Optimalisatie en toepassingen van de isolatie van zenuwgas-geremd butyrylcholinesterase uit plasma

(1)

Afstudeerverslag

Optimalisatie en toepassingen van de

isolatie van zenuwgas-geremd

butyrylcholinesterase uit plasma

Yvonne Vogels

03.07.2014

(2)

Afstudeerverslag

Optimalisatie en toepassingen van de isolatie van zenuwgas-geremd butyrylcholinesterase uit plasma,TNO Defensie en Veiligheid, CBRN Protection

Auteur Yvonne Vogels

ymg.vogels@student.avans.nl Opleiding Forensisch Laboratorium Onderzoek Instelling Avans Hogeschool

Academie voor de Technologie van Gezondheid en Milieu Lovensdijkstraat 61-63 4818 AJ Breda Tel: 076-5250500 Stagebegeleider Avans Hogeschool Henk Haarman hf.haarman@avans.nl Stagebegeleider TNO Alex Fidder alex.fidder@tno.nl

Locatie TNO Defensie en Veiligheid Lange Kleiweg 137

2280 AA Rijswijk

Periode 17.02.2014 – 04.07.2014 Versie 1

(3)

Pagina | I

Voorwoord

Dit afstudeerverslag geeft het onderzoek weer over de optimalisatie en toepassingen van de isolatie van zenuwgas-geremd butyrylcholinesterase uit humaan plasma. Dit is het onderzoek waar ik de afgelopen 20 weken bij TNO Defensie en Veiligheid te Rijswijk aan gewerkt heb.

Dit zelfstandige project heb ik niet helemaal alleen gedaan. Voor alle hulp die ik me maar kon bedenken wil ik in het bijzonder mijn stagebegeleider Alex Fidder bedanken, voor de hulp bij het opstarten van het project, bij alle toegepaste technieken/methoden en bovenal voor alle kennis die hij altijd enthousiast met mij wilde delen. Daarnaast wil ik de onderzoeksleider van de vele onderzoeken binnen mijn project bedanken, Marcel van der Schans, met zijn altijd kritische blik op de resultaten en al zijn vragen die tot vervolgonderzoeken leidden. Lai Fun Chau wil ik graag bedanken voor het delen van haar kennis over bepaalde technieken en de toepassing hiervan, als ik weer eens bij haar op het laboratorium mijn onderzoek kwam uitvoeren. Ook wil ik graag Ad de Jong en Debora van der Riet bedanken voor het analyseren van mijn eindeloze rij monsters en het toelichten van de resultaten van deze monsters. Het was nooit een probleem om even langs te lopen met een vraag die zij maar al te graag beantwoordden. En niet te vergeten wil ik mijn docentbegeleider Henk Haarman bedanken voor de ondersteuning die hij vanuit school heeft geboden.

Als laatste, maar zeker niet als minste, wil ik al mijn collega’s bij TNO bedanken voor de geweldige en zeer leerzame tijd die ik heb gehad. In het bijzonder wil ik alle medestagiaires bij TNO bedanken. Ik heb veel feedback en steun, maar ook gezelligheid van hun mogen ontvangen.

Yvonne Vogels Rijswijk, 2 juli 2014

(4)

Pagina | II

Samenvatting

Het doel van dit onderzoek is het optimaliseren van Immuno-Magnetic Separation (IMS) om zenuwgasblootstelling in humaan plasma aan te tonen. Deze methode is toegepast bij diverse projecten.

Bij de IMS methode worden magnetic beads gecoat met monoclonale antilichamen tegen BuChE. Hiermee wordt het zenuwgas-geremde BuChE geïsoleerd uit plasma of een oplossing met enkel het enzym BuChE. Na isolatie werd het aan de beads gebonden BuChE gedigesteerd met pepsine voor het enzymatisch knippen tot peptiden. Het pepsine digest met het te onderzoeken nonapeptide FGESAGAAS (met zenuwgasadduct) werd geanalyseerd met Liquid Chromatography – Triple Stage Quadrupole – Tandem Mass Spectrometry (LC-TSQ-MS/MS). Deze methode werd geoptimaliseerd door de hoeveelheid beads (Protein G Dynabeads) per monster te variëren van 20 tot 80 µl en te vergelijken met Streptavidine beads met gebiotinyleerde antilichamen. Ook zijn er variaties aangebracht in het gebruikte cross-linking reagens DMP in triethanolaminebuffer en een vergelijking uitgevoerd met een ander reagens (BS3_{in DPBS). Ook werd getracht te kwantificeren door het} toevoegen van een bekende hoeveelheid synthetisch nonapeptide tijdens verschillende stappen van IMS. Hiermee kan de oorspronkelijke hoeveelheid bepaald worden. Daarnaast werden er plasma en oplossing met BuChE nageremd om te bepalen of er een 100% remming plaats vind bij het toevoegen van een overmaat aan zenuwgas.

Snelle diagnose methode met biotine-OP is een methode om ongeremd BuChE na te remmen en te isoleren, zodat alleen het geremde BuChE overblijft voor een analysemethode. Ongeremd BuChE stoort hierbij. Een voor 50% geremd (met Sarin) monster en een ongeremd monster werden nageremd met biotine-OP en vervolgens met VX (om de remming van biotine-OP te controleren). Voor het verwijderen van BuChE met biotine-OP werd er gebruik gemaakt van biotine – streptavidine affiniteit. Vervolgens zijn de monsters bewerkt met IMS en geanalyseerd met de LC-TSQ-MS/MS.

De controle voor de opslag van biologische monsters werd uitgevoerd door een aantal plasma en volbloed monsters (geremd met Sarin) op te slaan bij opslagtemperaturen van -74, -20 en 4 °C. De monsters werden na een bepaalde opslagtijd (tijdsbestek van 1 tot 14 dagen) bewerkt met IMS en geanalyseerd met de LC-TSQ-MS/MS.

Bij IMS blijkt dat een hoeveelheid van 40 µl Protein G Dynabeads met een verdund cross-linking reagens van DMP in triethanolaminebuffer, de minimale hoeveelheid is voor het isoleren van al het BuChE (met zenuwgasadduct) uit plasma of oplossing van BuChE. Na het toevoegen van het synthetisch nonapeptide blijkt dat er een verlies van nonapeptide is tijdens de stappen van IMS. Daarnaast blijkt dat na het toevoegen van een overmaat zenuwgas, het nageremde zenuwgas nog steeds wordt gedetecteerd. Hiermee is de methode geoptimaliseerd op basis van kosten en het gebruik van verschillende zenuwgassen. Een vervolgonderzoek voor IMS zal zijn het kwantificeren. Bij de snelle diagnose blijkt dat de biotine-OP niet zorgt voor een volledig remming van het ongeremde BuChE, maar wel dat de hoeveelheid VX afneemt naarmate er meer biotine-OP wordt toegevoegd. Een vervolgonderzoek is nodig om de methode en de biotine-OP te optimaliseren of een ander middel te zoeken met hetzelfde principe.

Bij de opslag van biologische monsters blijkt dat plasma en volbloed minimaal 14 dagen bewaard kan worden bij -74, -20 of 4 °C. Een temperatuur van 4 °C heeft als extra voordeel dat volbloed indien nodig afgedraaid kan worden om plasma te verkrijgen. Een vervolgonderzoek hierop kan zijn om meer variatie aan te brengen in de opslagtemperaturen en het tijdsbestek.

(5)

Pagina | III

Inhoudsopgave

Voorwoord ... I Samenvatting ... II Afkortingenlijst ... V 1. Inleiding ... 1 2. Theoretische achtergrond ... 2 2.1 TNO ... 2 2.2 Chemische strijdmiddelen ... 3 2.3 Zenuwgassen ... 3

2.4 Zenuwgassen in het centrale zenuwstelsel ... 6

2.5 Verificatie van blootstelling aan zenuwgassen ... 7

3. Materiaal en Methoden ... 10

3.1 Chemicaliën, materialen en apparatuur ... 10

3.2 Immuno-Magnetic Separation ... 10

3.3 Ellman methode ... 12

3.4 Snelle diagnose: gebruik van biotine-OP ... 13

3.5 Controle opslag biologische monsters ... 14

4. Resultaten ... 15

4.2 Digest van HuBuChE ... 21

4.3 Kwantificering ... 24

4.4 OPCW: Biomedical Sample Analysis ... 26

4.6 Naremmen ... 30

5. Discussie ... 35

5.2 OPCW: Biomedical Sample Analysis ... 35

5.4 Naremmen ... 36

6. Conclusie ... 38

(6)

Pagina | IV

6.3 Snelle diagnose: gebruik biotine-OP ... 38

6.4 Naremmen ... 38

7. Aanbevelingen ... 40

7.3 Naremmen ... 40

Literatuurlijst ... 41 Bijlagen ... Bijlage I: Organogram van TNO ... Bijlage II: Chemische eigenschappen van Sarin, Soman en VX ... Bijlage III: Schematische weergave van de snelle diagnose: biotine-OP ... Bijlage IV: Scenario OPCW monsters ...

(7)

Pagina | V

Afkortingenlijst

ACh Acetylcholine AChE Acetylcholinesterase

AMPA’s Alkyl methylphosphonic acids (alkyl methylfosfonzuren) Biotine-OP Organofosfaat (OP) met biotine label

BuChE Butyrylcholinesterase BuSCHI Butyrylthiocholine iodide BS3 bis(sulfosuccinimidyl)suberate

CBRN Chemisch, Biologisch, Radiologisch, Nucleair CWA Chemical Warfare Agent (chemisch strijdmiddel) DMP Dimethyl pimelimidate hydrochloride

DTNB Dithiobisnitrobenzoaat

EMPA Ethyl methylphosphonic acid (ethyl methylfosfonzuur)

GA Tabun

GB Sarin

GD Soman

HuBuChE Humaan butyrylcholinesterase

IMPA Isopropyl methylphosphonic acid (isopropyl methylfosfonzuur) IMS Immuno-Magnetic Separation

LC-MS/MS Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry LS natriumlaurylsulfaat

MPA Methylphosphonic acid (methylfosfonzuur) OP Organophosphate (organofosfaat)

OPCW Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons

PMPA Pinacolyl methylphosphonic acid (pinacolyl methylfosfonzuur)

TNO Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek TSQ Triple Stage Quadrupole

(8)

Pagina | 1

1. Inleiding

Bedreigingen in de wereld met chemische strijdmiddelen zijn altijd aanwezig. De neurotoxische middelen, oftewel de zenuwgassen vormen de grootste bedreiging vanwege de grote schadelijke effecten die deze middelen met zich meebrengen. Vanwege deze bedreigingen en ernstige schadelijke effecten wordt er steeds meer onderzoek gedaan naar bescherming tegen chemische strijdmiddelen. Eén van de organisaties in de wereld die onderzoek doet naar deze middelen is TNO. De onderzoeken vinden plaats in het Prins Maurits gebouw in Rijswijk op de afdeling CBRN Protection. Hier wordt onder andere onderzoek gedaan naar mosterdgas, Lewisiet en verschillende zenuwgassen zoals Tabun, Sarin, Soman en VX.

In dit verslag wordt het onderzoek beschreven dat als doel heeft het optimaliseren van een methode om zenuwgasblootstelling in humaan plasma aan te tonen en het uitvoeren van deze methode bij verschillende toepassingen. Zenuwgassen zijn organofosfaten die binden aan enzymen die zorgen voor een goede werking van het centrale zenuwstelsel. Eén van deze enzymen is acetylcholinesterase, de binding tussen de organofosfaten en acetylcholinesterase zorgt ervoor dat het enzym niet meer zijn werking kan doen. Dit geeft zeer schadelijke effecten voor het menselijk lichaam en kan de dood tot gevolg hebben. Het andere enzym waar de organofosfaten aan binden is butyrylcholinesterase. Binnen TNO is er een methode ontwikkelt waarmee de blootstelling aan een organofosfaat kan worden aangetoond door gebruik te maken van butyrylcholinesterase als biomarker. Immuno-Magnetic Separation zorgt ervoor dat het zenuwgas-geremde enzym wordt geïsoleerd uit humaan plasma, waarna butyrylcholinesterase enzymatisch geknipt kan worden door pepsine tot peptiden. De peptide waar de binding met het organofosfaat heeft plaats gevonden is het gewenste product. Dit is een nonapeptide, een peptide van negen aminozuren lang, met sequentie FGESAGAAS. Het mengsel van peptiden, waarin FGESAGAAS zich bevindt, kan geanalyseerd worden door middel van Liquid Chromatography – Triple Stage Quadrupole – Tandem Mass Spectrometry (LC-TSQ-MS/MS).

Dit afstudeerverslag bestaat uit 7 hoofdstukken. In hoofdstuk 2 staat de theoretische achtergrond beschreven over dit onderzoek. In hoofdstuk 3 staan de uitgevoerde experimenten en in hoofdstuk 4 de resultaten die zijn gekomen naar aanleiding van de experimenten in hoofdstuk 3. In hoofdstuk 5 en 6 staan de discussie en conclusie en als laatste in hoofdstuk 7 worden de aanbevelingen gegeven. Dit verslag wordt afgesloten met de literatuurlijst en de bijlagen.

(9)

Pagina | 2

2. Theoretische achtergrond

2.1 TNO

In 1932 werd de ‘Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek’ (TNO) opgericht op basis van een speciale wet die in 1930 werd aangenomen. Deze wet werd in 1985 herzien en geldt sindsdien als de publiekrechtelijke basis van TNO.

In de wet wordt de relatie van TNO met de overheid geregeld. Het komt er globaal op neer dat TNO een onafhankelijk onderzoeksorganisatie is die op ‘armlengte’ afstand van de overheid opereert. Diezelfde wet beschrijft de speciale relatie tussen TNO en het Ministerie van Defensie. Vrijwel al het wetenschappelijk onderzoek wordt buiten het ministerie gedaan en voor een groot deel bij TNO. Bij TNO staat de missie altijd centraal: TNO verbindt mensen en kennis om innovaties te creëren die de concurrentiekracht van bedrijven en het welzijn van de samenleving duurzaam verbeteren[1]. Halverwege de jaren dertig verrijst aan de Lange Kleiweg in Rijswijk een aantal gebouwen voor de productie van munitie t.b.v. onderzoek. In 1957 betrekt ook het Chemisch Laboratorium er zijn nieuwe behuizing. Het gebouw wordt genoemd naar Prins Maurits (1567 – 1625) die als militair zijn tijd ver vooruit was, hij gebruikte wetenschappelijke kennis voor nieuwe oorlogsstrategieën[1].

Figuur 1: TNO Prins Maurits Laboratorium te Rijswijk.

2.1.1 Organisatie

De Raad van Bestuur is de top van TNO. Deze raad bestaat uit 3 leden en is belast met het besturen van de organisatie. De Raad van Bestuur heeft alle bevoegdheden, voor zover die niet bij of krachtens tegen de TNO-wet aan andere organen is opgedragen. De Raad van Bestuur wordt gecontroleerd en ondersteunt door de Raad van Toezicht. Daarnaast is er nog de Raad voor het Defensieonderzoek die het beleid bepaalt ten aanzien van defensieonderzoek met inachtneming van de verantwoordelijkheden van de Raad van Bestuur[1, 2].

TNO is werkzaam binnen zeven thema’s en twee expertisegebieden. De thema’s en expertisegebieden worden aangestuurd door Managing Directors en ondersteund door staforganen. De zeven thema’s zijn: Gebouwde omgeving, Integrale Veiligheid, Energie, Gezond Leven, Industriële Innovatie, Informatiemaatschappij en Mobiliteit. Hierbij worden mensen en kennis met elkaar verbonden om innovaties te creëren die de concurrentiekracht van bedrijven en het welzijn van de samenleving duurzaam versterkt. De twee expertisegebieden zijn: Technical Sciences en Earth, Life en Social Sciences. Deze expertisegebieden zijn samen een bron van bevlogen medewerkers en faciliteiten van wereldklasse waarmee de thematische impactdoelstellingen van TNO worden gerealiseerd[2]. In bijlage I staat het organogram van TNO, hierin staat de organisatie van TNO in een schema weergegeven.

(10)

Pagina | 3

2.1.2 CBRN Protection

CBRN Protection is de afdeling binnen TNO waar dit project is uitgevoerd en is gestationeerd in het Prins Maurits gebouw in Rijswijk. Deze afdeling valt onder het expertisegebied “Earth, Life and Social Sciences” en werkt voornamelijk onder het thema “Integrale Veiligheid”[1].

CBRN incidenten zijn gebeurtenissen waarbij per ongeluk of opzettelijk Chemische, Biologische, Radiologische of Nucleaire agentia zijn vrijkomen. Incidenten met CBRN agentia zijn een potentiële dreiging voor militairen, hulpdiensten en voor de algemene samenleving. De kans dat een CBRN incident plaatsvindt is klein, maar de impact hiervan in termen van fysische schade en sociale effecten op langere termijn worden als bijzonder hoog beschouwd[3].

CBRN Protection heeft vele opdrachtgevers. Het Nederlandse Ministerie van Defensie is de primaire klant van CBRN Protection. Ook worden er onderzoeken uitgevoerd in opdracht van de Amerikaanse overheid. Daarnaast is TNO een “designated laboratory” voor de Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons (OPCW), wat de sterke positie van TNO voor de analytische chemie op dit gebied weergeeft[3].

2.2 Chemische strijdmiddelen

Eén van de onderdelen die wordt onderzocht op de afdeling CBRN Protection zijn chemische strijdmiddelen. Een chemisch strijdmiddel (Chemical Warfare Agent, CWA) is een extreme toxisch chemische stof die wordt gebruikt in oorlogen, conflicten, terroristische, extremistische en dictatorische activiteiten, kwaadaardige vergiftigingen en executies[4].

Deze strijdmiddelen geven giftige chemische stoffen af die het lichaam aantasten via de longen, de huid of het darmkanaal. Meestal gaat het om industriële chemische stoffen die in kleine hoeveelheden veilig zijn maar dodelijk in grote hoeveelheden[5].

De giftige component van een chemisch strijdmiddel heet zijn “chemisch middel”. Op basis van hun werkingsmechanisme, dat wil zeggen de route van penetratie en hun effect op het menselijk lichaam, zijn chemische strijdmiddelen onder te verdelen in verschillende categorieën:

• Verstikkende middelen

• Blaartrekkende middelen

• Bloed vergiftigende middelen

• Prikkelende middelen

• Psychotische middelen

• Toxines

• Zenuwgassen[6]

De zenuwgassen zullen verder worden toegelicht. Dit zijn de chemische strijdmiddelen die zijn gebruikt tijdens het onderzoek bij TNO.

2.3 Zenuwgassen

Zenuwgassen zijn ontdekt tijdens het ontwikkelen en verbeteren van pesticiden. Zenuwgassen hebben invloed op de overdracht van zenuwimpulsen in het zenuwstelsel. De overbrenging van zenuwprikkels wordt verstoord, doordat het enzym acetylcholinesterase wordt geremd. De zenuwen brengen informatie van de zintuigen naar de hersenen en boodschappen uit de hersenen naar de spieren. Door de remming ontstaan hevige, oncontroleerbare spiertrekkingen, gevolgd door de dood als de ademhalingsspieren verlamd raken[5, 6, 8].

Alle zenuwgassen behoren chemisch tot de groep van fosforverbindingen en worden ook wel organofosfaten (organophosphates, OP’s) genoemd. Deze organofosfaten zijn organische

(11)

Pagina | 4 fosforverbindingen met een centraal fosforatoom dat omgeven is door vier verschillende groepen. In het geval van de organofosfaten zijn drie van de vier groepen heteroatomen. De organofosfaten kunnen worden onderverdeeld in twee algemene groepen, de V en de G agentia[9].

2.3.1 De V- en G-agentia

Zoals hierboven staat beschreven kunnen de organofosfaten worden onderverdeeld in twee verschillende groepen, de V- en de G-agentia. De bekendste zijn de G-agentia, waarbij de G staat voor “German”, omdat de G-agentia zijn ontwikkeld in Duitsland. Onder de G-agentia vallen Tabun (GA), Sarin (GB) en Soman (GD). De tweede letter is toegevoegd ter identificatie voor elk zenuwgas. De G-agentia hebben twee zuurstofatomen gebonden aan het centrale fosforatoom.

De V-agentia, waarbij de V staat voor “Venom of Venomous”, werden later geïntroduceerd. Onder de V-agentia vallen onder andere VX, VE, VM en VG. De V-agentia hebben twee zuurstofatomen en een zwavelatoom gebonden aan het centrale fosforatoom. De V-agentia zijn toxischer en minder vluchtig dan de G-agentia[4, 9].

De chemische eigenschappen en toxiciteit van de organofosfaten Sarin, Soman en VX zullen verder worden toegelicht. Deze zenuwgassen worden gebruikt tijdens het onderzoek bij TNO.

Sarin

Sarin (GB) heeft als IUPAC-naam (RS)-2-(fluormethylfosforyl)oxypropaan. In figuur 1 staat de structuurformule van Sarin weergegeven. Sarin is een kleur- en geurloze vloeistof die voornamelijk wordt opgenomen via de luchtwegen. Zie bijlage II voor de chemische eigenschappen van Sarin. Sarin heeft de hoogste dampdruk en is hiermee het vluchtigst van alle G-agentia. Ook is Sarin zeer goed mengbaar met water waarin het uiteindelijk hydrolyseert, terwijl de meeste zenuwgassen slecht oplossen[6, 9].

De waarden van toxiciteit zijn schattingen van de dosis die lethale effecten hebben op de mens. Er wordt geschat dat bij een inhaleringsconcentratie van 100 mg·min/m3 Sarin 50% van de blootgestelde populatie zal sterven (de LCt50). Bij een blootstelling via de huid wordt geschat dat de dosis van 1700 mg/individu dodelijk is voor de helft van de blootgestelde populatie (LD50). Het verschil tussen deze waarden wordt bepaald door de vluchtigheid van de stof. Het zenuwgas verdampt op de blote huid[6].

Soman

Soman (GD) heeft als IUPAC-naam 3-(fluor-methyl-fosforyl)oxy-2,2-dimethylbutaan. In figuur 1 staat de structuurformule van Soman weergegeven. Soman is een kleurloze vloeistof met een fruitige geur. Zie bijlage II voor de chemische eigenschappen van Soman[6].

Er wordt geschat dat bij een inhaleringsconcentratie van 100 mg·min/m3_{Soman 50% van de} blootgestelde populatie zal sterven (de LCt50). Bij een blootstelling via de huid wordt geschat dat een dosis van 300 mg/individu dodelijk is voor de helft van de blootgestelde populatie (LD50). Het verschil tussen deze waarden wordt bepaald door de vluchtigheid van de stof. Het zenuwgas verdampt op de blote huid[6].

VX

VX heeft als IUPAC-naam O-ethyl S-[2-(diisopropylamino)ethyl]methylfosfonothiolaat. In figuur 1 staat de structuurformule van VX weergegeven. VX is een kleur- en geurloze vloeistof. V-agentia blijven langer intact vanwege hun oplosbaarheid in koud water en lage vluchtigheid en zijn hierdoor langer aanwezig in het milieu. Zie bijlage II voor de chemische eigenschappen van VX[6].

Er wordt geschat dat bij een inhaleringsconcentratie van 50 mg·min/m3 VX 50% van de blootgestelde populatie zal sterven (de LCt50). Bij een blootstelling via de huid wordt geschat dat een dosis van 10 mg/individu dodelijk is voor de helft van de blootgestelde populatie (LD50). Doordat VX minder vluchtig is dan bovenstaand G-agentia is het verschil tussen de inhaleringsconcentratie en de lethale dosis via de huid kleiner[6].

(12)

Pagina | 5

Figuur 2: Structuurformules van de organofosfaten Sarin, Soman en VX.

2.3.2 Effecten

Kenmerkende symptomen bij blootstelling aan een lage dosis zenuwgas zijn een verhoogde productie van speeksel, een loopneus, druk op de borst, hoofdpijn, vermoeidheid, verslechterde spraak, hallucinaties en misselijkheid. Daarnaast vernauwen de pupillen waardoor het zicht vermindert, hierdoor ontstaat er pijn bij het concentreren op één voorwerp[6].

Bij blootstelling aan een hogere dosis zenuwgas ontstaan er symptomen als vernauwing van de luchtwegen en secretie van slijm in de luchtwegen. Dit kan leiden tot moeilijkheden met ademhalen en hoesten. Ongemak in het maag- en darmkanaal kan leiden tot kramp en braken. Ook is er sprake van incontinentie, overmatig speeksel, tranende ogen en zweten. Als de vergiftiging matig is kan dit zich uiten door middel van verzwakkende spieren, trillingen of samentrekkingen[6].

Bij blootstelling aan een hoge dosis zenuwgas zijn de symptomen meer uitgesproken. Het slachtoffer raakt buiten bewustzijn en ondergaat hevige stuiptrekkingen. Zenuwgassen kunnen spierverlamming veroorzaken en invloed hebben op het ademhalingscentrum in het centrale zenuwstelsel. Door de combinatie van deze twee effecten treedt uiteindelijk de dood op door verstikking[6].

2.3.3 Metabolisme

De zenuwgassen Sarin, Soman en VX worden gemakkelijk gehydrolyseerd tot alkyl methylfosfonzuren (alkyl methylphosphonic acid, AMPA) en vervolgens zeer langzaam gehydrolyseerd tot methylfosfonzuur (methylphosphonic acid, MPA). In figuur 2 wordt het metabolisme van Sarin, Soman en VX schematisch weergegeven[4, 10].

Figuur 3: Schematische weergave van het metabolisme van de zenuwgassen Sarin, Soman en VX[10].

Door middel van enzym gemedieerde hydrolyse en chemische hydrolyse worden Sarin, Soman en VX omgezet in alkyl methylfosfonzuren. De metaboliet van Sarin is isopropyl methylfosfonzuur (IMPA), de metaboliet van Soman is pinacolyl methylfosfonzuur (PMPA) en de metaboliet van VX is ethyl methylfosfonzuur (EMPA). Uiteindelijk zullen alle drie de zenuwgassen omgezet worden in de metaboliet methylfosfonzuur (MPA)[10].

(13)

Pagina | 6

2.4 Zenuwgassen in het centrale zenuwstelsel

Zenuwgassen hebben een remmende werking op de activiteit van bepaalde enzymen in het centrale zenuwstelsel. Doordat een enzym geremd wordt kunnen allerlei complicaties optreden. Hierbij gaat het vooral om de enzymen acetylcholinesterase en butyrylcholinesterase. Dit zijn de enzymen waar zenuwgassen aan binden.

2.4.1 Acetylcholinesterase

Acetylcholinesterase (AChE) is een enzym dat aanwezig is in de neuronen en gliacellen van het menselijk brein. Dit enzym wordt vooral geassocieerd met zenuwen en spieren[8]. De belangrijkste rol van AChE is de snelle hydrolyse van de neurotransmitter acetylcholine (ACh), waardoor de overdracht van zenuwimpulsen bij de cholinerge synapsen wordt beëindigd[8, 11].

Zenuwcellen dragen signalen over van de ene cel naar de andere cel. Deze signaaloverdracht kan zijn tussen twee zenuwcellen onderling of tussen een zenuwcel en bijvoorbeeld een spiercel en vindt plaats door middel van neurotransmitters in de synaps. Dit is de ruimte tussen een zenuwcel en de doelcel met het axonuiteinde van de zenuwcel aan de ene kant en een dendriet van een andere zenuwcel of de oppervlakte van een spiercel aan de andere kant. De eerste bekende neurotransmitter is acetylcholine. Acetylcholine verzorgt de signaaloverdracht tussen zenuwcellen en spiercellen. Nadat de neurotransmitter de opdracht heeft volbracht, de zenuwimpuls van de ene naar de andere cel heeft getransporteerd, dient de neurotransmitter te worden uitgeschakeld. Acetylcholinesterase is het enzym dat de neurotransmitter acetylcholine verwerkt. Acetylcholinesterase splitst acetylcholine in zijn samenstellende delen, azijnzuur en choline[12].

2.4.2 Butyrylcholinesterase

Butyrylcholinesterase (BuChE) is ook wel bekend als plasma cholinesterase of pseudocholinesterase en is net als AChE een enzym dat aanwezig is in de neuronen en gliacellen van het menselijk brein. AChE en BuChE behoren samen tot de cholinesterasen-groep[8].

In het menselijk lichaam komt BuChE tien keer zo veel voor als AChE. Dit enzym is terug te vinden in bijna elk weefsel van het menselijk lichaam, waaronder in plasma, de lever, het brein, de spieren, speeksel, de nieren, het hart, dikke en dunne darm, de huid, de milt en in de longen. BuChE kan fungeren als een “back-up” voor AChE, doordat BuChE minder selectief is in de grootte en aard van de acylgroep aan choline is BuChE daardoor in staat is om verschillende choline te hydrolyseren. BuChE ontgift organofosfaten door een covalente binding aan te gaan[4, 13, 14]. Er zijn ook aanwijzingen dat BuChE deelneemt aan de eerste stadia van de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel[8].

2.4.3 Inhibitie van AChE en BuChE

Zenuwgassen behoren tot de meest gevreesde wapens en zijn een uiterst barbaarse manier om mensen te vermoorden. Zenuwgassen komen in het lichaam terecht door inademing of absorptie via de huid en sijpelen door de weefsels tot bij het doelwit, de zenuwcellen. Het zenuwstelsel wordt ontregeld doordat de zenuwgassen het enzym acetylcholinesterase blokkeren[12]. AChE is een serineprotease. Serineproteasen zijn enzymen die bestaan uit een katalytisch (actief) centrum gevormd door drie cruciale aminozuren. Deze aminozuren zijn histidine, asparaginezuur of glutaminezuur en serine. Bij AChE zijn de cruciale aminozuren histidine, glutaminezuur en serine[8]. Zenuwgassen reageren snel met de hydroxylgroep van serine in het actieve centrum van AChE en vormen een fosfaat of fosfonaatester. Gefosfonyleerd AChE kan ACh niet meer hydrolyseren, waardoor er complicaties optreden[15].

In figuur 4 staat de schematische weergave van de reactie tussen het enzym acetylcholinesterase en een organofosfaat. Het organofosfaat gaat een reactie aan met de OH-binding van serine, omdat het

(14)

Pagina | 7 zuurstofatoom licht negatief geladen is. Dit komt doordat het waterstofatoom van serine een waterstofbrug vormt met het stikstofatoom van histidine. De verlatende groep “X” wordt geëlimineerd en de rest van het molecuul blijft covalent gebonden aan serine[6, 12].

Er kan ook nog dealkylering plaats vinden, ook wel de verouderingsreactie genoemd. De reactie wordt gekatalyseerd door het enzym zelf en kan zeer snel gaan. Na het “verouderen” is het geremde enzym nog beter bestand tegen hydrolyse en heeft reactivering met oxime geen zin meer. Het verouderingsproces heeft een verschillende tijdsduur per zenuwgas[6].

Figuur 4: Schematische weergave van de reactie tussen acetylcholinesterase en een organofosfaat (zenuwgas). Legenda: X = verlatende groep en R = Restgroep (verschilt per zenuwgas)[8].

Zenuwgassen hechten zich op dezelfde manier aan butyrylcholinesterase als aan acetylcholinesterase. Het verschil is de positie van het aminozuur serine. Bij BuChE zit serine op positie 198 en bij AChE op positie 203. Het is niet duidelijk welke effecten de inhibitie van BuChE veroorzaken, doordat ook de functie van het enzym redelijk onbekend is.

2.4.4 Toepassing van AChE en BuChE

De aanhechting van een zenuwgas aan het enzym BuChE geeft weinig complicaties in het lichaam, doordat het weinig tot niets bijdraagt aan de hydrolyse van acetylcholine. Toch is BuChE voor dit onderzoek van groot belang. Het menselijk lichaam heeft tien keer meer BuChE dan AChE: ongeveer 680 nmol BuChE en 62 nmol AChE[14]. Daarnaast is het gemakkelijker te isoleren uit bloed. Door deze eigenschappen vormt BuChE een betere biomarker om de blootstelling van zenuwgassen aan te tonen dan acetylcholinesterase.

2.5 Verificatie van blootstelling aan zenuwgassen

De verificatie van blootstelling aan zenuwgassen is nog steeds in ontwikkeling. Dit is belangrijk omdat de resultaten van de analyse van biomedische monsters kunnen worden gebruikt als bewijs voor de bevestiging van het gebruik van deze middelen. Ten tweede zijn de gezondheidsrisico’s van zelfs lage blootstellingen nog niet volledig bekend, waardoor het belangrijk is om aan te tonen of iemand is blootgesteld of niet om bezorgde militairen en burgers gerust te stellen. Een aantal verificatie methoden zijn al ontwikkeld zoals reactivering door fluoride, de analyse van de hydrolyse producten van zenuwgassen, het meten van geremd cholinesterase en de massa spectrometrische analyse van het gefosfyleerde nonapeptide FGES(x)AGAAS, waarbij x staat voor het zenuwgasadduct. De belangrijkste biomarker in de onderzoeken is het adduct van zenuwgassen dat wordt gevormd met het eiwit butyrylcholinesterase in het menselijk lichaam[15, 16].

(15)

Pagina | 8

2.5.1 Ellman methode

De oudste methode voor het aantonen van blootstelling aan zenuwgassen is door het meten van de afname van acetylcholinesterase activiteit in het bloed door middel van de originele colorimetrische Ellman methode of variaties hiervan. Deze meting is snel, gevoelig en toepasbaar in het veld, maar het heeft ook een aantal tekortkomingen. Ten eerste wordt het zenuwgas niet geïdentificeerd, ten tweede is de specificiteit laag, omdat er verschillende andere chemische stoffen zijn die bijdragen aan de remming van AChE en ten derde levert het geen betrouwbaar bewijs voor de blootstelling aan zenuwgassen als het remmingsniveau lager is dan 20%[17].

Het principe van deze methode is dat de mate van thiocholine productie gemeten wordt wanneer acetylthiocholine wordt gehydrolyseerd door het enzym AChE[18]. Een variatie op de originele Ellman methode is het testen van de BuChE activiteit in plaats van de AChE activiteit. Bij deze methode geldt hetzelfde principe alleen wordt er butyrylthiocholine gebruikt in plaats van acetylthiocholine.

De volgende reactie vind plaats:

Butyrylthiocholine iodide (BuSCHI) thiocholine + acetaat Thiocholine + dithiobisnitrobenzoaat (DTNB) gele kleur

De mate van kleurverandering in een bepaald tijdsbestek kan worden gemeten met de spectrofotometer bij 412 nm[18].

Deze methode wordt gebruikt om plasmamonsters te testen op BuChE activiteit, om te controleren of de isolatiemethode gelukt is en om te bepalen of de BuChE activiteit afneemt naarmate plasma blootgesteld wordt aan een zenuwgas. Daarnaast geeft de mate en snelheid van kleurverandering ook een indicatie over de concentratie van het geïsoleerde enzym.

2.5.2 Immuno-Magnetic Separation

Immuno-Magnetic Separation (IMS) is een methode voor het isoleren van BuChE uit humaan plasma ter identificatie en analyse van het adduct van zenuwgassen dat wordt gevormd met het eiwit BuChE. Hierbij wordt gebruik gemaakt van magnetic beads. Dit zijn magnetische bolletjes met een speciale coating van proteïne G dat als een schil erom heen zit. Bij IMS worden de magnetic beads geconjugeerd met monoklonale antilichamen, in dit geval anti-BuChE, die zich binden aan de proteïne G schil met hoge affiniteit. Vervolgens zal het plasma worden toegevoegd en het eiwit BuChE dat in het plasma zit zal binden aan de antilichamen op de beads. Nadat het eiwit is verwijderd uit het plasma met de beads vindt digestie plaats door toevoeging van pepsine. Er ontstaat een mengsel van peptiden, waaronder het nonapeptide FGESAGAAS waar het zenuwgas gebonden is, dat wordt geanalyseerd door middel van de LC-TSQ-MS/MS[19]. In figuur 5 staat de IMS methode schematisch weergegeven.

Figuur 5: Schematische weergave van Immuno-Magnetic Separation[19].

(16)

Pagina | 9 Een variatie en verdere ontwikkeling op deze methode is de conjugatie van antilichamen op beads gebaseerd op de streptavidine-biotine interactie. Bij deze aanpak worden antilichamen gebiotinyleerd met biotine en geconjugeerd met streptavidine magnetic beads om een stabiel complex te vormen. Ook bij deze methode wordt er gebruikt gemaakt van eiwit digestie met pepsine en analyse met LC-TSQ-MS/MS[20].

2.5.3 Massaspectrometrie: LC-TSQ-MS/MS

Massaspectrometrie is een veel gebruikte techniek waarmee informatie kan worden verkregen over zowel de kwantitatieve als kwalitatieve compositie van organische en anorganische oplossingen. Daarnaast verschaft deze techniek informatie over de structuur van moleculen en de isotopische verhouding van atomen in een oplossing. Dit is af te lezen uit een massaspectrum, dat wordt verkregen door moleculen in een oplossing om te zetten in ionen waardoor scheiding op basis van de massa/lading verhouding (m/z) mogelijk is[21].

Het mengsel van peptiden na Immuno-Magnetic Separation waar het nonapeptide FGESAGAAS met het zenuwgasadduct zich in begeeft wordt geanalyseerd met de LC-TSQ-MS/MS. Dit staat voor Liquid Chromatography – Triple Stage Quadrupole – Tandem Mass Spectrometry. Op basis van vloeistofchromatografie worden de componenten in het mengsel gescheiden en vervolgens geanalyseerd met de Triple Stage Quadrupole massaspectrometer (TSQ). Een quadrupole bestaat uit vier magnetische staven waarover een spanning wordt gezet. Het te analyseren monster komt via de LC-kolom de massaspectrometer in, waar de moleculen in het monster worden omgezet tot ionen door middel van negatieve elektronen. De ionen worden versneld door een elektrisch veld en krijgen hierdoor kinetische energie, waardoor ze naar de eerste quadrupole (Q1) worden geleidt. De ionen worden in het magnetisch veld zodanig afgebogen dat de ionen met een lage en hoge m/z-waarde neerslaan op de wanden van de massaspectrometer en de ionen met een m/z-waarde die ertussen ligt door het magneetveld heen kunnen. Het magneetveld kan worden verandert zodat er bepaald kan worden welke m/z-waardes doorgelaten worden. Dit is de selectie van de uitgangsstof, ook wel het ouder ion genoemd. De doorgelaten ionen komen in de tweede quadrupole (Q2) terecht die als “collision cell” fungeert. In deze cel kan er wel of geen verdere fragmentatie van de ionen plaats vinden door middel van “collision gas”. Dit gas, meestal argon, botst met de ionen, waardoor deze verder fragmenteren. Dit wordt “collision-induced dissociation (CID)” genoemd. Vervolgens gaan de ionen naar de derde quadrupole (Q3), die dezelfde werking heeft als de eerste quadrupole en bepaalde fragmenten door laat naar de detector. Dit is de selectie van het te analyseren product, ook wel fragment ion of dochter ion genoemd. In de detector worden de fragmenten geanalyseerd en geregistreerd[21]. In figuur 6 staat een schematische weergave van de Triple Stage Quadrupole weergegeven.

(17)

Pagina | 10

3. Materiaal en Methoden

3.1 Chemicaliën, materialen en apparatuur

In deze paragraaf staan alle chemicaliën, materialen en apparatuur beschreven die gebruikt zijn tijdens dit onderzoek.

3.1.1 Chemicaliën

Protein G Dynabeads (Novex, 10004D); Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS (Lonza, BE17-512F); anti-butyrylcholinesterase (Thermo Scientific Pierce, Clone, 3E8); triethanolaminebuffer oplossing (0.2M, Sigma Aldrich, T0449-120ML); dimethyl pimelimidate dihydrochloride, DMP (Sigma Aldrich, D8388-1G); Tris Buffered Saline, TBS, 10x solution (Sigma Aldrich, T5912); bis(sulfosuccinimidyl)suberate, BS3 (Thermo Scientific, 21585); MilliQ (Millipore); Albumine from bovine serum (96%, Sigma Aldrich, A2153-100G); Tris HCl (99%, Sigma Aldrich, T5941-500G); NaCl (99,5%, Sigma Aldrich, 71376-1KG); Tween 20 (Sigma Aldrich, P7949); pepsine (pig gastric mucosa, Roche, CAS9001-75-6); mierenzuur (5% gesynthetiseerd door TNO); butyrylthiocholine iodide, BuSCHI (gesynthetiseerd door TNO); dithiobisnitrobenzoaat, DTNB (gesynthetiseerd door TNO); natriumlaurylsulfaat, LS (13%, gesynthetiseerd door TNO); biotine-OP (11 mM in CHCl3, gesynthetiseerd door TNO); VX (5,9 mg/ml in IPA, gesynthetiseerd door TNO); Sarin (9,98 mg/ml in IPA, gesynthetiseerd door TNO); streptavidine beads (MPG, MSTR0510); impa-FGESAGAAS (gesynthetiseerd door TNO); empa-FGESAGAAS (gesynthetiseerd door TNO).

3.1.2 Materialen

ChromalinkTM Biotin Antibody Labeling Kit (Solulink); magneet (GenoMagnet); epjes 1.5 ml (Eppendorf); epjes 0.8 ml (Eppendorf); 96-wells plaat, platte bodem (Costar); cuvetten (Greiner Labortechnik); Amicon Ultra 0.5 ml 10kDa cut off filter (Sigma Aldrich); Amicon Ultra 0.5 ml 30kDa cut off filter (Sigma Aldrich); Glazen vials 4.0 ml (Grace); Stopwatch; TPX Short Tread Vial, LCMS 0.2 ml (Grace).

3.1.3 Apparatuur

Vortex (Labinco, L46); Thermomixer compact (Eppendorf); Balans (SartΦrius research); KingFisher ml systeem (Thermo Electron Corporation); Centrifuge (Eppendorf); Spectrofotometer voor 96-wells platen (ASYS, UVM340); Spectrofotometer (Jasco V-560, UV-VIS); Waterbad (Haake, DC1); Stoof (Carbolite).

3.2 Immuno-Magnetic Separation

Door middel van Immuno-Magnetic Separation werd BuChE uit humaan plasma geïsoleerd. Hierbij werd gebruik gemaakt van magnetic beads (Protein G Dynabeads). Ter optimalisatie werden er verschillende experimenten uitgevoerd.

3.2.1 Conjugatie antilichamen aan beads

Het conjugeren van antilichamen aan de beads werd uitgevoerd per 100 µl. De bead-oplossing (100 µl) werd drie keer gewassen met Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS, 200 µl) om de beads te ontdoen van de “opslag-oplossing”. Vervolgens werd er antilichaam bevattende oplossing toegevoegd (50 µg/ml anti-BuChE in DPBS, 400 µl) aan de beads en geïncubeerd gedurende 18 uur in een thermomixer (450 rpm) bij kamertemperatuur.

Na incubatie kon er verder worden gegaan met verschillende stappen voor het cross-linken van de antilichamen aan de beads:

• Cross-linken met DMP in triethanolaminebuffer

Na de incubatie werden de beads twee keer gewassen met triethanolaminebuffer oplossing (0.2M, 200 µl) en geïncubeerd met dimethyl pimelimidate dihydrochloride (DMP) in triethanolaminebuffer

(18)

Pagina | 11 oplossing (5.4 mg/ml DMP in triethanolaminebuffer; 10x verdund of onverdund, 200 µl) gedurende 30 minuten in een thermomixer (450 rpm) bij kamertemperatuur. Hierna werden de beads gedurende 15 minuten geïncubeerd met Tris Buffered Saline (TBS, 200 µl) bij kamertemperatuur. Ten slotte werden de beads drie keer gewassen met Phosphate Buffered Saline met 0.05% Tween 20 (PBST, 100 µl).

• Cross-linken met BS3 in conjugatie buffer

Na de incubatie werden de beads twee keer gewassen met conjugatie buffer (DPBS, 200 µl) en geïncubeerd met bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3_{) in DPBS (5 mM, 250 µl) gedurende 30 minuten} in een thermomixer (450 rpm) bij kamertemperatuur. Hierna werd er quencing buffer (1M Tris HCl pH 7.5, 12.5 µl) toegevoegd en werden de beads gedurende 15 minuten geïnicubeerd bij kamertemperatuur. Ten slotte werden de beads drie keer gewassen met PBST (100 µl).

3.2.2 Biotine en Streptavidine

Naast Protein G Dynabeads was er ook een mogelijkheid om de conjugatie van antilichamen aan beads uit te voeren met Streptavidine beads en een biotine label. Er werd gebruik gemaakt van de Chromalink Biotin Labeling Kit (Solulink). Deze methode staat beschreven in paragraaf 2.5.2.

Ten eerste werd er een bufferuitwisseling uitgevoerd. Een 1.5 ml 1x modificatie buffer (150 µl 10x modificatie buffer + 1350 µl MililQ) en een 1.5 ml 1x PBS buffer (150 µl 10x PBS buffer + 1350 µl MilliQ) werden bereid voor elk monster. De bodemsluitingen en dopjes van twee ontzoutingskolommen werden losgedraaid, waarna deze werden afgedraaid in een centrifuge (1 minuut, 1500xg) voor het verwijderen van de opslagoplossing. De opslagoplossing werd verwijderd en de ontzoutingskolommen werden aan de zijkant gemarkeerd waar het resin opwaarts ging en kregen de letter A en B. Vervolgens werd bij A 1x modificatie buffer (300 µl) en bij B 1x PBS buffer (300 µl) toegevoegd en werden de kolommen afgedraaid met een centrifuge (1 minuut, 1500xg). Dit werd drie keer uitgevoerd. De vloeistoffen werden verwijderd en antilichaam (anti-BuChE; 1 mg/ml, 100 µl) werd geladen op kolom A. Aan kolom B werd 1x PBS buffer (100 µl) toegevoegd. De kolommen werden nogmaals gecentrifugeerd (2 minuten, 1500xg) en het eluaat met het antilichaam uit kolom A werd overgebracht naar een schoon 1.5 ml epje. Om het resin van kolom B te rehydrateren werd er 300 µl 1x PBS buffer toegevoegd.

Na de bufferuitwisseling vond de biotinylering plaats. Als eerste werd de stock-oplossing met biotine voorbereid in watervrij DMP (0.5 mg in 100 µl) en gesuspendeerd tot een heldere gele vloeistof. De hoeveelheid toe te voegen biotine aan het antilichaam (anti-BuChE) werd berekend door middel van de ChromaLink Biotin Protein Labeling Calculator. De aangegeven hoeveelheid werd toegevoegd aan het antilichaam en gedurende 120 minuten geïncubeerd in een thermomixer (450 rpm) bij kamertemperatuur.

Na de incubatie vond de tweede bufferuitwisseling plaats. Eerst werden kolom B met 300 µl 1x PBS buffer en kolom A met 300 µl MilliQ gecentrifugeerd (1 minuut, 1500xg), waarna de bufferuitwisseling kon beginnen. De inhoud van de afgeronde biotinylering reactie (anti-BuChE met biotine, ±100 µl) werd op kolom B geladen en MilliQ (100 µl) werd toegevoegd aan kolom A. De kolommen werden gecentrifugeerd (2 minuten, 1500xg), zodat het antilichaam met biotine werd verzameld. Deze oplossing werd geconjugeerd met Streptavidine beads.

De oplossing met streptavidine beads werd gesuspendeerd en 100 µl van de oplossing werd overgebracht naar een 1.5 ml epje. Een 2% Albumine oplossing (stopvloeistof, 20 mg/ml albumine in DPBS, 200 µl) werd toegevoegd aan de beads en geïncubeerd gedurende 30 minuten in een thermomixer (450 rpm) bij kamertemperatuur. Na incubatie werden de beads drie keer gewassen met een was-oplossing (50 mM Tris HCl 150 mM NaCl 0.05% Tween pH 8.0, 200 µl) en vervolgens opnieuw geïncubeerd met anti-BuChE in DPBS (10 µg in 120 µl) gedurende 30 minuten in een

(19)

Pagina | 12 thermomixer (450 rpm) bij kamertemperatuur. Na incubatie werden de beads nogmaals gewassen met was-oplossing (100 µl) en vervolgens gesuspendeerd in PBST (100 µl).

3.2.3 Isolatie BuChE uit plasma

Na uitvoering van de experimenten beschreven in paragraaf 3.2.1 of 3.2.2 werd de PBST verwijderd en MilliQ (100 µl) toegevoegd aan de beads. De incubatie van de beads in humaan plasma vond geautomatiseerd plaats door middel van het KingFisher mL systeem. Een programma voor deze uitvoering werd geïnstalleerd en vervolgens gestart; Eerst werden de beads (verschillende hoeveelheden mogelijk (in µl)) overgebracht in het plasma (200 µl) en gedurende 2 uur geÏncubeerd. Hierna werden de beads overgebracht in DPBS (1000 µl) en gewassen gedurende 2 minuten. Deze stap werd nogmaals herhaald en ten slotte werden de beads overgebracht in MilliQ (100 µl). Na afronding van het programma werden de beads en het plasma overgebracht in schone epjes (1.5 ml). Het programma van de KingFisher staat hieronder in figuur 7 weergegeven.

Figuur 7: Schematische weergave van het KingFisher mL systeem en het programma met de verschillende incubatie stappen.

3.2.4 Digesteren met pepsine

Na de isolatie van BuChE uit plasma werd een pepsine oplossing (0.25 mg/ml pepsine in 0.63% mierenzuur, 75 µl) toegevoegd aan de beads en geïncubeerd gedurende 1.5 uur in een thermomixer (1100 rpm) bij 37 °C. Na incubatie werd het supernatant overgebracht naar een Microcon Ultra 10 kD cut off filter en werden de beads gespoeld met 0.6% mierenzuur (100 µl). Na het spoelen werd ook het mierenzuur overgebracht naar de filter. Het filter werd 20 minuten gecentrifugeerd (11000 rpm). Na het centrifugeren werden de monsters naar de LC/MS afdeling gebracht voor verdere analyse.

3.3 Ellman methode

Om te bepalen of de isolatiemethode effectief was werd er gebruik gemaakt van de LC-TSQ-MS/MS. Echter is dit een dure analysemethode en mogen er alleen gespecialiseerde werknemers mee werken. Naast de LC-TSQ-MS/MS werd er gebruik gemaakt van de Ellman methode om de enzymactiviteit van BuChE in het plasma aan te tonen. Deze methode werd uitgevoerd op twee verschillende manieren.

• Manier 1

De eerste manier werd uitgevoerd door gebruik te maken van een 96 wells plaat en een spectrofotometer voor 96 wells platen. De plasma monsters werden in duplo gemeten. In elke te gebruiken well werd eerst dithiobisnitrobenzoaat (DTNB, 100 µl), vervolgens plasma monster (10 µl) en als laatste butyrylthiocholine iodide (BuSCHI, 100 µl) gepipetteerd. De 96 wells plaat werd in de spectrofotometer geplaatst en gemeten bij 412 nm. Aan de hand van de verkleuring werd

(20)

Pagina | 13 vastgesteld of er nog enzymactiviteit in het plasma monster aanwezig was of niet. Hoe geler de kleur, hoe meer enzymactiviteit.

• Manier 2

De tweede manier werd uitgevoerd door gebruik te maken van een cuvetten en een spectrofotometer (UV-VIS). De plasma monsters werden in duplo gemeten. Voor elk monster werd een vial van 4.0 ml gevuld met DTNB (1500 µl) en BuSCHI (1500 µl). Vervolgens werden de vials verwarmd door middel van een waterbad tot 25 °C. Na het verwarmen werden de volgende stappen per monster uitgevoerd. Als eerste werd het plasma monster (20 µl) toegevoegd aan de vial en werd er een stopwatch gestart. Als de oplossing z’n uiterste gele kleur had bereikt werd de stopwatch stil gezet en stopvloeistof (13% natriumlaurylsulfaat (LS), 150 µl) toegevoegd. Vervolgens werd het geheel overgebracht in een cuvet en gemeten met de spectrofotometer bij 412 nm. Bij de blanco werd na verwarmen enkel stopvloeistof (150 µl) toegevoegd, het geheel overgebracht in een cuvet en gemeten op de spectrofotometer bij 412 nm. Met behulp van een invulsheet in Excel werd de concentratie BuChE in humaan plasma berekend.

3.4 Snelle diagnose: gebruik van biotine-OP

Er werd een nieuwe methode opgesteld waarbij IMS werd toegepast. Bij deze nieuwe methode werd er gebruik gemaakt van een biotine-OP, een organofosfaat met een biotine label eraan vast. Zie figuur 8 voor de structuur van de biotine-OP.

NH N H O S O NH O P F O CH₃

Figuur 8: Structuur van de biotine-OP

Door middel van deze biotine-OP werd een oplossing van humaan butyrylcholinesterase (HuBuChE) dat niet in z’n geheel was geremd met een organofosfaat na geremd, waardoor het aanwezige ongeremde HuBuChE verwijderd kon worden en alleen het geremde HuBuChE overbleef voor een analysemethode waarbij gekeken wordt naar de aanwezigheid van geremd HuBuChE. Ongeremd HuBuChE stoort hierbij.

3.4.1 Oplossing met HuBuChE

Er werd begonnen met een oplossing van HuBuChE (80 nM, 2x200 µl) welke werd geremd met Sarin voor 50% en een ongeremde oplossing van HuBuChE (blanco, 80 nM, 3x200 µl). De 50% geremde oplossing (2x200 µl) werd geremd met biotine-OP (10 µM in MililQ, 20 µl per 200 µl). Ook de blanco (2x200 µl) werd geremd met biotine-OP (40 µl per 200 µl). Naast deze monsters werd er ook een blanco (200 µl) meegenomen die niet werd geremd met biotine-OP. De monsters werden geremd gedurende 2 uur en vervolgens werd de enzymactiviteit gemeten met de Ellman methode (zie paragraaf 3.2). Nadat de enzymactiviteit werd gemeten van de monsters werd er na geremd met een andere organofosfaat, in dit geval VX. Aan elk monster dat was geremd met biotine-OP werd VX (20 µM, 2 µl per 200 µl) toegevoegd. De monsters werden overnacht geïncubeerd, zodat VX met al het eventuele overige HuBuChE kon remmen en hydrolyseren. Na deze stap waren er vijf verschillende monsters; tweemaal HuBuChE met Sarin, biotine-OP en VX, tweemaal HuBuChE (blanco) geremd met biotine-OP en VX en eenmaal ongeremd HuBuChE. Van deze vijf monsters werden er twee (1x HuBuChE geremd met Sarin, biotine-OP en VX en 1x HuBuChE geremd met OP en VX) bewerkt met streptavidine magnetic beads om het HuBuChE geremd met biotine-OP te verwijderen. Dit werd gedaan door 50 µl streptavidine magnetic beads gedurende 1 uur te

(21)

Pagina | 14 incuberen met het te bewerken monster in een thermomixer (450 rpm) bij 20 °C. Na deze stap werden de monsters geconcentreerd met een Microcon Ultra 30 kD cut off filter. Aan de geconcentreerde oplossingen werd een pepsine oplossing toegevoegd (2.5 mg/ml pepsine in 6% mierenzuur, 20 µl). Vervolgens werden de oplossingen geïncubeerd gedurende 2 uur bij 37 °C in een stoof. Na incubatie werden de monsters naar de LC/MS afdeling gebracht voor verdere analyse met de LC-TSQ-MS/MS. Een schematische weergave van deze methode is terug te vinden in bijlage III.

3.5 Controle opslag biologische monsters

Ter controle voor de opslag van biologische monsters werd er een methode opgesteld waarbij gebruik werd gemaakt van IMS. Bij deze methode werden plasma en volbloed geremd met Sarin (100%) en vervolgens bij verschillende temperaturen bewaard (-74, -20 en 4 °C) en op verschillende dagen bewerkt met IMS. In onderstaande tabel staan de gegevens van de monsters met de

verschillende opslagtemperaturen en tijdstippen (in dagen) weergegeven.

Tabel 1: Biologische monsters met tijdstippen en opslagtemperaturen Tijdstip (in dagen) Monsters en opslagtemperaturen 1 Plasma -74 °C (200 µl) Plasma -20 °C (200 µl) Plasma 4°C (200 µl) Volbloed -20 °C (200 µl)* Volbloed 4 °C (200 µl)* 3 Plasma -74 °C (200 µl) Plasma -20 °C (200 µl) Plasma 4°C (200 µl) Volbloed -20 °C (200 µl)* Volbloed 4 °C (200 µl)* 8 Plasma -74 °C (200 µl) Plasma -20 °C (200 µl) Plasma 4°C (200 µl) Volbloed -20 °C (200 µl)* Volbloed 4 °C (200 µl)* 10 Plasma -74 °C (200 µl) Plasma -20 °C (200 µl) Plasma 4°C (200 µl) Volbloed -20 °C (200 µl)* Volbloed 4 °C (200 µl)* 14 Plasma -74 °C (200 µl) Plasma -20 °C (200 µl) Plasma 4°C (200 µl) Volbloed -20 °C (200 µl)* Volbloed 4 °C (200 µl)* *Volbloed werd 1:1 verdund met MilliQ.

Tijdens de uitvoering met IMS werden de monsters in duplo meegenomen. De hoeveelheid Protein G Dynabeads voor het isoleren van het BuChE uit plasma en volbloed werd bepaald aan de hand van de optimalisatie van de IMS methode.

(22)

Pagina | 15

4. Resultaten

4.1 Immuno-Magnetic Separation

Immuno-Magnetic Separation (beschreven in paragraaf 2.5.2) werd uitgevoerd voor de isolatie van zenuwgas geremde BuChE uit plasma. Er zijn verschillende experimenten uitgevoerd ter optimalisatie van deze methode.

4.1.1 Protein G Dynabeads en Cross-Linking reagens DMP

IMS is als eerste getest met 25 µl en 75 µl Protein G Dynabeads en twee varianten van het cross-linking reagens DMP in triethanolaminebuffer in plasma dat 50% was geremd met Sarin (GB). Het experiment is uitgevoerd met vier verschillende monsters en een blanco, zie tabel 2.

Tabel 2: Hoeveelheden plasma, beads en cross-linking reagens per monster.

Monster 50% plasma-GB (µl) Protein G Dynabeads

(µl) Cross-linking reagens M1: 1408YV03 200 75 20 µl 5,4 mg/ml DMP in triethanolaminebuffer + 180 µl triethanolaminebuffer M2: 1408YV04 200 25 20 µl 5,4 mg/ml DMP in triethanolaminebuffer + 180 µl triethanolaminebuffer M3: 1408YV05 200 75 200 µl 5,4 mg/ml DMP in triethanolaminebuffer M4: 1408YV06 200 25 200 µl 5,4 mg/ml DMP in triethanolaminebuffer Blanco: 1408YV07 200 - -

Na de uitvoering van IMS werd er verwacht dat er geen enzymactiviteit meer in het plasma aanwezig zou zijn. Dit werd getest met de Ellman methode. Alle monsters zijn in duplo gemeten bij tijdstip 0, 3 en 10 minuten. In tabel 3 staan de gemeten extincties weergegeven.

Tabel 3: Ellman methode, enzymactiviteit in het plasma

Monster Extinctie 1 Extinctie 2 (duplo)

Extinctie bij T = 0 (412 nm) 1408YV03 0,327 0,315 1408YV04 0,441 0,410 1408YV05 0,417 0,396 1408YV06 0,429 0,425 1408YV07 0,476 0,458 Extinctie bij T = 3 (412 nm) 1408YV03 0,344 0,327 1408YV04 0,826 0,724 1408YV05 0,587 0,538 1408YV06 0,796 0,818 1408YV07 0,967 0,951 Extinctie bij T = 10 (412 nm) 1408YV03 0,412 0,367 1408YV04 1,228 1,158 1408YV05 0,913 0,807 1408YV06 1,315 1,327 1408YV07 1,597 1,560

(23)

Pagina | 16 Alle extincties zijn gemiddeld en uitgezet in een grafiek. De grafiek en tabel met de gemiddelde extincties zijn hieronder weergegeven.

Tabel 4: Gemiddelde extincties van de plasma monsters en de blanco bij T = 0, 3 en 10 minuten.

Monster T = 0 T = 3 T = 10 M1: 1408YV03 0,321 0,336 0,390 M2: 1408YV04 0,426 0,775 1,193 M3: 1408YV05 0,407 0,563 0,860 M4: 1408YV06 0,427 0,807 1,321 Blanco: 1408YV07 0,467 0,959 1,579

Figuur 9: Grafiek met de gemiddelde extincties weergegeven per plasma monster en blanco bij T = 0, 3 en 10 minuten. Op de y-as staan de extincties weergegeven en op de x-as de monsters (M1 t/m M4) en de blanco.

Hoe hoger de staven in de grafiek, hoe hoger de extincties en hoe hoger de enzymactiviteit. Bij monster 1 is de enzymactiviteit het laagst en blijft het laagst in een tijdsbestek van 10 minuten. Dit is bij de andere monsters niet het geval. Bij de andere monsters is er nog enzymactiviteit aanwezig in het monster. Dit is af te leiden aan de hand van de blanco (nummer 5) waarbij de enzymactiviteit geleidelijk aan hoger wordt.

Er is niet alleen gekeken naar enzymactiviteit van de plasma monsters, maar ook naar het pepsine digest van de beads om te kijken welke hoeveelheden beads en cross-linking reagens er het best gebruikt kan worden. Het pepsine digest bestaat uit een mengsel van peptiden afkomstig van gedigesteerd HuBuChE, waaronder de nonapeptide FGESAGAAS waaraan het organofosfaat, in dit geval Sarin, zit gebonden. Dit wordt onderzocht met de LC-TSQ-MS/MS.

Hieronder staat het ion chromatogram weergegeven van het pepsine digest behorende bij de monsters 1 tot en met 4 die in tabel 2 staan beschreven. Er is gemeten op FGESAGAAS-impa, het ion chromatogram is weergegeven in figuur 10 en bijbehorende piekoppervlakten zijn genoteerd in tabel 5. 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600 1,800 M1 M2 M3 M4 Blanco Extinctie bij T = 0 Extinctie bij T = 3 Extinctie bij T = 10

(24)

Pagina | 17

Figuur 10: Ion chromatogram na analyse met de LC-TSQ-MS/MS, gemeten op FGESAGAAS-impa. Monster 1 tot en met 4 staan van boven naar beneden.

Tabel 5: Piekoppervlakten van FGESAGAAS-impa van de monsters 1 tot en met 4.

Monster Area FGESAGAAS-impa

M1: 1408YV03 638149

M2: 1408YV04 37224

M3: 1408YV05 431989

M4: 1408YV06 153232

Uit het resultaat blijkt dat er een verschil is in de piekoppervlakten bij de verschillende hoeveelheden beads. Zo is bij monster 1 en 2 het oppervlak van de FGESAGAAS-impa piek bij 25 µl beads (M2) 94% lager dan het oppervlak van de FGESAGAAS-impa piek bij 75 µl beads (M1) en bij monster 3 en 4 is het oppervlak van de FGESAGAAS-impa piek bij 25 µl beads (M4) 65% lager dan het oppervlak van de FGESAGAAS-impa piek bij 75 µl beads (M3).

Daarnaast blijkt uit de resultaten dat er verschil is in de piekoppervlakten bij de variatie in cross-linking reagens. Zo is het piekoppervlak van de FGESAGAAS-impa piek bij monster 1 32% hoger dan het piekoppervlak van de FGESAGAAS-impa piek bij monster 3. Maar zo blijkt het piekoppervlak van de impa piek bij monster 2 76% lager te zijn dan het piekoppervlak van de FGESAGAAS-impa piek bij monster 4.

4.1.2 Cross-Linking reagens DMP en BS3

Als tweede werd bij IMS een andere cross-linking reagens getest, BS3 in PBS. Hierbij werd het cross-linking reagens DMP in triethanolaminebuffer meegenomen ter vergelijking. Er werd gebruik gemaakt van 20 µl en 80 µl Protein G Dynabeads in plasma dat 50% was geremd met Sarin. Het experiment is tweemaal uitgevoerd met vier verschillende monsters en een blanco, zie tabel 6.

(25)

Pagina | 18

Tabel 6: Hoeveelheden plasma, beads en cross-linking reagens per monster.

Monster 50% plasma-GB (µl) Protein G Dynabeads

(µl) Cross-linking reagens M1: 1410YV03 en 1410YV12 200 80 20 µl 5,4 mg/ml DMP in triethanolaminebuffer + 180 µl triethanolaminebuffer M2: 1410YV04 en 1410YV13 50 + 150 µl DPBS 20 20 µl 5,4 mg/ml DMP in triethanolaminebuffer + 180 µl triethanolaminebuffer M3: 1410YV05 en 1410YV14 200 80 BS3 in conjugatiebuffer (5 mM). M4: 1410YV06 en 1410YV15 50 + 150 µl DPBS 20 BS3 in conjugatiebuffer (5 mM). Blanco: 1410YV07 en 1410YV16 200 - -

Na de uitvoering van IMS werd er verwacht dat er geen enzymactiviteit meer in het plasma aanwezig is. Dit werd getest met de Ellman methode. Alle monsters zijn in duplo gemeten bij tijdstip 0, 3 en 10 minuten. In tabel 7 staan de gemeten extincties weergegeven.

Tabel 7: Ellman methode, enzymactiviteit in het plasma

Monster Extinctie 1 Extinctie 2

(duplo)

Duplo Extinctie 1 Extinctie 2

(duplo) Extinctie bij T = 0 (412 nm) 1410YV03 0.598 0.581 1410YV12 0.781 0.711 1410YV04 0.820 0.756 1410YV13 0.737 0.826 1410YV05 0.979 1.115 1410YV14 1.195 1.132 1410YV06 1.611 1.006 1410YV15 0.867 0.824 1410YV07 0.980 1.030 1410YV16 1.112 1.140 Extinctie bij T = 3 (412 nm) 1410YV03 0.631 0.615 1410YV12 0.837 0.854 1410YV04 1.253 1.180 1410YV13 1.290 1.311 1410YV05 1.699 1.915 1410YV14 1.989 2.006 1410YV06 1.819 1.745 1410YV15 1.826 1.820 1410YV07 1.811 1.891 1410YV16 1.983 2.108 Extinctie bij T = 10 (412 nm) 1410YV03 0.745 0.728 1410YV12 1.140 1.148 1410YV04 1.901 1.835 1410YV13 1.899 1.747 1410YV05 2.019 2.030 1410YV14 2.091 2.099 1410YV06 1.970 1.952 1410YV15 2.002 2.009 1410YV07 2.016 2.044 1410YV16 2.079 2.182

De extincties 1 en 2 zijn gemiddeld en uitgezet in een grafiek. Hieronder staan de tabel en grafiek van de gemiddelde extincties weergegeven per uitvoering.

Tabel 8: Gemiddelde extincties van de plasma monsters en de blanco bij T = 0, 3 en 10 minuten.

T = 0 T = 3 T = 10 T = 0 T = 3 T = 10 1410YV03 (1) 0.590 0.623 0.737 1410YV12 (1) 0.746 0.846 1.144 1410YV04 (2) 0.788 1.217 1.868 1410YV13 (2) 0.782 1.301 1.823 1410YV05 (3) 1.047 1.807 2.025 1410YV14 (3) 1.164 1.998 2.095 1410YV06 (4) 1.309 1.782 1.961 1410YV15 (4) 0.846 1.823 2.006 1410YV07 (5) 1.005 1.851 2.030 1410YV16 (5) 1.126 2.046 2.131

(26)

Pagina | 19

Figuur 11: Grafiek met de gemiddelde extincties weergegeven per plasma monster en blanco bij T = 0, 3 en 10 minuten van de 1e uitvoering van het experiment met de monsters 1410YV03 tot en met 1410YV07. Op de y-as staan de extincties weergegeven en op de x-as de monsters (M1 t/m M4) en de blanco.

Figuur 12: Grafiek met de gemiddelde extincties weergegeven per plasma monster en blanco bij T = 0, 3 en 10 minuten van de 2e uitvoering van het experiment met de monsters 1410YV12 tot en met 1410YV16. Op de y-as staan de extincties weergegeven en op de x-as de monsters (M1 t/m M4) en de blanco.

Uit het resultaat blijkt dat de enzymactiviteit van de monsters 1410YV03 en 1410YV12 (monster 1 in figuur C en D) het laagst is en blijft. Dit zijn de monsters waarbij het cross-linking reagens DMP in triethanolaminebuffer is gebruikt. De monsters waarbij het cross-linking reagens BS3 in PBS hebben een stijgende lijn in de enzymactiviteit, net zoals de blanco.

4.1.3 Biotine en Streptavidine

Ter optimalisatie van IMS is er ook een methode uitgevoerd met de interactie tussen biotine en streptavidine (beschreven in paragraaf 2.5.2). Deze methode is getest met 200 µl HuBuChE-oplossing dat voor 50% was geremd met Sarin en verschillende hoeveelheden streptavidine beads. De methode is tweemaal uitgevoerd met vier verschillende monsters, zie tabel 9. Er is één enkel verschil tussen de twee uitvoeringen van het experiment. Bij de eerste uitvoering zat er een tijd van 8 dagen tussen de biotinylering van het antilichaam en de rest van de methode, dit is bij de tweede uitvoering niet het geval. Bij de tweede uitvoering is de gehele methode op één dag uitgevoerd.

0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 M1 M2 M3 M4 Blanco Extinctie bij T = 0 Extinctie bij T = 3 Extinctie bij T= 10 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 M1 M2 M3 M4 Blanco Extinctie bij T = 0 Extinctie bij T = 3 Extinctie bij T = 10

(27)

Pagina | 20

Tabel 9: Hoeveelheden HuBuChE-oplossing en beads per monster.

Monster 40 nM 50% HuBuChE-GB oplossing (µl) Streptavidine beads (µl) M1.1: 1412YV07 M2.1: 1414YV07 200 20 M1.2: 1412YV08 M2.2: 1414YV08 200 40 M1.3: 1412YV09 M2.3: 1414YV09 200 60 M1.4: 1412YV10 M2.4: 1414YV10 200 80

Het pepsine digest van de streptavidine beads is geanalyseerd op FGESAGAAS, FGESAGAAS-mpa en FGESAGAAS-impa met de LC-TSQ-MS/MS. De piekoppervlakten zijn weergegeven in tabel 10 en 11.

Tabel 10: Piekoppervlakten van FGESAGAAS-impa van de monsters 1.1 tot en met 1.4

1.1 14150

1.2 4914

1.3 9650

1.4 14877

De piekoppervlakten van FGESAGAAS-impa zijn uitgezet in een grafiek, zie figuur 13.

Figuur 13: Grafiek met op de y-as de piekoppervlakte van FGESAGAAS-impa van de monsters 1.1 tot en met 1.4 uitgezet tegen de hoeveelheid streptavidine beads in µl op de x-as.

Uit het resultaat blijkt dat er een verschil is in oppervlakten van de FGESAGAAS-impa piek bij de verschillende hoeveelheden beads. Zo is de piek van 80 µl beads (M1.4) 35% groter dan de piek van 60 µl beads (M1.3) en de piek van 60 µl beads (M1.3) 49% groter dan de piek van 40 µl beads (M1.2). Alleen de piek van 20 µl beads (M1.1) is groter (65%) in plaats van kleiner dan de piek van 40 µl beads (M1.2).

Tabel 11: Piekoppervlakten van FGESAGAAS-impa van de monsters 2.1 tot en met 2.4

2.1 188761

2.2 254209

2.3 298188

2.4 342867

De piekoppervlakten van FGESAGAAS-impa zijn uitgezet in een grafiek, zie figuur 14.

R² = 0,0375 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 0 20 40 60 80 100 A re a Streptavidine beads (µl) FGESAGAAS-impa Lineair (FGESAGAAS-impa)

(28)

Pagina | 21

Figuur 14: Grafiek met op de y-as de piekoppervlakte van FGESAGAAS-impa van de monsters 2.1 tot en met 2.4 uitgezet tegen de hoeveelheid streptavidine beads in µl op de x-as.

Uit het resultaat blijkt dat er een verschil is in oppervlakten van de FGESAGAAS-impa piek bij de verschillende hoeveelheden beads. Zo is de piek van 40 µl beads (M2.2) 26% groter is dan de piek van 20 µl beads (M2.1), de piek van 60 µl beads (M2.3) 15% groter dan de piek van 40 µl beads (M2.2) en de piek van 80 µl beads (M2.4) 13% groter dan de piek van 60 µl beads (M2.3). Ook blijkt dat de toename van de piekoppervlaktes steeds meer afneemt, terwijl de hoeveelheid beads steeds meer toeneemt.

Uit de resultaten blijkt ook dat er een verschil is in piekoppervlakten van de FGESAGAAS-impa piek tussen de twee uitvoeringen van het experiment. De piekoppervlaktes van de tweede uitvoering (M2.1 tot en met M2.4) zijn vele malen groter dan die van de eerste uitvoering (M1.1 tot en met 1.4). Zo is het piekoppervlak van M2.1 (20 µl beads) 93% groter dan het piekoppervlak van M1.1 (20 µl beads), het piekoppervlak van M2.2 (40 µl beads) 98% groter dan het piekoppervlak van M1.2 (40 µl beads), het piekoppervlak van M2.3 (60 µl beads) 97% groter dan het piekoppervlak van M1.3 (60 µl beads) en het piekoppervlak van M2.4 (80 µl beads) 96% groter dan het piekoppervlak van M1.4 (80 µL beads).

Daarnaast blijkt uit de resultaten dat er een verschil is in de oppervlaktes van de FGESAGAAS-impa piek van de monsters 1408YV03 tot en met 1408YV06 (paragraaf 4.1.1, tabel 5) waarbij gebruik is gemaakt van Protein G Dynabeads en cross-linking reagens DMP in triethanolaminebuffer in tegenstelling tot de monsters van de streptavidine beads. Zo is het piekoppervlak van 1408YV03 (75 µl beads) 46% groter en 1408YV05 (75 µl beads) 21% groter dan het piekoppervlak van 1414YV10 (M2.4; 80 µl beads), maar het piekoppervlak van 1408YV04 (25 µl beads) is 80% kleiner en 1408YV06 (25 µl beads) 19% kleiner dan het piekoppervlak van 1414YV07 (M2.1; 20 µl beads).

4.2 Digest van HuBuChE

IMS is getest met een HuBuChE-oplossing ter controle van de kwaliteit van de methode en dan voornamelijk de kwaliteit van de Protein G Dynabeads. Hierbij werden niet alleen de beads gedigesteerd met pepsine, maar ook de HuBuChE-oplossing zelf en de HuBuChE-oplossing die leeggehaald was door middel van de beads. Dit experiment is drie maal uitgevoerd, zie tabel 12, 14 en 16 voor een beschrijving van de gebruikte monsters.

R² = 0,9898 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 0 20 40 60 80 100 A re a Streptavidine Beads (µl) FGESAGAAS - impa Lineair (FGESAGAAS -impa)

(29)

Pagina | 22

4.2.1 Digest van HuBuChE (1)

Tijdens de eerste uitvoering van het experiment is er gebruik gemaakt van drie verschillende soorten monsters (weergeven met de drie verschillende tinten blauw in tabel 12).

Tabel 12: Monsters van de eerste uitvoering van het experiment

Monster Concentratie 50% HuBuChE-GB (nM) Hoeveelheid 50% HuBuChE-GB (µl) Hoeveelheid Protein G Dynabeads (µl) Hoeveelheid pepsine in mierenzuur 1411YV08 40 200* - 0,25 mg/ml in 0,625% (75 µl) 1411YV09 40 200* - 0,25 mg/ml in 0,625% (75 µl) 1411YV10 40 200* - 0,25 mg/ml in 0,625% (75 µl) 1411YV11 40 200* - 0,25 mg/ml in 0,625% (75 µl) 1411YV12 40 200* - 0,25 mg/ml in 0,625% (75 µl) 1411YV13 - - 20 0,25 mg/ml in 0,625% (75 µl) 1411YV14 - - 40 0,25 mg/ml in 0,625% (75 µl) 1411YV15 - - 60 0,25 mg/ml in 0,625% (75 µl) 1411YV16 - - 80 0,25 mg/ml in 0,625% (75 µl) 1411YV18 46 65 - 2 mg/ml in 5% (10 µl)** 1411YV19 46 65 - 2 mg/ml in 5% (10 µl)**

*Deze monsters werden eerst geconcentreerd met een 30KD filter, hierdoor is de hoeveelheid oplossing geslonken van 200 µl naar een onbekende hoeveelheid. Vervolgens zijn de monsters gedigesteerd met pepsine. **2 mg/ml in 5% mierenzuur (10 µl) staat gelijk aan 0.267 mg/ml in 0.667% mierenzuur.

De monsters 1411YV13 tot en met 1411YV16 zijn het pepsine digest van de beads die gebruikt zijn bij het isoleren van HuBuChE uit de oplossingen 1411YV08 tot en met 1411YV11. Het monster 1411YV12 is als blanco meegenomen bij IMS (zonder beads) en vervolgens gedigesteerd met pepsine en de monsters 1411YV18 en 1411YV19 zijn HuBuChE-oplossingen met een aangepaste concentratie die direct zijn gedigesteerd met pepsine. Alle monsters zijn geanalyseerd op FGESAGAAS-impa met de LC-TSQ-MS/MS, de resultaten staan weergegeven in onderstaande tabel 13.

Tabel 13: Piekoppervlakten van FGESAGAAS-impa van de monsters uit tabel 12.

1411YV08 8305 1411YV09 Verwaarloosbaar 1411YV10 Verwaarloosbaar 1411YV11 Verwaarloosbaar 1411YV12 189900 1411YV13 745055 1411YV14 1029212 1411YV15 990628 1411YV16 1119556 1411YV18 180282 1411YV19 250282

De piekoppervlakten van FGESAGAAS-impa in de monsters 1411YV13 tot en met 1411YV16 zijn uitgezet in een grafiek, weergegeven in figuur 15.