aan analyse vervangen. Ten tweede wordt het septum elke 100 uur vervangen. Het septum wordt door de naald van de autosampler keer op keer doorstoken waardoor het gaatje groter kan worden wat weer gevolgen kan hebben voor de druk in de injector en de kolom. Als laatste wordt de massa spectrometer elke week ‘getuned’. Hierbij moeten de resultaten aan een aantal standaarden voldoen en wanneer dit niet het geval is mag er niet geanalyseerd worden. Tijdens dit onderzoek zijn er met de drie genoemde onderdelen geen problemen geweest waardoor kan worden aangenomen dat deze geen invloed hebben gehad op de resultaten.
Na elke analyse van een monster wordt een zogeheten blanco volgens hetzelfde programma gedraaid met als doel alle resten van het voorgaande monster te verwijderen. Deze blancos moeten gecontroleerd worden op onregelmatigheden. Indien deze onregelmatigheden zich voordoen kan dat duiden op vervuiling van de kolom en moet deze schoongemaakt worden of wordt een stuk van 30 cm aan de injector kant weggenomen. Ook het GC chromatogram wordt gecontroleerd om te zien of wel de juiste pieken zijn doorgestuurd naar de MS met de heart-cut methode.
Vanuit eerder onderzoek is gebleken dat mycocerosaten elueren bij temperaturen van rond
de 280 °C en hoger.19 Ook bleek een opwarmsnelheid van 5 °C/minuut een goede scheiding
op te leveren.1,7 Vanuit dit oogpunt is een M. ulcerans standaard geanalyseerd met behulp van FID om de exacte retentietijden te bepalen voor de heart-cut methode. Er werd daarbij gezocht naar een triplet en een doublet met een singlet ertussen. Dit singlet, C26, zou 2
minuten na het triplet moeten elueren en het doublet binnen een minuut na de C26.7 Het
triplet en het doublet zouden dan afkomstig moeten zijn van de mycocerosaten.
Het gezochte patroon werd gevonden en om er zeker van te zijn dat het de juiste stoffen betrof werd een standaard van C26 volgens hetzelfde programma geïnjecteerd. Het patroon en de piek van de C26 zijn te zien in Figuur 6.
55.0 55.5 56.0 56.5 57.0 57.5 58.0 58.5 59.0 59.5 60.0 60.5 61.0 61.5 62.0 min 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 uV(x10,000)
Figuur 6: FID chromatogram van M. ulcerans standaard (zwart) en C26 standaard (roze) ingezoomd op de verwachtte mycocerosaten.
De C26 standaard elueerde op de verwachtte retentietijd waarna besloten werd de heart-cut tijden als volgt te kiezen, dusdanig dat de pieken zo strak mogelijk uitgesneden werden (tabel 1).
Tabel 1: heart-cut tijden gekozen op basis van M. ulcerans standaard en C26 standaard.
Piek signaal Starttijd heart-cut Eindtijd heartcut
Triplet 56,45 57,05
C26 59,20 59,65
Doublet 60,40 60,95
Na analyse van de M. ulcerans standaard met behulp van MS werden de volgende retentietijden (tabel 2)voor mycocerosaat en C26 gevonden met bijbehorende massaspectra (figuren 7, 8 en 9). In het MS chromatogram is echter een sterk stijgende basislijn te zien dat duidde op mogelijke problemen met de GC-MS door vervuiling of inlek van lucht.
100.0 102.5 105.0 107.5 110.0 112.5 115.0 117.5 120.0 122.5 125.0 127.5 130.0 132.5 135.0 137.5 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 (x1,000,000)
Figuur 7: MS chromatogram van de M. ulcerans standaard in total ion count (TIC).
110.500 110.750 111.000 111.250 111.500 111.750 112.000 112.250 112.500 112.750 113.000 113.250 113.500 113.750 114.000 114.250 114.500 114.750 115.000 115.250 115.500 115.750 116.000 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 (x10,000)
Figuur 8: MS Chromatogram van de M. ulcerans standaard gekeken op m/z ratio 101.
112.250 112.500 112.750 113.000 113.250 113.500 113.750 114.000 114.250 114.500 114.750 115.000 115.250 115.500 115.750 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 (x1,000) 5 4 1 2 3
Tabel 2: Retentietijden van de mycocerostaten en C26 zoals aangegeven in figuur 8 en 9. Piek: Retentietijd: 1: Mycocerosaat C27 112,0 2: Mycocerosaat C28 112,1 3: C26 114,1 4: Mycocerosaat C29 114,8 5: Mycocerosaat C30 115,0 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 0.0 2.5 5.0 7.5 (x1,000) 101 88 43 253 57 209 139 322 241 356 179 281 169 311 386 402 442 460 487 497 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 (x1,000) 101 88 384 140 43 355 458 57 170 195 271282 311 344 429 399 203 235 489 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 (x10,000) 74 43 57 139 281 191 410 97 207 254 315 239 343 355 165 385 445 490500 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 (x1,000) 101 88 43 69 135 191 270 147 322 197 222 278 310 365 380 416 429 459 499 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 0.0 1.0 2.0 3.0 (x1,000) 43 101 88 55 384 270 343 145 156 237 177 206 294 316 358 411 438450 487499
Figuur 10: Massa spectra van de pieken 1 t/m 5 van de standaard behorende bij de retentietijden van tabel 2.
1
2
3
4
Door de lage concentratie van de gebruikte standaard (1x108/mL) hebben de massa spectra (figuur 10) veel last van de achtergrond die ontstaat door de gevoeligheid van de massa spectrometer. Deze massa spectra komen niet allemaal goed overeen met de massa spectra die eerder verkregen zijn door Dang19 en die te zien zijn in Bijlage 1. Waar de pieken
1en 2 uit figuur 7, 8 en 10 grote mate van gelijkenis vertonen met de literatuur en de C26
volledig overeenkomt met de eerder behaalde resultaten, vertonen de pieken 4 en 5 slechts een kleine mate van overeenkomst. Een mogelijke verklaring zou de lage concentratie kunnen zijn maar dit kon niet verder worden onderzocht.
Bij spike experiment 6 (gespiked met 109/mL) werd er echter een overeenkomstig patroon
gevonden in het MS chromatogram van fractie 2, de 20% diethylether in hexaan extractie. Bij de overige fracties (resultaten in de bijlage) werden geen mycocerosaten gevonden. Dit resultaat werd vergeleken met het patroon afkomstig van de monsters zonder M. ulcerans (code 1-2). 111.500 111.750 112.000 112.250 112.500 112.750 113.000 113.250 113.500 113.750 114.000 114.250 114.500 114.750 115.000 115.250 115.500 115.750 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 (x100,000) 110.250 110.500 110.750 111.000 111.250 111.500 111.750 112.000 112.250 112.500 112.750 113.000 113.250 113.500 113.750 114.000 114.250 114.500 114.750 115.000 115.250 115.500 115.750 116.000 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 (x100,000)
Figuur 11: a) MS chromatogram bekeken op m/z 101 van sample 6-2 (zwart) en sample 1-2 (roze) ingezoomd op de mycocerosaten. b) MS chromatogram bekeken op m/z 410 om te kijken naar C26.
Ook de massa spectra van de pieken in figuur 11 (weergegeven in figuur 12) kwamen overeen met die van de standaard en wederom kwamen de pieken 4 en 5 niet overeen met de eerder behaalde resultaten waar de pieken 1 t/m 3 dat wel doen (bijlage 1). Ook zijn in het chromatogram van sample 1-2, die zonder M. ulcerans, op de plaats van piek 4 en 5 duidelijk pieken te zien. Dit bemoeilijkt de detectie van de mycocerosaten aanzienlijk. Het feit dat de massa spectra van de pieken 4 en 5 ook niet duidelijk overeenkomen met het patroon dat van mycocerosaten verwacht mag worden maakt dat detectie op basis van die pieken extra wordt bemoeilijkt. In het massa chromatogram van sample 1-2 bekeken op m/z 410 is geen C26 te zien, wat een gunstig resultaat is. Wel ziet het massa chromatogram er erg rommelig uit waardoor een betrouwbaar conclusie moeilijk getrokken kan worden.
a
25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 (x1,000,000) 101 88 57 43 269 129 155 171 207 237 289 309 337 353 381 396 424 450 478 500 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0(x100,000) 101 88 57 43 223 141 169 265 209 424 183 293 307 337 360 381 407 451 481 497 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 (x100,000) 74 43 57 410 143 97 199 367 185 241254 271 311 325 379 151 431 449 471 499 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 (x100,000) 101 88 58 207 147 195 225 253 275 309 327 355 452 134 372 414 429 476 499 33 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 (x100,000) 98 55 88 41 127 253 309 384 239 289 324 356 398 452 201 437 155 188 499
Figuur 12: Massa spectra van de pieken 1 t/m 5 bij sample 6-2.
De overige fracties (bijlage 2 en 3) leken soms kleine pieken te bevatten op de plaats van de mycocerosaten en in sommige gevallen zelfs pieken van C26 waarbij het massa spectrum ook duidelijk overeen kwam met de standaard. Een verklaring hiervoor is niet gevonden.
Van spike experimenten 2 en 5 (1x105 en 1x108 /mL respectievelijk) leken de resultaten
geen mycocerosaten te bevatten. Daar waar die afwezigheid in spike experiment 2 nog enigszins te verklaren zou zijn geweest door het naderen van de detectielimiet, die volgens
Dang7 voor mycocerosaten zo rond de 104/mL zou moeten liggen, is dat voor experiment 5
niet zo. In experiment 6 zijn de pieken namelijk nog zeer duidelijk en met een grote signaalsterkte. Door de concentratie met 10 te verlagen zou in theorie een signaalsterkte verkregen moeten worden die ongeveer 10x lager is waarbij nog steeds een aanzienlijke
1
2
3
4
signaal zou moeten overblijven. Dit is echter niet het geval en na controle van de blanco’s en de FID chromatogrammen bleken er technische problemen te zijn met de GC die de resultaten mogelijk negatief hebben beïnvloed. Door een gebrek aan tijd is het onmogelijk gebleken om de monsters opnieuw te analyseren.
Om de methode te valideren moet aan een aantal eisen worden voldaan. Dat de methode aan deze eisen voldoet, zal volgend onderzoek aan moeten tonen. In de eerste plaats zullen de selectiviteit en de gevoeligheid bepaald moeten worden. Is M. ulcerans de enige mycobacterie die mycocerosaten bevat? Het antwoord daarop is nee, maar is het wel de enige die zweren veroorzaakt? Ook mogen de bestanddelen van de matrix niet interfereren met de detectie van de biomarkers, dit is de selectiviteit. De methode moet ook in staat zijn de hoeveelheden te detecteren die daadwerkelijk in het lichaam voorkomen. Bij een spiking experiment worden de concentraties van tevoren bepaald maar in een menselijke matrix is dit niet het geval. Hiermee samen valt de detectielimiet, wat is de kleinste hoeveelheid van de mycocerosaten die gedetecteerd kan worden. Uit onderzoek van Dang (2013)7 met M.
tuberculosis in sputum bleek deze te liggen rond de 104 maar geldt dit ook voor M. ulcerans
in huidweefsel? Ook moet de reproduceerbaarheid onderzocht worden, is het mogelijk om dezelfde resultaten te boeken wanneer het onderzoek wordt uitgevoerd door iemand anders, ergens anders of met een GC van een ander merk?
Het spike experiment is de eerste stap in de richting van selectiviteit, hiermee kan worden aangetoond of het mogelijk is de mycocerosaten aan te tonen in de matrix. Voor de gevoeligheid werd ervoor gekozen samples met een lagere concentratie te analyseren met als doel te bepalen bij welke concentratie de mycocerosaten niet meer te onderscheiden zijn van de matrix. De matrix zonder M. ulcerans werd daarom ook geanalyseerd.
6. Conclusie
Doel van dit onderzoek was het aantonen van mycocerosaten, afkomstig van M. ulcerans, wanneer gespiked in huidweefsel. Uit dit onderzoek is gebleken dat dit mogelijk is mits de concentratie mycobacteriën hoog genoeg is. Of dit genoeg is om mycocerosaten als biomarker te gebruiken voor de diagnose van M. ulcerans in patiënten moet nog blijken. De detectielimiet is niet gevonden en er is ook onduidelijkheid over de identiteit van pieken 4 en 5 (figuren 8, 9 en 10) waardoor die mogelijk geen valide biomarkers zijn voor M. ulcerans. Ook werd er tijdens dit onderzoek gewerkt met huidweefsel en geen huidbiopten wat het geval zou zijn wanneer een met Buruli ulcer besmette persoon zou worden onderzocht.
7. Dankwoord
Dr. Wim KokDr. Hans-Gerd Janssen Dr. Arend Kolk
Msc. Marta Pacheco Botelho Mourão FNWI
HIMS
8. Referenties
[1] Dang, N. A.; Kolk, A. H. J.; Kuijper, S.; Janssen, H.; Vivo-Truyols, G. Metabolomics
2013, 9 , 1274–1285
[2] Kaal, E.; Kolk, A. H. J.; Kuijper, S.; Janssen, H. Journal of Chromatography 2009, 1216, 6319–6325
[3] Lakshmi, H. M. R.; Angala, P. S.; Gopinath, C. International Journal of
Pharmaceutical Quality Assurance 2013, 4, 42–51
[4] Skoog, D. A.; Crouch, S; Holler, J. F.; West, D. M. Fundamentals of Analytical
Chemistry, 8th ed.; Brooks/Cole: Belmont, 2003.
[5] Redman, J. E.; Shaw, M. J.; Mallet, A. I.; et al. Tuberculosis 2009, 89, 267–277 [6] Minnikin, D. E.; Besra, G. S.; Bolton, R. C.; et al. Annales de la Societe Belge de
Medecene Tropicale 1993, 73, 25–34
[7] Dang, N. A.; Kolk, A. H. J.; Kuijper, S.; Janssen, H.; Vivo-Truyols, G.; et al. Plos
One 2013, 8, e76263
[8] Ross, B. C.; Marino, L.; Oppedisano, F.; et al. Journal of Clinical Microbiology 1997, 35, 1696–1700
[9] Layre, E.; Moody, D. B. Biochemie 2013, 95, 109–115
[10] Jackson, M.; Stadthagen, G.; Gicquel, B. Tuberculosis 2007, 87, 78–86
[11] MacCallum, P.; Tolhurst, J.C.; Buckle, G.; Sissons, H. A. J Pathol Bacteriol 1948, 60, 92–122
[12] Van der Werf, T. S.; Van der Graaf, W. T. A.; Tappero, J. W.; Asiedu, K. The
Lancet 1999, 354, 1013–1018
[13] Morris, A.; Gozlan, R.; Marion, E.; et al. Plos Neglected Tropical Diseases 2014, 8, e2660
[14] WHO, Buruli ulcer Fact sheet N°199 2013
[15] Meyers, W. M.; Shelly, W. M.; Connor, D. H.; Meyers, E. K. American Journal of
Tropical Medicine and Hygiene 1974, 23, 919–923
[16] Chemlal, K.; Huys, G.; Laval, F.; et al. Journal of Clinical Microbiology 2002, 40, 2370–2380
[17] Chemlal, K.; Huys, G.; Fonteyne, P. A.; et al. Journal of Clinical Microbiology 2001, 39, 3272–3278
[18] Guimaraes-Peres, A.; Portaels, F.; de Rijk, P.; et al. Journal of Clinical Microbiology
1999, 37, 206–208
[19] Dang, N. A. non published results
[20] Neil, D. D.; Patricia A. G.; James J. B. Encyclopedia of Analytical Chemistry;
9. Bijlages
Bijlage 1: 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00(x10,000) 101 43 57 129 111 156 183 207 239 253 281 309 339 367 410 424 460 484 493Massa spectrum mycocerosaat C27
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00(x10,000) 101 57 43 193 123 164 136 269 221228 281 310 342 356 381 403 424 461470 500
Massa spectrum mycocerosaat C28
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00(x10,000) 74 87 43 143 382 339 111 157 199 283 351 O O Massa spectrum C26 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00(x10,000) 101 57 43 193 123 164 136 281 269 221 239 312322 353 381 403 424 470 500 458
Massa spectrum mycocerosaat C29
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00(x10,000) 101 57 69 111 143 171 183 208 253 281 309 381 409 452 365 240 329 430 471 492
Bijlage 2: Experiment 1
Massa chromatogram code 1-1 TIC
108.5 109.0 109.5 110.0 110.5 111.0 111.5 112.0 112.5 113.0 113.5 114.0 114.5 115.0 115.5 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 (x100,000,000)
Massa chromatogram code 1-1 m/z 101
110.0 110.5 111.0 111.5 112.0 112.5 113.0 113.5 114.0 114.5 115.0 115.5 116.0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 (x10,000)
Massa chromatogram code 1-1 m/z 410
109.0 109.5 110.0 110.5 111.0 111.5 112.0 112.5 113.0 113.5 114.0 114.5 115.0 115.5 116.0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25(x10,000)
Massa chromatogram code 1-2 TIC 100.0 101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 118.0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 (x100,000,000)
Massa chromatogram code 1-2 m/z 101
101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 118.0 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 (x100,000)
Massa chromatogram code 1-2 m/z 101 zoom
111.250 111.500 111.750 112.000 112.250 112.500 112.750 113.000 113.250 113.500 113.750 114.000 114.250 114.500 114.750 115.000 115.250 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 (x100,000)
Massa chromatogram code 1-2 m/z 410
109.5 110.0 110.5 111.0 111.5 112.0 112.5 113.0 113.5 114.0 114.5 115.0 115.5 116.0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 (x100,000)
Massa chromatogram code 1-3 TIC 101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0(x10,000,000)
Massa chromatogram code 1-3 m/z 101
101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0(x10,000,000)
Massa chromatogram code 1-3 m/z 410
107.5 108.0 108.5 109.0 109.5 110.0 110.5 111.0 111.5 112.0 112.5 113.0 113.5 114.0 114.5 115.0 115.5 116.0 116.5 117.0 117.5 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 (x10,000)
Massa chromatogram code 1-4 TIC 101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 118.0 119.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 (x10,000,000)
Massa chromatogram code 1-4 m/z 101
101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 118.0 119.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 (x100,000)
Massa chromatogram code 1-4 m/z 410
109.0 109.5 110.0 110.5 111.0 111.5 112.0 112.5 113.0 113.5 114.0 114.5 115.0 115.5 116.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 (x10,000)
Massa chromatogram code 1- 5 TIC 101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 118.0 119.0 120.0 121.0 122.0 123.0 124.0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 (x10,000,000)
Massa chromatogram code 1-5 m/z 101
101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 118.0 119.0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 (x100,000)
Massa chromatogram code 1-5 m/z 410
101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 118.0 119.0 120.0 121.0 122.0 123.0 124.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 (x1,000)
Bijlage 3: Experiment 6
Massa chromatogram code 6-1 TIC
101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 118.0 119.0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 (x10,000,000)
Massa chromatogram code 6-1 m/z 101
101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 118.0 119.0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 (x100,000)
Massa chromatogram code 6-1 m/z 410
100.0 102.5 105.0 107.5 110.0 112.5 115.0 117.5 120.0 122.5 125.0 127.5 130.0 132.5 135.0 137.5 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 (x1,000)
Massa chromatogram code 6-2 TIC 101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 (x100,000,000)
Massa chromatogram code 6-2 m/z 101
101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75(x1,000,000)
Massa chromatogram code 6-2 m/z 101 zoom
111.500 111.750 112.000 112.250 112.500 112.750 113.000 113.250 113.500 113.750 114.000 114.250 114.500 114.750 115.000 115.250 115.500 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 (x1,000,000)
Massa chromatogram code 6-2 m/z 410
109.5 110.0 110.5 111.0 111.5 112.0 112.5 113.0 113.5 114.0 114.5 115.0 115.5 116.0 116.5 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 (x100,000)
Massa chromatogram code 6-3 TIC 101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 (x10,000,000)
Massa chromatogram code 6-3 m/z 101
101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 (x1,000,000)
Massa chromatogram code 6-3 m/z 410
108.0 108.5 109.0 109.5 110.0 110.5 111.0 111.5 112.0 112.5 113.0 113.5 114.0 114.5 115.0 115.5 116.0 116.5 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25(x10,000)
Massa chromatogram code 6-4 TIC 101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 118.0 119.0 120.0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 (x10,000,000)
Massa chromatogram code 6-4 m/z 101
101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 118.0 119.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 (x100,000)
Massa chromatogram code 6-4 m/z 410
100.0 102.5 105.0 107.5 110.0 112.5 115.0 117.5 120.0 122.5 125.0 127.5 130.0 132.5 135.0 137.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 (x1,000)
Massa chromatogram code 6-5 m/z TIC 101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 118.0 119.0 120.0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 (x10,000,000)
Massa chromatogram code 6-5 m/z 101
101.0 102.0 103.0 104.0 105.0 106.0 107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 118.0 119.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 (x100,000)
Massa chromatogram code 6-5 m/z 410
107.0 108.0 109.0 110.0 111.0 112.0 113.0 114.0 115.0 116.0 117.0 118.0 119.0 120.0 121.0 122.0 123.0 124.0 125.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 (x10,000)
