Bacterieziekte bij begonia : vergelijking van detectietechnieken

(1)

Proefstation voor de Bloemisterij Linnaeuslaan 2a

1431 JV Aalsmeer Tel. 02977-26151

BACTERIEZIEKTE BIJ BEGONIA

Vergelijking van detectietechnieken Intern verslag nr. 4 Projectnr. 591 juli 1985 Ing. J. Schuuring Dr. G.W.L. van Vuurde Ir. H. Rattink Prijs f. 5,—

Interne verslagen zijn te bestellen door overmaking van de kosten op giro-rekening 174855 ten name van Proefstation voor de Bloemisterij, Aalsmeer.

(2)

BACTERIEZIEKTE BIJ BEGONIA

Het onderzoek werd volgens het opgestelde schema (zie bijlage A) uitgevoerd. De inoculatie gebeurde door op een stengel aan de basis een druppel van de

bacteriesuspensie aan te brengen en met een naald door de druppel heen in de stengel te prikken tot aan de vaatbundel(s). De bacteriesuspensie werd naar binnen gezogen. Per plant werden 8-10 stengels geïnoculeerd. Bij de verwerking van de monsters na 15 dagen na inoculatie werd naast de SX-bodem ook een special pepton + CaC^-bodem gebruikt.

44 dagen na inoculatie werd nogmaals een serie monsters bekeken. Resultaten

Bij de 3e monstername (15 dagen na inoculatie) waren bij enkele planten van de behandeling, waarbij met 109 sporen per ml was geïnoculeerd, de eerste

bladsymptomen te zien. Daarna werden geleidelijk aan bij de andere behandelingen, gecorreleerd aan de hoeveelheid inoculum, symptomen zichtbaar. Bij de laatste monstername na 44 dagen waren bij alle behandelingen symptomen te zien.

Op dat moment werden ook bij planten, die niet geïnoculeerd waren, enkele bladeren met symptomen gevonden.

ELISA

De waarden van ELISA, uitgevoerd bij de NAK-S (Bijlage 1) en op het IPO (Bijlage 2 ) , zijn te gelijkmatig om betrouwbare conclusies te kunnen maken. Meestal was ook de achtergrondkleuring te sterk.

Immunofluorescentie

Met de IF-techniek werd bij de monsters, genomen na 2 dagen na inoculatie, nog niet X.begoniae aangetoond (Bijlage 3). Na 8 dagen na inoculatie werden positieve reacties gevonden, vooral na 28 uur schudden bij 26°C in een ver-rijkingsmedium. De meest betrouwbare reacties werden gevonden bij de monsters na 15 dagen na inoculatie, die gedurende 4 uur bij 4°C in een gewone buffer

waren geschud.

Met dé IF-techniek werd ook regelmatig de bacterie aangetoond in monsters van de niet geïnoculeerde planten. In monsters van planten, die met 109 bacteriën per ml waren geïnoculeerd, werd de bacterie sneller en in grotere hoeveelheden gevonden.

Selectieve_bodems

In monsters genomen na 2 of 8 dagen na inoculatie, werd met de SX-bodem en via dubbeldiffusie de bacterie niet aangetoond (Bijlage 4 ) . Na 15 dagen na inoculatie werd alleen bij de hoogste concentratie de bacterie gevonden. Met de special pepton + CaClp-bodem bleek algemeen eerder en vaker de

bacterie aan te tonen te zijn, ook bij lagere inoculum-hoeveelheden. Bij de monstername na 44 dagen na inoculatie werd een goede correlatie

ge-vonden tussen de resultaten van de IF-techniek en de special pepton + CaC^-bodem. Conclusie

Het vergelijkende onderzoek heeft aangetoond, dat ELISA momenteel n i e t bruik-baar i s om routinematig grote hoeveelheden bladmonsters van Begoniaplanten te onderzoeken op de aanwezigheid van geringe hoeveelheden X.begoniae. Hetzelfde geldt voor de SX-bodem. Wel bruikbaar l i j k t de special-pepton + CaCl2-bodem. De r e s u l t a t e n met de IF-techniek z i j n goed. Schudden in een verrijkingsmedium geeft b i j monsters, die k o r t e r e t i j d na i n o c u l a t i e zijn genomen meer p o s i t i e v e r e a c t i e s dan schudden in een normale buffer. De beste r e s u l t a t e n (meeste p o s i t i e v e r e a c t i e s ) werden verkregen na korte t i j d schudden (4 uur) b i j lage temperatuur (4°C) .

(3)

Aanbevelingen

Voor routinematige onderzoek van Begoniaplanten op de aanwezigheid van

X-begoniae kan gebruik worden gemaakt van de IF-techniek. Om aspecifieke reacties te voorkomen lijkt schudden in een normale buffer bij lage temperatuur (4°C)

de beste methode, waarbij de tijdsduur bijvoorbeeld ca. 15 uur bedraagt.

Monsters, positief bevonden met IF, kunnen nagechecked worden, op de special pepton + CaCl2-bodem (Ca-oxalaat - kristalvorming), eventueel gevolgd door dubbel-diffusie en eventueel nogmaals IF.

- Tijdens praktische toepassing van de IF-techniek zal voortdurend aandacht besteed moeten worden aan de specificiteit van het te gebruiken anti-serum. - Vervolmaking van de special pepton + CaCl2-bodem is noodzakelijk.

- De mogelijkheden om met behulp van ELISA routinetoetsingen uit te voeren moeten verder onderzocht worden

- Ontwikkeling van een toe.tsmethode m.b.t. de techniek van monoclonale anti-bodies is zeer wenselijk.

juli 1985

Ing. J. Schuuring Dr. G.W.L. van Vuurde Ir. H. Rattink

(4)

U i t g a n g s m a t e r i a a l B e g o n i a - p l a n t e n ( c v . 'Schwabenland' maanden oud, één h e r k o m s t . I n o c u l a t i e : BIJLAGE A u i t m e r i s t e e m c u l t u u r , 4-5 I n o c u l e r e n met X.beggniae 10,10". io-\ 10

X.begpniae, afkomstig van IPO, , 10 , 10 bacteriën/ml en coi

Concentraties: O(Water), ontrole (=peincultuur) Per behandeling 10 planten. Bladeren verwonden met carborundumpoeder. Suspensies vernevelen. Na inoculatie planten onder plastic tent. Monstername:

Na 2,8 en 15 dagen per behandeling 75 bladponsjes van 1 cm diameter. Ponsjes mengen; 15 ponsjes uit behandeling 0,10,10 en controle naar F.A. Hakkaart; 4 x15 ponsjes bewerken.

Schema:

Mengmonster A: via buffer (water) 1. 4U schudden bij 4°C

(60 ponsjes) (2 x 15 ponsjes) (15 ponsjes)

2. 24u schudden bij 26°C (15 ponsjes) 48u schudden bij 26°C -B: via NBG (2 x 15 ponjes] 3. 4U schudden bij 4°C (15 ponsjes) 4. 24u schudden bij 26°C (15 ponsjes) 48u schudden bij 26°C Werkverdeling

Inoculatie + monstername : PBA

Uitvoering technieken : NAK-S + PBA in Roelofarendsveen Beoordeling ELISA : NAK-S, IPO

Beoordeling SX : NAK-S + PBA Beoordeling IF: IPO + NAK-S,

IF ELISA SX-bodem IF ELISA SX-bodem IF ELISA SX-bodem IF ELISA SX-bodem IF ELISA IF ELISA SX-bodem Tijdschema : 21 april 1985 23 april 1985 29 april 1985 6 mei 1985 inoculatie Ie monstername(2d) 2e monstername(8d) 3e monstername(15d)

(5)

o pq 55 <u •H 4J CÖ r-H 3 Ü o e •H « c e CU 00 (0 T3 00 u o vO CM U 3 3 CM U - I U O vO CM M 3 3 00 CM u o -3-u 3 3 <* O N o r-i vO O r-H U - I O i—i -* O • " * CO o r—i CM O i - H O r - H o O i o f—* vO O r - H i n O 1—1 -* o _{r - H} CO O 1—1 CM O i - H O 1—1 o < T i O i - H vO O r - H m o i - H -* o r - H CO o r - H CM O H O r - H O r-H O O O CM r-H r-H O O O —1 CM CM O O O CM CO CM O O O CM CO CM CM CM CO CO -3" CO CN CM CM v o r^~ i—1 O i - l CM r-H CO CM _ i r-H CM CO CM o «* o o co m _{r-H CM CO | - ~} O O O CM CO VO r-H CM CO O O O CM O - < H O O O CM O r-H i—I o m o cr\ oo m _{H H} _N _N o o o oo oo r~» r - H O -tf CO vO CM 0 0 r-l CM - * CO O O - Ï M O N i—1 O H o> C/\ N 1 r-H r-H CO - t f N N S N S 1 r-H r-H CO "3" CM «d- CO s t ON 1 r-H CM - * m CM - H vo co r^ l r-H r-H CO CO O N S H N | r-H 1-H CO - * N H N v O N 1 r-H i-H CO -3" O ON -3- r-H o 1 r H C O -vf O <T> m CM 00 1 H t o n u o _vO CM u 3 3 CM m o o _vO CM u u <U 3 M-l 3 4H 3 00 PO CM U O <* u 3 3 -* o\ o f - H vO O r-H m o i—i <r o r - H CO o ! - H CN O i - H O l - H O O V o r - H vO O r - H m o r - H -* O i - H CO O r - H CM O r - H O r - H O o\ o r - H vO O r—i m o r—i •St O r - H CO o i - H CM O r - H O r - H O CM o co m -3- vo r-H O O O O O r-H O O O O O CM o o o o o CM o o o o o --H O O O O O r-H o co r-~ r~. o i - H i—1 CO VO r—1 < f f ~ r-H r - | r-H CM > * N oo m I V r - H CM co r-~ CM I-H m r-H CM co CN oo i-v m m -tf r-H co m v£> v O 0 0 -d" CO v O r-H r-H CN CO - * O CM < f ON - 3 - CM r-H r-H CM vO -vf -tf CO - H r-H co m V£> H 0 0 - * - * CTi CO CM i n i-» rv. CO r-H CM 00 co 0 0 r-i CM < • I V VO CM o m I-H <j\ 1 r-H r-l co co CM CM <y\ <t co l r-H r-H CO < " CM CM O vO vO | r-< CM CO -tf CN O CO CM CO 1 H H N N O I O - J vO » 1 r-H CM < t m co r^ tv_{t-H CM - * v O} CT\ o 1 r-H o m o o 1 r-H i-H CO - 3 " O 00 O vO vO 1 r-H co i n VO ö eu 4-1 3 e in o m m m m r-i r-H c o m CJV ö cu u 3 e in o m m m m i-H r-H co m CT>

(6)

g

3 u o c cd c c (U 00 « m o o VO CM U 3 3 CM m u o _o CM U 3 3 00 CM U O <f H 3 3 >* Oi O 1 — 1 vO O i — i m o i — i -a-o l—l o-i O i-H CM O 1—4 o 1 — 1

°

oi o _1—4 vO O 1—4 m o »—1 «•d-O i — i CO O i — i CM O i — 4 O • — 1 O Ol O i — 4 vO O i — I u-i O i — I -tf O 1—4 en o • — i CM O 1—4 o 1 — 1 o ^ — V <-< oi m oo CM o <-i co vo vo v-x o vo m vo CM i—1 C M O O O ^ O O N H Cl H O ^H O O O ^ • s C M o oo oi oi o H <f Vu H sf H .—1 i—I i—1 N-^ O •—! O i—i o O (O M •* in o\ in 1-4 H in I-* ei eti en x ^H H ci m oo >-i oi CM —4 M T l CO CO H CM vo co in i-H i-4 H N H * O o CM <a- o st i—1 i H a\ vo oo •-< C M CM vo -* in i — i f — i H Vf ^ m S i—1 i-H o <-i —i m in ^N O oo r-^ co •—i C M s-^ CM VO -tf -4 A, n t n s i n s N N O - Î H i—1 •—1 C M o m ci oo -H .-1 1-4 Cl «3- 00 -* 00 I — 1 I — 1 CO -3" Cl <f 00 i — 4 co -* oi o r*» N M N O O CI i — 4 i — 4 CI m <t-i — <t-i r-» •—4 -* t — i vO l-~ i — 4 r~ i—( r~-CM A i — 1 «* A vO O CM A vO CM vO A 1—4 i — 1 CM • H CI CM O vO O U o _vO CM U 3 3 CM m u o _v£) CM u u _{U) s} <4-i d <4-l

5

°° P Q C M CJ o -d-u ₃ 3 -d-oi o 1—4 vO o 1—4 m o •—1 <* o _1—4 CO o 1—1 CM o 1—4 o 1—4 o o> o 1—4 VO o 1—4 in o 1—4 sf o 1—1 co o 1—1 CM o 1—4 o 1—1 o oi o 1—4 vO o 1—4 m o _1—1 «d-o 1—4 CO o 1—1 CM O 1—4 O _1—1 o ~* O" CO CO <f —4 CM m r-~ O ^H o co o o O o —< o O CM CO O O 1 — 4 i — 1 o o o vo o o -n in -d- -* i — l 1 — 4 O --I 00 CM 00 CM CM O vO N Ol O —4 CM CM vO in VO -d-1 — 4 -d-1 — 4 CM vO vO CM I-» 1—4 N V D O M O O 1 — 4 l — l Cl vO N vO -ï l — l 1 — 4 ci N O I O m CM CM Cl vO Ol Ol O 1-4 CM CM ~* <t -4 00 i — 1 » j - N H i n * H M N CM CM 1-1 Ol vO i—l >—4 C M C M C M v O v O i-l ^H O H 0 0 C 1 O —4 CM CM CO Ol lO 1—4 i — 1 Cl i-l N S Cl —4 CM i—i C M o m —i i-l -H CM CM CM Ol CO Ol 1—4 1—4 Cl CM vO -d" \0 1 — 1 CM 1—4 O i — 1 -<r 00 CM CM o • ^ m r~« co Cl s-/1 CM VO I-» <* m CM 00 1 — 1 -d-CM Ol CM O -* Ol CO m i — i Cl vf Ol CM Vf oo i — i CM -d-CM Ol i—l Ol 1—4 CM 4-1 d m o m m m in d i—i r-i c i m oi d 0) 4-1 3 m o m m m m d •—! •—i c i m oi

(7)

w

sa

>-} M M 4-1 «J 3 CJ o e cd e (3 cu 60 cd X) 00 O P-t {3 (U T3 et) cfl co H >J 3 ü O CO Ö e 0) 00 CO csl n CU 4-1 4-1 PQ x : CS| m CM 3 CNI m 3 NO CN| i—1 CM t—It—1 *—1 - * CM •—1 i n - * c N c o \ c - * c ^ < t

•—I CN i—l •—I r—f

C M C M i n c N C O C N C N r H CM CM co •—i co CM co CN CNI CO - * I A v£> ON o o o o o o o ö u cu 4-1 4-1 3 PQ CD PQ Z O 3 vD CN •C CM lO CJ 3 vu CN J3 CN m m o o vO CN -3- CN r~- co o i—l f—l ^O »—1 i—i -^- r-> o •—< •—i •—• CM r o - ï m * o \ o o o o o o o cO (3 a CU M tir m M 0) 4-1 4-1 3 PQ O PQ z •C CN m 3 vO CN , c < r 3 -* X! CN m 3 vO CN JS < f 3 <* oo < r •—i o »—i CO o (Tv r~- - * ON t~- —i o co - j - co co - * -d- CM cN ON m oo m CO —1 CN —1 i-I •—1 CN O CM CM ON <t tf r -•-H LO r—1 co PH r-. co CM m r-~ r > cN co - * m vo ON o o o o o o o

(8)

0 0 w

sa

i j •-Î l-l m C/3 4-> c Q) U CO O 3 i H C M O G 3 C :<u •H » J CU 4J O cd X! 3 CU <u e :cu •H M dl 4J u cd X> 0) 60 •H CS O <-H e CÖ • 3 ^ CU eu o o 1—1 3 cd X I n ei) 0) H Cl) CD > !H CU 0) Ù0 CU 0 g N Il II II II II

I +1+ t t

CU • H 4-1 cd rH ü O c • H CS CU 00 cd - 3 u i i-H CU • H 4-1 cd r H 3 CJ O CS •H CS CU 60 cd TS oo CU • H •u cd r H 3 CJ o 3 •H 3 cu 60 cd • 3 CN pp o vO CN X CN m c j o vO CN co CN u o s t X ! s f CJ o vO CN Xï CN IT) CJ O vO CN XS CO CN CJ O s t ja s t CJ O VO CN ,3 CN m u o vO CN XI 00 CN CJ O s t , 3 s t • • 3 U <U > CJ CS"

+1 1 +1 1 1 +1 + +

1 1 t 1 1 1 + +

1 1 +1 +1 +1 1 1 £

1 1 1 1 1 1 1 +1

+1 +1 +1 1 1 +1 1 +1

1 1 +1 1 1 1 1 +1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 CN ro st in vo a\ o o o o o o o o cu •H 4-1 cd r-t 3 o o s • H CU ÖO cd • 3 l O i-H 01 • H 4-) cd rH 3 o o 3 •H 3 CU 60 cd - 3 00 cu •H 4J cd rH 3 o o s •H 3 eu 60 cd • 3 CN u cu 14-1 m 3 CJ O vO CN X I CN m CJ o vO CN X 00 CN CJ O s t X I s t CJ O CN XI CN u-i CJ O vO CN X I oo CN CJ O s t X I s t CJ O vO CN XI CN m CJ o vO CN XI 00 CN CJ O s t X I s t • " 3 U <U > CJ PH 1 +1 1 1 + + | 1 + +1 1 + 1 1 + 1 +

+1 1 +| +| +| + +| t

1 1 1 1 1 1 1 1 1 + 1 1 1 1 I I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 cN ro st m vO a\ o o o o o o o o

(9)

BIJLAGE 4 2 dagen na Inoculatie

- S X platen negatief, behalve reincultuur 8 dagen na Inoculatie

- S X platen negatief, behalve reincultuur

15 dagen na inoculatie 1) 4 uur 4°C 0 10 102 103 10* 105 106 109 JKJ as?

+

-as? -+++ NBG zetmeel-vorming —

-+

DDD ~ -CaCl2 vorming

+

+? ++

+

-++ JKJ as? -as?

-+

Buffer zetmeel vorming —

-+

DDD —

-+

CaCl2 vorming —

+

-+

- -H-2) 24 uur 26°C 0 10 102 103 104 105 106 109 JKJ — --H-+ NBG zetmeel-vorming ~

-+

DDD "~

-+

CaCl2 vorming —

-+

-++ JKJ — -+++ Buffer zetmeel vorming ~

-+

DDD ""

-+

CaCl2 vorming ~"

-+

-

(10)

-H-Vervolg Bijlage 4 15 dagen na inoculatle 3) 52 uur 26°C NBG Buffer JKJ zetmeel-vormlng DDD CaCl2 vorming JKJ zetmeel vorming DDD CaCl2 vorming 0 10 io: 10-10< 10! 10( 10« +

-H-H-+

44 dagen na inoculatie NBG 4°C

0

10 102 103 10* 105 106 109 DDD

-+

+

C a C 1 2

++

-H-+

+

+++ -H-h

+++

IF

-+++

-H-+

+++

++

r" 1 1 ++ 2 6 ° C DDD

-—

-+

+

C a C l 2

+ (+)

+++

+

-H-++

+

IF

+ (+)

++ -H-++ (+)

+

-t-H-

m

(11)

-Cd

sa

• J >-) M m co M • J W

S

55 (U i - I 4-1 «) r-l 3 O O c • H R) a G 0 ) 0 0 m X I CM C J o VO esi U 3 3 CSl m u o vO CM U 3 S oo CM U O si-M 3 3 -* O N o r H vO O i—i m o *—i -* o t - H oo O i—i CM O 1—1 o 1—1 o ON o t - H vO O i—i m o i—1 <* o I—1 CO o I—1 CM o 1—1 o f—1 o cri o i—i vO O i—1 m o I - H <t o i—i oo O ^ H CM O i—1 O i - H O O O O O O ro O O O —< O CM i—i o o o o O O O O r H —< O 0 0 *-H O O CM CM ^ H 0 0 o o < t r-> ON r^ CM O O O O O 00 1—1 O O O O O 1-H i—i r-* m vo r^ CM •-H CM co m o m oo •—< •—' «—< •-H CM 00 o •—• •—I O •—i o o oo < r O N * r -^ H r - l O 0 0 0 0 ON < * CM r H CM n < t N m ~ j s CM m r-- o oo H r—1 O H N N - J S • < t 0 0 0 O CM i - l CM r H CO CO VO i—1 v O i—l <t 0 0 ON i-H oo oo \ o H m o oo vo i-H •-H CM CM vO H < f N H I O O H oo oo r^ 00 00 oo oo ON m i - l f l CM VO rH - * 00 *-« 0 0 VO CM r H CO oo oo CM o v o m r H oo CM m «3- 0 0 vO 00 O O l o i - i CM oo m u o vO CM u 3 3 CM m o o vO CM M

tl

<" 2 m 3 MH 3 oo PQ CM C J o -tf u 3 3 <* O N o 1—4 vO o 1—1 i n o i—H < t O i—1 co O —' CM O — i O r—1 O ON o 1—1 vO O i - H m o _i—i -* o p H oo O i—i CM O r - 1 o i - H o ON o I—1 VO o 1—1 m o 1—1 -* o 1—1 0 0 o 1—1 CM o _1—t o 1—1 o O O -tf vo r~ - * O CM CO VO v O CM 1—1 o o o o o o i—1 i—1 CM O O O r-H oo r^ oo m oo — 1 l—1 •—1 O —i oo oo <i- ON o * H -3- oo ON oo o CM p>. o i n oo r H r H —-1 N r - l ^ - S CO CM H H M - t s t co r-. CM -4- m i—i CM s t m r~--3- m o vo O N r~. i—1 CM CM co m m O N s t ON vo t~^ i—1 i—1 CM 0 0 m N • * s t u ^ CM s t vO ON CM i—l CM r-» r-» co < t s t r-i o o r-. CM co rH CM CM s t vO r H o CO s r VO o 1—1 CM VO O -3" r H VO r H CM CM s f H h r O N < f O i - l CO s t 0 0 •-H vo oo CM r-~ H r-i oo co r-~ CM v O i—1 0 0 CM CM r H CM CM VO H M f i f O v C C O i—i < t m ON CM oo CM m m CM r H CO - t f 0 0 CM r » m s t CM oo r H CO V f I-» CM VO O ON r H < t r H CM CO v O 3 <u 4-1 3 a • H E o 1—1 m o s t o t - H o o 0 0 r H 1—1 m m r H CO o o i n oo r~-i r—1 i n m m O N 3 0) 3 e m o m m m m »-H —H co m ON