Ontwikkeling van een screeningsmethode voor [beta]2 - agonisten in weefsel : residuen van clenbuterol in vlees en organen van slachtkuikens en kalveren

Inventariserend onderzoek naar het voorkomen van ,82-agonisten in diverse matrices ( 404.0622).

Ontwikkeling van biotechnologische methoden van onderzoek (505.0740). Projectleider drs. R. Schilt

Rapport 91.03 Januari 1991

Ontwikkeling van een screeningsmethode voor ,82-agonisten in weefsel.

Residuen van clenbuterol in vlees en organen van slachtkuikens en kalveren.

W. Haasnoot, ARM. Hamers, C.A Kan· en R. Schilt

• Centrum voor Onderzoek en Voorlichting voor de Pluimveehouderij "Het Spelder holt"

Afdeling Biofarmaceutische Analyse

Goedgekeurd door: dr.

F.A Huf

Rijks-Kwaliteitsinstituut voor land- en tuinbouwprodukten (RIKILT) Bornsesteeg 45, 6708 PD Wageningen, Nederland

Postbus 230, 6700 AB Wageningen, Nederland Telefoon 08370-75400

Telex 75180 RIKIL Telefax 08370-17717

VERZENDLIJST

INTERN: directeur sectorhoofden projectleider

afdeling Biofarmaceutische Analyse (5x) programmabeheer en informatieverzorging (2x) bibliotheek

circulatie

EXTERN:

Dienst Landbouwkundig Onderzoek Directie Wetenschap en Technologie

Directie Voedings- en Kwaliteitsaangelegenheden Directie Veterinaire Dienst

Directie Veehouderij en Zuivel

Directie Rijksdienst voor de keuring van Vee en Vlees

Rijksdienst voor de keuring van Vee en Vlees -Centraal Laboratorium (L.M.H. Frijns) Directie Algemene Inspectiedienst

Ministerie van Welzijn, Volksgezondheid en Cultuur, Veterinaire Hoofdinspectie Directie Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieuhygiëne

Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieuhygiëne (dr. R.W. Stephany) Produktschap voor Vee en Vlees

Produktschap voor Pluimvee en Eieren

Produktschap voor Veevoeder/adviescommissic schadelijke stoffen

Directie Centrum voor Onderzoek en Voorlichting voor de Pluimveehouderij "Het Spelderholt"

Centrum voor Onderzoek en Voorlichting voor de Pluimveehouderij "Het Spelderholt" (drs C.A. Kan)

Benelux Economische Unie, Werkgroep SP/Lab/11 Hormonen en Anti-hormonen Secretaris Overleggroep Residuanalyse (drs. M. Vertommen)

Secretaris LAC werkgroep Diergeneesmiddelen (dr. J.H. Boot) Secretaris LAC stuurgroep Vee, Vlees en Eieren (drs. D.G. Kloet) Meyvis en Co bv (D. Bruynzeel)

ABSTRACT

Development of a screening methad for the determination of ,82-agonists in tissue. Residues of clenbuterol in meat and organs of broilers and calves

Report 91.03 Janumy 1991

W. Haasnoot, ARM. Hamers, C.A. Kan' and R. Schilt

Department of Bio-Pharmaceutical Analysis, State Institute for Quality Control of Agri-cultural Products (RIKILT)

PO Box 230, 6700 AE Wageningen, The Netherlands

' Spelderholt Centre for Poultry Research and Information Services (COVP) Spelderholt 9, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands

3 figures, 4 tables, 4 annexes, 11 reEerences

In open literature, data about the presence of residues of clenbuterol and other ,8 2-agonists in poullry meat and organs after treatment are not clescribed. For the control on abuse of clenbuterol, such data are necessary, so an animal experiment was performed. Fiveweek olcl broilers (n=20) were given clenbuterol containing feed (1 mg/kg) for five clays and directly after the application and after one day withdrawal, the broilers were slaughtered ancl samples of meat, liver, kidney and caecal and gizzard contents were taken. For the detection of clenbuterol a multi-screening methocl, based on an enzyme-immunoassay (EIA), was used. Clenbuterol was extracted from the sample matcrials by 0.01 M hydrochloric acid and the extracts were purified with immuno-affinitychromato-graphy (IAC). By using a system for "Automatic Sample Preparation with Extraction Columns" (ASPEC), this purification step was automized. Directly after the five clays of feeding with clenbuterol containing feed, the mean concentrations (n=5) of clenbuterol found in meat, kidney, liver and the caecal and gizzard contents were 3, 20, 22, 83 and 46 ng/g, respectively. After a one day withdrawal period of clenbuterol, in the same materials, mean concentrations (n=5) of 1, 3, 7, 23 and 5 ng/g were found, respectively. For the control of abuse of clenbuterol in broilers, the liver is probably the most suitable materia i.

The sample malcrials used in this study were stared at -20°C for two years. To confirm the data on the absolute concentrations of clenbuterol, such an animal experiment could be repeated. Whereas the metbod applied is suitable for the determination of more ,8 2-agonists, such an animal experiment could also include some other ,82-agonists, such as salbutamol, cimaterol, mabuterol en terbutaline.

Keywords: beta-agonistic drugs, clenbuterol, broilers, meat, liver, kidney, caecal, gizzard, enzyme-immunoassay, screening.

VOORWOORD

Met dank aan het CLRVV, i.c. dhr. L.M.H. Frijns, voor het uilvoeren van een aantal GC-MS analysen in runderlevers.

De firma's Meyvis en Co bv (Bergen op Zoom) en Gilson (Villiers de Bel, Frankrijk) worden bedankt voor het gedurende 3 maanden beschikbaar stellen van een ASPEC-systeem.

INHOUD ABSTRACT 1 VOORWOORD 2 SAMENVATTING 5 1 INLEIDING 7 2 ONDERZOEK 8 2.1 Monstermaterialen 8 2.2 Analysemethoden 8 2.2.1 Screeningsmethode 9 2.2.2 HPLC-methode 10 2.2.3 Extractie-en opzuiveringsprocedure 10 2.2.4 Immuno-affiniteitschromatografie met behulp van de ASPEC 10

3 RESULTATEN EN DISCUSSIE 12

3.1 Methodeontwikkeling 12

3.2 Resultaten onderzoek monsters afkomstig uit het kuikenexperiment 14 3.3 Onderzoek van levermonsters afkomstig van kalveren 18

4 CONCLUSIE 20

5 LITERATUUR 21

BIJLAGE I 22

BIJLAGE 11 23

SAMENVATriNG

In verband met de controle op het oneigenlijk gebruik van clenbuterol en andere {3

2-agonisten is het noodzakelijk over gegevens te beschikken over de wijze van toediening aan en het voorkomen van residuen bij pluimvee. In de literatuur zijn gegevens over een

mogelijke residuvorming van o.a. clenbuterol in vlees en organen van pluimvee niet be-schreven. Over de toepassing van clenbuterol en andere ,8ragonisten bij pluimvee zijn

wel enkele gegevens bekend.

Om deze reden werd een dierexperiment uitgevoerd, waarbij aan kuikens (n=20) gedu-rende vijf dagen clenbuterolhoudend voeder (1 mg!kg) werd verstrekt. Direct volgend op

de toediening en één dag daarna werden de kuikens gedood en werden monsters van

vlees, nier, lever, spiermaaginhoud en blindedarminhoud genomen.

Voor de bepaling van clenbuterol werd een, recent ontwikkelde, muili-screeningsmetho-de voor ,82-agonisten toegepast, welke gebaseerd is op een enzym-immunologische test

(EIA). Voor de monstervoorbewerking werd gekozen voor een zure extractie gevolgd door een opzuivering met behulp van immuno-affiniteitschromatografie (!AC). Door gebruik te maken van een onlangs geintroduceerd systeem voor "Automatic Sample Pre-paration with Extraction Columns" (ASPEC) werd deze opzuivering geautomatiseerd.

Bij de dieren die zonder wachttijd werden geslacht zijn gemiddelde gehalten (n=5) ge-vonden van 3 ng/g in vlees, 20 ng/g in nier, 22 ng/g in lever, 83 ng/g in de blindedarmin-houd en 46 ng/g in de spiermaaginhoud. In dezelfde matrices werden na een wachttijd van één dag gemiddelde gehalten gevonden van 1 (vlees), 3 (nier), 7 (lever), 23

(blinde-darminhoud) en 5 ng/g (spiermaaginhoud).

Voor een controle op een eventueel gebruik van clenbuterol is, van de eetbare weefsels, de lever de meest geschikte matrix omdat het gehalte aan clenbuterol hierin relatief hoog is en het minst snel afneemt na stoppen van de behandeling. De spiermaaginhoud lijkt voor dergelijke doeleinden minder geschikt, omdat het gehalte aan clenbuterol daar-in relatief snel afneemt.

Tussen de resultaten verkregen met de EIA en een methode gebaseerd op JAC "on-line"

gekoppeld aan HPLC werd een goede overeenkomst verkregen, hetgeen impliceert dat weinig metabolieten, waarmee de gebruikte antilichamen kruisreacties vertonen, aanwe-zig zijn in de onderzochte monsters.

Omdat het monstermateriaal uit het dierexperiment gedurende twee jaar bij -20°C was bewaard, is het mogelijk dat de absolute gehalten in werkelijkheid hoger kunnen liggen.

Een aanvullend experiment zou dit kunnen verduidelijken. Keuring is daarentegen moge-lijk zoals blijkt op grond van de gevonden resultaten.

Omdat de in dit rapport beschreven methode in principe geschikt is voor de bepaling van

meerdere ,82-agonisten lijkt het zinvol om bij zo'n aanvullend experiment eveneens

ande-re ,8₂-agonisten zoals: salbutamol, mabuterol, cimalerol en terbutaline, te betrekken, hetgeen o.a. samenhangt met de behoeften bij de uitvoering van het Nationale Program-ma Pluimvee.

1 INLEIDING

,82-agonisten kunnen een positief effect hebben op de groei en de vlees/vet verhouding, het zogenaamde "herverdelende effect" van landbouwhuisdieren. Voor veterinair thera-peutische toepassing is clenbuterol als enige ,82-agonist geregistreerd voor behandeling van ademhalingsaandoeningen en voor toepassing bij het remmen van weeën bij

runde-ren en paarden, echter niet als groeibevorderaar. Cimaterol is specifiek voor

mestdoel-einden ontwikkeld maar als zodanig (nog) niet geregistreerd. In de literatuur wordt bij pluimvee de toepassing van clenbuterol [Dalrymple et al., 1984 en Asato et al., 1984),

van cimaterol [Dalrymple 1987, Scholtyssek 1987] en L-640,033 [Duquette 1987] be

-schreven. Hierbij werden, in meer of mindere mate, een toename in groeisnelheid,

verbe-terde voedselbenutting en een kwalitatief betere karkassamenstelling waargenomen. Met

cimaterol werd het beste resultaat verkregen bij doses van 0,125 tot 0,5 mg cimalerol per

kg voer.

In de open literatuur zijn geen gegevens bekend over residuen van clenbuterol in vlees en organen van pluimvee. In verband met de controle op het oneigenlijk gebruik is het

noodzakelijk om over deze gegevens te kunnen beschikken.

Om deze reden werd in november 1988 een dierexperiment met kuikens uitgevoerd waarbij aan 20 slachtkuikens, met een leeftijd van ca. vijf weken, gedurende vijf dagen

voer werd gegeven waaraan clenbuterol was toegevoegd (1 mg!kg). Direct volgend op de

laatste toediening en één dag daarna werden telkens 10 kuikens gedood en werden mon-sters vlees, lever, nier, blindedarminhoud en spiermaaginhoud genomen.

Om reden dat de in deze tijd beschikbare analysemethode voor clenbuterol in lever deel

uitmaakte van het registratiedossier, kon de methode niet worden toegepast voor dit

onderzoek. Publicatie van de gegevens en de gebruikte methode was op grond van het

vertrouwelijk karakter niet mogelijk. Sinds deze tijd hebben de ontwikkelingen echter

niet stilgestaan en zijn zowel een multi-screeningsmethode als een

multi-bevestigingsme-thode ontwikkeld [RIKILT Rapport nr. 90.51, december 1990].

De multi-screeningsmethode is gebaseerd op een enzym-immunologische test (EIA).

Hierbij worden (polyclonale) antilichamen gebruikt voor de herkenning van clenbuterol

en kruisreagerende verbindingen (metabolieten en andere ,8₂-agonisten). Deze methode

is opgezet als snelle screeningstest voor urine. Voor andere monstermaterialen, zoals uit

het dierexperiment zijn verkregen (weefsels, maag- en darminhoud), moest een

opwer-kingsprocedure worden ontwikkeld.

Bij de bepaling van ,82-agonisten in urine en veevoeders wordt in het RIKILT gebruik

gemaakt van immuno-affiniteitschromatografie (IAC) als monstervoorbewerkingstechniek

en gaschromatografie in combinatie met massaspectrometrie (GC-MS) als detectie- en

etvarin-gen met IAC werd deze monstervoorbewerkingstechniek gebruikt voor de materialen uit het kuikenexperiment Van Meyvis en Co bv/Gilson Medica! Electranies (Villiers Ie Bel,

Frankrijk) werd een systeem voor "Automatic Sample Preparatien with Extraction Co-lumns" (ASPEC) in bruikleen verkregen om een onderzoek naar de mogelijke automati-sering van deze monstervoorbewerkingstechniek uit te voeren. Om clenbuterol uit de

monsters te extraheren werd gekozen voor 0,01 M zoutzuur als extractievloeistof. Zure waterige vloeistoffen worden ook gebruikt voor de extractie van ,82-agonisten uit

veevoe-ders [Schilt e.a. 1990, Courtheyn e.a. 1989] en weefsels [Fürst 1989]. Om te kunnen beoordelen of eventueel aanwezige metabolieten van clenbuterol de resultaten van de EIA-metingen beïnvloeden, werden enkele monsters eveneens onderzocht met behulp van IAC on-line gekoppeld aan HPLC. Deze techniek werd eerder beschreven voor de

analyse van urinemonsters [Haasnoot e.a. 1990].

2 ONDERZOEK

2.1 Monstermaterialen

- Het dierexperiment met kuikens is uitgevoerd op het Centrum voor Onderzoek en Voorlichting voor de Pluimveehouderij (COVP) "Het Spelderholt" onder proefnummer

650.09.

In twee dummy kooien van proef 002.03 werden 20 slachtkuikens op een leeftijd van ca.

vijf weken gedurende vijf dagen (start 9 november 1988) gevoerd met clenbuterol hou

-dend voeder (1 mg/kg, clenbuterol als hydrochloride). 10 kuikens (nrs. 1 t/m 10) werden direct daarop volgend gedood (14 november, dag 0). De overige 10 kuikens (nrs. 11 t/m

20) werden gedurende 1 dag gevoerd met normaal "blanco" voer en vervolgens gedood op 15 november (dag 1). Van de 20 kuikens werden monsters vlees, lever, nier,

spier-maag- en blindedarminhoud genomen.

De monsters werden bij -20°C opgeslagen tot het moment van analyse.

- Blanco materialen vergelijkbaar aan de bij de kuikenexperiment verkregen materialen

werden verkregen van het COVP.

- Via het CLR W werden levermonsters van tien runderen, genomen in een slachthuis, verkregen.

2.2 Analysemethoden

Voor het beschreven onderzoek zijn twee analysetechnieken gebruikt, een

2.2.1 Screeningsmethode

De screeningsmethode is gebaseerd op een enzym-immunologische test (EIA). In de EIA wordt gebruik gemaakt van in een konijn opgewekte (polyclonale) antilichamen tegen clenbuterol (gekoppeld aan runder serum albumine). Deze antilichamen worden gekop-peld aan een hveede type antilichamen, die gecoat zijn aan de wand van de putjes van

een microtiterplaat Dit laatst genoemde type is in schapen opgewekt tegen konijnen antilichamen.

Gelijk met het monster wordt een vaste hoeveelheid enzym-gelabeld salbutamol (salbuta-mol-"horseradish peroxidase" (HRP)) aan de wells toegevoegd. Het in het monster

aan-wezige clenbuterol gaat een competitie aan met het enzym-gelabelde salbutamol om het

aantal bindingsplaatsen van de antilichamen (competitieve EIA). Vervolgens wordt een substraat (TMB) toegevoegd en een kleurreactie gemeten. De intensiteit van de kleur is omgekeerd evenredig met de clenbuterolconcentratie. De concentratie in de monsters wordt berekend aan de hand van een standaardcalibratiecurve. Deze calibratiecurve heeft voor clenbuterol een bereik van 5 - 500 pg aan absolute hoeveelheden clenbuterol. Uit-gaande van 50 J.Û monsteroplossing toegevoegd aan de test bedraagt het bereik 0,1 - 10 ng/ml (zie figuur 1). 100 !Ö! BO

t

60 !l ~ )( ₄₀ g ;!: 20 o~--~~~~~~--~~~~~~ 0.1 10 clt'<'bule<ol (nglmll

Figuur 1: Calil>raliecmve voor clenl>ulerol EIA

De kruisreactiviteit van de antilichamen voor mabuterol bedraagt 120%, waardoor voor deze ,82-agonist een vergelijkbare detectiegrens wordt verkregen. Voor andere ,82

-agonis-ten (zoals salbutamol, carbuterol, cimaterol, terbutaline, tulobuterol en pirbuterol) is de kruisreactiviteit van de antilichamen lager (1 - 18%) en daardoor ligt de detectiegrens en

het bereik van de test voor deze stoffen op een hoger niveau. Voor een meer uitgebrei

-de omschrijving van de test en de daarvoor benodigde reagentia etc. wordt venvezen naar RIKILT Rapport nr. 90.51 (december 1990).

Van de monsters (weefsel en spiermaag- en blindedarminhoud) worden waterige extrac-ten gemaakt die worden opgezuiverd met behulp van immuno-affiniteitschromatografie (zie 2.2.3).

2.2.2 HPLC-methode

Naast de onder 2.2.1 beschreven screeningsmethode is een HPLC-methode met "on-line"

immuno-affiniteitschromatografie toegepast op een aantal monsters. Dit ter bevestiging

van de met de screeningsmethode gevonden waarden.

Deze HPLC-methode is ontwikkeld voor de directe bepaling van clenbuterol in

urine-monsters. Hierbij wordt een kolomschakelsysteem gebruikt waarmee de

immuno-affini-teitskolom (anti-clenbuterol gekoppeld aan een op sepharose gebaseerde drager) via een

tweede voorkolom (Reversed Phase C18-materiaal) aan de analytische kolom kan

wor-den gekoppeld. Clenbuterol wordt hierbij gedetecteerd met ultra-violet (UV)-detectie

(220 nm). De absolute detectiegrens voor clenbuterol bedraagt ca. 1 ng. Een uitgebreide

omschrijving van het systeem alsmede de toepassing voor urinemonsters is eerder

gepu-bliceerd [Haasnoot e.a. 1990].

Voor de uitvoering van deze methode worden zure waterige extracten van het

monster-materiaal bereid (zie schema I, 2.2.3).

2.2.3 Extractie-en opzuiveringsprocedure

In schema I wordt de, voor de diverse typen monsters gelijke, extractie- en

opzuiverings-procedure weergegeven.

Voor hergebruik van de JAC-kolom wordt deze, alvorens een volgend monster

geanaly-seerd kan worden, eerst gespoeld met 1 mi methanol/0,5 M azijnzuur (pH 3,5; 80/20, v/v)

en vervolgens met 2 ml water. Deze extra spoelstap met de elutievloeistof wordt

uitge-voerd om een mogelijke overdracht van clenbuterol tussen opeenvolgende monsters te

voorkomen.

2.2.4 Inununo-affiniteitschromntografie met behulp van de ASPEC

Bij de toepassing van immuno-affiniteitschromatografie (JAC) in combinatie met de EIA

werd gebruik gemaakt van het ASPEC-systeem (Automatic Sample Preparatien with

Extraction Columns, Gilson Medica! Electronics, Villiers Ie Bel, Frankrijk). Ten behoeve

van dit systeem werden veertien reservoirs met 20 J.Lm frits (Varian, DEC 100 [capaciteit

1,5 ml]) gevuld met ca. 0,2 mi van het affiniteitsmateriaal. Dit affiniteitsmateriaal werd in

het RIKILT gemaakt door de koppeling van polyclonale antilichamen (PCA) aan tresyl

geactiveerd Sepharose (Pharmacia). De bereiding van de antilichamen en de

koppelings-procedure aan Sepharose werden eerder beschreven [Haasnoot e.a. 1990).

De aan de variabelen van de in de ASPEC aanwezige programma's (150 en 160)

(

Schema 1: Schematische weergave van de analyseprocedure voor de bepaling van clen

-buterol.

5 mi supernatant aanvullen tot 50 mi met PBS en 25 mi in de HPLC (zie 2.2.2)

(c~. 0,25 g monster)

1 g monster+ 10 mi 0,01 M HCI Ultra-turrax (1 min.)

10 min centrifugeren (8000 g; 4°C) supernatant op pH 7 brengen (NaOH lM) 10 min centrifugeren (8000 g; 4°C)

2 mi op de JAC kolom (0,2 rul gel) (ca. 0,2 g monster)

kolom spoelen met 2 mi water en

0,5 mi 80% methanol

P₂-agonisten elueren met 1 rul methanol/0,5 M azijnzuur

(pH 3,5; 80/20, v/V) I

eluaat indampen en residu opnemen in 200 Jll PBS/lween

3 RESULTATEN EN DISCUSSIE

3.1 Methodeontwikkeling

Bij het kuikenexperiment zijn monsters lever, nier, vlees, blindedarm- en

spiermaagin-houd genomen. Voor de bepaling van clenbuterol in deze matrices was het noodzakelijk

een analysemethode te ontwikkelen. In november 1990 werd een enzym-immunologische

multi-screeningsmethode (ETA) voor de bepaling van

fi

2-agonisten in urinemonsters in

gebruik genomen [RIKILT rapport nr. 90.51). Voor de monstervoorbewerking is gebruik gemaakt van immuno-affiniteitschromatografie (IAC). Deze techniek werd reeds

toege-past voor de opzuivering van urinemonsters en extracten van veevoeders voor de beves-tigingsmethode voor

fi

2-agonisten, gebaseerd op gaschromatografie in combinatie met

massaspectrometrie (GC-MS) [Schilt e.a., 1990]. Bij deze techniek worden antilichamen (dezelfde als gebruikt bij de EIA) geïmmobiliseerd op een onoplosbare drager (Sepharo-se). Met behulp van JAC kunnen uit waterige monsters/extracten die

fi

2-agonisten

wor-den geïsoleerd waarvoor de antilichamen kruisreacties vertonen. Bij de bevestigings me-thode worden !AC-kolommen gebruikt met een begincapaciteit van ca. 1000-1500 ng (per 1 mi gel). Voor de combinatie van JAC en EJA zijn, vanwege de lagere absolute

de-tectiegrens van de EIA, kolommen met een dergelijke hoge capaciteit niet nodig.

Geko-zen werd voor een JAC-kolom met een gelvolume van 0,2 mi (begincapaciteit 200-300

ng). Hiervoor werd een lege Disposable Extraction Column (DEC 100, volume 1,5 mi) gebruikt. Dit formaat kolom past in het ASPEC-systeem. Het gebruik van kleine JAC-kolommen heeft als voordeel dat kleinere volumina aan was- en elutievloeistoffen nodig

zijn.

Als voorbewerking voor de GC-MS methode wordt JAC gebruikt in combinatie met een

Soliel Phase Extractie (SPE, C18-kolom). Hierbij wordt het eluaat van de JAC-kolom (5

mi 0,1 M azijnzuur) op pH 7 gebracht alvorens op de SPE-kolom te brengen. Deze pH

verandering is noodzakelijk om voldoende retentie van de verschillende

fi

2-agonisten op

de SPE-kolom te verkrijgen.

Ten behoeve van de EJA werd, omwille van de eenvoud (en snelheid), gekozen voor

uitsluitend JAC als monstervoorbewerking. Als elutievloeistof werd een mengsel van

methanol en 0,5 M azijnzuur (80/20, v/v; pH 3,5) gebruikt. Dit eluaat (1 mi) kan in ca.

30 min worden drooggedampt Om, alvorens te elueren, zoveel mogelijk water van de JAC-kolom te verwijderen werd de kolom eerst gespoeld met een 0,5 mi 80% methanol. Van vier kolommen werd de maximale capaciteit bepaald direct na bereiding en na

ana-lyse van ca. 60 monsters (15 analysen per kolom), inclusief het monstermateriaal van de

kuikens 1, 2, 11 en 12 (zie tabel 1). Hiervoor werd 500 ng aan clenbuterol op de kolom

gebracht. Na elutie van de !AC-kolom werd het eluaat drooggedampt en het residu

op de analytische kolom werd gebracht.

Na de eerste capaciteitsbepaling (begincapaciteit; zie tabel I) werden blanco monsters

(water) over de !AC-kolommen gebracht en het residu opgenomen in 100 J.Li eluens,

waarvan 20 J.Ll in de HPLC werd gebracht. In de blanco monsters kon geen clenbuterol

worden aangetoond ( <2 ng in het residu). Dit geeft aan dat de eventuele overdracht

(kruiscontaminatie) bij hergebruik van de !AC-kolommen kleiner is dan 1%.

Tabel 1: De capaciteit van vier !AC-kolommen bepaald met behulp van HPLC

direct na het maken van de !AC-kolom (begincapaciteit) en na ca. 15 analyses per kolom.

begincapaciteit capaciteit na 15 analyses percentage kolom 1 138 32 23 capaciteit in ng clenbuterol

kolom 2 kolom 3 kolom 4

166 302 283

33 68 80

20 23 28

Uit tabel I blijkt dat de capaciteit van de !AC-kolommen daalt tijdens het gebruik.

Aan-gezien slechts een geringe hoeveelheid monsterextract, overeenkomend met maximaal 0,2

g monster, op de kolommen wordt gebracht, was de capaciteit voor deze toepassing

vol-doende om monsters te controleren op de aanwezigheid van ,8₂-agonisten. Uitgaande van

0,2 g monster op de kolom is de maximaal te bepalen concentratie aan clenbuterol

150-400 ng/g (afhankelijk van de capaciteit van de kolommen die varieert van 32-80 ng).

Alleen het gehalte aan clenbuterol in de blindedarminhoud van kuiken 2 (dag 0, zie

tabel ill) benadert deze concentratie. Voor de kwantitatieve bepaling van clenbuterol in

de monsters afkomstig van 6 kuikens (nrs. 3, 4 en 5; dag 0 en nrs. 13, 14 en 15; dag 1)

uit het kuikenexperiment werden 10 nieuwe !AC-kolommen gebruikt.

Voor de extractie van clenbuterol uit het monstermateriaal werd gebruik gemaakt van

een zure (0,01 M HCl; pH 2) waterige oplossing. Bij die pH is clenbuterol positief

gela-den en goed extraheerbaar in waterig milieu. Uitgaande van 1 g monster en 10 mi

extrac-tievloeistof wordt na homogeniseren (met behulp van een Ultra-Turrax) en centrifugeren

een !AC-kolom gebracht kan worden wordt de pH op 7

+

0,5 gesteld. Hierbij werd met name bij de vlees-, lever- en niermonsters een troebeling in het extract waargenomen, waardoor een extra centrifugestap noodzakelijk werd. Van dit extract werd 2 mi (over-eenkomend met 0,2 g monster) op de. JAC-kolom gebracht. Het (na wassen) van de kolom verkregen eluaat werd drooggedampt en het residu opgenomen in 200 J.tl

PBS-{fween (overeenkomend met 1 g monster per mi PBS/tween). Hiervan werd 50 J.tl met

de EIA geanalyseerd (bereik is 0,1 tot 10 ng per g monster). Daarnaast werd een tweetal

verdunningen meegenomen: 1 op 10 verdund in PBS{fween (bereik van 1 tot 100 ng per

g monster) en 1 op 100 verdund (bereik van 10 tot 1000 ng per g monster).

3.2 Resultaten onderzoek monsters ufkomstig uit het kuikenexperiment

Om de analyseprocedure te testen en het achtergrondsignaal (ruis) van de combinatie JAC met EIA te meten werden blancomonsters vlees, lever, nier, spiermaag- en blinde-clarminhoud onderzocht. Daarnaast werd aan dit materiaal een stanelaard clenbuterol toegevoegd (50 ng/g niveau) om het terugvindingspercentage van clenbuterol te kunnen berekenen (zie tabel 11).

Tabel II: Achtergrondsignaal, uitgedrukt in gehalte aan clenbuterol (ng/g), verkregen met de

EIA in blanco monsters en de terugvindingspercentages na toediening van

clenbute-rol op het 50 ng/g niveau.

monstermateriaal gehalte recovery met een evt. toevoeging (ng/g) (%)

vlees 0,3 vlees

+

50 ng/g 36 72 vlees

+

50 ng/g 38 76 lever 0,6 lever

+ 50

ng/g 33 66 lever

+

50 ng/g 31 62 nier 1,0 nier

+

50 ng/g 31 62 nier

+ 50

ng/g 32 64 blindedarminhoud 0,8 blindedarminhoud

+

50 ng/g 25 50 blindedarminhoud

+

50 ng/g 27 54 spiermaaginhoud 0,9 spiermaaginhoud

+

50 ng/g 34 68 spiermaaginhoud

+

50 ng/g 28 56 Gemiddeld 63

Het gemeten achtergrondsignaal in de diverse typen monstermaterialen is

<

1 nglg. Het

terugvindingspercentage werd berekend op gemiddeld 63%, hetgeen overeenkomt met

eerdere bevindingen met IAC als monstervoorbewerking [Haasnoot e.a. 1990].

Van 10 kuikens uit de dierproef (kuikens 1 t/m 5; dag 0 en 11 t/m 15; dag 1; zie 2.1)

werden de diverse monstermaterialen onderzocht. De resultaten zijn weergegeven in

tabel liL Uit deze tabel blijkt dat, volgens verwachting, de hoogste gehalten aan

clenbu-terol worden gevonden in de blindedarminhoud. Van de eetbare delen worden in de

lever de hoogste waarden gevonden. In het vlees zijn de gehalten laag; op dag 1 komen

de gehalten nauwelijks boven het achtergrondsignaal van de methode (ca. 1 nglg) uit. Dit

achtergrondsignaal dient nog nader gedefinieerd te worden door meer blanco materiaal

afkomstig van verschillende dieren te analyseren. Voor een controle op het eventuele gebruik van clenbuterol lijkt lever de meest geschikte matrix omdat de

clenbuterolcon-centratie hierin het minst snel afneemt. Voor controledoeleinden is de spiermaaginhoud

minder geschikt omdat gehalte aan clenbuterol snel vermindert. Het monstermateriaal

van de overige tien kuikens uit het kuikenexperiment is niet geanalyseerd omdat deze

hoogwaarschijnlijk geen belangrijke additionele informatie zullen opleveren. Omdat het

monstermateriaal circa twee jaar oud is bestaat er een mogelijkheid dat het totale gehal

-te aan clenbuterol is afgenomen. Bij urinemonsters van runderen is in sommige gevallen

vastgesteld dat de gehalten aan clenbuterol teruglopen, zelfs bij bewaren bij -20°C. De

resultaten uit deze proef geven in ieder geval aan dat de uitscheiding van clenbuterol

Tabel 111: kuiken nr. 1 en 11 2 en 12 3 en 13 4 en 14 5 en 15 gemiddeld

De gehalten aan clenbuterol (ng!g) gevonden met de ElA in monster vlees, nier, lever, blindedarminhoud en spiermaaginhoud van tien kuikens welke gevoederd zijn met cle n-buterol bevattend voeder (zie 2.1 ).

vlees nier lever blindedarmin- spi crmaagin-houd houd dag dag dag dag dag dag dag dag dag dag

0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 3,0 0,8 13,8 1,5 19,1 3,9 36,7 8,1 34,7 2,4 2,4 0,6 21,5 1,4 22,1 7,8 109 26,1 27,2 3,3 2,7 1,6 20,5 3,5 23,5 4,3 52 17,6 69 10,3 2,8 1,4 17,7 3,2 9,0 4,3 107 37,4 36,3 3,6 2,7 1,0 25,2 3,9 36 13,6 ll1 23,9 63 3,6 2,7 1,1 19,7 2,7 21,9 6,8 83 22,6 46 4,6

Naast de in tabel lil weergegeven monsters zijn tevens een lever en een niermonster

onderzocht met een aantal toevoegingen van clenbuterol (controlemonsters op het 5 en

20 ng!g niveau; n=6).

Het terugvindingpercentage aan clenbuterol in deze controlemonsters bedróeg gemiddeld

68%, hetgeen goed overeenkomt met de eerdere bevindingen op het 50 ng!g niveau (tabel II).

Bij ronderurinemonsters is gebleken dat het met de EIA gevonden gehalte aan

clenbute-rol over het algemeen hoger ligt dan die gevonden met een GC-MS methode. Daarbij

werd aangenomen dat dit veroorzaakt werd door de aanwezigheid van metabolieten

waarvoor de antilichamen kruisreacties vertonen. Om te kunnen beoordelen of de

clen-buterolgehalten in de monsters afkomstig uit het kuikenexperiment zijn verhoogd door

de aanwezigheid van metabolieten werd een aantal monsters eveneens onderzocht met een methode waarbij JAC on-line is geschakeld met HPLC. Deze methode werd eerder

beschreven voor de bepaling van clenbuterol in urine [Haasnoot e.a. 1990).

Waterige extracten van de monsters, overeenkomend met 0,5 g monster, uit het

kuiken-experiment (zie 2.2.3) werden op dit geautomatiseerde systeem gebracht. In figuur 2

rrr- -I o ' •:I' ,,...

A

..

.

B

I I I I I I I I I I I I I I I "' I I I I I I I I t I l f ) I I I I I <S>

"'

·~

-Figuur 2: Chromalogrammen van de spiermaaginhoud van A; kuiken nr. 5 (dag 0; S219 nglg) en B: kuiken nr. lS (dag 1; 3,8 ng/g).

I I I

"'

-I I I

Uit figuur 2 valt duidelijk het verschil af te lezen tussen het gehalte aan clenbuterol in twee monsters spiermaaginhoud genomen op dag 0 en op dag 1. Voor dit onderzoek werd alleen uitgegaan van dezelfde extracten als gebruikt bij de EIA De gevoeligheid van de HPLC-methode kan eenvoudig worden vergroot door uit te gaan van meer mon-stermateriaaL

In totaal zijn 17 monsters (zie bijlage 2) volgens beide methoden geanalyseerd en de resultaten worden met elkaar vergeleken in figuur 3. De correlatiecoëfficient tussen de resultaten van beide methoden is hoog (0,9602). Met de EIA werden gemiddeld iets hogere waarden (factor 1,1) gevonden dan met de HPLC-methode. Hieruit kan gecon-cludeerd worden dat in de onderzochte matrices nauwelijks meetbare hoeveelheden aan metabolieten, waarvoor de gebruikte antilichamen kruisreactiviteit vertonen, voorkomen.

80 70

•

60 OI 50 ' Ol

.s

₄₀ <{

•

üi ₃₀

•

20

•

•

•

10

•

•

•

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 1-PLC (ng/g)

Figuur 3: Vcrgelijking van de resultaten vcrkregen met de EIA en met de HPLC -mc-thodc van 17 monsters lever, spiermaag, etc.

3.3 Onderzoek van levermonster·s afkomstig van kalveren

Naast de monsters uit het kuikenexperiment zijn tien kalverlevers onderzocht, die zijn

verkregen via het CLRVV. Deze monsters werden tevens door het CLRVV geanaly-seerd met behulp van de GC-MS methode waarbij de extractie- en

opzuiveringsprocedu-re is gevolgd zoals beschreven in bijlage lil

In tabel IV worden de volgens beide methoden gevonden gehalten aan clenbuterol

weer-gegeven. Hieruit blijkt dat alle met de EIA positief bevonden monsters ook met de GC-MS positief worden bevonden. De correlatie (r = 0,701) tussen de gehalten gevonden

met de EIA en de GC-MS is laag indien vergeleken met die verkregen tussen de EIA en de HPLC (zie figuur 3). De oorzaak van dit verschil kon niet worden verklaard.

Het gehalte aan clenbuterol in vleesmonsters, afkomstig van dezelfde kalveren als

waar-van de in Tabel IV beschreven levermonsters werden genomen, varieerde van 0,3 tot 4 nglg.

Tabel IV: Gehalten aan clenbuterol in runderlevers gevonden met de EIA en met de GC-MS methode.

RIKILT-nummer CLRVV-nummer gehalte aan clenbuterol (ng/g)

EIA GC-MS* 90 54445 90

sv

708 1,2 1,2 90 54446 90

sv

709 6,3 9,3 90 54447 90

sv

710 5,3 7,0 90 54448 90

sv

711 9,9 11,7 90 54449 90SV712 9,3 6,7 90 54451 90

sv

714 9,5 17,1 90 54453 90

sv

716 4,4 10,5 90 54455 90

sv

718 2,5 5,9 90 54457 90

sv

720 5,1 9,7 90 54459 90

sv

722 4,7 3,3 90 54459

+

20 ng/g 21 90 54459

+

20 ng/g 18

4 CONCLUSIE

De combinatie van een monstervoorzuivering op basis van immuno-affiniteitschromato-grafie (IAC) met de enzym-immunologische test (EIA) is geschikt voor het bepalen van clenbuterol in weefsels en spiermaag- en blindedarminhoud van kuikens. De detectie-grens van deze combinatie is onder andere afhankelijk van het gemeten

achtergrondsig-naal in het monstermateriaaL Deze bijdrage moet nog nader worden vastgesteld door meer blanco-materiaal te onderzoeken. De monstervoorbewerking kan grotendeels geau-tomatiseerd worden door gebruik te maken van het ASPEC-systeem. Hierdoor wordt de bepaling minder arbeidsintensief en meer reproduceerbaar.

Voor de controle op een mogelijk gebruik van clenbuterol is lever de meest geschikte

matrix omdat het gehalte aan clenbuterol hierin het minst snel afneemt.

Van een aantal monsters komen de resultaten verkregen met de EIA goed overeen met die verkregen met de HPLC-methode, waaruit geconcludeerd kan worden dat in de

on-derzochte matrices geen meetbare hoeveelheden aan metabolieten voorkomen waarvoor de gebruikte antilichamen kruisreactiviteit vertonen.

Omdat het geanalyseerde monstermateriaal uil het kuikenexperiment relatief oud was, kunnen de absolute gehalten in de loop van de tijd zijn afgenomen. De behandeling kon in elk geval worden aangetoond.

5 LITERATUUR

Asato G., Baker P.K., Bass RT., et al., Repartitioning agents: 5-[1-hydroxy-2-(isopropylami-no)ethyl]-anthranilonitril and related phenethanolamines; agents for promoting growth,

increasing muscle accretion and reducing fat deposition in meat-producing animals., Agric. Biol. Chem. 48 (11) 2883-2888, 1984

Cole D.J.A. e.a., CEC Seminar "Beta-agonists and their effects on animal growth and

carcass quality", Brussel 19-20 mei 1987, J.P. Hanrahan (Ed.), Elsevier p 137.

Courtheyn D., Verhé R en de Winne A., Quick and efficient clean-up procedure for the simultaneous determination of clenbuterol and cimaterol in urine and feed

sam-ples, Benelux Working Group Hormones and Antihormones SP/LAB/h (1988) 41.

Dalrymple RH., Baker P.K., Gingher P.E. et al., Metabolism and Nutrition: A repartitio-ning agent to imprave performance and carcass composition of broilers, Poultry Science 63:

2376-2383, 1984

Dalrymple RH. e.a., CEC Seminar "Beta-agonists and their effects on animal grmvtll

and carcass quality", Brussel, 19-20 mei 1987, J.P. Hanrahan (Ed.), Elseviers applied

science, p 163.

Duquette P.F. e.a., CEC Seminar "Beta-agonists and their effects on animal growth

and carcass quality", Brussel, 19-20 mei 1987, J.P. Hanrahan (Ed.), Elseviers applied

science, p 173.

Fürst P. e.a., GC-MS Bestimmung von Clenbuterol in Lebensmitteln, Futtermitteln und Urin, Deutsche Lebensmittel Rundschau, vol.85 (2) 1989, 35.

Haasnoot W, Ploum M.E, Paulussen RJ.A, Schilt R en Huf F.A, Rapid determination of clenbuterol residues in urine by high-performance liquid chromatography with

on-line automated sample processing using immunoaffinity chromatography, J. Chrom 2

(519) 323.

Haasnoot W, van Bruchem G.O., Hamers ARM. en Schilt R, De ontwikkeling van

een multiscreeningsmethode voor ,82-agonisten in urine, RIKILT rapport 90.51,

de-cember 1990.

Schilt R, Haasnoot W, Jonker M.A., Hooijerink H en Paulussen RJ.A., Proceedings of the EuroResidue conference, Noordwijkerhout, 21-23 mei 1990, p 320.

Schilt R, Farmacologie en analysemethoden voor de residu-bepaling van beta(2)-ago-nisten, RIKILT rapport 89.47, september 1989.

Scholttyssek S. e.a., CEC Seminar "Beta-agonists and thcir effects on animal grmvtll

and carcass quality", Brussel, 19-20 mei 1987, J.P. Hanrahan (Ed.), Elseviers applied

BIJLAGE I: Waarden voor de verschillende parameters in te vullen in de

pro-gramma's 150 en 160 van het ASPEC-systeem.

FILE 150 (configuratie):

- Cartridge volume

- Sample rack code

- Tubing volume

- Sequentia! - Inject

FILE 160 (initialisatie):

- Input ram exit

- Change solvent param.

- Number of conditioning solvents

- First solvent position

- First solvent volume

- Second solvent position

- Second solvent volume

- Dispensar speed -Air volume - Sample volume - Sample height -Speed -Air volume

- Number of washing solvents

- First solvent position

- First solvent volume

- Second solvent position

-Second solvent volume

-Speed

-Air volume

- Number of eluting solvents

- Position eluting solvent

- Eluting solvent volume

-Air volume

=

1000 (J.Ll)

=

28

=

10000 (J.Ll) = 0 (no) = 0 (no) = 0 (na) = 1

(yes)

=2

=

3 (methanol/0,5 M azijnzuur, 80/20, v/v) = 1000 (J.Ll) = 1 (water) = 2000 (J.Ll)

=4

=

50 (J.Ll)

=

2000 (J.Li) = 3 (mm) =3 = 50 (Jû)

=2

=

1 (water) = 2000 (Jû) = 2 (80% methanol) = 500 (JLl)

=4

=

100

=

1 = 3 (methanol/0,5 M azijnzuur, 80/20, v/v)

=

1000 (JLI) = 100

BIJLAGE 11: Vergelijking van de resultaten verkregen met de EIA en de HPLC

-methode.

Omschrijving monster gehalte clenbuterol (ng/g)

EIA HPLC

Nier dag 0 (kuiken 1) 13,8 25,0

Nier dag 1 (kuiken 11) 1,5 3,5

Lever dag 0 (kuiken 1) 19,1 27,2

Lever dag 1 (kuiken 11) 3,9 8,5

Lever dag 0 (kuiken 3) 23,5 24,1

Lever dag 1 (kuiken 13) 4,3 5,0

Spiermaaginhoud dag 0 (kuiken 3) 69 65

Spiermaaginhoud dag 1 (kuiken 13) 10,3 8,1

Lever dag 0 (kuiken 4) 9,0 13,8

Lever dag 1 (kuiken 14) 4,3 4,5

Spiermaaginhoud dag 0 (kuiken 4) 36,3 32.7

Lever dag 0 (kuiken 5) 36,0 25,8

Spiermaaginhoud dag 0 (kuiken 5) 63 52,9

Spiermaaginhoud dag 1 (kuiken 15) 3,6 3,8

Blanco nier

+

20 ng/g 13,4 9,4

Blanco nier

+

20 ng/g 12,5 12,4

BIJLAGE III: Concept-protocol voor de bepaling van clenbuterol in levermonsters zoals aangeboden aan het CLRW dd 23-11-1990 voor de incidente-le analyse van een aantal runderlevers.

PROTOCOL BFA 90.02 dd 23-11-1990

BEPALING VAN CLENBUTEROL IN LEVER (IAC-SPE-GC-MS) EXTRACTIE:

Weeg in een centrifugebuis 10 g lever af en voeg 50 ng gedeutereerd clenbuterol (d6, interne st.) en 50 ml 0,01 M HCl (pH 2) toe

Homogeniseer gedurende 2 min m.b.v. een ULTRA-TURRAX

Centrifugeer gedurende 15 min bij 15.000 g en bij 0-4°C

Filtreer het koude (0-4°C) supernatant over een vouwfilter en vang het filtraat op in

een erlenmeyer

Breng het filtraat op pH 7

+

0,5 m.b.v. enkele druppels 1M NaOH (controleer de pH m.b.v. een pH-meter)

Centrifugeer het op pH gebrachte filtraat gedurende 10 min bij 15.000 g en bij 0-4°C

IAC-OPZUIVERING:

Breng 25 ml (5 x 5 ml) van het supernatant op een !AC-kolom (anti-clenbuterol, 1

ml)

Was de JAC-kolom met 5 x 1 ml water

Desorbeer clenbuterol van de JAC-kolom met 5 mi 0,1 M azijnzuur (pH 3,5) en vang

het eluaat op in een 10 ml buis en vervolg de opwerkingsprocedure met de

SPE-OP-ZUIVERING

Spoel de JAC kolom met achtereenvolgens 5 ml methanol/water (70/30), 5 mi 0,1 M

azijnzuur en 2

*

5 ml water. De kolom is nu klaar voor het volgende monster. Breng

na het laatste monster 5 mi 0,02% natriumazide-opl. op de kolom en laat ca. 4 ml van

deze oplossing door de kolom lopen (1 mi boven de kolom laten staan). Sluit de

ko-lom af en bewaar deze in de koelkast.

SPE-OI'ZUIVERING:

Activeer een SPE-kolom (C-18, 3 mi, Analytichem nr. 607203) door deze te spoelen

met achtereenvolgens: 3 mi methanol en 2 • 3 ml water Breng de pH van het eluaat op 10 m.b.v. 10 M NaOH

Centrifugeer (3000 rpm) indien het op pH gebrachte eluaat troebel wordt!

Breng het op pH gebrachte eluaat op de geactiveerde SPE-kolom

Was de SPE-kolom met achtereenvolgens 3 mi water en 2 • 2,5 mi methanol/water

(50/50, v/v)

Laat de kolom korte tijd drogen (m.b.v. vacuum)

Elueer clenbuterol met 2

*

1 mi methanol

Voeg aan het eluaat een spatelpuntje natriumsulfaat toe, homogeniseer en

centrifu-geer (3000 rpm)

Damp het supernatant droog onder stikstof