Ontwikkeling methode voor het bepalen van vitamine B6 in levensmiddelen

(1)

Onderwerp: Ont1>1ikkeling methode voor het bepalen van vitamine B₆ in levensmiddelen

Bijlagen: 13.

Voorgaand verslag: 83.77.

Verzendlijst: direkteur, sektorhoofden, direktie VKA, afdeling AH (4x), medewerkers, projektbeheer, projektleider (Hollman), circulatie.

(2)

(3)

RAPPORT 85.34 Pr.nr. 505.0100

Projekt: Ontwikkeling methoden voor het bepalen van micronutriënten in levensmiddelen

Onderwerp: Ontwikkeling methode voor het bepalen van vitamine B6 in levensmiddelen

Bijlagen: 13

Voorgaand verslag: 83.77

Doel:

Ontwikkeling van een methode voor het bepalen van vitamine B6 in levensmtddelen.

Samenvatting:

Twee reversed phase HPLC-systemen voor de scheiding van pyridoxine (PN), pyridoxamine (PM) en pyridoxal (PL) lo~erden onderzocht lolaarbij de invloed van een aantal variabelen in kaart gebracht \o~erd. De voor de analyse van vitamine B6 wenselijk geachte hydrolyse van de

fos-faatesters werd onderzocht met behulp van standaardoplossingen van de B6 vitaminen. Hierbij werd aandacht geschonken aan een enzymatische hydrolyse en aan een hydrolyse bij verhoogde druk en temperatuur (autoclaaf).

Conclusies:

- Ion-paar chromatografie met behulp van heptaansulfonaat blijkt het meest geschikt.

- De enzymatische hydrolyse (Clara-Diastase) is volledig na 2 uur. -De hydrolyse met behulp van een autoclaaf (121°C) is pas volledig na

5 uur. Deze hydrolyse \olOrdt geremd door hoge zuurconcentraties.

Verantlwordelijk: ir P. HoUman

Et>\

Medewerker/Samensteller: R. Binnendijk

P-'P)

Projektleider: ir P. Hallman

(4)

waarschijnlijk vervallen van een clean-up, voorgesteld een metltode te ontwikkelen waarbij gebruik gemaakt wordt van reversed-phase HPLC in combinatie met flurorescentiedetectie, vooraf gegaan door ontslui-ting bij verhoogde temperatuur.

Als uitgangspunten voor de chromatografie zijn twee publicaties genomen: een reversed phase chromatografiemethode (2) en een variant hierop gebaseerd op ion-paar chromatografie (3).

Voor de ontsluiting zijn zowel de ontsluiting bij verhoogde tem-peratuur, onder andere toegepast door de AOAC (4), als de enzyma-tische hydrolyse toegepast, deze laatste ontsluiting wordt ook onder andere gebruikt bij de bepaling van vitamine B₁ en

n

₂ (5,6).

2. Fluorescentie optima

Bepaald zijn de excitatie-emissiemaxima van de

n

₆ componenten, met behulp van de Perkin-Elmer LS 4 fluorescentiedetector, in:

- kaliumdiwaterstoffosfaat 0,0667 M/fosforzuur pH = 2,6 4% methanol (zie bijlage 1 t/m 3). component excitatie (nm) PL 285 PN 288 PM 292 emissie (nm) 377 394 395 - kaliumdiwaterstoffosfaat 0,0667 M/fosforzuur pH = 2,6 natrium-1-heptaansulfonaat 0,012 M tetraethylammoniumchloride 0,0075 M isopropanol 3,75% (zie bijlage 4 t/m 6).

component excitatie emissie

(nm) (nm)

PL 287 378

PN 288 395

P~l 292 395

Er is dus geen invloed van het eluens op de ligging van de maxima.

(5)

-3. Chromatografie

3.1 Reversed phase

Nagegaan is in hoeverre de in de literatuur beschreven methoden geschikt zijn voor de scheiding en bepaling van de drie vitamine B₆

componenten (zie RIKILT-rapport 83.77). Als uitgangspunt dient het systeem beschreven door O'Reilly (2). Hij gebruikt een spherisorb 10 ~m RP 18 25 x 0,4 cm kolom met als eluens een 0,067 M kaliumdi-waterstoffosfaatbuffer op pH 2,6 gebracht met fosforzuur (zie tabel 1

en bijlage

7).

De analysetijd bedraagt dan circa 10 minuten. De anal~ tetijd kan verkort worden door aan de buffer een minder polaire

vloeistof toe te voegen (b.v. methanol). Na toevoegen van 4% methanol bedraagt de analysetijd circa 6 minuten. De flow bedraagt 1,6 ml/min.

Tabel 1 k' % methanol PM PL PN 0 0,47 3,00 4,60 2 0,43 2,20 3,23 3 0,37 1,93 2,76 4 0,37 1,70 2,40 5 0,37 1,57 2,13 6 0,30 1,40 1,90

Tevens wordt door deze toevoeging een betere piekvorm verkregen

% methanol 0

4

~m 1,3 1,1 AspL 1,7 1,2 AspN 2,1 1,6

Waarbij As de asymetriefactor op 10% van de piekhoogte is.

De elutievolgorde is: PM, PL, PN.

Nadat de spherisorb kolom niet meer bruikbaar was, het schotelgetal

liep terug van± 12.000 tot± 2.500, was het niet mogelijk eenzelfde

kolom, met dezelfde eigenschappen, te verkrijgen.

(6)

-Alternatieven zoals Hyperail 5 ODS (15 x 0,46 cm), Lichrosorb 5 RP 8 (15 x 0,46 cm) en het Chrompack cartridge systeem (spherisorb 7 ~ C18, 20 x 0,3 cm) voldoen niet. Het probleem in deze is de piekasymmetrie. Door het toevoegen van tetraethylammoniumchloride kan de pieksymmetrie verbeterd worden. Het gevolg van deze toevoeging is ook dat PH nauwe

-lijks meer wordt vertraagd waardoor deze in het vloeistoffront belandt, zelfs als geen methanol aan de buffer wordt toegevoegd.

3.2 Ion-paar reversed phase

Hilliams (3) beschrijft de scheiding van de drie 86 componenten met behulp van ion-paar chromatografie; loopvloeistof: 0.0324 M azijnzuur (pH 2,6), 0,081 H heptaansulfonzuur, 10% isopropanol; kolom ~ Bonda-pack Cl8 (30 x 0,39 cm). Deze methode diende als uitgangspunt voor een alternatieve methode, nadat de methode beschreven in hoofstuk 2.1 niet meer voldeed.

Diverse parameters zijn bekeken, als kolom wordt het cartridge systeem van Chrompack (Spherisorb C18 7 pm 20 x 0,3 cm) gebruikt, als basis voor de loopvloeistof de kallumdiwaterstoffosfaat/fosforzuur buffer pH = 2,6.

3.2.1 Flow (bijlage 8)

Loopvloeistof: Kaliumdhmterstoffosfaat 0,0667 H/ fosforzuur pH 2, 6 Natrium-1-heptaansulfonaat 0,008 H component PL PN PM 8534 .3 Isopropanol 10%. flow (ml/min) U (cm/sec) k' H (pm) k' H (pm) k' H (pm) 0,86 39,5 1,04 33,6 1,73 27,9 0,3

o, 113

0,85 42,0 1,03 38,8 1,69 36,7 0,4 0,150 0,86 43,2 1,05 40,8 1,73 49,8 0,5

o,

190 0,85 40,0 1,03 46,2 1,70 56,7 - 4

(7)

-Gekozen is, om een redelijke analysetijd te verkrijgen, voor een flow

van 0,4 ml/min, dit komt overeen met een flow van circa 1,0 ml/min bij

een diameter van 0,46 cm.

3.2.2 Tegenionconcentratie (bijlage 9)

Loopvloeistof: Kaliumdü;raterstoffosfaat 0,0667 H/fosforzuur pH 2,6

Isopropanol 10%.

Flow: 0,4 ml/min.

concentratie natrium-1-heptaansulfonaat

PL PN PH 0,604 0, 724 0,813 mol/1 0,697 0,841 1,14 0,877 1,06 1, 7 2 0,992 1,21 2,28

Het blijkt dat het veranderen van de tegenionconcentratie namo1elijks

invloed heeft op de scheiding van PL en PN. Om de analysetijd kort te

houden is gekozen voor een concentratie van 0,008 H aan n

atrium-1-heptaansulfonaat.

3.2.3 Bufferconcentratie (bijlage 10)

Loopvloeistof: Natrium-1-heptaansulfonaat 0,008 H

Isopropanol 10%.

Flow: 0,4 ml/min.

PL PN PH

concentratie kaliumd

iwaterstoffosfaat/fosfor-zuur buffer pH

=

2,6 mol/1 0,0335 0,0503 0,0667 0,0834 1,10 1,32 2,61 0,915 1 '11 2,03 0,815 0,992 1,61

o,

762 0,915 1,35

Het veranderen van de bufferconcentratie heeft nauwelijks invloed op

de scheiding van PL en PH. Om het eluens een redelijke buffer capaci

-teit te geven is gekozen voor een concentratie van 0,0667 molair.

(8)

-3.2.4 Isopropanolconcentratie (bijlage 11)

Loopvloeistof: Kaliumdh1aterstoffosfaat 0,0667

I

fosforzuur pH 2, 6

Natrium-1-heptaansulfonaat 0,008 H Flow: 0,4 ml/min. isopropanolconcentratie mol/1 2,50 3, 7 5 5,00 7,50 10,00 12,50 PL 3,39 2,14 1,61 1,07 0,811 0,685 PN 4,79 2, 98 2,15 1,34 0, 977 0, 792 PH 6,64 4,19 3,32 2,25 1,58 1,23

Het blijkt dat de isopropanolconcentratie invloed heeft op de

scheiding van PL en PN. Om deze twee componenten basislijn te scheiden

moet de isopropanolconcentratie kleiner zijn dan circa 4%.

3.2.5 Kolomtemperatuur (bijlage 12)

Loopvloeistof: Kaliumdiwaterstoffosfaat 0,0667 H/fosforzuur pH 2,6

Natrium-1-heptaansulfonaat 0,008 H Isopropanol 3,75% Temperatuur (oC) k' 25,0 29,8 34,0 39,0 44,0 PL 1,85 1,70 1,60 1,50 1,40 PN 2,60 2,30 2,20 2,00 1,80 PH 3,40 3,20 3,00 2,80 2,50

Door de temperatuur te verhogen van 25°C naar 44°C wordt de

analyse-tijd verkort van 11 minuten naar 9 minuten.

3.2.6 Optimalisering loopvloeistof

Uit bovenstaande blijkt dat verhoging van de tegenionconcentratie de

retentie van PM het sterkst b~invloedt, het effekt op PL en PN is kleiner en voor beide componenten gelijk. De bufferconcentratie heeft

eveneens op PH het sterkste effekt, terwijl PL en PN gelijk reageren.

De isopropanolconcentratie heeft een gelijk effekt op PM en PL en een

iets sterker effekt op PN. Bij een keuze van de bovengenoemde

parame-ters zal de scheiding tussen PN en PL bepalend zijn, naast een

mini-male bufferconcentratie en een maximale analyseduur

(

±

10 min).

(9)

-De drie 86-componenten zijn basislijn gescheiden en elueren binnen 12

minuten van de kolom indien als loopvloeistof wordt gebruikt (zie

bij-lage 13A):

kaliumdh1aterstoffosfaat 0,066 7 ~1/ fosforzuur pH 2, 6

natrium-1-heptaansulfonaat 0,008 M

isopropanol 3,75%

De asymmetriefactoren en k' met bovenstaand systeem zijn:

As k' PL 3,0 2,14 PN 1,8 2,98 PH 1,2 4,19

Om deze factoren te verlagen is tetraethylammoniumchloride (0,0075 M)

toegevoegd.

Door deze toevoeging elueren de B_{6 componenten sneller zodat de samen}

-stelling van de loopvloeistof als volgt aangepast ~.;rerd:

kaliumdiwaterstoffosfaat 0,100 H/fosforzuur pH = 2,6

natrium-1-heptaansulfonaat 0,012 H

isopropanol: 3,20%

tetraethylammoniumchloride 0,0075 H

De drie B6 componenten zijn basislijn gescheiden en elueren binnen 8

minuten (zie bijlage 138).

As k' PL 1, 6 1,12 PN 1,4 1, 41 PH 1,2 2,02

Opmerking. Aan de injectievloeistof dient tegenion te worden

toege-voegd, zelfde concentratie als in loopv.loeistof, omdat anders A, uit

y

=

A x+ B, van de ijklijn van PN significant afwijkt van 0.

3.3 Detectiegrenzen

Bepaald zijn de detectiegrenzen voor de twee systemen, gemeten bij een

signaal-ruisverhouding van 3:1 op basis van piekhoogte.

(10)

-- Reversed phase, kolom i.d. 0,46 cm.

Maximale excitatie- en emissiegolflengte (zie hoofdstuk 2), voor de

chromatografische omstandigheden zie hoofdstuk 3.1.

PH PL PN De tee tiegrens absoluut (ng) in product (mg/100 g)* 0,05 0,003 0,20 0,28 0,01 0,015

- Ion-pair reversed phase kolom i.d. 0,30 cm.

Excitatiegolflengte: 285 nm, emissiegolflengte: 385 nm.

Voor de chromatografische omstandieheden wordt verwezen naar

hoofd-stuk 3.2.6. PL PN PH 4. Ontsluiting De tee ti eg rens absoluut (ng) in product (mg/100 g)* 0,03 0,002 0,04 0,002 0,02 0,001

Voor de ontsluiting van B6, bepaald als PH, PL en PN, zijn een aantal

procedures beschreven. Hierin is een tweedeling aan te brengen (zie

RIKILT-rapport 83.77).

- Zure- en enzymatische hydrolyse; een kortere zure hydrolyse bij

circa 100°C om de vitamine-matrixverbindingen te verbreken gevolgd

door een enzymatische hydrolyse (o.a. fosfatase) om de fosfaatvormen

van de B6 vitameren te hydrolyseren.

- Zure hydrolyse bij verhoogde druk en temperatuur. Hierbij worden zowel de vitamine-matrix als de vitamine-fosfaatverbindingen

verbro-ken. Hierbij wordt vaak een onderscheid gemaakt tussen dierlijke en

plantaardige producten, zowel wat betreft de zuursterkte (resp.

0,055 N en 0,44 N) als de extractieduur (5 resp. 2 uur).

*

Bij inweeg van 10 g in 100 ml en een injectievolume van 20 ~1.

(11)

-Zowel de enzymatische hydrolyse als de hydrolyse bij verhoogde druk en

temperatuur werden onderzocht, waarbij van de

n

_{6 standaard} zowel de

stabiliteit als het omzettingspercentage bepaald werden. Voor alle

experimenten zijn standaarden van de firma Merck gebruikt (art.nrs.

7523,7524,7526,7527, 7547).

De experimenten zijn meestel op twee niveau's uitgevoerd namelijk 0,05

mg/100 g en 0,10 mg/100 g. Hierbij is een zodanige hoeveelheid stan

-daard in bewerking genomen dat deze hoeveelheid overeenkomt met een

monster van dit gehalte bij een inweeg van 10 g in 100 ml.

4.1 Zure- en enzymatische hydrolyse.

4 .1.1 Standaardstabiliteit na zut·e hydrolyse

Voor chromatografische condities zie hoofdstuk 3.2.6.

Het mengsel van standaarden werd opgelost in 50 ml 0,2 N zwavelzuur

en verwarmd in een kokend waterbad gedurende een bepaalde tijd. Analy

-ses werden in enkelvoud uitgevoerd.

niveau: 0,05 mg/100 g. Hydrolysetijd (min) 15 60 90 Recovery (%) PH PL 100 100 100 102 100 102 niveau: 0,10 mg/100 g, in enkelvoud Hydrolysetijd Recovery (%) (min) PH PL 15 102 102 60 100 100 90 100 100 PN 99 100 100 PN lOl 99 99

De zure hydrolyse bij circa 100°C, die voorafgaat aan de enzymatische

hydrolyse, kan tenminste gedurende 90 minuten worden toegepast.

(12)

-4.1.2 Omzetting na enzymatische hydrolyse

Nagegaan is welke hydrolysetijd en welke enzymconcentratie nodig zijn

om PNP respectievelijk PLP om te zetten in PH respectievelijk PL bij

een temperatuur van 45°C. Hierbij is gekeken naar de vorming van PN en PL. Heting van de afname van PHP ,.,as niet mogelijk vanwege een

storende component in het chromatogram, meting van PLP lo~as niet

moge-lijk gezien de geringe respons van PLP.

Voor de chromatografische condities zie hoofdstuk 3.2.6. Aan stan-daard, opgelost in 50 ml 0,2 N zwavelzuur, wordt 10 ml 2,5 N natrium

-acetaat toegevoegd de pH is dan 4,5, hierbij wordt 2,5 respectievelijk

5 ml enzym, opgelost in water (20 g per 100 ml), gepipetteerd (enzym:

Clara-Diastase Fluka 27540). De experimenten werden in enkelvoud

uitgevoerd. enzymconcentratie Vorming (%) 015 s/60 ml PL PH niveau ms/100 _s 0₂05 0110 0105

o

₂10 hydrolysetijd (min) 20 85 83 47 47 40 85 88 68 65 60 91 86 76 67 120 90 89 84 84 enzymconcentratie Vorming (%) 1

₈

;6o ml PL PM

niveau ms/100

₈

0105 0210 0&05 0110

hydrolysetijd (min)

20 94 89 66 69

'•O 88 91 88 82

60 91 87 88 91

120 92 88 94 94

liet blijkt dat, voor wat PL betreft, na 120 minuten hydrolyseren circa

90% gevormd is, dit geldt voor beide enzymniveau's. Bij PM is na 120

minuten hydrolyseren, bij de hogere enzymconcentratie, circa 94% gevormd.

8534.9 - 10

(13)

Deze niet volledige omzettingen kunnen verklaard worden door het feit dat zowel de PLP- als de PMP-standaard niet zuiver, dus geen 100%, zijn. Zo bevat de PLP-standaard volgens de declaratie, al 6 tot 9% water.

Er ~wrdt geen noemenswaardig verschil gevonden tussen de twee niveau' s respectievelijk 0,05 mg/100 g en 0,10 mg/100 g. Een hydrolysetijd van

minimaal 120 min is vereist bij een enzymconcentratie van 1 g/60 ml.

Na afronding van dit onderzoek bleek ons dat de fabrikant van

Ciara-Diastase (Fluka) onlangs gestopt is met de produktie van dit

enzym-mengsel. Als mogelijk alternatief kan dienen Hylase 100 (7).

4.2 Zure hydrolyse bij verhoogde druk en temperatuur (autoclaaf).

4.2.1 Standaardstabiliteit na autoclaaf

Een mengsel van PM, PL en PN, opgelost in zwavelzuur met wisselende

normaliteit, werd gehydrolyseerd gedurende 2 uur en 5 uur, temperatuur

121°C. Voor chromatografie zie hoofdstuk 3.2.6.

De experimenten werden in enkelvoud uitgevoerd.

Hydrolysetijd: 2 uur. -niveau: 0,1 mg per 100 g, enkelvoud. normaliteit Recovery (%) zwavelzuur PL PN PH 1, 8 92 97 98 0,9 97 97 96 0,45 98 98 98 0,225 96 96 98 0,056 98 102 103 - niveau: 0,05 mg per 100 g, enkelvoud.

normaliteit Recovery (%)

zwavelzuur PL PN PH 1,8 94 96 93 0,9 93 97 96 0,45 98 99 101 0,225 100 99 101 0,056 100 102 100 8534.10 - 11

(14)

-Hydrolysetijd: 5 uur.

- niveau: 0,1 mg per 100 g.

normaliteit Recovery (%)

zwavelzuur PL PN PH 1 ,8 93 98 99 0,9 100 104 105 0,45 98 100 98 0,225 96 104 98 0,056 98 95 96 - niveau: 0,05 mg per 100 g. normalitelt Recovery (%) Z\oTavelzuur PL PN PH 1,8 97 94 93 0,9 90 93 91 0,45 94 95 91 0,225 9ll 100 96 0,056 93 90 90

Als conclusie kan getrokken worden dat de stabiliteit van de vitameren

enigszins ongunstig b~invloed wordt door hoge zuurconcentraties. Bij

de onderzochte condities van tijd en temperatuur blijkt 0,45 N

a

₂

so

₄

een veilige grens.

4.2.2 Omzetting na autoclaaf

Nagegaan is welke hydrolysetijd en welke zuurconcentratie nodig zijn om PMP respectievelijk PLP volledig om te zetten in PM respectievelijk PL; temperatuur 120°C, overdruk 1,05 atm.

Voor chromatografie zie hoofdstuk 3.2.6.

(15)

-Hydrolysetijd: 2 uur.

- niveau 0,1 mg per 100 g.

normaliteit Vorming

(

%

)

piekhoogte

zwavelzuur PL PH PMP gem. gem. 1,8 82 82 48 48 0,9 83 88 88 86,3 47 48 47 47,3 S,3 0 ,4S 86 90 90 88,7 S6 S9 S9 S8,0 S,7 0,22S 84 94 94 90,7 68 73 73 71,3 4,2 0,112 93 92 92 ,S 78 78 78,0 2,9 O,OS6 90 90 84 84 - niveau O,OS mg per 100 g, enkelvoud. 1, 8 0,9 93 91 81 88,3

ss

so

L1l _'•8,₇ 2,S 0,45 88 92 90 90,0 57 65 65 62,3 2,9 0,225 100 85 84 89.7 77 69 69 71,7 2,2

o

,

112 84 84 84,0 77 77 77

,o

1, 5 0,056 104 104 80 80

-

.

·

kwantificeren niet mogelijk. Hydrolysetijd: 5 uur. - niveau 0,1 mg per 100 g. normaliteit Vorming

(

%

)

rest PHP zwavelzuur PL P~1 (%) gem. gem. 1,8 0,9 90 89 88 89,0 81 76 74 77

,o

11 0,45 96 89 92 92,3 92 80 86 86,0 9 0,225 92 92 95 93,0 92 89 92 91,0 6 O,OS6 90 99 99 96,0 85 96 97 92,7 8534.12 - 13

(16)

-~ niveau 0,05 mg per 100 g.

normaliteit Vorming (%) piekhoogte

zwavelzuur PL PN P~fP gem. gem. 1,8 x x 0,9 x 89 87 88,0 x 80 76 78,0 7 0,45 x 94 93 93,5 x 95 99 97,0 7 0,225 92 95 97 94) 7 86 93 95 91,3 7 0,056 90 96 96 94,0 84 94 95 91,0

- : kwantificeren niet mogelijk.

x: niet geanalyseerd.

Evenals bij de enzymatische hydrolyse blijkt dat Pt-fP minder makkelijk wordt omgezet. Rekening houdend met de onzuiverheid van PHP en PLP

wijzen percentages

>

90% op een volledige omzetting. Een hydrolysetijd

van 2 uur blijkt voor wat betreft de omzetting van Pt-fP bij alle onder-zochte zuurconcentraties te kort te zijn. Duidelijk is dat naarmate de zuurconcentratie toeneemt de omzetting afneemt. t-feting van Pt-fP (waar mogelijk) toont aan dat afbraak van de gefosforyleerde vitameren onwaarschijnlijk is. Afbraak van de vrije vitamere•t kon eveneens

nauwelijks vastgesteld worden (zie 4.2.1), zodat de lage omzetting bij

hoge zuurconcentraties niet verklaard kan worden door instabiliteit van de vitamerenv

Voor een volledige hydrolyse van de gefosforyleerde vitamcr.eu is autoclaveren gedurende 5 h bij zuurconcentraties

<

0.225 N H2S04

noodzakelijk.

5. Conclusies fh.!.o!!a.!,o,&r.!!,fg

- Reversed phase HPLC biedt goede mogelijkheden voor de scheiding van PL, PN en PH. Het gebruik van een fosfaatbuffer (pH

=

2,6) als mobiele fase blijkt minder geschikt vanwege de geringe retentie van PH (k' < 0.5) en de slechte piekvorm van de vitameren bij de meeste kolomtypes.

(17)

-- Ion-pair chromatografie met behulp van heptaansulfonaat ondervangt bovengenoemde problemen. Door varleren van de bufferconcentratie, de concentratie tegenion en de volumefraktie 2-propanol kan de retentie van PN, PH en PL be'invloed worden, hetgeen resulteert in een flexi-bel chromatografisch systeem.

Extractie

--- Bij gebruik van het enzymmengsel Ciara-Diastase is de omzetting van

PLP en PHP na 2 uur kwantitatief.

- De hydrolyse van PLP en P~W bij verhoogde temperatuur en druk (autoclaaf 121°C) is pas na 5 uur volledig bij zuurconcentraties

<

0.225 N H2S04. Onder deze condities zijn PL, PN en PM stabiel. De

hydrolyse wordt geremd door toenemende zuurconcentraties.

Literatuur

1. RIKILT-rapport 83.77, literatuuroverzicht analysemethoden voor

vitamine B6 in voedingsmiddelen.

2. lol.J. O'Reilly, P.J.M. Guelen, M.J.A. Hoes, E. van der Kleijn: J. Chromatogr., ~ (1980) 492.

3. A.K. lolilliams,

P.o.

Cole: J. Agric. Food Chem.,

Q

(1975) 915. 4. Honlitz, lol.: Official Hethods of Analysis of the Association of

Official Analytica! Chemist 43.159 pag. 849, 12e ed., Washington 1975.

5. Intern analysevoorschrift nr. A 111. 6. Intern analysevoorschrift nr. A 112.

7. D.E. HacBride, J. Food Sci., ~ (1983) 748.

(18)

(19)

-~ :l - - -è)

--==::..:

-==-

-=-

,...

~

- -:-:::::::- --

- -

-

-- -

=-=- - -

=

= --- -

=--=

-,-

-

---

---=

---- ----!- - - -1- - - -- -- -- -- -- - - -- - - -r-- - - ·- - - - · --

--

-

- -

- ....

- - - -

- -

- - -- - -

-

- -

-- -- -- -- -- --

- - ---·~ -

- -

- - ·- - -

- - - -

----

-

~iMJ.~~ -~"PI#j.~/l;;:-kf11J=---- =n..- - _ -• _ I n ~-- -~~~---rr----1----r -- --~---

-- I- - -1

-- --

-==

-

--==

-- - 1---- --t ·

--

-- --1 - --t-

-- --

---

-~--+---;----1---t - - - -- r... ~.l ~~-~ 7.l1. c.6-=zpx.~ ~---~---~ 1- 1 - - -- - - -=-~---1----4-==---+--- - I- - -- --=:f-..tutll.~'--;~ ~-

-

===

--=-

=!=

==

-:_-_-_--1_==--=---1-- -f---· ·- 1----LJ -- - _ ,- - --- -t - - -·-~_:-__ -_-_-_ _j-::::::::~~-~~=j===

- --==-

-=,---J'l~ ~rt~al~

-_

-__

__

-==-

-

--=

- - -+- - 1 -- -t ---1---4~-~~-~-4 ~- r---- - 15

--

~,

l,.töJ<.)p--.!-!1'- - _ - -- - -I-

--~~

îê

~

f

~~

g

~§

=~

i

~~f=~

- - ~- - -- -r--- - !---- !---- !---- ~~~--- --~- ~

-=--=--

_~-.

-~---

_

--

1 -_-_-_

--t

==-=

- -- - -

-ft#--<-

_

~~

1 -

~~~

----

~

r--

~

-=--= ~-

--

1-

-

-t-

-

1

-- - -· -- ·- r--- - - -- ---1-- --1· ---+--~ l"i" · - - - --- : l _;" -7 -~ -F-~

"

- --+---+- --l· ---+---+---+--1---/-_ - - - =l~t=~~=:t:,_t=\--=t===t===t==l - 1- - -__ --1-::::._-::::._~--:._-'-

_ - -

V

_

,

_

-

-.r--~--f\-

_--=

.=.._

'

--=;

_

-

-~~~~-=~~---~----~-

-

k\

----~-

--

1

r · - - - -~ -- ---1---- _-_-_,i-f-_-_-_-_·-+-+-_-_-_--4-4 ---~--f+ ---~-./,-_/ __ - - - • -j

===

=--

==

~

;

-=

f=="

-_ - -

=--==t==t=t===l:==~f't--== - --l- --1--- ::>

- -

1 ---7

- _ _ _

,

_ - - -

-

- _~,

- - -

:h

- -

-

\

- -

r-.

--_

,.

~----+---4f---~---~L--~---I---+--+---+--~----4t~---~~·-+----l

~I

-_- -- 1-- -_-_

+

,

_

-

1 ~

-

._L

~-f

-

~

_::::::

__ ,. __

=

=----

r

-

:

~

-

~~

--

~

~----

-

~

=

~

= E _-- - _ _

-

i-=-

f

---f

=-:::-

- -

-

~-

~

-

- -- - jC - - -:

~

~=

~ - - __:_ -~ ·- __ -+~---~---__ +-.._-·- - - -t- - - 1r---_

3'

--

-t---~-1>1) r--

-

I

1·-a==t~:::-.:

__

---=::::t===t=_-\~'--

-

---

"---;;/--

--

~ -

-·-· ---;-1 -::--r--:= · - - i-- - - -1---'-T"'---t - I- - ·- t - --· - -____.x=- . -

--- --- - - - · - - -

-- - -__:__--== -_-_-_-~--- --=---t==t=~~---.<._~ë' 1- - - --

--r=-

-

1--==

=--

-

- -

---

-

-:

i:§

=-

-

--=---

-=-

-

---

-=....::.---

-

---~--===:::-·!-- - ---·-- ~--- --- - -- - · - - - -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- - - - --N- ---- - - - ___ ,_ - - - -- - - L"'>- -- - - - -- - ,

-=

-

:. -

--

(20)

-~

-

~-~~

~

--f . - i___::.(]

!J/f-

-

-UV

~

=

~

-

~

!--èj_ _ ·-~---- 1~-"!!!1 - t- - - ---...,.._ - - - ...

-

-=-=- -

~Z-~"!)

_

----~-·-

-~

~---- 1- - 1 -- -~ 7~ - - - -- f---=· -:-==t==~===t===l===t' r--- ,_"""- --

--

-

r

~

--___D~ - - - -- - - -- - - \ 10 ...o-__ __ - -- - -- - -\LO _ o __ - - --t

==-

- - -1-

-

--

-

--

-

- - - -- --+-+-t--- - t- --t--\1- - - -+-- -+-I - - - -- - -- - -

-=

=

+-

---

-

- -

=~=---

-

\

-

---

-

-- - - - --+----!1- - -+- - - + -- - l- ----l---1.--t•- - - f--t--~--+---~---t--~+--~--~--1---t - - - - 1 --- - -

-!- - - -

-

--- -."<f'

"<t\

I

t

=

==

=

4 ===

=~

==

=

~

====

~

===

t

===--_

+----l

-_-

~

--

~--+

----

1

1 -

~~

-

1-

---·

===

-

--

·-....:--_-_-_-J-__ -_-::_-_'i---~-~-11-==-=.=i~

-==-

-~

==-...:::-

---

-

-~- ~9-.___ 1--

--

-

--

--=

==

=

.t--- ---"1- -1- - -+- -/--1- -- +---+- - ---1--- -r -_-_-

-=

=-

---

-1-

-

--1

'i-- - - -- -

-

~

---~ - - - /- - - -1 - -- - - --~~ - -~- _ _.::_ -~-=- o · \-=-!i ~ --t---~---+----+//---+---~t---t---+----+----+---~·----1-~~~-~--~~ -_

___{'

~

-

- - jr--

-

~-

- - -- - -

I

~

§

~

-

~

-

~

=::

J

· -

-

-=--

...

-

~

- - --

-

=

r=--=

-~

-==

-==---

-\

~

J - -

==

r-

- ---

-

\

-

.

--=:;;

:::

/

.

-

+

-

-==t===t:==t==~,=~~it:l ~ -'-7 -- - - ~--

-=;;,I

-

1- - o-1----t"-~j --- --+---t----+----l---_"~_ ----L. ~ L ,71_ ...r;:t. >~'- :> ..u --r r A -~"--lt---.-::>...-lt---t-- ~t-- ~t--1-- -+--- - - - -- - - -· --1-- - - '=---- - -- ---- - -~--- -- -- -- - -- - - - -- - -

-

-- - - -- - - -- - - - -- - --t-- -- - i - - ..-: _ _ .- -

---:-=

=- -- --- --

·= - - - - -~~§§~! - --t- --1-- -- l--- - - ~:__ - - - -1 -- - -- - - -- - - -- - -

-

- - - -

---

-~--+---!---- ----t---1~ - - - - ·- - -- - - - f ---N- - - - -- - -

- - -

- - - ·---;;:;;--·~ - - - - ---t- - _ ---Ir--- -- --_{- -}- _-- - ~ , -

--

-

- -

-

--

-.

--=-.,

-

-=-

----

-:=..=

(21)

-·-- -·-- -·--_- _- - - - _{- - -} _~_5{--"l_- _"' - _{- -} _{- -} _{- - -} _- _{- - - -}₁_{- -}_--1 1--~--=-

--- _-

---

--=- ----

---=- -

==

~-~-

-

====

·-

=---~

- -

- - - - 1-- 1-- - - 1- - - --- - - -1- - - ---~ - -1 -;:-·- - · - --;- f--- - - -- - -/1. ___:;;_ /- ---tr- --- -- rrJ-U-~ _,.-, ---!../- --,-, 1- ----J- - + - - -1- -

l l

--

-

- - - -

--

_--

-

-~ --~ 1- - -1 ·- - ~----=--=1~==1===1=

=::-

l~---

-

...;;:1

7 - -- _ -- - -+_-__ - -1- - - - - --~~----1·_-_-_-l_--_--1-==~---

-

---

-- ~~ ~,r.;- _-::&x,~=.J1f..j,~-- - -~-- - -

-=-

=

-

·-=

- - - - 1-_ 1-_ 1-_ 1-_ - - - ,_ - - - -

l---====---=1

---~+;-.-

(")

·-

-~ --=-

'--

---==-

__

--

- ..

-- --

c-· --~ -/ ~ - - - 1 - ·-- ~f

-

----

1--- --1 -1---

-~-==

~

-- =

-

--~=-=-=-:~

r

---:.~ ~---

--\--===

-===--~----~---=-/-- ~-=

---

-- ' -- - - - --+---1 - - - - -/- - - ---- -o- - \-:- ---- : ,_ - - - '- - --~----:. -- - 1

--

7

~ I --. ----,

- -

-

~ ~

-

--

-

- - -

- ~--~-. :-:j

----

-

---=

-

*

=::_=: -

~

~~

=

~

-=--

=

--=--

\

-

~

-

=--

.::

-

~

--

~

-

-~

-

I

~

--

---:-

--

~--

~

~-

-=

~

=!

'

-

~

-

_.--...".::::-/ L.___ _,_- _-_{- -}. .

-== ---.

~

_1-- _- _{- - -}

~

_- ~

~

--

_-.:c

1--==

_{- - -}

=lf=

_{t -}_{- -}

==t==

_--t_{- -}_--1-

~

===t=s:=

_{- - 1 - '}

±

=

.-

;;:

.._.,V

- - - -

-

--::--·-

-

~

-

--

~

-

~

J - --~;/===

"

"-

---=~----

---

-

--

-

-f---1 ~ - - - -~ --1--- +-- -1- - --==::t===t==t==-+--~-

-

- -

- - - -- - - --

---

-1 -- - -t -- - - .... --- - , .--:--- - - .- - - - -1--- -1--- - - - -- - - _ , - - ~- 1 -- - - -- - - -f -·- - - -~=--

--

--- --- ---

-

----

-

- - - -

_

-

- = - - - -

- -

~

--- - - -- - - - _ _ _ _ ___, - - _...-- _ _, _- _- -- _- ---N

_-

- - -

- - - -

_{- -}

1

--~

-=--

_::_:

=---

=----=--

....=.:...~ -·- _::-

-

- - -

-

- -

-

-==---=--=--=-

~

-

- --- -=--=--~--- - - -.:=.... .=--- _. -=, _--'

.

i I : : I : _: I

(22)

J..

f"

'-' -

~--~

-=

1-

- -

-(5 --... y-

_{- -}

_..,

--

1-- -

--

_-

_--_{f -}

-1- -- 1

-~~

~

--

-

_--

_{- -}

t -.'~

- -

- - -

----

--

- _{· -}

-

- -

t -r~ I - 1- --

- -

-i"'\ -;;::;;-

-1"1\

~

I -_ ---'»

-

_FIJ-If~

~

~-

'(u-m-

LL.

~

~~

Lq~

lu:j..!!:_

'

f-.

--.

-

I ~-(;;# _~OTJ "-M-- VI!T, f -' I

-J

--

--~ff-1.:. .:11..1. _{- l}_{-Ilt(. '/~}

- -

-~f

,..,

- -

_{- -}

....,... f---__Q)

"'

.-...J:O_

-

~ Ll

-,

-- '..!'Y ~ -l ·-

-

' 1- -

--

-I

--

-

-1\ -..,

--

- -

-I

J _~

-#I

.k. _r~_-_U;t

_{- -}

1---' / I I'X.. )Lf -_ -_ b -_ .A,...,.

--

- -

1- - -~ 1

--

_-

_{- -}

_{- - · - -} _- _--_ _.,j _lf'K-~p..n.~

_-

_{- - - -} _- _-_{- · -}

_---

_{- - -}

_-

_{- -}

_-

_{- -}

_- _-_- -- --

- -

_---

-

- - - - -

_{- -}

- -

· -

- -

- . -

- -

-~~

~---~- -

-- - -

- - - -

- -

-

I

-~±= 1-

- - -

- - I -

- -

- ~

- -

- - -

-

_~--- - - -f -

--

-

- - -

-

- -

----

- - -

_{- -}

- -

--

1-- - -

---

- - -

- -

₍

-~ 1--7'f -;-." -1- j , -TA. ~ - ·- 1.0 ' I - -

-

--

.'I

,

~

l.Wd

-::

'~

_~~~---

- - -

-f-/-J'V

3 -

1-· - · -1- -·- - -, -- - '- - -

- -

_{- -}

_----

f --

-

---

- -

- - - f--- ----1 ,_

- - -

-

1- 1----

- -

f - - "' --

_--

--1-- -:~

-

-'"'i

- i-- i-- -i-- _.m. f-D -_~ . - -

--

·--- _- '=u)'- _ o __

-~ 'T"\_- -- - -

- -

-/

3 ~

~- ·

---

1--· · - _-

-

- -

· - -

1-

-

1 -

-

\

~

-/

-

'\ _ 1-

-

--

-

_=::j f--.--

_{- -}

- -

-

.::.:::----;-

- -

-4 - -·

--

7 -

~-- -\r· - - - -~- - - · - -- -- - _- _{- -}

_-

--l - _n

-

· -

-

- -

- - -- · -_1-_{" "}_- -

--

i

--I

-

~

-1

/-I~

·- - ·

-~

·-

-

1

--

/

--

- -

· -

_-

-

- -- - ·--

--f - - - -- -- - L -- - _-

--/ - -

- -

-

-~ - -- -

- -

/

--o

--

-

- -

- - - -

- -

-

--

-

n- -

-

7 -

-

~

+

- -

- - - c--~

--:s:: -- --

-/

-

- ·- --

-

\

--

- -

-~

_:_

-

-=F

- · -

- -

i----\

-

--

--~ -~

· --

---- - -

z

-

--

- - - - -

- -;- 1-

-~

~

-~

--

I

_1\

r- -t--;.- -

-

- -

-~

~---=-- 'i -1 _-_" /

--

-

-~-

_--

_\

-.

--

-~~~oP- 1 -~ ' '

1\

-

~

r-

.

I

_-

-

_--

-

_-

1--~~

-- - - -- _- - - -

- -

- _""i. _-₁₁-- - - -- - -

--

-

1"'-.

-

--

,

-

1 --F---'

"

-

-/

-

--

....:c - -!- -

...

- -

_1--_-

- -

₁ -- -- --- - --· - - -

- - -

- - - -1- -

- -

· -

_{- - -}

- - -_-

_{- -}

₁_-

_{- -}

_{- - -}

_-

1---

--,.-

- -

· ·

---

t---- - ··-- - - -1 -- _-_--r-._- 1-:-:::: _- _·_-

_--

-

_{- -}

-- -- -- --

--- - -

-

- -

_~

_{- -}

- I-

-

--

----

- - - -

1-- - - -

- -

-

e-. -- -

- -

----~ - - -

--

_{- -}

_--

_-

_{- - -}

_{- -}

_- :a_N-_-

--

-

_--=-~

---- --

- -

f -

- -

· - - -- -- --

- -

- - - - -

-

....

-

- -

--

- I _-::;,: -

- - - - -

-

--

-

- -

- I

I

___

.l

- -

- - -

-

- -

- - - -

--

--, --

--

-

- - - ---- - -

-

- ·

-- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --

- - ~

-

- -

-·--

_- _--·-=:> - - - -

-

--

-

-- -- -- -- -- -- --

---

- - - -

- - -

_-

=---=--~ -

-

- · -- -

- - -

- -

-: ' i : • . _: I

.

; : _:

.

_'

,

(23)

:JS

-

--r~z-~, - 1- 1- .... 10 _ ~

-=;r;

-

l

k.A

~.

n--;.

--I-~'- ~ q) - - - ' - 1 - - - -

-~

-~~~

~

-<

1

_~l

_!!ii

_-

_~~~

_-

_~

_-

_~~~

_~

_~-

71

_~

_{_:tf}

_--

_ll

_{-_}

_V:9.l"

_-

_~=t,...

_{_}

_-

•J.-

_:_

i_

--

.:;:~

-

_,..ll' - - --l- -1 ---. -1- I ~----::7 --;:; I_____!_ - - · - -- t - - -

-==--

IL7 rl ~-IJ~ ~I

W.z'J

[;ZS

--~-- _.::_::1·- --1:-_-__ -_-__ -_-_ -r-.· 1--1- - ,_ ""' -

h

- ----0) I 14 'I ~-~- ~ _()) ~l-\----l -~ ""' . ,~ ,, 1--'- 1- - - 1- /--i--\ - - -1- - - 1 -

---

,

_

'

~,-=-;__:_:_ -~

· -

-

/

---'-

-\

- - - -

- - -f -- 1- ~ILJ J/ .Jl rM,I' I~Pl J. .,; j____l_ 1---- - - -,~ ''7~ -" ~-- \ - - - - -1- :. --t--... - -- 1- - - __ , __ -\- -

==

=l=

=

")

=t=

=

=l

:~

==-

~

.

~

=~==:J==

+==

-- -

-11

J

-

a:-z

ç I- - -• .-:----\ __w - 1 -- --1_t::_j)- J . • r~,... ~ ~ __ _ _____ _ - - - -- - ----~ -.1,-J':H ~-_:-1-

-===

===~--

-.::___ -_ - ·- -·- ---

,

_ _

_

- - - r - - - - 1 - - - 1 - - --

_.

-

--- --- ·--~ 71 ~+-# ... 1-'1 -\- -- J's.. - ' - 1

---

-

-~

~

--

~

-

1 -

!

-r=-

---=-=--

~

j

-~ ---

-=

--=-

~

-

__

-

--- --- 1--- _ _ __::_ !f~ [~~ '- - -- - - 1--- - - f - - _, - - --+--- - - ·---~----1-- --- - ,_ ~-- - r=-/ - -1- . , -- -- - - -1- - ' - - - - --J +---~~~~~~~- ~ --- ---

- -

~-'

,

...

,1~ 1 1- - - - -1- - 1- ""?'\' _ __{()_ - -1- en ---~---1----~ '-~--+---4-~-~---4 ---- 1- ~ -- - ~- -~---1-1----,1--1_1---- 1

--

-

-==~--1---=\1-f - - - - f - - f - - - . \

--

1 -

b

-1 - - 1 - - - 1- 1- - - . - - -

----

1=\

--

~- -1 - - - 1 - - - l l ) - ... ~ - (""j- 1 -j~ 1 -- =m·

~

o

=

_

J

=

=f

- -1 -· -

-====l--=

----

-

~~

--

~~

;_1

==1---

-

\

-

_ f - -- -- - - i -- i - · - -

~

-

~

-

r

-~=~

~

~~~

l

~

§

~~

f-

~

§~~

-L-'- · \ - - - -~

-r

-~-

r

~

l'"\

~~

--

~

~~~~

~

-

rr~

-

r

~

-~

L

-:-~-

~

:

=

~

--1

~

-t-

~{~~~

--

~

-~~

të

~~--=~-

t

~---~

1~

-

\

~~

---

~

~-~~-

~

-~-

7"\~

-

~

-

r

-~

~

--~~

-

-~-~

~~-

-\

~

-

r~

· ~

~~

i~

-

=-

1 -=

-

--=~- - -+1- --\lo I - - - ---+-~-- ~\- __ 1'--·--.r f--:-_-+f----_-li==\-_Jr---1 ---~ ~ ,__ .. f- ----~-~ ( " " ' )' - -~- - ! - \ '- b - - -\ -'-~) I I 1 - l--==-4~ ~ r'-· --,.§ :---, - - I - ~- - - -1---:_- - - - --\- ~ ~- - - - f- - --\~ -

--

,...~

--

~7

==-

'

==

..:==-~-= --=--~-~

-=]_

~

-'

-

~

-===-

-===

1 ~

f'

- -- -1-- ---IIIL--/- -1 - -

~

:J

~

-n7/.._ _ _ _ - - - - -- -

~

-\ = -oq 1 .--' 7

=

F

=

=l

=:.=

==+

==-

=-=t

-=-=-

=

i

~

-=--=-=

i

=-=-=

-=

i

==

=t::::t

==1~i.=

-

:;;J

..

~

- -

:::s ---jf - - - - 1- - -- - · - - - --1 - - \ - -

--+---1---1---1

-

~----+---1

-~g--~m

_=t==

~~~

_.

.,..,~-h J

-

I

== ---

-

~

--===

r-

~

==

~

---=

_-_·

-

--==

-

-=

-=-

~

'=

:-

~f--

-==~---

--- - - -

- - - -

--~ - - - f--· -1- - - -- - - f -- - 1- - - •· - - - I~ -- . - 1--- - - -1 - -~

-- --

-

-- --f --

_...:=-:

--=-=~-- -

==----=:=- -

--=-

_{- - -}

-

-- --

_{- - -} _{· - -}

-

_-_-;;...._-

-

_{- -}

-

_- _- _{- -} - -- -- - N

-- -- --=

--==--=--

-=-:-=- - -

--

- -

--

-

=-

--=--=-

~ ~

-

- --~-- -- ---

-- -- -- -- --

- · - -

-

-- - - ____J

-I ; :

:

: ; I I

(24)

~ I i

(25)

I ' '~

....

\ ,C:l>

.

._ .c:>

Êf illt:;t::±:r

~tEa

re

TI=E= ·~ 1 t~ ;~

r.-n:

!~

m

..

~ f+H f++ ~~i;

fttf

~i i ~~* 1

l

n~

H!!

t~ I~:Jt:::tt:i :"t~ ~

'E

!tt!::;:ft!;:::rt

l!H

±! B l& n~ !'--,----,-~m S=ä ;i

$!

t~~ ~ ~ In -rr iirt~ ~ :rj lf!ll~IF,:y ltt: jj ft±~

!fi@:

u

1 1!!1

11 ti ;Ii;;::;:t;:~~~~~t:! tl!tf:!::r::::_Jt: ~~~

:mm

I!J.f ;J ±:;:± ll:+::~1t :I

s:::li8

1 1f

.

:~r ~; lt llt: 1fî

f++T

-::U

·tt IJT.l:!:~ffi~)!'

I

J#

~til~ ::rT!ffi~

Wie!

:~t

te~ :;~ --->+ -- :~~ +-- :~

M

ntt~\ ~!

o"

!~~ .,~t!!

:n

5 ~~ge~= l7~f

~

ni

~

qm

$

1

g

~ ~~ ~·· .. ~ ~.1~~~ ·-~.$~ JiT~ ~

~~~~~~ il!~~~;~.~ \:±rp ~s!~~ ~·mlru ~;!

~-·-~~~~~~i;ls~~*i ":!!~ '~ill~~: ,,, ~

:~c++ r+ ~ -- -TI-- t]i ~±! - - ~ tj~

il\

:

trES!

!i

:pc:::

~f..-1-,-L-' ~1--4--# cl--~· t·~~~~ r-~~ ~+~~$~:n :~~~=~l~:i ·t-:-c+-"T . Jl!l':t:!:::r! FE!f! . !l' - ï:;:;=-r·

0

+;-;+-..J"- -+.... .o: --r· . .,. '·.,..---+ Z:;::;:!:Ji i ~ l :r..:.

(26)

:!:::;:~ "!:!i . '-'++ ~ I·· Pi ;:~ ~î~T.!.l til~~~lit~~l~ l~iî' I ::;.I '.' ·.'~' :t ·~ j" li ~ t:tt

±

l

.f!

itft{f~ ~~~ l;::~c

l

i{$

· -rg ',...,.

8

A4 210x297 mm ~ +\·+ ' tr' 11 I ï~

l

U

~ :=. I t;~ ,,;~ \_ti if "~ ti i ~Jif fT:\.'++++ lL .. +;:; ;~'

f

~

T I I+

l

iJl

·-iP -J4 :i!"

ia

'

-'-:T

'

;~

~

H

~i=

~

' ~

i-- Ht I !i: -.

~

~~

±:'"

00

MADE IN GERMANY

(27)

(28)

r_{1-.:l_}•

".r,

(t-.._.... o

8

A4 210x297 mm ~

(29)

I~ i! ~ ~ ~lP lt!:;: _~.,.,t± !~:C:~ P+ 1'-lli:

~J

±.I+= ~·~ ~jii~ ~~~

n

i

lt 1:1: I~ I~

I

r

:tt =lil !ti

IÎ!tiEI

1

_ü

_mi_l:t:;::c it ;::.-:!:;:+i: :.~ j~

rm!

mï

(30)

_.__L_' . I l . . I . .

H

' ..

Ij _ . -

H+-r-

htii.J...J_

1 ., I I

L.!...++J

.

...:_i_.:~~l-L..: .... iT ...

:

I

:

.l.! .

!

V

11 .

~

i I' I . : i, ; ! : ; I : . •

i~

l

I

~

T

-~

·

i '

!

H ' .,-1 - LJ::, )N>u_l'

~

-1

1: : :. ; ; i :

! ·

,

i ,; I

I

'

:

! . : ! ~ • . ~ : 'I I . I . . I I l I I : l l l I ( . I I ... I : ,., . . . • I : : . : :, !.

I

'

,

.

'

j I • I 1 ! ~ :. : : : : 1 1 ' • I :.

I

'I •. 1•1 _: _'_._·_.

··.±'

,

₁_I_' _• _I _; _• _: _I_'_I_. _I _I _._. _! ( "; . . • ; : ' ,: I I I . i I I I . i : I I . ' .' ' I ·. I . . .' I ' I : -: - .· 1 _- _· _• _, 1 : • • • • • , : , • :...L._1 ~ • .: • -++~· ;=-j'...,-t--+-7-rH--'-'--t----+-;--r.-:--₇ ~f---'--~-:--•-1 I ; ~ ' : : . I : I : I

I

' .

:

.

~ I : :-;--: ~ I ; • •

!

:

I

I .,

'

f!lF-'-

'

1 · .

i I

I

~ ! ; -~) . I . : I : : ; : I

I

: : '

:

I I. ', ! . ~ .

I

.

. :

:

j i : : : : . I

I

· ,

.

;

:

i

I

,.

!

Î i ' I i . ., I : • 11 !

i

!

I I i

1 :

!

~ ~ I I : : ! 11

i

I l

i

I . ! : i :

i

i : : , , ! , , , 1 . , 1, , : ; l ' l ' l ' i l ' , , l~ · i't~ ·I ' J! : I ,; . . ,J. ,I . •I , , • I I : - . : . ! : ! . . . . ! I I ! I I ; : ' . : I I ' I I -I. i : I I .... ' ! I ' ·A-'- I I I I ; ! I i I I ' . JL.l.... _; _. ' . , I ' . . . . . - I~' 'I I I : . : . I ! ' : ' ""T""fTTI I 11 I I ' .I i I ! b · I I ' I ; •

I

:

I I 11 ' : I i ,. I . I • : • • j r - . I I . I I l i I I ~

I

....

.

I : ...). I I • • I . I • • I

I

.

'

I . / ~ I . . I . I - ' . . i I I I I I I I~· I ~1 . I I ' ' ' I ' ' . I .

-i'

·'

(

.

I

l t • jl;, ,i·! -1 :: I .•

'l

li

i: ' 111. li ;ljJ,,-1 ,ty.. jilf ·;, ,; ': 1!1-' i ,:!· ; ' ~I ! - . . ' ' ! ! ! : ~ : ; : : . : ~ -W-+L ' i I -~ CL . l-: I i 'v-' . ! : ~

r-

:

i ~....L c.l .. I • ~-· ~

: I : i

t

l

-

I

:

;

.

:

!

::

I : : I

I

i

I ;

r:

'

i :

r ti,

! .

!

I

: :

l : I 111

~'i1j

!li

f

i

i : : ! . :

'!

'

I

i : ! il

I

: :.

'

.

I ;

::

, :

i I

'

+

. .

. ;

i

.

..

.

:

.

'

,

; :

.

. :

' I I

:

! : : ' 11

i

:

! :.I I i ll! I

i

l

i

j':

I

b-1

i ·, I . I:

i

i :I: : I. I I i . I' ' I . . ~ . .

:

~

.

i I ~-; .. ~ . ·l I : I . i: ! i I I . ; : .. I:

rsrr

·.

,

I ;·,

J

~

· .

-r,~ 1 . . . : . 1 -. : I . • : : , • I ,· 1 :~ I , I i I ~ , I

+:n

i

i ~ , : . : ~ : : · i : - : :

i

!

1 . • . : , ,

:::

1 ·:

:

~

'

,

'

• :

0

!

:

: 1 ' 1 1•:! ;:, Î 0 i

1 ~

:

·

1 1;

!

t i i

1 '

:1

:

',ii:

::

l

·

!i•' :·;j I • , !

_J_j_J__:

:

~

'

I i_l· ! : ' : . : : I I I; i I :' :i I ; i I : ; I

l

~~f--'--"- ., . i ': :' I. ~- . .. :

~

; i' . :- , • . . 1 , :. : : I •

~

i

1 ~

i : i : :

1 ~

:

~

u

:

'

:

1

i

~

,

:

~

:

~

;

:

1, 1 : :

!

i

1 11

~

1 : :

!

: :

:

; ··

1 ' :-1 i ! ,, : : . :.

<

• I I i ; ' ' . I ! ' " . I : ' i i ; i

I .

' ;

'

i I : I !

ll

i

I

'

I I

I

I i

I

i 11 . : : . : . ' ! . : . ' . ;

.

:i

1 : : . 1 ::, . : ·:, ·,:: : .

~

1 -h~

r

-~

~f..

,

'

üJ

i

,

,-~,

i

I

,

i:;

I

..

W:

~__j_J_j_

1 :,

i .

1 -

.

~

I 11 " -~' I • • i:

:

I

'':

',.J:--1 I. i '. I' 11 I '.:!

i'

:

'

I'

I

I I:

I

'

:

I : ·• . . : ' I • • '.I : '! : : ; I

i

:~. 1 1 I : . I ' : ' ' • : .. ,) I i ! : I I : ' : : I '

i

I ! I . ;

i*"

:

I

i

;

'

:

t

'

. ;

i

;

.

i : : ;I :l. . . i

i

. ..., - · i I . / " ~ I .J . . . . I . I I ' • L . I ' • • I . I • • --:f '-rf=""-:f.~---:

..

Q

.

..

.

:

.

,

~

.

-·

~--:--l~'î--,- ~-:-•,t ï__.__,l_'l t:-.,-

I

.

I ~~--.

-

:

-

.

:----:,-~-:: ,-,-~1 i I . I ! I : I : . . I I ' • . I

I

t . I ' . ..J i I I I : . I I I • I I :

d

'

I

'

,j . : ; : : ( ., · 1 , .

o

.

·

i : · ; ,

.CE

: :

1 _I

dv

;

.

:

_!_:_.

c

_~ I 1 ₁ f .

1 P!l

. :

1 1,

1·

i

oL

i : :. • . :

s

:

.

o!J

:

· :

:

o

r

.

u~

_

.

__JI ----. : ' . ! ! : I i • : I . ' ' .L .... j.~tJJ __ I __ . :....U...: .. :_I_;_j__!j_;}_LJ_;_;...1· .!...m' I 1+-+_:~- .. __ ]__· ._;_: t-! . :

!

.

:

.

I ':: l : ~~-, - I : i .. ; ' : '

I

I; i I~ ;

I:

I : .. l

I'

I

!'

I i

l

i!

i

,

.

:

i

i i 11! . :. :

1 1:

:'

i:

1: I . ; :. : :

!:,

'-:-di t • ! • : · · . ' '

:

· >i

'

.

,

.

4-ii : ' I ::,~rl~ ; ·:j :: i: !: j t

:

j

:

.! · ;· ,'

ll,l

.

·:

'

i!iJ

-~- .

:-z:.

t

:

.

m

·

~ ~~ -,/

;

~ ~ ~

.

i. : ;t'~· ;:; , ,;;- : ' fl ·! t '· .: .... ..::..J..._· ~;·:.:.:__

-'--'-

.

_._

--~#-1-t--~

-'--'-

·

· r - !...i...J • Ll...L:...~--t"T"ö·~f--,-[--'-t I --~ ' I ! ' . i ' lv . '

I .

i i ! ' .

I

'

I I . I : .

'I :

i i

I

'

:

: :

I

'

I : l i u·,

I

i I ! :

I'

.

I ; :, : : I ; ' I ; I i I ,. : I : . : ' I i . I! . : .. :· I . : :I i; I 1 :i. i : ! I I.. I ! ! ' I. ; i

i

i l 1 ,. ; i !

I:

I'

'

I. I I I i I.: j

:

I

I . I : ::. I .; ; :I 'i :: ': :. ' I;! ! :: I ; :; : i ' : I: i: I I . . ; I; i 11 1;

I

i

:i ! I ; I :\i '

'j

I; i

1 !

I i

I

! :: '

:

!

! !

.ttt

.

:

· ::

~

1 ::

':

:

8

1

-w.--

-

·

T---;-+₁·

4 -

--

:

7"

-ri-1;

:

.

:

.

1 :,;

·\-T,

₁ -1

· +

;-

îfl!1l:

-~tt

,~i:

· ;

,

;

:!

I_

1

i

l

;

t;-;-

·r

---t-

1• . : . - . . I ; I . ' I ' , , . . . I ' i I i I' . ' I : : ' . . . I:.

I

:

.

,.

I '

I

,

,.

·~· 'I :) . i ! I : . . . I '. ' . '. . : I . ' I I ' .

I .

I I ' I . ' ' I ' ' ' I I I I . i . I . ' ' I . I . ' I; I :I ; . . ; ::

l

'

l

'

.

I;: ; : . I ' . . . : I j : ! I I : I

:

,.i

;

'

I

ll

'

-:-::

I I I' i :I!; I: : ' i ' ' I . I . ' I . ! I ' . I ' . ! . . . ' . . . i I i I . - ' ' . " ' . . . I ! i I I . I I I I : • • i . ' .J...:...LL.:.J . I . . . I .~!-'-~-~