Procesanalyse Pathologisch Anatomisch Laboratorium

P

ROCESANALYSE PATHOLOGISCH ANATOMISCH

LABORATORIUM

Afstudeerverslag over de optimalisatie van het verwerkingsproces van

patiëntmateriaal op het PAL, Amphia ziekenhuis

P

ROCESANALYSE PATHOLOGISCH ANATOMISCH

LABORATORIUM

Afstudeerverslag over de optimalisatie van het verwerkingsproces van

patiëntmateriaal op het PAL, Amphia ziekenhuis

Michelle Molenaar

Mjjh.molenaar@student.avans.nl

Biologie & Medisch Laboratoriumonderzoek, leerjaar 4 Mei 2013

Avans Hogeschool Breda Locatie Lovensdijkstraat 61-63

Begeleidster Avans Hogeschool: Ilse Hartel: eh.hartel-slager@avans.nl

Amphia Ziekenhuis Breda Locatie Molengracht

Begeleider Amphia Ziekenhuis: Mark van Olmen: molmen@amphia.nl Begeleidster Amphia Ziekenhuis: Astrid Dillise: adillisse@amphia.nl

V

OORWOORD

Tijdens de afstudeerperiode van oktober 2012 tot mei 2013 bij het Amphia ziekenhuis Molengracht is een procesanalyse, zowel als een in- en outputanalyse en een knelpuntenanalyse op het pathologisch analytisch laboratorium (PAL) verricht. Deze afstudeerstage op het PAL is gekozen vanuit een histologisch oogpunt, waarbij de minor histologie in 2011/2012 is afgerond op Avans Hogeschool tijdens de opleiding Biologie en Medisch laboratoriumonderzoek. De afstudeerperiode op het PAL was erg leerzaam en interessant, maar daarnaast ook leuk en gezellig door de goede hulp en omgang van collega’s. Ook de uitbreiding en verbetering van praktijkvaardigheden zijn hierbij positieve punten.

Ten eerste wil ik vanuit het Amphia ziekenhuis mijn stagebegeleiders Mark van Olmen en Astrid Dillise hartelijk bedanken voor hun hulp en begeleiding. Ook de werkgroep procesanalyse heeft mij goed op weg geholpen tijdens het verloop van het project. Daarnaast gaat dank uit naar alle medewerkers op het PAL, vanwege hun hulp en gezelligheid. Ten slotte wil ik mijn stagebegeleidster Ilse Hartel bedanken voor haar begeleiding vanuit Avans Hogeschool.

Michelle Molenaar Mei 2013

S

AMENVATTING

Wanneer bij patiënten een aandoening wordt ontdekt of verwacht, kan weefselmateriaal worden afgenomen. Aan het stellen van een diagnose gaat een histologisch proces vooraf, waarbij verschillende stappen van weefselbewerking aanwezig zijn. In een dergelijk proces kunnen essentiële dingen mis gaan, waarbij het stellen van een juiste diagnose kan worden belemmerd. Daarom is binnen het pathologisch laboratorium in het Amphia ziekenhuis een procesanalyse, compleet met in- en outputanalyse, een knelpuntinventarisatie en een oplossingeninventarisatie uitgevoerd. Om het histologische proces in kaart te brengen, werd ten eerste enkele maanden routine meegelopen op het pathologisch laboratorium. Hierbij werd elke stap geanalyseerd en achtergrondinformatie verzameld. Nadat een procesanalyse verricht was, werd elke stap binnen het histologische proces onderverdeeld in activiteiten. Deze in- en outputanalyse werd begonnen bij de ontvangst van patiëntmateriaal en eindigde bij het archiveren van dit materiaal. Tijdens het in kaart brengen van het verwerkingsproces van patiëntmateriaal, werd op enkele knelpunten gestuit. Om het histologische proces zo goed mogelijk te laten verlopen, werden deze knelpunten geïnventariseerd. Vervolgens werd gezocht naar geschikte oplossingen of verbeterpunten voor de gevonden knelpunten.

Na het verzameling van informatie werd het hoofdproces en de in- en output per stap samengesteld. Met behulp van de orderbrief kan patiëntmateriaal bij de ontvangst worden genummerd. Door het inzetten van de orderbrief wordt dit materiaal gekoppeld aan het PA-nummer. Dit gekoppelde patiëntmateriaal wordt gebruikt om weefselcassettes te printen. Met behulp van deze cassettes kan het weefsel in de bijbehorende cassette worden ingesloten. Het ingesloten materiaal kan vervolgens worden doorgevoerd, waarna het doorgevoerde weefsel ingebed kan worden. Het ingebedde materiaal wordt vervolgens tot coupes gesneden en geplakt op een bijbehorend preparaatglaasje. Deze wordt gekleurd en doorgegeven. Indien er navragen zijn, worden extra coupes gesneden en gekleurd, waarna het materiaal ten slotte gearchiveerd wordt. Bijbehorende knelpunten werden onderverdeeld in een door het laboratorium management systeem (LMS)-gestuurde oplossing en oplossingen in het belang van de analist. Met behulp van LMS zouden de volgende knelpunten opgelost kunnen worden: verkeerd nummeren van materiaal bij ontvangst, verwisseling van weefselstukjes bij insluiten, verkeerd inbedden van (huid-)weefsel, verwisselingen bij het snijden en monteren van coupes, verliezen van materiaal, doorgeven van preparaten aan de patholoog en verkeerde barcodestickers van (immunologische-) kleuringen. Knelpunten in het belang van de analist waren contaminatie en het gebruik van een verkeerde controlecoupe.

I

NHOUDSOPGAVE

2.3 Ontvangst en Macroscopische bewerking weefselmateriaal ... 9

2.3.1 Ontvangst en voorbewerking materiaal ... 9

2.3.2 Uitsnijden materiaal ... 10

2.3.3 Insluiten kleine weefselstukjes ... 11

2.3.4 Invriezen vers materiaal ... 11

2.3.5 Zagen/ontkalken/verweken hard materiaal ... 11

2.3.6 Vastleggen patiënten- en onderzoeksgegevens... 11

2.4 Histologische bewerking weefselmateriaal ... 12

2.4.1 Doorvoeren tot en met paraffine ... 12

2.4.2 Gieten van weefselstukjes... 13

2.4.3 Snijden en monteren ... 13

2.4.4 kleuren van coupes ... 15

2.4.5 Ventana Special Stainer ... 24

2.5 Immunologie... 25

2.5.1 DNA in situ hybridisatie en Fluorescentie in situ hybridisatie ... 26

2.5.2 Ventana IHC/ISH stainer ... 26

2.6 Microscopie ... 27

2.7 Doorgeven aan patholoog ... 28

2.8 Archiveren ... 28

2.9 Laboratorium informatie en management systeem (LMS) ... 29

3. Materiaal en methode ... 30

3.1 Routine pathologielaboratorium ... 30

3.1.1 Ontvangst en voorbewerking materiaal ... 30

3.1.2 Macroscopische bewerking materiaal ... 30

3.1.3 Histologische bewerking materiaal ... 31

3.1.4 Doorgeven aan pathologen ... 32

3.1.5 Archiveren ... 32

6 3.2.1 Procesanalyse ... 33 3.2.2 In- en Outputanalyse ... 33 3.2.3 Knelpuntinventarisatie ... 33 3.2.4 Oplossingeninventarisatie ... 33 4. Bevindingen ... 34 4.1 Procesanalyse ... 34 4.2 In- en outputanalyse ... 36 4.3 Knelpuntinventarisatie ... 38 4.4 Oplossinginventarisatie ... 42 4.5 Overzicht ... 48 5. Conclusie en aanbeveling ... 49

5.1 Conclusie en aanbevelingen in het belang van LMS ... 49

5.2 Conclusie en aanbevelingen in het belang van de analist ... 50

6. Discussie ... 52

Literatuurlijst ... 54

Bijlage I. Kleurpanels om aandoeningen te diagnosticeren ... 62

Bijlage II. Methode van uitgevoerde histologische routine- en speciaalkleuringen ... 63

Bijlage III. Tijdsbepaling van het proces per weefseltype ... 67

7

1. I

NLEIDING

Pathologie, ook wel ziekteleer genoemd, is een vak waarbij verschillende processen deelnemen. Het pathologisch en cytologisch laboratorium bestaat dan ook uit een histologisch en cytologisch gedeelte. De histologie richt zich op weefselverwerking, terwijl de cytologie dit op celniveau verzorgd. Binnen de histologie wordt daarnaast nog een afscheiding gemaakt naar immunologie. Deze richting richt zich op het aankleuren van weefselcoupes met behulp van antilichamen en in-situ hybridisatie. Orgaandelen, weefsels en cellen worden onderzocht om een bepaalde aandoening te constateren of uit te sluiten . [1]

Tijdens het histologische en immunologische proces kunnen knelpunten ontstaan, die de diagnostisering van weefselmateriaal vermoeilijken. Om deze knelpunten op te kunnen lossen, was het in kaart brengen van het gehele histologische en immunologische proces het eerste doel. Hierbij werd ook een in- en output analyse verricht, om te bepalen waar een product tijdens dit proces eindigde en verder ging. Daarnaast werden knelpunten gezocht en geconstateerd, waarbij mogelijke oplossingen en verbeteringen bedacht werden.

In dit afstudeerverslag bevindt zich in hoofdstuk 2 de theoretische achtergrond, waarbij de histologische en immunologische processen beschreven en uitgelegd worden. In hoofdstuk 3 zullen alle uitvoeringen die verricht zijn, zowel op het laboratorium als tijdens de proces- en knelpuntenanalyse, besproken worden. In hoofdstuk 4 zijn de hieruit ontstane bevindingen weergegeven, gevolgd door in hoofdstuk 5 een conclusie en in hoofdstuk 6 een discussie.

8

2. T

HEORETISCHE ACHTERGROND

2.1 HISTOLOGIE EN PATHOLOGIE

Het menselijk lichaam is opgebouwd uit diverse orgaanstelsels. Elk stelsel bevat organen die in samenwerkingen met elkaar optimaal functioneren. Ieder orgaan bevat vervolgens verschillende weefsels, elk met een bepaalde functie. Weefsel wordt gedefinieerd als een groep cellen van dezelfde opbouw en functie. [2] In Afbeelding 1 is een voorbeeld weergeven van orgaanstelsels in het menselijke lichaam, waarbij de colon apart is genomen (orgaan) en uitvergroot is op microscopisch niveau (weefsel). Histologie betekent weefselleer in de letterlijke zin, waarbij pathologie daarnaast een synoniem voor ziekteleer is.

A B C

Afbeelding 1. Orgaanstelsels van de mens weergegeven in A, waarbij de colon als voorbeeld is genomen in B en ingezoomd is op histologisch weefselniveau in C. [3][4][5]

Histologie is, kort samengevat, het bestuderen van weefsel op microscopisch niveau. Zoals in afbeelding 2 te zien is, kan onderscheid gemaakt worden tussen bindweefsel, spierweefsel, epitheelweefsel en zenuwweefsel, met elk een eigen functie. Wanneer (delen van) orgaanstelsels en weefsel niet of anders functioneren dan de bedoeling is, wordt gesproken van ziekte. Om deze ziekte te kunnen diagnosticeren, kan (een deel van) een orgaan of weefselbiopt worden uitgenomen. [6]

9

Afbeelding 2. Vier weefseltypen, waarbij bindweefsel is weergegeven in A, epitheelweefsel in B, spierweefsel in C en zenuwweefsel in D. [7]

Om weefselmateriaal te kunnen bekijken met behulp van een microscoop, dient dit materiaal bepaalde stappen te ondergaan. Ten eerste is weefsel vaak te dik om gelijk onder een microscoop te bekijken. Dit weefsel dient in plakjes van 3 µm te worden gesneden, ook wel coupes genoemd. Deze coupe is van nature kleurloos en zal dus geen contrast vormen onder een microscoop. Door onderscheid te maken tussen cel- en weefselcomponenten met verschillende kleurstoffen, wordt dit contrast wel gevormd. [8] In een pathologisch laboratorium wordt weefsel op deze manier verwerkt. De relevante stappen tijdens dit proces worden beschreven in paragraaf 2.2.

2.2 ROUTINE PATHOLOGIELABORATORIUM

Wanneer bij patiënten een aandoening wordt ontdekt of verwacht, kan weefselmateriaal worden afgenomen. Aan het stellen van een diagnose gaat een complex proces vooraf, waarbij verschillende stappen van weefselbewerking aanwezig zijn. In het Amphia ziekenhuis bestaat dit hoofdproces uit de ontvangst en voorbewerking van patiëntmateriaal, de macroscopische bewerking van dit materiaal, gevolgd door de histologische bewerking, eventueel microscopische controle en het doorgeven van patiëntmateriaal aan pathologen. Om een procesanalyse uit te kunnen voeren, wordt dit hoofdproces in kaart gebracht in paragraaf 2.3 tot en met 2.9.

2.3 ONTVANGST EN MACROSCOPISCHE BEWERKING WEEFSELMATERIAAL

2.3.1 O

Pathologisch materiaal wordt in fixatief door een bode of medewerker van een specifieke afdeling, bijvoorbeeld de operatiekamer, in het ziekenhuis binnengebracht op de afdeling pathologie. Het materiaal wordt met een aanvraagbrief ontvangen, waarop onder andere de patiëntengegevens, de aard van het ingezonden materiaal en soms de vraagstelling staan. Materiaal kan in formaline vervoerd worden, maar soms ook zonder fixatie, zoals urine. [9] Formaline, ook wel formaldehyde genoemd, is een organische stof die gebruikt wordt om weefsel te conserveren. Formaldehyde is een vluchtige stof en ontstaat door het gedeeltelijk laten oxideren van methanol. [10]

10

Na controle wordt het patiëntmateriaal gesorteerd op cito- en vriescoupemateriaal, speciale bewerking en standaard routinebewerking. Onder speciale bewerking vallen nierbiopten, huidbiopten voor immunofluorescentie (IF), vers ontvangen lymfeklieren, obducties, haarprotocol, huid-, spier/fascie-, en cristabiopten. [9]

2.3.2 U

Patiëntmateriaal wordt bij ontvangst op patiëntnummer gerangschikt en klaargezet voor de patholoog of analist. Bijbehorende weefselcassettes worden geprint, waarbij specifieke stukje weefsel uitgesneden en ingedoosd worden. Bij het uitsnijden worden verschillende kleuren cassettes gebruikt, zoals is weergeven in tabel 1. [11] Cassettes worden geprint met behulp van de Leica IPC, een geautomatiseerd printsysteem voor weefselcassettes. Deze wordt weergeven in afbeelding 3. [12]

Afbeelding 3. Leica IPC, waarmee automatisch weefsel-cassettes geprint kunnen worden [12]. Tabel 1. Weefselcassettes met bijbehorende kleurcodes voor het insluiten van uitsnijdmateriaal [11].

Kleur cassette Weefselinhoud

Wit Uitsnijdmateriaal met een standaard haematoxyline-eosine (HE) kleuring. Oranje Uitsnijdmateriaal met een standaard HE-kleuring en extra kleuringen. Geel Cito-aanvragen met standaard HE-kleuring of extra kleuringen. Groen Uitsnijdmateriaal van secties met een standaard HE-kleuring.

Rood Huidweefsel met haarprotocol, een standaard HE-kleuring en het snijden van een serie coupes of serie op.

Zoals in tabel 1 te zien is, worden witte weefselcassettes gebruikt voor standaard weefsel. In een oranje cassette worden weefselstukjes ingedoosd waar een speciale kleuring bij hoort. Gele cassettes worden gebruikt om aan te duiden dat deze moet spoed behandeld dienen te worden. Groene weefselcassettes bevatten obductiemateriaal en rode cassettes een haarprotocol.

Met behulp van G2 Speech wordt onder het juiste patiëntendossier de macroscopie van het (uitgesneden) weefsel ingesproken in het Uniforme Decentrale PALGA Systeem (UDPS). Stichting

11

PALGA is de beheerder van de landelijke databank van patiëntgegevens en pathologie-uitslagen. UDPS is hierbij de module die gebruikt wordt om verslaglegging van patiëntmateriaal mogelijk te maken. [13] G2 Speech is een module die aansluit bij UDPS, waarbij met behulp van spraak verslaglegging mogelijk gemaakt wordt. Hierbij wordt gebruik gemaakt van digitaal dicteren, waarbij de patholoog of analist dicteert en het secretariaat dit in UDPS verwerkt. [14]

Bij het inspreken van patiëntmateriaal worden de afmetingen van het weefsel en soms het gewicht beschreven. Ook de kleur en structuur met eventuele afwijkingen worden ingesproken. De locatie van de uitgenomen weefselstukken wordt daarnaast aangegeven. Elke weefselsoort heeft een ander uitsnijdprotocol. Bij een darmresectie met tumor wordt bijvoorbeeld een verschillend uitsnijdprotocol gevolgd dan een darmresectie met kenmerken van de ziekte van Crohn.

2.3.3 I

In de uitsnijkamer worden klein materiaal en spoelvochten macroscopisch beschreven en ingesproken met G2 Speech onder het bijbehorende patiëntendossier. Hierbij wordt de patiëntnaam en het patiëntnummer vermeld, gevolgd door het aantal weefselstukjes welke (totaal) ingesloten worden in het aantal cassettes en de kleur en afmetingen van dit weefsel. Indien nodig, kunnen weefselstukjes eerst gekliefd worden. De weefselcassettes zijn, vergelijkbaar met groot uitsnijdmateriaal, onderverdeeld met behulp van een aantal kleurcodes. [15] [16]

2.3.4 I

Indien weefsel voor vriescoupes gebruikt wordt of wanneer een bepaald onderzoek niet mogelijk is na het gebruik van paraffine, wordt patiëntmateriaal ingevroren. Het invriezen dient zo snel mogelijk te gebeuren, om verval van het patiëntmateriaal te voorkomen. Vriescoupes worden gesneden wanneer een snelle uitslag genoodzaakt is, zoals tijdens een operatie. In de vriesmicrotoom kan weefsel worden bevroren, waarna dit gereed is om te snijden. Vloeibare stikstof is een oplossing die gebruikt wordt om weefsel te laten bevriezen. [17] _{Vloeibare stikstof is kleur- en geurloos en wordt}

zwaarder naarmate deze stof kouder is. Het kookpunt ligt daarnaast bij -196 ◦C. [18]

2.3.5 Z

/

/

Hard weefsel, zoals botstukken en nagels, dienen na fixatie ontkalkt of verweekt te worden. Uit grote botstukken wordt een schijf gezaagd, waardoor snellere ontkalking plaatsvindt. Ontkalking kan plaatsvinden met behulp van zuren, waarbij de kalkzouten uit het botstuk geïoniseerd en weggespoeld worden. Het nadeel van zuren is dat de morfologie van het ontkalkte weefsel wordt aangetast. [19] Bothard weefsel wordt in principe ontkalkt met ontkalkingsmedium DC2, dat uit chloorwaterstofzuur en EDTA bestaat. [20] Chloorwaterstofzuur, ook wel bekend als zoutzuur, is een kleurloos gas, dat in water een sterk (bijtend) zuur vormt. [21] Ontkalking kan ook plaatsvinden met behulp van alleen EDTA, een chelaatbindende agens. Calciumionen uit het botstuk binden in geïoniseerde vorm aan EDTA en kunnen uit het weefsel verwijderd worden. EDTA is minder schadelijk voor de morfologie dan het gebruik van zuren. De ss-dubbelbinding welke in nagels aanwezig is, wordt met behulp van kaliumhydroxide afgebroken en zo verweekt. Nagels dienen goed gefixeerd te worden met formaline. Door crosslinking valt deze niet uit elkaar wanneer SS-bruggen worden verbroken. [19]

2.3.6 V

-

Bij binnenkomst van patiëntmateriaal worden patiënt- en materiaalgegevens in Palga UDPS gezet. Het onderzoeksnummer en patiëntennummer worden gescand, waarna de macroscopie van het weefsel ingesproken wordt met behulp van G2 Speech, zoals in paragraaf 3.2.1 en 3.2.2 besproken

12

wordt. Na verwerking van het materiaal, wordt de microscopie ook in G2 Speech ingesproken door de pathologen. De pathologen autoriseren vervolgens de microscopie met bijbehorende conclusie en diagnose. [22]

2.4 HISTOLOGISCHE BEWERKING WEEFSELMATERIAAL

2.4.1 D

Na de macroscopische bewerking van patiëntmateriaal, volgt de histologische bewerking. Alvorens weefsel gesneden en gekleurd kan worden, dient dit doorgevoerd en gegoten te worden. Doorvoeren gebeurt met een van de doorvoermachines. De Pathcentre van Thermo Scientific, zoals in afbeelding 4 te zien is, is hier een van. Deze is in staat om 306 cassettes door te voeren en maakt gebruik van het vacuüm trekken van de cassetteruimte in de machine. [23]

De eerste stap tijdens dit proces, is het fixeren met 4% formaline. Fixatie houdt in dat de structuur van weefsels en cellen vastgelegd wordt. Enzymen, eiwitten en fosfolipiden binnen dit weefsel worden daarbij geïnactiveerd, gedenatureerd en gecrosslinkt. Hierdoor wordt de moleculaire structuur behouden, waardoor geen weefsel- of celverval optreed. [8] [24] Vervolgens wordt het weefsel gedehydrateerd met behulp van een oplopende ethanolreeks. Dehydratatie zorgt voor een onttrekking van water uit het weefsel, waardoor paraffine de plaats van het water later kan invullen. Paraffine is hydrofoob, waardoor dehydratatie vereist is. Na dehydratatie, wordt het weefsel geïmpregneerd met xyleen. Xyleen spoelt eerder gebruikte ethanol uit het weefsel, waardoor paraffine tijdens de laatste stap het weefsel kan opvullen. Paraffine en ethanol mengen namelijk niet. Ten slotte wordt het weefsel geïmpregneerd met vloeibare paraffine van 56 ◦C. Paraffine zorgt hierbij dat weefsel tot coupes gesneden kan worden. [25]

Afbeelding 4. Pathcenter doorvoermachine, waarbij weefselcassettes doorgevoerd worden (pijl). Formaline, alcohol en xyleen bevinden zich in de bakken onderin de machine (pijlpunt). [23]

Een andere doorvoermachine welke gebruikt kan worden tijdens het doorvoerproces, is de Tispa Processor I. Een groot voordeel van deze doorvoermachine is dat minder schadelijke stoffen gebruikt

13

worden. Tijdens het doorvoeren worden hierbij ethanol, koolstofdioxide en paraffine gebruikt. De Tispa Processor is in staat op een cyclus voor 100 biopten binnen 1,5 uur te voltooien. Groter materiaal kan in 3,5 uur doorgevoerd worden. [26]

2.4.2 G

Na impregnatie worden weefselstukjes in vorm gegoten met behulp van paraffine en een inbedunit. Het weefselstukje wordt in een metalen malletje gelegd, waarin zich een dun laagje vloeibare paraffine bevindt. Paraffine, bestaande uit koolstofverbindingen, is een vaste stof die boven ongeveer 37 ◦C begint te smelten. Indien het weefselmateriaal op een goede manier in het malletje ligt, wordt het geheel op een koelplaatje gezet. Hierdoor komt het materiaal vast te zitten in de reeds lichtelijk gestolde paraffine. Het malletje wordt volgegoten met paraffine, waarna de plastic cassette hierop aangedrukt wordt. Op een koelplaat worden de paraffineblokjes gekoeld, waarna na stolling de paraffineblokjes uit de malletjes geklikt kunnen worden en hiervan coupes gesneden kunnen worden. Paraffine dient tijdens dit proces als verstevigend hulpmiddel om weefsel snijdbaar te maken tot coupes met een dikte van 3 μm. [27]

De inbedunit van het Amphia ziekenhuis bestaat uit de Tek Embedding Console en de Tissue-Tek Embedding Cryo Module. De embedding console dient metalen malletjes en paraffine warm te houden, waarna de cryo module de gegoten blokjes koelt en verhard. In de embedding consule bevindt zich een kraantje, waaruit na indrukken van een drukplaatje paraffine stroomt. [28][29] In afbeelding 5 is de Tissue-Tek embedding console met bijbehorende cryo module weergeven. Het paraffinekraantje wordt met de pijl aangegeven, met daarnaast de twee verwarmde laatjes. [29]

Afbeelding 5. Tissue-Tek embedding module met bijbehorende tissue-tek cryo module, waarbij weefsel in vloeibare paraffine tot weefselblokjes gegoten kunnen worden. [29]

2.4.3 S

Nadat de paraffineblokjes gehard zijn, zoals in paragraaf 2.4.2 besproken wordt, kunnen coupes gesneden worden. Van paraffineblokjes worden met behulp van een microtoom weefselcoupes of – lintjes gesneden van 3 μm. De dikte van de coupes is erg belangrijk voor het microscopische beeld. Na het snijden van coupes, worden deze in een warmwaterbad gestrekt en op een preparaatglas geplakt. Vriescoupes worden met behulp van een vriesmicrotoom gesneden, waarna deze direct worden opgevangen. [30]

14

Een (rotatie-) microtoom bevat een rotatiewiel, dat voor verticale beweging van de blokhouder zorgt. De blokhouder kan daarnaast richting het mes bewegen op de dikte die van tevoren is ingesteld (standaard 3 μm). [31] In afbeelding 6 wordt een rotatiemicrotoom weergegeven. De meshouderbasis kan naar voren en achteren geschoven worden. Het paraffineblokje dient in de preparaathouder geplaatst te worden, waarna deze met een bedieningspaneel op de juiste afstand van het mes gezet kan worden. Wanneer alle instellingen juist zijn, kan met behulp van het handwiel het paraffineblokje worden aangesneden. [32]

Afbeelding 6. Leica RM2245 rotatiemicrotoom met preparaathouder, handwiel, meshouderbasis en meshouder, bedieningspaneel en afvalbak. [32]

Afhankelijk van de kleur- en tekstcode op de eerder geprinte weefselcassette, dienen een aantal coupes of linten gesneden te worden en een etikettering op de objectglaasjes geplakt te worden. Elke sticker bevat op de eerste regel een uniek nummer, beginnend met een T (histologie), C (cytologie), S (sectie) of controle. Op de tweede regel bevindt zich de verdere nummering. Wanneer er per patiënt twee weefselpotjes binnen gekomen zijn, staat er (afhankelijk van het aantal potjes) voor de gebruikte letter een I, II, III enzovoorts. Op de derde regel komt het verzoek of de gewilde kleuring, zoals in afbeelding 7 is weergeven. [33]

Afbeelding 7. Twee objectglasetiketten, met op de eerste regel het pathologienummer, gevolgd door de nummering van het aantal weefselpotjes of –cassettes en op de derde regel het verzoekje of de kleuring. [33]

15

In tabel 2 worden de hoeveelheid en het soort preparaatglaasjes met bijbehorende cassettekleur en –tekst weergeven. [34]

Tabel 2. Het aantal en de soort preparaatglaasjes die per cassettekleur gebruikt worden voor het plakken van weefselcoupes [34]

.

Kleur cassette Soort en hoeveelheid glaasjes

Wit, groen Standaard, een preparaat voor de HE-kleuring.

Oranje Extra kleuring. Uitsnijdwerk dient in 2 lintjes gesneden te worden, waarvan coupes op Starfrostglaasjes (behalve PAS) geplakt worden.

Roze 3 Lintjes voor 3 HE-kleuringen van klein weefselmateriaal. Ook bij agar worden 3 lintjes gesneden voor 3 HE-kleuringen.

Blauw 2 Lintjes voor 2 HE-kleuringen van celmateriaal.

Rood Haarprotocol waarbij sprongsgewijs een serie wordt opgesneden voor 10 HE-kleuringen.

Zoals in tabel 2 duidelijk gemaakt wordt, snijdt een analist van een standaard cassette slechts enkele coupes. Bij oranje en blauwe cassettes worden echter 2 lintjes van meerdere coupes aan elkaar gesneden. Van elk lintje wordt dan een coupe geplakt. Roze cassettes bevatten naaldbiopten en worden in 3 lintjes gesneden. Bij een haarprotocol wordt het paraffineblokje compleet opgesneden.

2.4.4

Nadat coupes gesneden en geplakt zijn, kan het weefselmateriaal worden gekleurd. Een standaard HE-kleuring wordt machinaal uitgevoerd, evenals de PAS-kleuring. Ook de alcian blue-, congorood-, grocott-, laguesse- en perlskleuring worden machinaal met de Ventana stainer uitgevoerd. Er wordt onderscheid gemaakt tussen kleuringen die kleurstoffen bevatten welke selectief binden aan een celcomponent en kleurstoffen die een chemische reactie gebruiken. [35]

ALCIAN BLUEKLEURING

Alcian blue is een basische, koperachtige kleurstof dat zich aan zure bestanddelen bindt. Alcian blue met een pH 1 is in staat om gesulfateerd zuur slijm aan te kleuren. Dit soort slijm is aanwezig in kraakbeen, longklieren en slijmbekercellen (in bijvoorbeeld de darm). Alcian blue met een pH van 2.5 kan naast gesulfateerd slijm ook gecarboxyleerd slijm aankleuren in bindweefsel en kraakbeen. In laboratoria wordt deze kleuring gebruikt om zure slijmdelen aan te kleuren in verschillende bindweefsel- en epitheeltumoren. [36] Bij tumoren uit het mesotheel, bijvoorbeeld, is een grote hoeveelheid niet-gesulfateerd zuur slijm aanwezig en ook bij artherosclerose wordt een toegenomen hoeveelheid waargenomen. Deze kleurstof vormt zoutverbindingen met de zure groepen in mucopolysachariden. [37] In afbeelding 8 is slijm blauw aangekleurd met behulp van de alcian blue kleuring. Dit slijm is afkomstig van slijmbekercellen in de colon. [38]

Afbeelding 8. Colon met slijmbekercellen, waarbij slijm blauw is aangekleurd dankzij de alcian bluekleuring. [38]

16

AURAMINEKLEURING

Auramine en rhodamine zijn is basische fluorochromen die zich binden aan mycoliczuur in mycobacteriële celwanden. Dit bestanddeel in de celwand licht op tegen een donkere achtergrond bij een bepaalde golflengte onder een fluorescentiemicroscoop, omdat zuurvaste mycobacteriën ontkleuring door zure ethanol tegengaan. Natriumpermanganaat voorkomt daarnaast aspecifieke bindingen van het fluorchroom. [39] Mycobacterium tuberculosis wordt door deze kleuring aangetoond en veroorzaakt tuberculose, een infectieziekte in de longen. In afbeelding 9 is de auraminekleuring op deze bacterie weergeven. [40]

Afbeelding 9. Mycobacterium tuberculosis, aangekleurd met de auramine fluorescentiekleuring. [40]

AZANKLEURING

De azankleuring is een dubbele kleuring met azocarmijn en anilineblauw. Bindweefsel (collageen, reticulum), spierweefsel, gliacellen, erytrocyten, celkernen en het bindweefselnetwerk in nierglomeruli wordt dankzij deze kleuring aangetoond. [41] _{De azankleuring is een trichroomkleuring}

waarbij azocarmijn, anilineblauw en orange G gebruikt worden. Azocarmijn is een zure kernkleurstof en kleurt basische eiwitten in celkernen aan. Anilineblauw kleurt het bindweefsel, zoals de naam al aangeeft, daarnaast blauw. Ook deze kleurstof is zuur, wat zorgt dat bindweefsel de kleurstof opneemt. In combinatie met Orange G wordt cytoplasma aangekleurd. [42] De azankleuring kan gebruikt worden voor het diagnosticeren van bijvoorbeeld levercirrose, waarbij een toename van bindweefsel aanwezig is. In afbeelding 10 is een vervet leverpreparaat weergeven, waarin duidelijk de onderscheiding te maken is tussen blauw bindweefsel en roze cytoplasma. [43]

Afbeelding 10. Leverweefsel, aangekleurd met de azankleuring. Bindweefsel kleurt hierbij blauw aan in combinatie met roze cytoplasma. [43]

17

CONGOROODKLEURING

Wanneer afzettingen van amyloïd in weefsel aanwezig zijn, kunnen deze eiwitten aangekleurd worden met behulp van congorood. Congorood heeft een hoge affiniteit voor de opeengehoopte β-sheets in amyloïd. [44] De binding van congorood aan deze sheets in amyloïd veroorzaakt een dubbelbreking onder de polarisatiemicroscoop, waardoor amyloïd appeltjesgroen aankleurt. Ook kunnen keratine, elastine en collagene vezels aangekleurd worden. [45] Amyloïdose is een aandoening waarbij amyloïdafzettingen een kenmerk zijn. Door deze afzettingen kan de werking van bepaalde organen verstoord worden. Een voorbeeld hiervan is de ziekte van Alzheimer (dementievorm), waarbij amyloïdplaques in de hersenen aanwezig zijn. In afbeelding 11 worden amyloïdafzettingen weergeven in vetweefsel. Deze afzettingen lichten appeltjesgroen op tegen een donkergroene achtergrond. [46]

Afbeelding 11. Amyloïdafzettingen die zich in een vetweefselbiopsie bevinden, weergeven onder een polarisatielens. [46]

FOUCHETKLEURING

Bilirubine is een galproduct dat ontstaat wanneer erytrocyten worden afgebroken. Om bilirubine bijvoorbeeld in ophopingen van galproducten in de lever aan te tonen, wordt de fouchetkleuring gebruikt. De oorzaak van een dergelijke ophoping zou een verstopping van de lever- of galwegen kunnen zijn. Fouchetreagents oxideert galpigment naar biliverdine, een product dat groen aankleurd.

[47]

In afbeelding 12 is leverweefsel met bilirubinestapelingen weergeven, aangekleurd met de fouchetkleuring. [48]

18

GIEMSAKLEURING

De Giemsakleuring is een speciale kern- en cytoplasmakleuring, voornamelijk bruikbaar voor hemapoëtische weefsels. Verschillende cellijnen kunnen met behulp van deze kleuring in kaart worden gebracht om tumoren en bloedafwijkingen te kunnen constateren. Ook parasieten kunnen hierbij gediagnosticeerd worden. De basische kleurstof methyleenblauw wordt gecombineerd met een zure kleurstof, zoals eosine of azure A/B. Zo worden verschillende celsoorten aangekleurd; eosinofielen nemen bijvoorbeeld eosine op, terwijl basofielen methyleenblauw zullen opnemen. [48] In afbeelding 13 is beenmerg aangekleurd met de giemsa-kleuring, waarbij de patiënt aan cutane mastocytose lijdt, ook wel mestcelziekte genoemd. Leukocyten zijn hier van elkaar te onderscheiden, lettende op de vorm en kern. [49]

Afbeelding 13. Beenmerg, aangekleurd met een Giemsakleuring. [49]

GRAMKLEURING

Om micro-organismen aan te tonen, kan de gramkleuring gebruikt worden. Kristalviolet kleurt hierbij achtergrondweefsel en nucleïnezuren uit deze micro-organismen aan. Na differentiatie met ethanol, zullen Gramnegatieve bacteriën en achtergrondweefsel ontkleuren. Grampositieve bacteriën hebben een dikkere celwand dan gramnegatieve, waardoor deze niet zullen ontkleuren. Een nakleuring met bijvoorbeeld saffarine zorgt er voor dat de achtergrond en gramnegatieve bacteriën roze aankleuren. De Gramkleuring wordt voornamelijk gebruikt om infecties aan te kunnen tonen. [50] In afbeelding 14 zijn grampositieve bacteriën aangekleurd in longweefsel. [51]

19

GROCOTTKLEURING

De Grocottkleuring, ook wel Grocott’s methanamine zilverkleuring, wordt gebruikt om schimmels aan te tonen in weefsel en zo een schimmelinfectie te kunnen diagnosticeren. Polysachariden in de celwand van schimmels worden geoxideerd door chroomzuur. Hierbij worden aldehydegroepen gevormd, die de zilverionen reduceren naar metallic zilver. Schimmels zullen hierdoor zwart aankleuren tegenover een groenblauwe achtergrond. [48] In afbeelding 15 is de zwarte aankleuring van schimmels duidelijk weergeven. [52]

Afbeelding 15. Schimmeldraden in weefsel, aangekleurd met behulp van de Grocottkleuring. [52]

HAEMATOXYLINE-EOSINEKLEURING

De haematoxyline-eosinekleuring is een routinekleuring die gebruikt wordt om de morfologie van een weefsel te onderzoeken. In een basische omgeving is het oxidatieproduct van haematoxyline, haematine genaamd, blauw. In een zure omgeving is deze roze. Met behulp van spoelen met kraanwater wordt deze kleurstof geblauwd. Eosine kleurt daarnaast cytoplasma en bindweefsel roze, waardoor een goed overzicht gecreëerd wordt in het weefsel. [53] Haematoxyline kan worden geoxideerd met behulp van natriumidodaat en kwikchloride. Vervolgens is haematine pas bindbaar met weefsel na het toevoegen van een beitsmiddel. Haematine is een zure kleurstof die zich aan basische bestanddelen bindt, zoals eiwitten in de celkern. Eosine is daarnaast een basische kleurstof, en bindt zich aan zure bestanddelen in het cytoplasma. In afbeelding 16 is een HE-kleuring weergeven, waarbij de celkernen duidelijk blauw- en het cytoplasma roze is aangekleurd. Verschillende bestanddelen van weefsel krijgen een roze kleur met behulp van eosine, maar elk in een andere tint. Bindweefsel kleurt bijvoorbeeld donkerder aan dan cytoplasma. [48]

20

JONESKLEURING

Om basaalmembranen in bijvoorbeeld nierglomeruli aan te kleuren, wordt de joneskleuring gebruikt. Hierbij kunnen afwijkingen geconstateerd worden in de nier. Koolhydraten in het basaalmembraan worden aangekleurd met behulp van methanamine. Perjoodzuur oxideert koolhydraten tot aldehyden, vergelijkbaar met de grocottkleuring. Zilvernitraat uit Jones zilveroplossing A zorgt voor zilverionen, terwijl oplossing B een basische omgeving verzorgt. Zilverionen worden hierbij gereduceerd tot (zichtbaar) metallic zilver. [54] In afbeelding 17 is een glomeruli in de nier weergeven en aangekleurd met een joneskleuring. Het basaalmembraan is hierbij grijs/zwart aangekleurd.

[55]

LAGUESSEKLEURING

Net als bij de Joneskleuring, worden met behulp van de laguessekleuring ook basaalmembranen aangetoond. Hierbij worden echter ook reticulinevezels aangekleurd, waarbij de laguessekleuring gebruikt kan worden om fibrose aan te tonen. Polysachariden in reticulinevezels en basaalmembranen worden wederom geoxideerd tot aldehyden met behulp van kaliumpermanganaat. De zilveroplossing wordt gereduceerd tot zichtbaar metallic zilver. Met behulp van goudchloride combineert zilver zich met chloride en slaat neer op de zilverdeeltjes in het weefsel. Met kernechtrood wordt de achtergrond aangekleurd. [56] In afbeelding 18 is leverweefsel weergeven waarbij het basaalmembraan en reticulinevezels grijs zijn aangekleurd met behulp van de laguessekleuring. [57]

Afbeelding 17. Nierglomeruli met zwart basaalmembraan, aangekleurd met een Joneskleuring. [55]

Afbeelding 18. Leverweefsel, aangekleurd met de laguesse-kleuring. Reticulinevezels en het basaalmembraan zijn grijs aangekleurd. [57]

21

LAWSON VAN GIESONKLEURING

Met behulp van de Lawson van Giesonkleuring kunnen elastische vezels in weefsel aangekleurd worden. Deze vezels bevinden zich voornamelijk in bloedvaten en de huid, waardoor bijvoorbeeld aderverkalking gediagnosticeerd kan worden. Fuchsine en resorcine zorgen in de Lawsonoplossing voor binding met elastische vezels waarbij Weigert’s ijzerhaematoxyline met aminozuren in celkernen bindt. Weigert’s haematoxyline bestaat uit bestanddeel A en B, waarbij B ijzerchloride bevat. IJzerchloride zorgt voor een oxidatie van het geheel tot ijzerhaematine. IJzerhaematine bindt zich aan histonen in de basische kernen van weefsel. Zure fuchsine bestaat daarnaast uit grote moleculen en kleurt bindweefsel rood. Kleine moleculen uit

picrinezuur kleuren het fijnere cytoplasma geel aan. [58] In afbeelding 19 is de Lawson van Giesonkleuring weergeven, waarbij collageen bindweefsel rood is aangekleurd. Elastisch bindweefsel is zwart gekleurd langs de wanden van de arterie weergeven. [59]

LEDERKLEURING

De lederkleuring, ook wel napthol AS-D chloroacetaat esterase genoemd, wordt gebruikt om myeloïde- en mestcellen aan te kleuren in weefsel. Naphthol AS-D Chloroacetaat wordt gehydroliseerd door het enzym esterase, wat zich in het weefsel bevindt. [60] Naphthol AS-D bindt vervolgens met diazoniumzout en vormt hierbij een neerslag. Deze neerslag is rood (fast red violet) of blauw (fast blue), waarbij pH erg belangrijk is. [61] In afbeelding 20 is de lederkleuring weergeven, waarbij positieve cellen rood zijn aangekleurd met daarnaast donkerblauwe celkernen. [62]

Afbeelding 20. Hyperplasie van beenmercellen, aangekleurd met de lederkleuring. Positieve cellen van de neutrofiele reeks zijn hierbij rood aangekleurd. [62]

Afbeelding 19. Een arterie, aangekleurd van de Lawson van Giesonkleuring. Collageen bindweefsel kleurt hierbij rood aan, terwijl elastisch bindweefsel zwart rondom en binnenin de arterie is aangekleurd. [59]

22

METHYLEENBLAUWKLEURING

Methyleenblauw is een kleurstof die veelvuldig op microbiologisch gebied gebruikt wordt. Daarnaast kunnen ook granulocyten aangekleurd worden. [63] Wanneer weefseldelen metachromatisch zijn, zoals mestcellen, slijm of kraakbeen, zal dit roodpaars aankleuren. Door het aantonen van mestcellen kunnen bijvoorbeeld allergische reacties bevestigd worden. Metachroïsme ontstaat door het vormen van nieuwe intermoleculaire bindingen tussen kleurmoleculen, wanneer deze dicht op elkaar gebracht worden. In bijvoorbeeld slijmproducten rangschikken de anionische koolhydraten de cationische kleurdeeltjes. Metachroïsme is, kort samengevat, het verschillen van kleur van een kleuroplossing na reactie met een specifiek weefseldeeltje. [64]

PERIODIC ACID SCHIFF

De periodic acid schiffkleuring, ook wel PAS-kleuring genoemd, wordt gebruikt om koolhydraten zoals glycogeen aan te kleuren in bijvoorbeeld slijmbekercellen. Ook basaalmembranen en schimmelinfecties kunnen aangetoond worden. Met behulp van perjoodzuur worden koolhydraten geoxideerd tot aldehyden. Alleen 1-2 glycolen worden bij de PAS-kleuring aangekleurd. [65] Fuchsine uit het Schiff’s reagens bindt aan de aldehydegroepen, waardoor deze roze kleuren. Ook kan een PAS+-kleuring gebruikt worden, ook wel PAS diastase genoemd. Amylase is een enzym dat glycogeen afbreekt tot glucose, waardoor glycogeen niet positief aankleurt. Wanneer deze in de normale PAS-kleuring wel positief is, kan geconcludeerd worden dat glycogeen aanwezig is. [48] In afbeelding 21 is de PAS+-kleuring vergeleken met de PAS-kleuring.

Afbeelding 21. PAS-kleuring (links), waarbij glycogeen als roze druppels worden aangekleurd in het celmembraan, vergeleken met de PAS+ diastase-kleuring (rechts), waarbij deze druppels verdwenen zijn. [66]

PERLSKLEURING

De perlskleuring wordt veelvuldig gebruikt om afbraakproducten van ijzer aan te tonen in bijvoorbeeld leverweefsel. In het beenmerg wordt ijzer in erytroblasten gebouwd, de voorlopers van erytrocyten. Bij de afbraak van erytrocyten, komen deze ijzerdeeltjes weer vrij en worden opgeslagen in macrofagen en hepatocyten in de lever. Ook kan ijzer zich binden aan hemosiderine, een eiwit in het bloed dat uit ferritinemoleculen bestaat. Om ijzerstapeling te kunnen diagnosticeren, kan deze kleuring gebruikt worden. Zoutzuur zorgt tijdens de perlskleuring voor het vrijkomen van ijzerionen uit eiwitten in weefseldelen. Deze ionen reageren met natriumferrocyanide, waarbij ijzerferrocyanide ontstaat. IJzerferrocyanide vormt een (Pruisisch) blauwe aankleuring. [67] Deze reactie gaat als volgt:

23

In afbeelding 22 is de perlskleuring op leverweefsel uitgevoerd, waarbij ijzerdeeltjes blauw zijn aangkleurd. [68]

Afbeelding 22. Leverweefsel, aangekleurd met de perlskleuring. IJzerdeeltjes zijn hierbij blauw aangekleurd in de cellen. [68]

TOLDUIDINEBLAUWKLEURING

De toluidineblauwkleuring wordt gebruikt om mestcellen aan te tonen in verschillende weefselsoorten. Mestcellen komen voornamelijk voor bij allergische reacties. Granulen in mestcellen reageren met tolduineblauw en kleuren hierbij paars. Achtergrondweefsel is blauw aangekleurd. Het verschillen van de kleur van een bepaald weefseldeeltje van de oorspronkelijke kleur van de oplossing, wordt metachomasie genoemd. [48] Bij ‘Methyleenblauwkleuring’ is dit reeds uitgelegd. In afbeelding 23 is de toluidineblauwkleuring weergeven, waarbij mestcellen paars aangekleurd worden

[69]

.

Afbeelding 23. Nasale poliep, waarbij mestcellen paars zijn aangekleurd met behulp van de toluidineblauwkleuring. [69]

SCHMORLKLEURING

De schmorlkleuring wordt gebruikt om ijzerionen in weefsel aan te kleuren. Bij deze kleuring wordt ferricyanide naar ferrocyanide gereduceerd, waarbij Pruisisch blauw gevormd wordt met behulp van ijzerionen. Ook kunnen argentafine en chromafine, evenals melanine en lipofuchsine worden aangetoond. [70] In afbeelding 24 zijn melanocyten blauw aangekleurd in huidweefsel met behulp van de Schmorlkleuring.

24

Afbeelding 24. Huidweefsel met melanocyten, aangekleurd met de Schmorlkleuring. [71]

ZIEHL-NEELSENKLEURING

De Ziehl-Neelsenkleuring wordt gebruikt om mycobacteria aan te tonen in bijvoorbeeld longweefsel. Deze zuurvaste bacteriën zijn de veroorzakers van tuberculose. Ook lepra kan met deze kleuring aangetoond worden. Zoals eerder besproken, kan deze bacterie met behulp van de auraminekleuring aangekleurd worden. Carbolfuchsine uit de ZN-kleuring wordt door de lipoïde capsule van mycobacteriën opgenomen. [72] In afbeelding 25 wordt de Ziehl-Neelsenkleuring weergeven, waarbij deze is uitgevoerd op sputum. [73]

Afbeelding 25. Sputum, aangekleurd met de Ziehl-Neelsenkleuring. Zuurvaste staven zijn hierbij roze aangekleurd tegenover een blauwe achtergrond. [73]

KLEURPANNELS

De kleuringen die in paragraaf 2.4.4 besproken zijn, kunnen in combinatie met elkaar zogenaamde panels vormen. Deze panels worden in bijlage I besproken. [74]

2.4.5 V

S

S

Met behulp van de Ventana BenchMark Special Stainer kunnen kleuringen automatisch uitgevoerd worden met bijbehorende kits. Ook deparaffinisatie is hierbij inbegrepen. Met behulp van barcodes worden preparaten en kits gescand en aan elkaar gelinkt, waardoor meerdere kleuringen in een machine uitgevoerd kunnen worden. In afbeelding 26 is de Ventana Special Stainer weergeven. In de carrousel kunnen kleurstoffen geplaatst worden. Onder de carrousel bevindt zich een laadklep, waarin preparaten geklikt kunnen worden. In de kast zijn wasvloeistoffen en afvalvaten geplaatst. [75]

25

Afbeelding 26. Ventana BenchMark Special Stainer, waarbij kits in de carrousel- (pijl) en preparaten in de laadklep (pijlpunt) geplaatst worden. Wasvloeistoffen en afvalvaten bevinden zich in de kast. [75]

2.5 IMMUNOLOGIE

Wanneer specifieke cellen of celdelen aangetoond dienen te worden, wordt gebruik gemaakt van immunohistochemie. Hierbij worden antilichamen gebruikt, die zich zullen hechten aan een bijbehorend antigeen. Wanneer aan de gebruikte antilichamen een label is gehecht, zoals een enzym of fluorescentielabel, kunnen antigenen opgespoord worden in het weefsel. Bij de aanwezigheid van een fluorescentielabel, kunnen de gekleurde coupes onder een fluorescentiemicroscoop worden bekeken. Bij de aanwezigheid van een enzym aan het antilichaam, zoals peroxidase, zorgt de omzetting van een toegevoegd substraat voor een aankleuring. Deze methode kan direct of indirect plaatsvinden. Bij de directe methode wordt een primair antilichaam inclusief label gebruikt, die direct op het epitoop hecht. De indirecte methode houdt in dat een primair antilichaam zich aan een epitoop hecht, waarbij een secundair antilichaam met label zich aan het primaire antilichaam hecht. De gevoeligheid van de indirecte methode is vele malen groter dan de directe methode. [8] Immunologische kleuringen worden aangevraagd om bijvoorbeeld de aard van een tumor of de geschiktheid van een behandeling te bepalen. In afbeelding 27 is de schematische weergave van de indirecte methode afbeeld.

26

Afbeelding 27. Schematische weergave van een antigeen-antistofreactie, waarbij het primaire antilichaam gebonden zit aan het antigeen (Ag). Het secundaire antilichaam heeft zich daarnaast gebonden aan het primaire antilichaam en bevat biotinemoleculen (B), welke zich aan avidine binden. Avidine (A) bevat het enzym (E), wat met behulp van een substraat een kleuromslag laat zien. [76]

2.5.1 DNA

F

DNA in situ hybdridisatie (DISH) is een methode op de afdeling immunologie waarbij een probe gehybridiseerd wordt aan een bepaalde sequentie in het target-DNA uit een weefselcoupe. Het DNA wordt hierbij gedenatureerd in een verwarmde omgeving, waarbij de probe zich kan binden aan de gewenste sequentie.[77] Bij fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) kan de probe gedetecteerd met behulp van een fluorochroom, dat aan de probe gebonden zit. Dit fluorochroom kan, wanneer avidine aan het fluorochroom bevestigd is, door middel van het binden aan biotine (dat reeds aan de probe gebonden zit) gekoppeld worden aan deze probe. [78] Bij chromogeen in situ hybridisatie (CISH) is dit hetzelfde geval, waarbij het fluorochroom vervangen is door een chromogeen. CISH kan echter onder een lichtmicroscoop bekeken worden, terwijl bij FISH een fluorescentiemicroscoop gebruikt dient te worden.

De DISH- en FISH-methoden kunnen gebruikt worden om het HER2-gen aan te tonen, dat aanwezig kan zijn bij patiënten met borstkanker. Wanneer dit gen aangetoond wordt, zorgt behandeling met Herceptin voor een gunstige prognose. [79] Bij deze methode wordt daarnaast een probe gericht tegen het centromeer van chromosoom 17, CEP17 genaamd. CEP17 functioneert als controle voor chromosoom 17, terwijl HER2 het allel aantoont dat deze borstkanker kan veroorzaken. [80] Wanneer deze in een ratio van 2:2 voorkomen, is Herceptine waarschijnlijk geen geschikte behandeling. Indien CEP17 wel twee keer voorkomt, maar het HER2-gen vaker aanwezig is per cel, kan Herceptine een geschikte behandeling zijn, omdat het gen geamplificeerd is. Wanneer CEP17 juist vaker voorkomt en het Her2-gen maar 2 keer, kan er sprake zijn van een vermeerdering van chromosoom 17 en wordt de aandoening niet speciaal veroorzaakt door het HER2-gen. [81]

2.5.2 V

IHC/ISH

De Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH stainer is een multimodaal systeem dat bestuurd wordt met behulp van een computer, waarbij zowel immunohistochemische kleuringen als fluorescentie en in situ hybridisatie kan worden uitgevoerd. Deze bevat 30 laadkleppen om preparaten onafhankelijk van elkaar te kleuren. In de carrousel kunnen verschillende antisera en –kits worden geplaatst. Preparaten kunnen met behulp van deze kleurmachine gekookt, geparaffineerd en gekleurd worden in een goed milieu. In afbeelding 28 is de kleurmachine afgebeeld. [82]

27

Afbeelding 28. Ventana Benchmark ULTRA stainer, waarbij immunohistochemische- en fluorescentieskleuringen kunnen worden uitgevoerd, evenals in situ hybridisatie. Preparaten worden in de laadkleppen geplaatst (pijl). In de carrousel (pijlpunt) worden antisera gezet. [82]

De Ventana Benchmark bevat vooraf ingeprogrameerde protocollen van immunohistochemische kleuringen en koppelt de barcode van ingevoerde preparaten aan immunohistochemische kleuringen. Met behulp van een naald en beweegbare arm in de carrousel wordt reagentia op de juiste preparaten gedruppeld. In deze carrousel worden ook de reagentiapompjes geplaatst. [83]

2.6 MICROSCOPIE

Na het kleuren van coupes met een speciaalkleuring, immunohistochemische kleuring of immunofluorescentie kleuring, worden preparaten gecontroleerd onder een microscoop. Een lichtmicroscoop wordt gebruikt voor (speciaal-) kleuringen en immunohistochemische kleuringen. De lichtmicroscoop bestaat ten eerste uit een condensor, waarbij een bepaalde hoeveelheid licht door gelaten kan worden. Vervolgens bevat de microscoop een objectief, die samen met de condensor een beeld vormt. Deze twee delen dienen goed van elkaar afgesteld te worden om optimaal beeldresultaat te verkrijgen. Met het oculair wordt het gevormde beeld vervolgens vergoot en geprojecteerd. In afbeelding 29 is een lichtmicroscoop, inclusief onderdelen, weergeven. [8]

28

Naast de lichtmicroscoop, wordt op een laboratorium ook fluorescentiemicroscopie toegepast. Fluorescerende onderdelen van weefsel of cellen zullen hierbij oplichten tegenover de achtergrond van dit materiaal. In een fluorescentiemicroscoop bevindt zich een excitatieflter, die de golflengte van de uitgestraalde lichtbundel beperkt tot een bepaald gehalte. Het licht dat uitgezonden wordt door het preparaat gaat door een sperfilter. Deze filter houdt overig excitatielicht tegen. Ook antigenen kunnen aangetoond worden met zogenaamde probes, zoals antilichamen. [8]

2.7 DOORGEVEN AAN PATHOLOOG

Wanneer coupes gekleurd zijn en uit de afdekmachine komen, worden deze doorgegeven aan de patholoog. Ten eerste worden de preparaten per patiënt op een plankje gelegd, waarna de coupes gecontroleerd worden met het bijbehorende paraffineblokje. Mammaweefsel en cito-preparaten behoren op rode plankjes gelegd te worden. Vervolgens wordt gecontroleerd of al het weefsel in het preparaat aanwezig is en deze goed gegoten, gesneden en gekleurd is. Per patiënt wordt de bijbehorende orderbrief bekeken, waarbij met behulp van de macroscopische beschrijving gecontroleerd wordt of het juiste weefsel in de preparaten aanwezig is. Daarnaast wordt gecontroleerd of alle (immunohistochemische) kleuringen aanwezig zijn. Na controle worden de preparaten doorgegeven aan de patholoog. [84]

2.8 ARCHIVEREN

Wanneer het proces van weefselbewerking is afgewerkt, worden in het nat-archief weefselrestanten op formaline bewaard. Droge weefseldelen worden ingevroren bij -85 c. Microscopische, afgewerkte preparaten worden op nummer gesorteerd en opgeslagen in het archief.

Afbeelding 29. Een lichtmicroscoop met oculair, objectief en condensor, waarbij weefsel- en celmateriaal vergoot en bekeken kan worden. [8]

29

Fluorescentiepreparaten worden ten minste 3 maanden in de koelkast bewaard. Ook de paraffineblokjes worden voor lange tijd bewaard in het archief. [85]

2.9 LABORATORIUM INFORMATIE EN MANAGEMENT SYSTEEM (LMS)

Tijdens elke stap van het histologische verwerkingsproces van weefselmateriaal, zoals in paragraaf 2.1 tot en met 2.7 is besproken, kan een fout optreden. Verwisseling van patiëntmateriaal en contaminatie zijn hiervan belangrijke voorbeelden, die kunnen leiden tot vals positieve of vals negatieve diagnoses van patiëntmateriaal. Om dit soort fouten te kunnen voorkomen, wordt het Laboratorium Management Systeem (LMS) geïntroduceerd op het pathologie laboratorium. Het LMS zorgt hierbij voor een verbetering in kwaliteit. Daarnaast kan materiaal in het systeem worden vastgelegd en worden geregistreerd. Mede hierdoor is patiëntmateriaal gemakkelijk op te sporen. [86] Elke werknemer logt met een eigen gebruikersnaam en wachtwoord in in het LMS systeem. Wanneer een PA-nummer gescand wordt, kunnen gemakkelijk onderzoeksgegevens worden bekeken, inclusief alle onderdelen die bij dit PA-nummer horen. Daarnaast zijn de uitsnijddetails en de navragen hier ook terug te vinden. Ook cassette-, label- en glasprinters kunnen worden gekoppeld aan LMS, evenals kleurmachines zoals de Ventana Benchmark. [86]

Bij de ontvangst zal een PA-nummer aan het patiëntmateriaal worden gekoppeld en labels worden geprint na het selecteren van het type onderzoek (bijvoorbeeld histologie) en het aantal inzendingen. Bij het uitsnijden zullen deze worden gescand, waarbij het onderzoek wordt geopend en de juiste cassettes kunnen worden geprint. Coupelabels zullen vervolgens bij het snijden van coupes worden geprint na het scannen van een paraffineblokje en het selecteren van een kleuring. Dit is ook het geval bij verzoekjes. Wanneer de coupes gereed zijn, kunnen deze worden afgemeld en worden doorgegeven naar de patholoog. Op het scherm zal een lijst verschijnen met coupes die afgemeld zijn en een lijst met coupes die nog afgemeld dienen te worden. De patholoog kan, na het bekijken van de coupes, extra verzoekjes doorgeven. Hierbij verschijnt een scherm met opties die de patholoog kan selecteren, zoals een bepaalde kleuring of serie. In het laboratorium is een scherm aanwezig waarop de verzoekjes te zien zullen zijn en labels kunnen worden afgedrukt. Na het kleuren van deze verzoekjes, kunnen de coupes weer worden afgemeld en worden doorgegeven naar de patholoog.

30

3. M

ATERIAAL EN METHODE

3.1 ROUTINE PATHOLOGIELABORATORIUM

3.1.1 O

Nadat patiëntmateriaal met bijbehorende orderbrieven ontvangen waren, werden deze gestickerd met een PA-nummer en onderverdeeld in groot uitsnijwerk, klein uitsnijwerk en huidmateriaal. Weefselcassettes werden met behulp van de Leica IP cassetteprinter geprint door de barcode op het patiëntmateriaal te scannen en de juiste cassette te selecteren. Indien nodig, werden patiëntgegevens in PALGA UDPS gezet en aan het PA-nummer gekoppeld. In tekstvak ”Onderzoeksnummer” werd het PA-nummer gescand, waarna in tekstvak “Patiëntnummer” het patiëntnummer werd gescand. Vervolgens werd de optie “Nieuw” geselecteerd en werd de pagina opgeslagen. [87]

3.1.2 M

3.1.2.1 UITSNIJDEN GROOT PATIËNTMATERIAAL

Na het opstarten van PALGA UDPS en G2-speech werd de barcodesticker van een van de potjes met patiëntmateriaal gescand, waarna het G2-speech geactiveerd werd. De patholoog beschreef hierbij het desbetreffende weefsel door te letten op het gewicht, de grootte, kleur en eventuele afwijkingen. Ook het PA-nummer en de patiëntnaam werden vermeld in G2-speech. Het patiëntmateriaal werd ingesneden, waarvan (delen van) dit weefsel werd ingesloten in bijbehorende cassettes. In het uitsnijschrift werd hierbij het aantal ingesloten delen genoteerd. Met behulp van dit uitsnijschrift werden preparaatlabels geprint, waarop het PA-nummer, nummering per PA-materiaal ( bijvoorbeeld A, B en I, II) en eventueel een verzoek of kleuring vermeld stond. Deze labels werden op preparaatglaasjes geplakt en op nummer gesorteerd. [87]

Indien al het patiëntmateriaal is ingesloten, worden de rekken met cassettes in de doorvoermachine (Pathcentre of Tispa) geplaatst. Om een normaal programma te selecteren met behulp van de Pathcentre, werd de “routine overnight”-optie geselecteerd. Bij biopten kon voor “rapid biopsy program” gekozen worden. Wanneer het doorvoerproces is afgerond, werden de rekken met cassettes in de stoof van 60°C geplaatst tot deze in paraffine gegoten werden. Het overgebleven patiëntmateriaal dat niet totaal is ingesloten, werd in het nat-archief bewaard. [87]

3.1.2.2 INSLUITEN KLEIN PATIËNTMATERIAAL

Het insluiten van klein weefselmateriaal werd door analisten ingesloten, wat vrijwel op dezelfde manier ging als het insluiten van groot patiëntmateriaal. Voor slijmerig of korrelig weefsel werd een biopsy bag gebruikt. Indien er erg kleine weefselstukjes aanwezig waren, werden biopsy pads in de cassette geplaatst. Bij flardjes weefsel werd agar gebruikt, waarna het gestolde agarblokje in een cassette werd gesloten. Ook bij klein weefselmateriaal wordt het PA-nummer, de patiëntnaam en een omschrijving van (het aantal) weefselstukjes gegeven in G2-speech. Daarnaast werden wederom preparaatlabels geprint met behulp van het uitsnijschrift en werd het weefselmateriaal doorgevoerd.

31

3.1.2.3 INVRIEZEN VERS WEEFSELMATERIAAL

Wanneer vriescoupes gesneden dienden te worden, werd vers materiaal ingevroren door middel van vloeibare stikstof. Het desbetreffende weefselstukje werd met behulp van Tissue Tek OCT-compound op de bodem van een filmbuisje gelijmd en in vloeibare stikstof geplaatst. Het filmbuisje werd vervolgens opgeborgen in de vriezer bij -80 ◦C. [89]

3.1.2.4 ZAGEN, ONTKALKEN OF VERWEKEN VAN HARD WEEFSELMATERIAAL

Wanneer botmateriaal ontvangen werd, zoals een heupkop, diende een plak uit dit materiaal gesneden te worden. In formaline werd deze plak gefixeerd en op ontkalkingsmedium gezet (DC2). Nadat het PA-nummer en het tijdstip van inzetten op een formulier genoteerd werden. Cristabiopten werden in EDTA ontkalkt in en in een buisje op de rotatieschijf geplaatst. Nagels dienden te worden verweekt met kaliumhydroxide gedurende 2 uur. Na het ontkalkings- of verwekingsproces kon het materiaal worden ingesloten en doorgevoerd. [90]

3.1.3 H

3.1.3.1 GIETEN VAN DOORGEVOERD WEEFSELMATERIAAL

Het rek met doorgevoerde weefselcassettes werd verplaatst van de stoof naar de verwarmde kamer van het gietstation, de Tissue-Tek embedding console. Het maldekseltje werd verwijderd, waarna met een verwarmde pincet het patiëntmateriaal in een malletje werd geplaatst. In het malletje werd eerder een laagje gesmolten paraffine gegoten. Het malletje werd even gekoeld op het koelplaatje, waarna het malletje werd volgegoten met paraffine en hier de weefselcassette op aangedrukt werd. Het geheel werd op de koelplaat geplaatst, de Tissue-Tek Embedding Cryo Module. Huidstukjes dienden op de zijkant ingebed te worden, terwijl buisvormige delen rechtop geplaatst werden. Wanneer de gegoten paraffineblokjes gekoeld waren, konden deze uit het malletje verwijderd worden. [91]

3.1.3.2 SNIJDEN EN MONTEREN VAN WEEFSELCOUPES

De paraffineblokjes die reeds gegoten waren, konden worden gesneden met behulp van een microtoom (Leica). Het waterbad werd opgewarmd tot 50 ◦C en de koelplaat werd aangezet. De coupedikte diende ingesteld te worden op 3 µm met een meshoek van 5 ◦. Het paraffineblokje werd in de blokhouder en een mes in de meshouder geplaatst, waarna met het linker handwiel of met het bedieningspaneel de juiste afstand tussen het mes en het paraffineblokje ingesteld werd. Het blokje werd ingesneden op ongeveer 30 µm tot het weefsel aan de oppervlakte aangesneden bleek te zijn. Na koelen werden maximaal 2 coupes van 3 µm op het bijbehorende preparaatglaasje geplakt door de coupes in het waterbad te strekken en dit glaasje hier onder te schuiven. Van roze cassettes diende 3 linten gesneden te worden. Van blauwe cassettes werden 2 linten gesneden, waarnaast van oranje cassettes 2 linten gesneden werden. Van elk lintje werd een coupe gemonteerd. Coupes die voor speciaalkleuringen gebruikt werden, behoorden op Starfrostglaasjes. [92][93]

Vriescoupes van reeds ingevroren weefselmateriaal werden gesneden met behulp van een vriesmicrotoom (Leica). De snijdikte was hierbij 3-5 µm met een meshoek van 5 ◦. Het ingevroren weefselstuk werd op een plateautje gelijmd en in de microtoom geplaatst. Met “trim” werd het vriesblokje ingesneden, waarna vervolgens een coupe werd opgevangen met behulp van een kwastje. Een Starfrost preparaatglaasje ging hier vervolgens bovenop, waardoor de coupe gemonteerd werd. Het vriesblokje werd vervolgens weer opgeslagen in de vriezer bij -80 ◦C. [93] [94]

32

3.1.3.3 KLEUREN VAN WEEFSELCOUPES

De routine- en speciaalkleuringen werden elk volgens aparte protocollen uitgevoerd. Deze uitvoering worden in bijlage II per kleuring weergeven. [95-107]

3.1.3.4 IMMUNOLOGISCH KLEUREN VAN COUPES

Immunologisch aankleuren van weefselcoupes werd gedaan met behulp van de Ventana Ultra Stainer. Barcodes werden met het Ventanaprogramma geprint, waarbij het juiste protocol geselecteerd en het PA-nummer ingevoegd werd. Na het bevestigen van de barcodes op de preparaten, werden deze in de lades van de machine geplaatst. De bijbehorende antilichaam-, enzym-, of chromogeenpompjes werden in de carrousel bevestigd en met het Ventanaprogramma werd de run gestart. Na kleuren van de coupes werden deze gespoeld in afwasmiddel en demiwater. Deze werden in de kleurmachine geplaatst en gekleurd volgens HE-IMH protocol, met uitzondering van DDISH en immunofluorescentiecoupes, alvorens deze met behulp van de afdekunit afgedekt werden. [108]

3.1.4 D

Na het kleuren en afdekken van weefselcoupes, werden deze per PA-nummer op een plankje gelegd en gecontroleerd met het paraffineblokje. Na controle werd de orderbrief bij het plankje gevoegd, waarna deze met behulp van UDPS op aantal materiaaldelen werd gecontroleerd. Indien de coupes per PA-nummer compleet zijn, werden deze doorgegeven naar de desbetreffende patholoog. [109]

3.1.5 A

Wanneer de patholoog gereed was met een diagnose stellen, werden de preparaten op chronologische volgorde opgeborgen in het archief, evenals paraffineblokjes. Fluorescentiepreparaten behoorden in het donker in de koelkast. [110]

33

3.2 PROCESANALYSE, IN- EN OUTPUTANALYSE EN KNELPUNTINVENTARISATIE

3.2.1 P

Om het histologische proces in kaart te brengen, werd ten eerste enkele maanden routine meegelopen op het pathologisch laboratorium. Hierbij werd elke stap geanalyseerd en achtergrondinformatie verzameld. Tevens werden protocollen gelezen over zowel de ontvangst van patiëntmateriaal als uitsnijden, insluiten, doorvoeren, gieten, snijden, kleuren, doorgeven en archiveren van materiaal. Hiervan werd een schema samengesteld waar elke stap bij betrokken werd, om een basis te creëren voor de knelpunteninventarisatie. Dit schema is weergeven in paragraaf 4.1 in het hoofdstuk “Bevindingen”. Daarnaast werd een tijdskostenschema opgesteld, waarbij per orgaan- en weefseltype de verwerkingstijd vanaf de ontvangst van materiaal tot het doorgeven hiervan in kaart werd gebracht. Dit schema is tevens weergeven in paragraaf 4.1. [111]

3.2.2 I

-

O

Nadat een procesanalyse verricht was, werd elke stap binnen het histologische proces onderverdeeld in activiteiten. Deze in- en outputanalyse werd begonnen bij de ontvangst van patiëntmateriaal en eindigde bij het archiveren van dit materiaal. Bij het nalopen van deze stappen werd bekeken wat de eerst uitgevoerde activiteit was en waar deze toe leidde. Hierbij werden wederom zowel de ontvangst van patiëntmateriaal als uitsnijden, insluiten, doorvoeren, gieten, snijden, kleuren, doorgeven en archiveren van materiaal behandeld. De in- en outputanalyse werd in een pijlenschema opgesteld en weergeven in paragraaf 4.2 in het hoofdstuk “Bevindingen”. [111]

3.2.3 K

Tijdens het in kaart brengen van het verwerkingsproces van patiëntmateriaal, werd op enkele knelpunten gestuit. Om het histologische proces zo goed mogelijk te laten verlopen, werden deze knelpunten geïnventariseerd. Bij deze inventarisatie werd de procesanalyse en in- en outputanalyse gebruikt het volledige stappenplan na te lopen. Bij elke stap werd gecontroleerd welke (mogelijke) knelpunten aanwezig zouden kunnen zijn door alle handelingen per stap na te gaan. Ook werd in het laboratorium registratie systeem (LRS) gekeken naar eerdere ingevoerde foutmeldingen met de optie “Rapportage afwijkingen”. Hierbij zijn ook de frequenties van de betreffende foutmeldingen opgezocht en grafieken verwerkt. De knelpunten werden vervolgens in een tabel weergeven in paragraaf 4.3 in het hoofdstuk “Bevindingen”. [111]

3.2.4 O

Nadat het proces in kaart gebracht werd en de aanwezige knelpunten hierbij samengesteld waren, werd gezocht naar geschikte oplossingen. Per knelpunt werd bekeken wat de aard hiervan was. Naar aanleiding van de aard van het knelpunt, zoals het verwisselen van materiaal of simpelweg het verliezen van materiaal, werd een oplossing bedacht. Daarnaast werd rekening gehouden met het LMS. Ook dit systeem werd zorgvuldig bekeken, omdat hiermee enkele knelpunten opgelost zouden kunnen worden. De oplossingeninventarisatie is afgebeeld in paragraaf 4.4. In paragraaf 4.5 is het complete overzicht van processtappen, knelpunten en oplossingen weergeven. [86]

34

4. B

EVINDINGEN

4.1 PROCESANALYSE

Om het complete histologische proces in kaart te brengen, zoals in paragraaf 3.2.1. vermeld werd, zijn alle hoofdstappen ten eerste omschreven. Deze hoofdstappen zijn daarbij onderverdeeld in tussenstappen, zoals in tabel 3 vermeld is.

Tabel 3. Hoofdstappen van het histologische proces, met daarbij tussenstappen die uitgevoerd worden om patiëntweefsel te verwerken.

Processtappen Tussenstappen

1. Ontvangst materiaal  Patiëntmateriaal wordt ontvangen, gekoppeld aan de orderbrief en genummerd, waarbij

bijzonderheden op de barcodesticker worden geschreven;

 Patiëntmateriaal wordt onderverdeeld in klein uitsnijwerk, huidmateriaal, uitsnijwerk, cytologie en vriescoupes.

2. Inzetten orderbrieven  Patiëntnummers worden gekoppeld aan het bijbehorende PA-nummer op de orderbrief in UDPS.

3. Printen cassettes  Weefselcassettes worden geprint met de bijbehorende orderbrief, waarop mogelijk bijzonderheden zijn vermeld, zoals het onderscheiden van een naaldbiopt of speciale kleuring.

4. Uitsnijden en insluiten materiaal

 De macroscopie van patiëntmateriaal wordt ingesproken met behulp van G2 Speech;

 Uitsnijwerk wordt door de patholoog en analist uitgesneden en ingesloten in bijbehorende cassettes;

 Klein uitsnijwerk en huidmateriaal worden door de analist ingesloten in bijbehorende cassettes;

 Vriescoupemateriaal wordt ingevroren met vloeibare stikstof;

 Etiketten van het ingesloten materiaal worden geprint en op glaasjes geplakt middels een uitsnijschrift.

5. Doorvoeren materiaal  Ingesloten materiaal wordt met behulp van de Tispa- of Pathcentre doorvoermachine.

6. Inbedden materiaal  Met behulp van het Tissue-Tek gietstation wordt patiëntmateriaal in paraffine gegoten tot een paraffineblokje.

7. Snijden en plakken coupes  Na insnijden worden coupes of linten gesneden van het paraffineblokje en op een bijbehorend glaasje geplakt.