Automatisering van de Speciële Immunologie van de AKCL

Automatisering van de

Speciële Immunologie van de AKCL

Bart Peters

Avans Hogeschool Breda

08-08-2014

Versie 1.0

Eindverslag Afstudeerstage

Eindverslag Afstudeerstage

Instelling opleiding

Avans Hogeschool Breda

Academie voor Technologie, Gezondheid en Milieu (ATGM)

Lovensdijkstraat 61-63

4818 AJ Breda

Instelling stage

Leids Universitair Medisch Centrum (LUMC)

Speciële Immunologie van de Afdeling Klinische Chemie en

Laboratoriumgeneeskunde (AKCL)

Albinusdreef 2

2333 ZA Leiden

Stage Periode

28-10-2013 - 31-07-2014

Opleiding

Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek

Onderwerp

Automatisering van de eenheid speciële immunologie met behulp

van het DSX systeem.

Versie

1.0

Inleverdatum

11-08-2014

Auteur

E-mailadres

Student nr.

Telefoonnummer

Bart Peters

b.peters1@student.avans.nl /

bart.peters@hccnet.nl

2038108

0615596603

Begeleider LUMC

E-mailadres

Telefoonnummer

Pascal Schippers

h.p.c.schippers@lumc.nl

071 5265159 (intern: 97861)

Jaap Bakker

j.a.bakker@lumc.nl

071 5264971

Begeleider Avans

E-mailadres

Telefoonnummer

Samenvatting

Met behulp van het DSX systeem worden interne ELISA bepalingen geautomatiseerd en externe

bepalingen geïmplementeerd op de speciële immunologie. Deze automatisering heeft voornamelijk

een tijdsbesparing met “walk away” automatisering tot doel. Deze automatisering verbreedt ook het

aantal analisten dat deze bepalingen kan uitvoeren en standaardiseert de uitvoering. Op deze manier

wordt het analysepakket uitgebreid en wordt de afdeling toekomstbestendig gehouden.

Om garant te staan voor de kwaliteit van het analysepakket en de patiëntenzorg worden deze

bepalingen gevalideerd. Tijdens een validatie wordt aan de hand van een aantal analytische en

klinische parameters bepaald of een methode onder praktijkomstandigheden voldoet aan vooraf

gestelde criteria.

De implementatie van ELISA’s op het DSX systeem is verdeeld in een aantal stappen. Eerst wordt een

DSX protocol (ASSAY) geschreven en worden monsters verzameld, eventueel al gemeten met een

referentiemethode. Vervolgens wordt de correlatie van de DSX met de manuele uitvoering van

dezelfde ELISA en de referentiemethode bepaald. Vervolgens wordt het vooraf geschreven

validatieplan uitgevoerd. Bij een geslaagde validatie wordt tenslotte de SOP geschreven of aangepast

indien de bepaling enkel overgezet is op de DSX.

De anti-C1q voldoet deels aan de validatiecriteria. Een methodevergelijking met de

referentiemethode moet de cut-off waarde nog verifiëren. De FGF-21 en complementactiviteits-

bepalingen op de DSX vertonen goede correlatie met de manuele uitvoering. De anti-MuSK, leptine

en adiponectine vertonen tevens goede correlatie en validatie moet worden vervolgd met

methodevergelijking met de verschillende RIA methodes.

Temperatuurvariatie (23 - 31°C) in de incubatoren op kamertemperatuur en onvoldoende mengen

door het lineaire schudden zijn twee duidelijke beperkingen van de DSX. Dit draagt waarschijnlijk bij

aan de slechte correlatie met de manuele uitvoering bij de anti-GAD en IL-6.

De DSX geeft bij alle geïmplementeerde ELISA’s een hogere OD bij monsters en in veel gevallen ook

bij controles en standaarden. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt tijdens de conjugaat en substraat

incubaties. Acht van de verschillende ELISA’s gebruiken Horse Radish Peroxydase (HRP) als conjugaat

en tetramethylbenzidine (TMB) als substraat. Daarnaast gebruiken drie ELISA’s alkaline fosfatase als

conjugaat, waarvan twee methoden p-nitrofenolfosfaat (PNPP) gebruiken als substraat. De derde

ELISA met alkaline fosfatase gebruikt NADPH.

HRP vertoont een stijging in activiteit tot de activiteit de piek bereikt op 45 - 50°C. Alkalische

fosfatase in combinatie met PNPP als substraat heeft een optimum temperatuur van 37°C.

Deze hypothese is getest door bij de anti-GAD de manuele incubatie te wijzigen met een verhoogde

temperatuur, omdat de DSX geen opties heeft om de temperatuur te verlagen. De anti-GAD bepaling

functioneert echter om andere redenen niet op de DSX. De hypothese moet met een ELISA worden

uitgetest die een goede correlatie vertoont tussen de DSX en de manuele uitvoering.

Voor optimaal gebruik van de DSX is koppeling met het patiënten datasysteem en de Revelation

software van de DSX gewenst. Dit verminderd de foutgevoeligheid van het handmatig invoeren en

het bespaart tijd. Binnenkort wordt deze koppeling opgezet.

Inhoudsopgave

1. Inleiding ... 5

2. Anti-C1q ... 6

3. Anti-GAD ... 30

4. Complementactiviteit ... 45

5. Anti-MuSK... 64

6. Leptine ... 79

7. Adiponectine ... 95

8. FGF-21 ... 111

9. IL-6 ... 124

Bijlagen ... 139

1. Inleiding

Het doel van elke analytische bepaling is het leveren van consequent betrouwbare en nauwkeurige

data. Om dit doel te bereiken dienen de gebruikte apparatuur en methodes gevalideerd te zijn voor

diagnostische bepalingen, en geverifieerd (korte validatie) voor research doeleinden of kleine

aanpassingen van diagnostische bepalingen. De resultaten van een validatie worden gebruikt om de

kwaliteit van een analytische methode te beoordelen op een verscheidenheid aan aspecten. Voordat

een aangepaste of nieuwe methode gebruikt mag worden voor de patiëntenzorg dient deze

gevalideerd te zijn.

Binnen de Speciële Immunologie wordt routine immunologische diagnostiek verricht, hierbij wordt

gebruik gemaakt van verschillende analysetechnieken. Om het analysepakket toekomstbestendig te

houden en uit te kunnen breiden, worden ELISA’s van de routine diagnostiek geïmplementeerd op

het DSX systeem, een ELISA processing systeem.

De eenheden Speciële Immunologie (SIM) en Speciële Bindingsanalyse (BA) worden samengevoegd

tot het SIMBA. Het pakket aan RIA’s van de bindingsanalyse wordt op termijn afgebouwd. Deze

bepalingen worden vervangen door andere methoden, zoals op de DSX geïmplementeerde ELISA

technieken.

Daarnaast worden in het kader van studies veel ELISA’s uitgevoerd door Onderzoek en Ontwikkeling

(O&O), de research tak van de Afdeling Klinische Chemie en Laboratoriumgeneeskunde (AKCL). Door

een tijd- en kostenbesparende uitvoering, bereikt door automatisatie op de DSX, heeft het AKCL een

grotere kans om studies binnen te halen.

Dit verslag is het eindproduct van een negen maanden durende stage op het Leids Universitair

Medisch Centrum (LUMC). Tijdens deze periode zijn ELISA methoden gevalideerd op de DSX van de

eenheid speciële immunologie van de AKCL. Deze stage is onderdeel van de opleiding Biologie en

Medisch Laboratoriumonderzoek (BML) op Avans Hogeschool te Breda.

Dit verslag is opgebouwd uit een achttal losstaande validatierapporten. De anti-C1q, anti-GAD en

activiteitsmeting voor de drie complementroutes bepalingen worden tot op heden manueel

uitgevoerd op de SIM. De anti-MuSK, leptine en adiponectine bepalingen worden uitgevoerd met

behulp van RIA methoden door de BA. De laatste twee daarvan worden tevens in het kader van

studies uitgevoerd. De FGF-21 en IL-6 bepaling worden met behulp van manuele ELISA uitgevoerd

door O&O.

CENTRAAL KLINISCH CHEMISCH LABORATORIUM

Unit Speciële Immunologie en Bindingsanalyse

VALIDATIE VAN DE ANTI-C1q BEPALING OP HET DSX SYSTEEM

Bart Peters

Concept

Beknopte conclusie

1. De DSX correleert met de manuele uitvoering van de ELISA.

2. De methode voldoet aan de gestelde criteria.

Voor akkoord het verantwoordelijk staflid

Datum:

Handtekening:

Inhoudsopgave

1. VOORONDERZOEK ... 3

1.1 CRITERIA WAARAAN APPARAAT/METHODE MOET VOLDOEN ... 3

1.2 INTERNE OF EXTERNE PRODUCTIE ... 3

1.3 INVENTARISATIE EN EVALUATIE RISICO’S VOOR GEBRUIK ... 3

1.3.1 Arbeidsomstandigheden en milieu ... 3

1.3.2 Gevaarlijke stoffen... 3

1.3.3 Productveiligheid ... 3

1.3.4 Restrisico’s ... 3

1.3.5 Koppeling met laboratorium informatiesysteem... 3

1.3.6 Europese aanbesteding ... 3

1.3.7 Wettelijke eisen die van toepassing zijn... 3

2 KEUZE LEVERANCIER ... 3

3 VALIDATIEPLAN APPARATUUR ... 4

3.1 INSTALLATIEKWALIFICATIE ... 4

3.2 OPERATIONELE KWALIFICATIE (FUNCTIONEREN ZONDER MONSTERS) ... 4

3.3 UITVOERINGSKWALIFICATIE (FUNCTIONEREN MET MONSTERS) ... 4

4 VALIDATIERAPPORT APPARATUUR ... 4

4.1 INSTALLATIEKWALIFICATIE ... 4

4.2 OPERATIONELE KWALIFICATIE ... 5

4.2.1 Resultaten van calibratie ... 5

4.2.2 Resultaten van de controles ... 5

4.3 UITVOERINGSKWALIFICATIE ... 6

4.3.1 Voldoet apparaat aan criteria? ... 6

4.3.2 Validatie koppeling(en) ... 6 4.3.3 Vervanging ... 6 5. VALIDATIEPLAN METHODE ... 6 5.1 ANALYTISCHE VALIDATIE ... 6 5.1.1 Achtergrond ... 7 5.1.2 Principe ... 7 5.1.3 Doelstelling validatie... 7 5.1.4 Werkwijze ... 7 5.2 KLINISCHE VALIDATIE... 10 6. VALIDATIERAPPORT METHODE ... 11 6.1 ANALYTISCHE VALIDATIE ... 11 6.2 KLINISCHE VALIDATIE... 13 7 DOCUMENTATIE ... 13 8 DISCUSSIE ... 13 9 CONCLUSIE ... 13 10 AANBEVELINGEN ... 13 LITERATUUR ... 14 BIJLAGEN ... 15 BIJLAGE I: PRECISIE ... 15

1.

Vooronderzoek

1.1 Criteria waaraan apparaat/methode moet voldoen

1 De optimale instelling van de DSX voor de methode moet worden bepaald, deze moet vervolgens aan de validatie criteria voldoen.

2 De nieuwe methode moet bij vergelijking correleren met de manuele referentiemethode.

1.2

Interne of externe productie

Er is gekozen voor de externe aanschaf van een kit van firma INOVA Diagnostics. De bepaling wordt intern

uitgevoerd.

1.3

Inventarisatie en evaluatie risico’s voor gebruik

1.3.1 Arbeidsomstandigheden en milieu

Indien de kap van de DSX is gesloten worden mogelijke risico’s door aërosolvorming beperkt.

1.3.2 Gevaarlijke stoffen

De volgende reagentia; conjugaat, monsterdiluent en de controles, bevatten kleine hoeveelheden (< 0.02 %) van

het carcinogene chloramphenicol.

1.3.3 Productveiligheid

CE-markering aanwezig?

Ja, op de bijsluiter van kit

1.3.4 Restrisico’s

Indien de DSX in werking is, moet voor manuele handelingen verricht worden binnen de werkruimte van het

apparaat gecontroleerd worden op de tijdlijn functie van de software of de pipetteerarm de komende minuut gaat

bewegen.

1.3.5 Koppeling met laboratorium informatiesysteem

Koppeling nodig?

Ja, op termijn GLIMS koppeling gewenst voor doorsturen van resultaten.

Extra software en/of hardware nodig? Ja, Extra software ter waarde van €3500.

1.3.6 Europese aanbesteding

Aanschaf boven de aanbestedingsgrens inclusief BTW?

Nee

1.3.7 Wettelijke eisen die van toepassing zijn

De bepaling moet voldoen aan de eisen van de norm ISO 15189 en de CE certificering voor Medische

hulpmiddelen voor IVD, namelijk 98/79/EC.

2

Keuze leverancier

contract

Service verlening

Recallsysteem Bereikbaarheid Kwaliteitssysteem Gecertificeerd Audit mogelijk

Inova NVT Ja - Onbekend Ja Ja Ja

Clindia Ja Ja - Onbekend Ja Ja Ja

De bepaling wordt geautomatiseerd door een methode aan de hand van een kit van firma

INOVA Diagnostics

implementeren op de DSX. De automatisatie dient de uitvoering te standaardiseren en een tijdsbesparing op te leveren met “walk away” automatisatie. Deze automatisering verbreedt ook het aantal analisten dat deze bepaling kan uitvoeren. De referentiemethode vertoont veel variatie door manuele coating van de microplaten.

3

Validatieplan apparatuur

Dit is geen validatie van apparatuur, indien bekend is dit deel wel ingevuld.

3.1

Installatiekwalificatie

Stel criteria op waaraan de installatiekwalificatie moet voldoen, bv ontwerpspecificatie, systeembeschrijving, identificatie, documentatie (waaronder certificaten, handleiding, logboeken, onderhoud en schoonmaak).

Beschrijf de wijze waarop, hoe vaak en door wie de installatiekwalificatie wordt uitgevoerd, de wijze waarop, de wijze van rapporteren, registreren en archiveren, inclusief door wie en de verantwoordelijken.

3.2

Operationele kwalificatie (functioneren zonder monsters)

Bepaal wat de kritische parameters zijn en waaraan iedere parameter moet voldoen. Met andere woorden: beschrijf de functionele testen van de kritische parameters inclusief de acceptatiecriteria, de eisen waaraan voldaan moet worden. Beschrijf de wijze waarop, hoe vaak en door wie de operationele kwalificatie wordt uitgevoerd, de wijze van rapporteren, registreren en archiveren, inclusief door wie en de verantwoordelijken.

Beschrijf hoe de procedure verloopt bij niet goed functioneren en welke acties worden ondernomen.

3.3

Uitvoeringskwalificatie (functioneren met monsters)

Bepaal wat de kritische parameters zijn en waaraan iedere parameter moet voldoen. Met andere woorden beschrijf de functionele testen van de kritische parameters inclusief de acceptatiecriteria, de eisen waaraan voldaan moet worden. Beschrijf de wijze waarop, hoe vaak en door wie de uitvoeringskwalificatie wordt uitgevoerd, de wijze van rapporteren, registreren en archiveren, inclusief door wie en de verantwoordelijken.

Beschrijf hoe de procedure verloopt bij niet goed functioneren en welke acties worden ondernomen.

Als wordt gekozen voor een verkorte validatieprocedure, moet de reden hiervoor in het rapport worden

aangegeven. Er mag niet standaard gekozen worden voor een verkorte procedure

4

Validatierapport apparatuur

4.1

Installatiekwalificatie

Gegevens leverancier van het DSX systeem van Dynex

Firma

Contactpersoon

Telefoonnummer

Bereikbaarheid

Datum binnenkomst:

Datum garantietermijn:

Inventarisatie

Inventarisatie

Inventarisnummer

06-820-0427

Inventarislijst gecontroleerd

Nee

Reserve onderdelen aanwezig

Nee

Randapparatuur aanwezig

Revelation 6.1 software op gekoppelde computer

Identificatie

Identificatie

Check

LUMC registratie etiket op apparaat

Apparaat ingeschreven in Ultimo

Etiket houdbaarheid preventief onderhoud

Noodzakelijke voorraad

Voorraad

Check

Benodigde materialen

Benodigdheden ingevoerd in FLITS

Opleiding

Zijn er voldoende analisten opgeleid om het apparaat te kunnen bedienen/beheren?

Opleiding

Check

Bedienen

Beheren

Documentatie aanwezig?

Documenten

Check

Certificaten

Onbekend

Handleiding

Documentatie Onderhoud en schoonmaak

Preventieve onderhoudsschema’s

Calibratie

Voorschriften aanwezig?

Voorschriften

Check

Apparaatvoorschrift

Bepalingsvoorschriften

Procedure bij niet goed functioneren

-

Logboeken

4.2

Operationele kwalificatie

4.2.1 Resultaten van calibratie

Door leverancier

4.2.2 Resultaten van de controles

4.3

Uitvoeringskwalificatie

4.3.1 Voldoet apparaat aan criteria?

Criterium

Voldoet Ja / Nee

4.3.2 Validatie koppeling(en)

Is/zijn de koppeling(en) gevalideerd?

4.3.3 Vervanging

Welk apparaat is vervangen?

Op welke datum is dit apparaat gestopt?

NVT

5.

Validatieplan methode

5.1

Analytische validatie

Voor uitvoering is een aantal monsters nodig van zowel patiënten die voldoen aan de normaalwaarden en patiënten

die hier niet aan voldoen.

Parameter Valideren ja /nee

Zo nee, waarom niet? Aantal monsters, hoe vaak gemeten

Criteria waaraan voldaan moet worden

Juistheid Ja 7 positief, 25 negatief,

duplo bepalingen

Correlatie met referentiemethode. Indien mogelijk ook met EQA monsters.

Precisie Ja 2 monsters in viervoud

over 5 dagen

Imprecisie ≤12 en ≤13% respectievelijk voor intrarun en interrun.*

Specificiteit Nee Vergt grote hoeveelheid bepalingen.

60 Positieve sera meten, te weinig materiaal Functionele

gevoeligheid

Ja Tijdens lineariteit <20 Units en boven de achtergrond (blanco) (Kwantificatielimiet)

Detectiegrens Nee Detectielimiet is eventueel te bepalen, maar niet noodzakelijk omdat de respons in OD van de lage controle met 25 Units en de negatieve controle ver genoeg uit elkaar liggen.

≤20 Units

Lineariteit Ja 10 verdunningen in

triplo

Affiniteit voor antilichamen mogelijk verschillend per patiënt en niet lineair. Meetgebied Ja Tijdens lineariteit ≤20 en >80 Units

(referentiemethode: 90 - 24000 IU/ml)

Interferenties** Ja 5 positieve ENA

monsters in duplo

Geen interferentie bij lage concentraties * Criteria afkomstig uit de bijsluiter van INOVA Diagnostics.

**Bijsluiter: Vermijd sterk hemolytische en lipemische monsters. Geen kruisreactiviteit gemeten met de ENA’s (SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1), Ribo-P en dsDNA.

5.1.1 Achtergrond

De Quanta Liteanti-C1q bepaling toont antilichamen tegen complementfactor 1q aan in serum. Deze kit van firma INOVA Diagnostics doelt als ondersteuning om patiënten met systemische lupus erythematosus (SLE) te screenen op risico voor het ontwikkelen van glomerulonephritis, een verzamelnaam voor een aantal nierziekten, meestal met effect op beide nieren. Het complementsysteem is een belangrijk onderdeel van het aangeboren afweersysteem. C1q is de herkenningsfactor van de klassieke route van het complementsysteem. De concentratie C1q in serum kan verminderd zijn bijvoorbeeld ten gevolge van verbruik, zoals bij abnormale activatie van de klassieke route. Autoantilichamen tegen C1q (Anti-C1q) komen voor in het serum van patiënten met diverse immuuncomplex ziekten zoals SLE, in het bijzonder bij patiënten met lupus nefritis. Deze antilichamen zijn pathogeen als een patiënt tevens circulerende immuuncomplexen heeft. Daarnaast komen anti-C1q antilichamen in zeer hoge frequentie voor bij patiënten met Hypocomplementemisch Urticarieel Vasculitis Syndroom (HUVS), en in mindere mate bij andere aandoeningen, zoals reumatoïde vasculitis, polyartritis nodosa, mixed connective tissue disease, membranoproliferatieve glomerulonephritis, en cryoglobulinemie. [1],[2]

5.1.2 Principe

IgG autoantilichamen tegen het collageen achtige domein van c1q worden in verband gebracht met het actieve ziektebeeld in SLE patiënten. Dit betreft een binding van het antigeen specifieke deel van IgG aan C1q (meestal de staart van C1q). Ongewenste binding van het Fc-gedeelte van IgG aan de kop van C1q wordt tegengegaan door het toepassen van een verhoogde zoutconcentratie. Een hoge zoutconcentratie verhindert de binding van de kop van C1q aan het Fc-deel van IgG, terwijl de binding van specifieke anti-C1q antilichamen onafhankelijk is van de zoutconcentratie. Om immuuncomplex vorming met andere delen van de C1q gecoate plaat te voorkomen, en dus de specificiteit te waarborgen, worden de monsters verdund met een diluent met een hoge zoutconcentratie. Voorverdunde controles en verdunde patiëntensera worden in

welletjes gebracht. Vervolgens wordt na incubatie ongebonden monster weggespoeld en wordt een met HRP gelabeld geit IgG, anti-humaan IgG conjugaat toegevoegd. Na een tweede incubatie en wasstap wordt TMB substraat toegevoegd. Na incubatie wordt een zwavelzuur stopvloeistof toegevoegd en wordt de kleurintensiteit gemeten bij 450nm, tegen een referentiefilter van 620nm.

De concentratie anti-C1q wordt berekend volgens onderstaande formule (na aftrekken van referentiefilter): Meetwaarde Monster = Monster OD x Anti-C1q ELISA Laag Positief (units) Anti-C1q ELISA Laag Positief OD (units)

Een positieve waarde anti-C1q duidt op een verhoogd risico op het ontwikkelen van glomerulonephritis bij SLE patiënten. Een waarde onder de negatieve cut-off grens duidt op de afwezigheid van anti-C1q.

De bepaling wordt geautomatiseerd op het DSX systeem van Dynex Technologies. Dynex Technologies is fabrikant van microplaat instrumentatie voor klinische diagnostiek, medicijnontwikkeling, biomedisch onderzoek en industriële toepassingen. De DSX is een ELISA processing systeem met een capaciteit van vier microtiterplaten en het is mogelijk meerdere bepalingen tegelijk uit te voeren op een plaat. Tevens kan de DSX een handmatig uitgevoerde ELISA plaat aflezen. De DSX is gekoppeld aan een computer met Revelation 6.1 DSX software. Deze software voert de meeste berekeningen, kalibraties en uitwerkingen van meetresultaten direct uit aan de hand van kalibratoren en staat het aanpassen en toevoegen van methodes toe. [3]

5.1.3 Doelstelling validatie

De ELISA van firma INOVA dient de huidige, zeer bewerkelijke ELISA te vervangen. Deze door Nierziekten ontwikkelde ELISA vertoont veel variatie door de manuele coating. De nieuwe ELISA dient reproduceerbaarder te zijn.

5.1.4 Werkwijze

Als eerste wordt de anti-C1q bepaling geïmplementeerd op de DSX vanaf de methode met de INOVA Diagnostics kit. Hierbij worden de optimale instelling van de DSX voor deze methode bepaald. Na deze verificatie worden de onderstaande parameters onderzocht. Na deze analytische validatie, waaronder een vergelijking met de huidige door het researchlaboratorium Nierziekten ontwikkelde ELISA als referentiemethode, wordt de SOP aangepast zodat deze bepaling voortaan uitgevoerd kan worden op de DSX.

Als een methode eenmaal succesvol is toegevoegd als ASSAY op de DSX kan de validatie beginnen. Voor een efficiënt validatieproces worden de onderdelen volgens onderstaande volgorde gecombineerd en uitgevoerd.

- Sensitiviteit en specificiteit en interferenties Ep Evalualor methode comparison

- Interferenties

- Precisie; interrun, tevens begin intrarun (loopt door over 5 dagen) en carry-over Ep Evaluator EP5 voor precisie en carry-over

- Lineariteit, gevoeligheid, detectie-en kwantificatielimiet en meetbereik Ep Evaluator EP6 voor lineariteit

Patiëntenmateriaal

Om de validaties van de verschillende bepalingen uit te voeren moet oud patiëntenmateriaal verzameld worden. De validaties worden uitgevoerd met serummonsters met nulwaarden of normaalwaarden en tevens per bepaling materiaal met positieve waarden. Indien geen patiëntenmateriaal aanwezig is moet extern geschikt materiaal gezocht worden.

Benodigd: 10μl serum per bepaling (dood volume: 400µl standaardbuis en 75µl in Sarstedt 500µl buis). Houdbaarheid monster:

KT < 1 uur 4°C 2 weken -20°C 1 jaar -70°C 10 jaar

anti-C1q positief materiaal

Hier is rekening gehouden met dood volume. Referentiewaarden kit (in Units):

• Negatief <20 • Laag Positief 20 – 39 • Matig Positief 40 – 80 • Sterk Positief >80

7 afwijkende waarden (≥ 90 IU/ml ) voor sensitiviteit (patiëntenmonsters gemeten met referentiemethode) verdeeld over het meetbereik.

Pools positief voor anti-C1q

Monster Hoeveelheid monsters Validatie onderdeel Volume Laag 5 IU/ml 27 metingen Precisie 0,7ml Midden 20 IU/ml 20 metingen Precisie 0,7ml Hoog 70 IU/ml 26 metingen Precisie 0,7ml Standaard stockoplossing ≥ 100 IU/ml

Verdund met 0-serum, 10 verdunningen in triplo

Lineariteit 0,7ml

Standaard verdunningsreeks

Verdunning 1/1 1/2 1/4 1/6 1/8 1/10 1/20 1/40 1/60 1/100

anti-C1q negatief materiaal

25x patiëntenmonsters met normaalwaarden (negatief voor anti-C1q) voor specificiteit (Indien negatief gemeten, eventueel te gebruiken voor 0-serum)

0-serum, pool negatief voor anti-C1q

5x blanco (monsterdiluent of 0-serum) lineariteit

5x normaalwaarden of andere blanco’s met verontreiniging voor interferenties, monsters positief voor ENA’s 0-serum voor hoog/laag bij precisie en carry-over en voor verdunningsreeks bij lineariteit, maak 4ml

Methodevergelijking (Sensitiviteit, Specificiteit en interferenties)

1. Bepaal de normaalwaarden voor deze bepaling door 25 monsters te analyseren.

2. Meet een zo groot mogelijk aantal monsters met afwijkende waarden voor de analyt, ook gemeten volgens de referentiemethode. Neem ook voldoende standaarden en controles mee met bekende concentraties.

3. Het uitsluiten van interferentie van de matrix moet worden uitgevoerd door minstens vijf verschillende monsters te analyseren per verstorende factor (hemolyse, lipemie, M-proteïne)

- Een mogelijkheid is het spiken van een negatief monster / blanco. Interferentie van deze verontreiniging kan dan bepaald worden door de meetwaarde te vergelijken met de blanco.

- Een andere mogelijkheid is het spiken met een mogelijk interfererende factor bij een monster met een lage concentratie analyt. Bij lage concentraties analyt heeft een interferende factor een duidelijker effect op de meetwaarde.

- Voor interferentie door kruisreactiviteit kunnen monsters met positieve ENA’s gebruikt worden. 4. Vergelijk de resultaten met de referentiemethode. Bepaal de correlatie tussen de twee methodes.

5. Als de twee methodes een goede correlatie vertonen kan verder gevalideerd worden, anders moet de ASSAY van de DSX aangepast worden tot de specificiteit in orde is. Om geen materiaal te verliezen kunnen ook eerst alleen de controles gemeten en vergeleken worden voor gevalideerd wordt.

Precisie

1. De intrarun is tegelijkertijd de carry-over. Analyseer 10 hoge en 11 lage concentraties analyt door een twee pools van patiëntenmateriaal te maken met bekende concentraties.

2. Neem steeds standaarden, controles en eventueel een blanco mee.

3. Meet voor de interrun na de eerste meting uit deze pools nog vier opeenvolgende dagen deze monsters in viervoud.

4. Bereken het gemiddelde, standaard deviatie en de relatieve standaard deviatie van de intrarun en de gehele interrun, inclusief de intrarun.

Carry-Over

De DSX wordt getest op een Carry-over effect bij de te implementeren bepalingen door 10 Hoge en 11 Lage monsters in een run te draaien volgens onderstaande tabel. Dit maakt deel uit van de interrun.

Volgorde van hoge en lage concentratie bij de Carry-Over test Volgorde

Hoog/Laag in DSX

L1 L2 L3 H1 H2 L4 H3 H4 L5 L6

L7 L8 H5 H6 L9 H7 H8 L10 H9 H10 L11

Carry-over statistische waarden en eisen aan bepaling:

- Het Laag-Laag gemiddelde en de standaarddeviatie van de duplo’s; L2, L3, L6, L7 en L8 (lage monsters volgend op een laag monster) - Het Hoog-Laag gemiddelde en de standaarddeviatie van de duplo’s;

L4, L5, L9, L10 en L11 (lage monsters volgend op een hoog monster) - Het Carry-over effect:

Het verschil tussen het Hoog-Laag gemiddelde en het Laag-Laag gemiddelde. - Error limiet: 3 keer de Laag-Laag standaarddeviatie.

- De Carry-over test is geslaagd indien het Carry-over effect het Error limiet niet overstijgt.

Lineariteit, kwantificatielimiet en meetbereik

1. Maak een hoog positieve standaard stockoplossing door gepoold materiaal te mengen met een monster met een hoge concentratie analyt.

2. Maak tenminste 10 geschikte verdunningen als standaardreeks en meet deze samen met geschikte kalibratoren en controles. Neem ook een vijftal blanco’s mee.

- De standaarden moeten van 80 tot 120% van de te verwachten concentraties in patiëntenmonsters beslaan.

3. Maak van de calibratiecurve een grafiek met correlatie coëfficiënt, het snijpunt met y-as en de helling, ofwel richtingscoëfficiënt.

4. Vergelijk de meetwaarden met de werkelijke waardes van de standaard door de standaarddeviaties te berekenen. 5. Controleer of het snijpunt met de y-as niet significant verschilt van nul.

6. De hoogste standaard met een acceptabele standaarddeviatie is het meetbereik. De laagste standaard die nog een acceptabele standaarddeviatie vertoont is het limiet van kwantificatie. Tenslotte is de laagste standaard die een positief signaal levert dat boven de blanco’s uitkomt het detectielimiet. Het detectielimiet moet een meetwaarde hebben die tenminste drie keer de meetwaarde van de blanco is.

5.2

Klinische validatie

Het gaat om een analytische validatie. De gegenereerde data kunnen worden gebruikt voor een verificatie van de referentiewaarden.

Parameter Valideren ja / nee

Zo nee, waarom niet? Aantal monsters, hoe vaak gemeten

Criteria waaraan voldaan moet worden Sensitiviteit Ja Aantal monsters eerder gemeten met

referentiemethode, 7 positief en 25 negatief.

Gevoeligheid kit volgens bijsluiter is 91,8%

Specificiteit Ja Positief

voorspellende waarde

Ja 7 Variatie binnen bepaling ≤15% VC Door manuele coating is de referentiemethode zeer variabel, er wordt enkel naar verschillen in positief /negatief gekeken bij de vergelijking. Negatief / Normaal voorspellende waarde Ja 25

Referentiewaarden Ja Tijdens het meten van de monsters voor sensitiviteit en specificiteit wordt de

referentiewaarde van de bijsluiter geverifiëerd.

• Negatief <20 • Laag Positief 20 – 39 • Matig Positief 40 – 80 • Sterk Positief >80

6.

Validatierapport methode

6.1

Analytische validatie

Een tweetal correlatie experimenten zijn uitgevoerd. Na het eerste experiment is de plaat tijdens de incubaties op KT niet in de incubator geplaatst, maar in de plaatlade gelaten. Hier blijft de temperatuur gelijk aan de omgevingstemperatuur op het lab, terwijl vastgesteld is dat de incubatoren ongecontroleerd opwarmen.

In onderstaande figuur zijn de meetwaardes van de DSX en manuele uitvoering vergeleken van het tweede correlatie experiment, zie figuur 1.

Figuur 1. De waardes van het tweede correlatie experiment, de DSX uitgezet tegen de manuele uitvoering.

De validatie is vervolgd volgens het plan in voorgaand hoofdstuk. De intrarun en Carry-Over zijn tegelijk bepaald met een drietal pools. Voor de interrun zijn nieuwe pools gemaakt zodat het meetbereik beter werd gerepresenteerd. Deze zijn vijf verschillende dagen gemeten. Tijdens deze dagen zijn ENA monsters gemeten. De ENA monsters voor bepalen van interferentie liggen onder de cut-off waarde. De meetwaardes komen overeen met die van een groot deel van de bij de

referentiemethode gemeten anti-C1q negatieve monsters. De ENA combinatie Ro en La veroorzaakt geen interferentie, evenals als de ENA CENP. Dit betekent dat Sjögren’s syndroom en CREST, milde systemische scleroderma, niet anti-C1q positief scoort.

De intrarun is succesvol afgerond met 3,3 en 3,6% variatie bij de lage- en hoge pool respectievelijk. De precisie pools hebben een variatie van 6,9% gemiddeld (6,7 - 7,2%). Hiermee is over het gehele meetgebied heen de interrun variatie gelijk, zie bijlage I. Op de plaat is geen Carry-Over effect aanwezig, zie bijlage II.

De lineariteit is bepaald met een twaalftal verdunningen van een hoge stockoplossing en een blanco. Het lineaire deel loopt tot de meetwaarde van 108 Units. Dit deel is met een aparte lijn weergegeven in figuur 2. Verder is de gehele verdunningsreeks exponentieel als de meetwaardes tegen de toegewezen waarden worden uitgezet. Het 0-serum is als blanco gemeten op 3 Units.

y = 0,8615x + 7,8403 R² = 0,9482 0 50 100 150 200 250 0 50 100 150 200 250 DSX (U nit s) Manueel (Units)

Correlatie DSX VS. Manueel

Figuur 2. De gemeten waardes uitgezet tegen de toegewezen waardes vertonen een lineair verband tot 108 Units. Het gehele meetbereik is exponentieel.

Bij de methodevergelijking zijn bij de correlatie experimenten en tijdens de precisie uitvoering monsters gemeten die eerder al met de referentiemethode gemeten waren. Dit waren 7 positieve monsters en 25 negatieve monsters.

De drie off waardes van de INOVA ELISA zijn in figuur 3 weergeven met horizontale lijnen (20, 40 en 80 Units). De cut-off waarde van 90 IU/ml bij de referentiemethode is weergegeven met een verticale lijn.

Figuur 3. Methodevergelijking met de cut-off waardes van de ref. methode verticaal (90 UI/ml) en van de INOVA ELISA horizontaal (20, 40 en 80 Units). y = -0,0171x2 _{+ 3,1894x + 6,678} R² = 0,9972 y = 2,6584x + 8,2112 R² = 0,9853 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Gem et en w aa rd e (U ni ts )

Toegewezen waarde (Units)

Lineariteit

Methode vergelijking

6.2

Klinische validatie

7 Documentatie

Documentatie aangepast

Document

Check

Aanvraagformulier Zoekwijzer bepalingen

Bepalingenoverzicht Intranet site CKCL Labonderzoek A-Z

Referentiewaardenkaartje

GLIMS instellingen, zie: CKCL-data$ on’vf-d4’(I:)\Blauwdruk\#Procedure wijzigingen of nieuwe bepalingen GLIMS-officieel.doc

Brief naar aanvragers -

SOP’s apparaten aangepast/aangemaakt NVT

SOP’s bepalingen aangepast/aangemaakt

8 Discussie

De criteria voor precisie worden met de DSX methode bereikt. De bepaling is lineair in het meetgebied (0-108 Units) dat van belang is voor de cut-off waarde. Bij de methodevergelijking is een duidelijk verband zichtbaar tussen de twee methodes. Indien de anti-C1q referentiemethode wordt gebruikt om de resultaten van de INOVA kit te beoordelen, zijn de sensitiviteit en specificiteit, wat correlatie met de referentiemethode betreft:

Sensitiviteit: 100% (n=7) Specificiteit: 68% (n=25)

Dit verschil is minder als niet naar de eerste cut-off van 20 Units, maar naar de tweede of derde cut-off wordt gekeken. Maar twee positieve monsters bij de referentiemethode liggen met de INOVA ELISA onder de grens van sterk positief, met 71 en 79 Units. Als deze grens gebruikt wordt:

Sensitiviteit: 71% (n=7) Specificiteit: 100% (n=25)

9 Conclusie

De DSX correleert met de manuele uitvoering van de ELISA. De methode voldoet aan de gestelde criteria.

10 Aanbevelingen

De juistheid van de INOVA ELISA dient nader onderzocht te worden. Dit kan door een gedegen methodevergelijking uit te voeren met meer anti-C1q positief materiaal en/of door externe kwaliteitsassessment (EQA). Indien meer positieve monsters beschikbaar zijn kan de cut-off waarde met meer zekerheid worden vastgesteld.

Literatuur

[1]

Cozzani E, Drosera M, Gasparini G et al. Serology of Lupus Erythematosus: Correlation between

Immunopathological Features and Clinical Aspects. Autoimmune Dis 2014;6:321359.

[2]

Mahler M, van Schaarenburg RA, Trouw LA. Anti-C1q autoantibodies, novel test, and clinical

consequences. Front Immunol 2013:4:117.

[3]

Bijsluiter QUANTA Lite anti-C1q ELISA kit, 704565, INOVA Diagnostics

Bijlagen

CENTRAAL KLINISCH CHEMISCH LABORATORIUM

Unit Speciële Immunologie

VALIDATIE VAN DE ANTI-GAD65 BEPALING OP HET DSX SYSTEEM

Bart Peters

Concept

Beknopte conclusie

1. De Mediphos anti-GAD ELISA is ongeschikt voor DSX implementatie.

Voor akkoord het verantwoordelijk staflid

Datum:

Handtekening:

Inhoudsopgave

1. VOORONDERZOEK ... 3

1.1 CRITERIA WAARAAN APPARAAT/METHODE MOET VOLDOEN ... 3 1.2 INTERNE OF EXTERNE PRODUCTIE ... 3 1.3 INVENTARISATIE EN EVALUATIE RISICO’S VOOR GEBRUIK ... 3 1.3.1 Arbeidsomstandigheden en milieu ... 3 1.3.2 Gevaarlijke stoffen... 3 1.3.3 Productveiligheid ... 3 1.3.4 Restrisico’s ... 3 1.3.5 Koppeling met laboratorium informatiesysteem... 3 1.3.6 Europese aanbesteding ... 3 1.3.7 Wettelijke eisen die van toepassing zijn... 3

2 KEUZE LEVERANCIER ... 3 3 VALIDATIEPLAN APPARATUUR ... 4

3.1 INSTALLATIEKWALIFICATIE ... 4 3.2 OPERATIONELE KWALIFICATIE (FUNCTIONEREN ZONDER MONSTERS) ... 4 3.3 UITVOERINGSKWALIFICATIE (FUNCTIONEREN MET MONSTERS) ... 4

4 VALIDATIERAPPORT APPARATUUR ... 4

4.1 INSTALLATIEKWALIFICATIE ... 4 4.2 OPERATIONELE KWALIFICATIE ... 5 4.2.1 Resultaten van calibratie ... 5 4.2.2 Resultaten van de controles ... 5 4.3 UITVOERINGSKWALIFICATIE ... 6 4.3.1 Voldoet apparaat aan criteria? ... 6 4.3.2 Validatie koppeling(en) ... 6 4.3.3 Vervanging ... 6 5. VALIDATIEPLAN METHODE ... 6 5.1 ANALYTISCHE VALIDATIE ... 6 5.1.1 ACHTERGROND ... 7 5.1.2 Principe ... 7 5.1.3 Doelstelling validatie... 7 5.1.4 Werkwijze ... 7 5.2 KLINISCHE VALIDATIE... 9 6. VALIDATIERAPPORT RESULTATEN ... 10 6.1 ANALYTISCHE VALIDATIE ... 10 6.1.1 Verificatie op de DSX ... 10 6.2 KLINISCHE VALIDATIE... 12 7 DOCUMENTATIE ... 13 8 DISCUSSIE ... 13 9 CONCLUSIE ... 13 10 AANBEVELINGEN ... 13 LITERATUUR ... 14 BIJLAGEN ... 15

1.

Vooronderzoek

1.1 Criteria waaraan apparaat/methode moet voldoen

1 De optimale instelling van de DSX voor de methode moet worden bepaald, deze moet vervolgens aan de validatie criteria voldoen.

2 De nieuwe methode moet bij vergelijking correleren met de manuele methode.

1.2

Interne of externe productie

Er is gekozen voor de externe aanschaf van een kit van firma Mediphos. De bepaling wordt intern uitgevoerd.

1.3

Inventarisatie en evaluatie risico’s voor gebruik

1.3.1 Arbeidsomstandigheden en milieu

Indien de kap van de DSX is gesloten worden mogelijke risico’s door aërosolvorming beperkt.

1.3.2 Gevaarlijke stoffen

Sommige Reagentia bevatten kleine hoeveelheden (< 0.1 % w/v) natriumazide als conserveermiddel.

Dit is zeer vergiftig bij opname door de mond. Ook geen contact maken met de huid. Vormt zeer vergiftige gassen

in contact met zuren. Zeer vergiftig voor in het water levende organismen; kan in het aquatisch milieu op lange

termijn schadelijke effecten veroorzaken.

1.3.3 Productveiligheid

CE-markering aanwezig?

Ja, op de bijsluiter van kit

1.3.4 Restrisico’s

Indien de DSX in werking is, moet voor manuele handelingen verricht worden binnen de werkruimte van het

apparaat gecontroleerd worden op de tijdlijn functie van de software of de pipetteerarm de komende minuut gaat

bewegen.

1.3.5 Koppeling met laboratorium informatiesysteem

Koppeling nodig?

Ja, op termijn GLIMS koppeling gewenst voor doorsturen van resultaten.

Extra software en/of hardware nodig? Ja, Extra software ter waarde van €3500.

1.3.6 Europese aanbesteding

Aanschaf boven de aanbestedingsgrens inclusief BTW?

Nee

1.3.7 Wettelijke eisen die van toepassing zijn

De bepaling moet voldoen aan de eisen van de norm ISO 15189 en de CE certificering voor Medische

hulpmiddelen voor IVD, namelijk 98/79/EC.

2

Keuze leverancier

contract

Service verlening

Recallsysteem Bereikbaarheid Kwaliteitssysteem Gecertificeerd Audit mogelijk

Mediphos NVT Onbekend - Onbekend Ja Ja Ja

De bepaling wordt geautomatiseerd door de ELISA van de manuele referentiemethode te implementeren op de DSX. Hierbij wordt dus dezelfde kit gebruikt van Mediphos. De automatisatie dient de uitvoering te standaardiseren en een tijdsbesparing op te leveren met “walk away” automatisatie. Deze automatisering verbreedt ook het aantal analisten dat deze bepaling kan uitvoeren.

3

Validatieplan apparatuur

Dit is geen validatie van apparatuur, indien bekend is dit deel wel ingevuld.

3.1

Installatiekwalificatie

Stel criteria op waaraan de installatiekwalificatie moet voldoen, bv ontwerpspecificatie, systeembeschrijving, identificatie, documentatie (waaronder certificaten, handleiding, logboeken, onderhoud en schoonmaak).

Beschrijf de wijze waarop, hoe vaak en door wie de installatiekwalificatie wordt uitgevoerd, de wijze waarop, de wijze van rapporteren, registreren en archiveren, inclusief door wie en de verantwoordelijken.

3.2

Operationele kwalificatie (functioneren zonder monsters)

Bepaal wat de kritische parameters zijn en waaraan iedere parameter moet voldoen. Met andere woorden: beschrijf de functionele testen van de kritische parameters inclusief de acceptatiecriteria, de eisen waaraan voldaan moet worden. Beschrijf de wijze waarop, hoe vaak en door wie de operationele kwalificatie wordt uitgevoerd, de wijze van rapporteren, registreren en archiveren, inclusief door wie en de verantwoordelijken.

Beschrijf hoe de procedure verloopt bij niet goed functioneren en welke acties worden ondernomen.

3.3

Uitvoeringskwalificatie (functioneren met monsters)

Bepaal wat de kritische parameters zijn en waaraan iedere parameter moet voldoen. Met andere woorden beschrijf de functionele testen van de kritische parameters inclusief de acceptatiecriteria, de eisen waaraan voldaan moet worden. Beschrijf de wijze waarop, hoe vaak en door wie de uitvoeringskwalificatie wordt uitgevoerd, de wijze van rapporteren, registreren en archiveren, inclusief door wie en de verantwoordelijken.

Beschrijf hoe de procedure verloopt bij niet goed functioneren en welke acties worden ondernomen.

Als wordt gekozen voor een verkorte validatieprocedure, moet de reden hiervoor in het rapport worden

aangegeven. Er mag niet standaard gekozen worden voor een verkorte procedure

4

Validatierapport apparatuur

4.1

Installatiekwalificatie

Gegevens leverancier van het DSX systeem van Dynex

Firma

Contactpersoon

Telefoonnummer

Bereikbaarheid

Datum binnenkomst:

Datum garantietermijn:

Inventarisatie

Inventarisatie

Inventarisnummer

06-820-0427

Inventarislijst gecontroleerd

Nee

Reserve onderdelen aanwezig

Nee

Randapparatuur aanwezig

Revelation 6.1 software op gekoppelde computer

Identificatie

Identificatie

Check

LUMC registratie etiket op apparaat

Apparaat ingeschreven in Ultimo

Etiket houdbaarheid preventief onderhoud

Noodzakelijke voorraad

Voorraad

Check

Benodigde materialen

Benodigdheden ingevoerd in FLITS

Opleiding

Zijn er voldoende analisten opgeleid om het apparaat te kunnen bedienen/beheren?

Opleiding

Check

Bedienen

Beheren

Documentatie aanwezig?

Documenten

Check

Certificaten

Onbekend

Handleiding

Documentatie Onderhoud en schoonmaak

Preventieve onderhoudsschema’s

Calibratie

Voorschriften aanwezig?

Voorschriften

Check

Apparaatvoorschrift

Bepalingsvoorschriften

Procedure bij niet goed functioneren

-

Logboeken

4.2

Operationele kwalificatie

4.2.1 Resultaten van calibratie

Door leverancier

4.2.2 Resultaten van de controles

4.3

Uitvoeringskwalificatie

4.3.1 Voldoet apparaat aan criteria?

Criterium

Voldoet Ja / Nee

4.3.2 Validatie koppeling(en)

Is/zijn de koppeling(en) gevalideerd?

4.3.3 Vervanging

Welk apparaat is vervangen?

Op welke datum is dit apparaat gestopt?

NVT

5.

Validatieplan methode

5.1

Analytische validatie

Voor uitvoering is een aantal monsters nodig van zowel patiënten die voldoen aan de normaalwaarden en patiënten die hier niet aan voldoen.

Parameter Valideren ja /nee

Zo nee, waarom niet? Aantal monsters, hoe vaak gemeten

Criteria waaraan voldaan moet worden Juistheid Ja Methodevergelijking met manuele uitvoering. Correlatie met referentiemethode. Indien

mogelijk ook met EQA monsters.

Precisie Ja 2 monsters in viervoud

over 5 dagen

Imprecisie ≤4 en ≤14% respectievelijk voor intrarun en interrun.*

Specificiteit Nee Vergt grote hoeveelheid bepalingen.

60 Positieve sera meten, te weinig materiaal Functionele

gevoeligheid

Ja Tijdens lineariteit ≤0,6 IU/ml en boven de achtergrond /blanco (Kwantificatielimiet)

Detectiegrens Ja Tijdens lineariteit ≤0,6 IU/ml

Lineariteit Ja 14 verdunningen in

triplo

Affiniteit voor antilichamen mogelijk verschillend per patiënt en niet lineair. Meetgebied Ja Tijdens lineariteit 0,6 - 250 IU/ml volgens bijsluiter

Interferenties** Mogelijk 5 monster in duplo Geen interferentie, of bij lage concentraties * Criteria afkomstig uit de bijsluiter van Mediphos.

5.1.1 Achtergrond

Het bepalen van autoantilichamen tegen glutaminezuur decarboxylase (anti-GAD65) doelt om Diabetes Mellitus (DM) type 1 te diagnosticeren en onderscheiden van DM type 2. DM type 1 wordt gekenmerkt door chronische auto-immuun gemedieerde destructie van alvleesklier β-cellen in de eilandjes van Langerhans, wat leidt tot verstoorde insuline productie. Ten grondslag aan type 1 diabetes ligt erfelijke aanleg, hoofdzakelijk op human leukocyt antigeen (HLA) allelen en andere risico factoren voor autoreactiviteit zoals polymorfismen in het insuline gen.

Tevens is de aanwezigheid van antilichamen in serum tegen cellen van de eilandjes van Langerhans een bepalende factor. Bij DM type 1 produceert het immuunsysteem in 65-80% van de gevallen antilichamen tegen GAD65. Dit is het 65KDa isovorm

membraaneiwit van de eilandjes van Langerhans in de alvleesklier. GAD65 katalyseert de decarboxylatie van glutamaat tot

gamma-aminoboterzuur (GABA), wat een rol speelt bij de vorming van een metaboliet van de citroenzuurcyclus.

Een andere autoantistof in serum die bij 65-80% van DM type 1 patiënten wordt gevonden is tyrosine phosphatase-achtig IA-2, een ander membraaneiwit in de eilandjes van Langerhans.

Onder andere antilichamen wordt anti-GAD65 gebruikt bij het diagnosticeren van latent autoimmune diabetes of adults

(LADA). LADA heeft het fenotype van DM type 2 omdat hierbij in volwassenen nog geen insuline afhankelijkheid is, doordat de schade aan insuline secrerende cellen beperkt is. [1],[2]

5.1.2 Principe

De manuele bepaling waarbij anti-GAD₆₅ gekwantificeerd wordt in serum, wordt geïmplementeerd op het DSX systeem. De huidige bepaling wordt verricht volgens een sandwich ELISA methode met een kit van firma Mediphos. Bij de bepaling wordt gebruik gemaakt van met GAD65 gecoate microplaten. Ten eerste worden calibrator, controle of serum toegevoegd aan de

welletjes. Anti-GAD65 bindt aan de coating van GAD65. Vervolgens wordt GAD65-biotine toegevoegd. Anti-GAD65 vormt

tussen stationair GAD65 en de vloeibare fase GAD65-biotine een tweewaardige brug, dit is dus een sandwich ELISA. De in dit

complex gebonden biotine correleert dus met de hoeveelheid anti-GAD65. Na wegwassen van ongebonden biotine wordt

streptavidineperoxydase toegevoegd. De reactie van het TMB wordt gekatalyseerd door peroxydase en geeft een kleuromslag. Vervolgens wordt de stopvloeistof toegevoegd. Dit is een sterk zuur en laat de eiwitten denatureren. Tenslotte wordt de optische dichtheid gemeten bij een golflengte van 450nm.

De bepaling wordt geautomatiseerd op het DSX systeem van Dynex Technologies. Dynex Technologies is fabrikant van microplaat instrumentatie voor klinische diagnostiek, medicijnontwikkeling, biomedisch onderzoek en industriële toepassingen. De DSX is een ELISA processing systeem met een capaciteit van vier microtiterplaten en het is mogelijk meerdere bepalingen tegelijk uit te voeren op een plaat. Tevens kan de DSX een handmatig uitgevoerde ELISA plaat aflezen. De DSX is gekoppeld aan een computer met Revelation 6 DSX software. Deze software voert de meeste berekeningen, kalibraties en uitwerkingen van meetresultaten direct uit aan de hand van calibratoren en staat het aanpassen en toevoegen van methodes toe. [6]

5.1.3 Doelstelling validatie

De automatisatie dient voornamelijk het aantal analisten dat deze bepaling uitvoert te vergroten. Manueel wordt de bepaling door een persoon uitgevoerd om de variatie tussen de metingen zo klein mogelijk te houden. De automatisatie dient de robuustheid te verbeteren.

5.1.4 Werkwijze

Als eerste wordt de anti-GAD bepaling geïmplementeerd op de DSX vanaf de manuele methode die in de huidige diagnostiek wordt gebruikt. Hierbij worden de optimale instelling van de DSX voor deze methode bepaald en na validatie, waaronder een methodevergelijking met de manuele uitvoering, wordt de SOP aangepast zodat deze bepaling voortaan uitgevoerd kan worden op de DSX.

Als een methode eenmaal succesvol is toegevoegd als ASSAY op de DSX kan de validatie beginnen. Voor een efficiënt validatieproces worden de onderdelen volgens onderstaande volgorde gecombineerd en uitgevoerd.

- Sensitiviteit en specificiteit en interferenties Ep Evalualor methode comparison

- Interferenties

Ep Evaluator EP7 voor interferenties

- Precisie; interrun, tevens begin intrarun (loopt door over 5 dagen) en carry-over Ep Evaluator EP5 voor precisie en carry-over

- Lineariteit, gevoeligheid, detectie-en kwantificatielimiet en meetbereik Ep Evaluator EP6 voor lineariteit

Patiëntenmateriaal

Om de validaties van de verschillende bepalingen uit te voeren moet oud patiëntenmateriaal verzameld worden. De validaties worden uitgevoerd met serummonsters met nulwaarden of normaalwaarden en tevens per bepaling materiaal met positieve waarden. Indien geen patiëntenmateriaal aanwezig is moet extern geschikt materiaal gezocht worden.

Benodigd: 25μl serum per bepaling (duplo, inclusief dood volume: minimaal 150µl). Houdbaarheid monster:

KT

4 °C 3 dagen -20 °C 1 jaar -70 °C

anti-GAD positief materiaal

Hier is rekening gehouden met dood volume. Referentiewaarden kit (in IU/ml):

• Negatief <3 • Dubieus 3,0 – 6,0 • Positief >6,0

20 afwijkende waarden (≥ 2,9 IU/ml )voor sensitiviteit (patiëntenmonsters gemeten met de referentiemethode) verdeeld over het meetbereik.

Pools positief voor anti-GAD

Monster Hoeveelheid monsters Validatie onderdeel Volume

Laag 5 IU/ml 27 metingen Precisie 2ml

Hoog 150 IU/ml 26 metingen Precisie 2ml Standaard stockoplossing ≥ 250 IU/ml

Verdund met 0-serum, 16 verdunningen in triplo

Lineariteit 2,5ml

Standaard verdunningsreeks in IU/ml

Concentratie 250 225 200 175 150 125 100 75 50 25 12,5 8 6 3 1 0

anti-GAD negatief materiaal

40x normaalwaarden patiëntenmonsters voor specificiteit (Indien negatief gemeten, eventueel te gebruiken voor 0-serum) 5x blanco SA-POD (potje G) voor lineariteit

0-serum, pool negatief voor anti-GAD

5x normaalwaarden of andere blanco’s met verontreiniging voor specificiteit

0-serum voor hoog/laag bij precisie en carry-over en voor verdunningsreeks bij lineariteit, maak 7ml

Methodevergelijking (Sensitiviteit, Specificiteit en interferenties)

1. Bepaal de normaalwaarden voor deze bepaling door 25 monsters te analyseren.

2. Meet een zo groot mogelijk aantal monsters met afwijkende waarden voor de analyt, ook gemeten volgens de referentiemethode. Neem ook voldoende standaarden en controles mee met bekende concentraties.

3. Het uitsluiten van interferentie van de matrix moet worden uitgevoerd door minstens vijf verschillende monsters te analyseren per verstorende factor (hemolyse, lipemie, M-proteïne)

- Een mogelijkheid is het spiken van een negatief monster / blanco. Interferentie van deze verontreiniging kan dan bepaald worden door de meetwaarde te vergelijken met de blanco.

- Een andere mogelijkheid is het spiken met een mogelijk interfererende factor bij een monster met een lage concentratie analyt. Bij lage concentraties analyt heeft een interferende factor een duidelijker effect op de meetwaarde.

- Voor interferentie door kruisreactiviteit kunnen monsters met positieve ENA’s gebruikt worden. 4. Vergelijk de resultaten met de referentiemethode. Bepaal de correlatie tussen de twee methodes.

5. Als de twee methodes een goede correlatie vertonen kan verder gevalideerd worden, anders moet de ASSAY van de DSX aangepast worden tot de specificiteit in orde is. Om geen materiaal te verliezen kunnen ook eerst alleen de controles gemeten en vergeleken worden voor gevalideerd wordt.

Precisie

1. De intrarun is tegelijkertijd de carry-over. Analyseer 10 hoge en 11 lage concentraties analyt door een twee pools van patiëntenmateriaal te maken met bekende concentraties.

3. Meet voor de interrun na de eerste meting uit deze pools nog vier opeenvolgende dagen deze monsters in viervoud.

4. Bereken het gemiddelde, standaard deviatie en de relatieve standaard deviatie van de intrarun en de gehele interrun, inclusief de intrarun.

Carry-Over

De DSX wordt getest op een Carry-over effect bij de te implementeren bepalingen door 10 Hoge en 11 Lage monsters in een run te draaien volgens onderstaande tabel. Dit maakt deel uit van de interrun.

Volgorde van hoge en lage concentratie bij de Carry-Over test Volgorde

Hoog/Laag in DSX

L1 L2 L3 H1 H2 L4 H3 H4 L5 L6

L7 L8 H5 H6 L9 H7 H8 L10 H9 H10 L11

Carry-over statistische waarden en eisen aan bepaling:

- Het Laag-Laag gemiddelde en de standaarddeviatie van de duplo’s; L2, L3, L6, L7 en L8 (lage monsters volgend op een laag monster) - Het Hoog-Laag gemiddelde en de standaarddeviatie van de duplo’s;

L4, L5, L9, L10 en L11 (lage monsters volgend op een hoog monster) - Het Carry-over effect:

Het verschil tussen het Hoog-Laag gemiddelde en het Laag-Laag gemiddelde. - Error limiet: 3 keer de Laag-Laag standaarddeviatie.

- De Carry-over test is geslaagd indien het Carry-over effect het Error limiet niet overstijgt.

Lineariteit, kwantificatielimiet en meetbereik

1. Maak een hoog positieve standaard stockoplossing door gepoold materiaal te mengen met een monster met een hoge concentratie analyt.

2. Maak tenminste 10 geschikte verdunningen als standaardreeks en meet deze samen met geschikte kalibratoren en controles. Neem ook een vijftal blanco’s mee.

- De standaarden moeten van 80 tot 120% van de te verwachten concentraties in patiëntenmonsters beslaan.

3. Maak van de calibratiecurve een grafiek met correlatie coëfficiënt, het snijpunt met y-as en de helling, ofwel richtingscoëfficiënt.

4. Vergelijk de meetwaarden met de werkelijke waardes van de standaard door de standaarddeviaties te berekenen. 5. Controleer of het snijpunt met de y-as niet significant verschilt van nul.

6. De hoogste standaard met een acceptabele standaarddeviatie is het meetbereik. De laagste standaard die nog een acceptabele standaarddeviatie vertoont is het limiet van kwantificatie. Tenslotte is de laagste standaard die een positief signaal levert dat boven de blanco’s uitkomt het detectielimiet. Het detectielimiet moet een meetwaarde hebben die tenminste drie keer de meetwaarde van de blanco is.

7. Controleer bij de hoge concentraties analyt of een high dose hook effect optreedt.

5.2

Klinische validatie

Het gaat om een analytische validatie. De gegenereerde data kunnen worden gebruikt voor een verificatie van de referentiewaarden.

Parameter Valideren ja / nee

Zo nee, waarom niet? Aantal monsters, hoe vaak gemeten

Criteria waaraan voldaan moet worden Sensitiviteit Ja Aantal monsters eerder gemeten met

referentiemethode, 20 positief en 40 negatief.

Gevoeligheid kit volgens bijsluiter is 92,3% en een specificiteit van 98,6 %, Specificiteit Ja

Positief voorspellende waarde

Ja 20 Variatie binnen bepaling en in vergelijking met referentiemethode. ≤15% VC Negatief / Normaal voorspellende waarde Ja 40

Referentiewaarden Ja Tijdens het meten van de monsters voor sensitiviteit en specificiteit wordt de

referentiewaarde van de bijsluiter geverifiëerd.

• Negatief <3 • Dubieus 3,0 – 6,0 • Positief >6,0

6.

Validatierapport resultaten

6.1

Analytische validatie

6.1.1 Verificatie op de DSX

Voor de anti-GAD Mediphos ELISA zijn zes correlatie experimenten uitgevoerd met kleine variaties in het protocol. Na slechte correlatie met de manuele uitvoering is een medewerker van firma Mediphos de resultaten komen bespreken om de implementatie van de anti-GAD op de DSX te ondersteunen.

Variaties die geprobeerd zijn op de DSX, waren onder andere het toevoegen van extra wasstappen en draaien met elk van de drie standen van de plaatschudder in de incubatoren. Ook is een bepaling uitgevoerd met incubatie bij 25˚C in plaats van bij KT. Deze variaties zijn uitgevoerd in verband met de slechte duplo’s en reproduceerbaarheid. De plaat is regelmatig op een extra plaatlezer (SpectraMax190) afgelezen om fouten in de spectrofotometer en berekeningen van de DSX te vinden. Tevens zijn meerdere standaardcurven geprobeerd, waaronder een cubic spline, four parameter logistic en logtransformaties. Op aanraden van Mediphos is de negatieve controle als eerste standaard met een concentratie van 1 IU/ml meegenomen, wat een heel klein verschil geeft in vergelijking met de blanco die gebruikt werd.

De resultaten van het laatste correlatie experiment zijn opgenomen en worden vergeleken met de originele manuele resultaten. Tijdens het laatste experiment is de manuele incubatie gewijzigd door een plaatverwarmer op 28°C te brengen, de

plaatschudder op 810rpm in te stellen, geen plaatafsluiters te gebruiken en het geheel af te schermen van direct licht. Op deze manier is de DSX het beste nagebootst, zodat de mogelijke oorzaak van de afwijking ontdekt kon worden.

De cut-off waardes van de anti-GAD liggen op 3,0 en 6,0 IU/ml, door de slechte reproduceerbaarheid in dit gebied zijn voornamelijk sera met lage waardes genomen bij een aantal experimenten.

Een verificatie experiment is uitgevoerd met 16 serummonsters. Deze zijn op dezelfde dag met de helft van een kit op de DSX gemeten en manueel uitgevoerd (en afgelezen op de DSX). In onderstaande figuren zijn de OD’s van de DSX en manuele uitvoering vergeleken van het verificatie experiment, figuur 1, evenals de concentraties van de monsters, figuur 2. De standaardcurves van de DSX rapporten zijn over elkaar heen geplaatst in figuur 3. De reproduceerbaarheid van twee

experimenten op de DSX zijn uitgezet in tabel 1. Hetzelfde is gedaan met de manuele uitvoering in tabel 2. De ruwe data van deze verificatie zijn opgenomen in bijlage I.

Figuur 1. De OD’s van het verificatie experiment, de DSX uitgezet tegen de manuele uitvoering.

y = 0,9936x - 0,0479 R² = 0,9974 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 DS X Manueel

OD Standaarden DSX VS. Manueel

Figuur 2. De waardes van het zesde correlatie experiment, de DSX uitgezet tegen de manuele uitvoering. Het uitzetten van monster OD’s geeft dit verband: y = 1,0241x + 0,001 (R² = 0,876)

Figuur 3. De standaardcurves over elkaar heen, de OD’s uitgezet tegen een logaritme van de concentraties. De cut-off waardes liggen op 3,0 en 6,0 IU/ml. y = 1,2464x + 0,1677 R² = 0,8888 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 DS X Co nc . ( IU/ m l)

Manueel Conc. (IU/ml)

Tabel 1. Reproduceerbaarheid DSX (Verschillend lotnummer, twee maanden tussentijd, geen wijzigingen protocol) Monsternummer 06-06-2014 03-04-2014 Gem. SD %RSD Nieuwe Pool 21,4 19,8 20,6 1,1 5,5 C-1310-1-03167 7,0 7,3 7,2 0,2 3,0 C-1310-1-10350 8,5 9,6 9,1 0,8 8,6 C-1311-1-12692 11,2 10,9 11,1 0,2 1,9 C-1312-1-00434 9,2 9,7 9,5 0,4 3,7 C-1312-1-00879 6,7 7,1 6,9 0,3 4,1 C-1312-1-04985 21,0 19,8 20,4 0,8 4,2 C-1312-1-06272 13,6 12,7 13,2 0,6 4,8 C-1312-1-10579 7,1 7,8 7,5 0,5 6,6 C-1401-1-02696 13,0 12,0 12,5 0,7 5,7 C-1401-1-05232 10,6 9,5 10,1 0,8 7,7 C-1401-1-05555 9,8 8,5 9,2 0,9 10,0 C-1402-1-16974 9,8 9,5 9,7 0,2 2,2 C-1403-1-01494 10,2 8,9 9,6 0,9 9,6 C-1403-1-10977 9,9 9,5 9,7 0,3 2,9 C-1403-1-13875 10,3 9,8 10,1 0,4 3,5

Tabel 2. Reproduceerbaarheid Manueel (Verschillend lotnummer, twee maanden tussentijd, met gewijzigde incubaties)

Monsternummer 06-06-2014 03-04-2014 Gem. SD %RSD Nieuwe Pool 18,4 16,0 17,2 1,7 9,9 C-1310-1-03167 5,4 3,2 4,3 1,6 36,2 C-1310-1-10350 8,5 6,3 7,4 1,6 21,0 C-1311-1-12692 8,8 6,6 7,7 1,6 20,2 C-1312-1-00434 8,0 6,0 7,0 1,4 20,2 C-1312-1-00879 5,5 3,1 4,3 1,7 39,5 C-1312-1-04985 13,4 12,5 13,0 0,6 4,9 C-1312-1-06272 10,9 8,5 9,7 1,7 17,5 C-1312-1-10579 6,0 3,8 4,9 1,6 31,7 C-1401-1-02696 10,6 7,7 9,2 2,1 22,4 C-1401-1-05232 7,9 5,5 6,7 1,7 25,3 C-1401-1-05555 6,6 3,9 5,3 1,9 36,4 C-1402-1-16974 8,6 5,6 7,1 2,1 29,9 C-1403-1-01494 7,1 4,9 6,0 1,6 25,9 C-1403-1-10977 7,9 6,3 7,1 1,1 15,9 C-1403-1-13875 8,1 5,0 6,6 2,2 33,5

6.2

Klinische validatie

Het gaat om een analytische validatie. De referentiewaarden moeten opnieuw worden vastgesteld indien de Mediphos ELISA op de DSX wordt geïmplementeerd.

7 Documentatie

Documentatie aangepast

Document

Check

Aanvraagformulier Zoekwijzer bepalingen

Bepalingenoverzicht Intranet site CKCL Labonderzoek A-Z

Referentiewaardenkaartje

GLIMS instellingen, zie: CKCL-data$ on’vf-d4’(I:)\Blauwdruk\#Procedure wijzigingen of nieuwe bepalingen GLIMS-officieel.doc

Brief naar aanvragers -

SOP’s apparaten aangepast/aangemaakt NVT

SOP’s bepalingen aangepast/aangemaakt

8 Discussie

De Mediphos anti-GAD ELISA is na de eerste correlatie experimenten als ongeschikt beoordeeld voor automatisering op de DSX. De cut-off waardes van 3,0 en 6,0 IU/ml liggen in het vlakke deel van de standaardcurve, niet het lineaire. Kleine variaties leiden tot grote concentratie verschillen en een te lage gevoeligheid in het lage meetgebied.

De standaardcurves vertonen goede correlatie en komen overeen met het QC certificaat. De monsters vertonen echter geen goede correlatie. De DSX vertoont tussen de twee uitvoeringen een acceptabele precisie. De gewijzigde incubatie manueel (hogere temperatuur, harder schudden en afgeschermd van licht) leidt tot grote verschillen. Dit leidt echter niet tot betere correlatie met de DSX, waar de gewijzigde incubatie voor moest zorgen.

De DSX plaatschudder in de incubator heeft drie standen, laag, midden en hoog, die ongeveer overeenkomen met 800, 1000 en 1200 rpm respectievelijk. De plaat wordt lineair geschud en dit is voornamelijk bedoeld om luchtbellen te verwijderen. Voor een protocol waarbij het een vereiste is dat goed gemengd wordt, is de DSX ongeschikt. Hiervoor moet de plaat echt ronddraaien.

De temperatuur van de DSX incubatoren varieert sterk, van 23 tot 31°C. Dit is niet te verhelpen. De DSX heeft alleen een ventilator om het apparaat stofvrij te houden. De temperatuur van de KT incubaties wordt niet gereguleerd. Deze is afhankelijk van de omgeving. Dit heeft waarschijnlijk effect op de conjugaat en substraat incubaties. HRP vertoont een stijging in activiteit tot de activiteit de piek bereikt op 45 - 50°C. Alkalische fosfatase in combinatie met PNPP als substraat geeft een optimum temperatuur van 37°C. [4], [5]

De combinatie van temperatuur variatie en slecht mengen verklaart de willekeurige slechte overeenkomst met de manuele uitvoering bij de anti-GAD. ELISA’s waarbij schudden een vereiste is (zeker bij incubatie op KT), kunnen dus niet op de DSX omdat deze niet in de plaatlade kunnen staan, waarin de temperatuur minder hoog oploopt.

9 Conclusie

De Mediphos anti-GAD ELISA is ongeschikt voor DSX implementatie.

10 Aanbevelingen

De manuele uitvoering van de Mediphos ELISA verloopt uitstekend. Indien de anti-GAD bepaling geautomatiseerd dient te worden zal dit met een andere ELISA kit geprobeerd moeten worden. Een mogelijkheid is de ELISA kit van firma IBL International.

De precisie van de Mediphos ELISA op de DSX is misschien iets te verbeteren door de eerste wasstap in twee delen te scheiden. De eerste cycli wordt per strip getimed op de incubatietijd, zodat elke strip even lange tussentijd heeft. Verscheidene protocollen hebben dit, waaronder die van de complementactiviteit. Het nadeel is dat dit de totale tijd van de wasstap verlengt.

Literatuur

[1]

Merger SR, Leslie RD, Boehm BO: The broad clinical phenotype of type 1 diabetes at presentation. Diabet

Med 2013; 30: 170–178.

[2]

Borg H, Fernlund P, Sundkvist G: Protein tyrosine phosphatase-like protein IA2-antibodies plus glutamic

acid decarboxylase 65 antibodies (GADA) indicates autoimmunity as frequently as islet cell antibodies

assay in children with recently diagnosed diabetes mellitus. Clin Chem 43 : 2358 –2363,1997

[3]

Matsuba T, Yano M, Abiru N et.al. Expression of Recombinant Human Glutamic Acid Decarboxylase

(GAD) in Myeloma Cells and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for Autoantibodies to

GAD. J Biochem (1997) 121 (1): 20-24.

[4]

Temoçin Z, Yiĝitoĝlu M: Studies on the activity and stability of immobilized horseradish peroxidase on

poly(ethylene terephthalate) grafted acrylamide fiber. Bioprocess Biosyst Eng (2009) 32:467-474

[5]

Mobley DM, Chengappa MM, Kadel WL et. al.: Effect of pH, temperature and media on acid and alkaline

phosphatase activity in "clinical" and "nonclinical" isolates of Bordetella bronchiseptica. Can J Comp Med.

Apr 1984; 48(2): 175–178.

[6]

Bijsluiter Mediphos anti-GAD ELISA:

http://medipan.de/index.php?page=shop.product_details&flypage=flypage.tpl+&product_id=26&category_

id=10&option=com_virtuemart&Itemid=3&lang=en, geraadpleegd op 31-07-2014