A DDENDUM SAMENVATTING EN CONCLUSIE
hoofdstuk 2 hebben we de hypothese getoetst dat heterogeniteit in de verhouding van
zuurstofaanbod en zuurstofvraag op microcirculatoir niveau tijdens endotoxemie verborgen blijft als alleen de gemiddelde PO2 waarde wordt gemeten. Zoals eerder aangetoond bleef de gemiddelde PO2 vrijwel onveranderd tijdens endotoxemie. Alleen d.m.v. analyse van de distributie van renale zuurstofspanning waren we in staat om het ontstaan van hypoxische microcirculatoire gebieden aan te tonen in de renale cortex van de rat. Deze vinding heeft geleid tot een tweede serie experimenten waarbij de renale bloedflow mechanisch werd gereduceerd tot het niveau zoals die tijdens endotoxemie werd waargenomen. Deze tweede serie experimenten moest antwoord geven op de vraag of de hypoxische microcirculatoire gebieden in de cortex specifiek waren voor endotoxemie en niet alleen een niet-specifiek fenomeen waren t.g.v. reductie van de bloedflow. De significante linksverschuiving in het corticale PO2 histogram in de richting van hypoxie, zoals geobserveerd tijdens endotoxemie, werd niet gezien in dieren waarbij een mechanische reductie van de bloedflow werd bewerkstelligd. In een derde groep dieren bestudeerden we de effecten van vloeistof- resuscitatie op de reversibiliteit van de microcirculatoire hypoxische gebieden. In deze dieren verdwenen de corticale microcirculatoire hypoxische gebieden na resuscitatie en herstelde de nierfunctie zich tot 50% van de baselinewaarde. Concluderend was endotoxemie geassocieerd met het ontstaan van corticale microcirculatoire hypoxische gebieden die niet werden gedetecteerd door gemiddelde PO2 metingen, hetgeen de hypothese van onze studie bewijst. Deze observaties suggereren een rol voor hypoxie in de pathogenese van endotoxemie-geïnduceerde ARF.
Na het aantonen van het ontstaan van microcirculatoire hypoxische gebieden tijdens endotoxemie zijn we op zoek gegaan naar therapeutische strategieën gericht op het tegengaan van microvasculaire hypoxie en behoud van nierfunctie. Stikstofoxide (NO) is een belangrijk molecuul waarvan bekend is dat het de renale microvasculaire tonus beïnvloed. Hierdoor speelt NO een rol in de regulatie van het renale zuurstofaanbod. Onder septische condities is de belangrijkste bron van NO de productie door iNOS, een enzym waarvan de werking kan worden onderdrukt door de klinisch gebruikte glucocorticosteroid dexamethason (DEX). In hoofdstuk 3 van dit proefschrift hebben we de hypothese getoetst dat inhibitie van iNOS d.m.v. lage dosis DEX leidt tot verbetering van een verminderde intrarenale oxygenatie en nierfunctie. Twee uur na de ontwikkeling van endotoxemische shock kreeg een groep ratten een bolus lage dosering DEX (0.1 mg/kg) toegediend
in aanvulling op standaard vloeistofresuscitatie. In deze dieren was drie uur later de renale iNOS mRNA expressie significant onderdrukt. Daarnaast voorkwam dexamethason het ontstaan van corticale microcirculatoire hypoxische gebieden, verbeterde het renale zuurstofaanbod en herstelde de zuurstofconsumptie van de nier significant. Naast een significantie verbetering van de systemische hemodynamiek herstelde DEX de nierfunctie en de tubulaire natrium terugresorptie tot beginwaarden. De conclusie van dit hoofdstuk is dat de behandeling van ratten met lage dosis dexamethason in aanvulling op vloeistofresuscitatie het endotoxine-geïnduceerde nierfalen herstelde en dat dit herstel geassocieerd was met een verbetering van de intrarenale microvasculaire oxygenatie. Lage dosis DEX zou potentieel een rol kunnen spelen als preventieve maatregel tegen het ontstaan van acuut septisch nierfalen.
Een andere klasse van stoffen die de vasculaire tonus moduleren zijn de prostaglandines. In de nier houden prostaglandines de balans tussen vasodilatatie en vasoconstrictie in stand en spelen zo een rol bij homeostase en nierfunctie. Prostacycline (PGI2) moet geacht worden een potentiele beschermende rol voor de nier te kunnen spelen in septische ARF, vanwege zijn potente vasodilatoire effecten. In hoofdstuk 4 hebben we de hypothese getoetst dat exogeen toegediende prostacycline een endotoxemie-geïnduceerde intrarenale vasoconstrictie tegengaat en zo positieve effecten heeft of de nierfunctie. Continue infusie van de prostacycline analoog iloprost (100 ng/kg/min), gestart 2 uur na start van LPS-infusie in aanvulling op vloeistofresuscitatie, resulteerde in een stabilisatie van hemodynamische parameters. Alle dieren werden anuur tijdens endotoxemie. Alleen bij de dieren die iloprost kregen was de kreatinine klaring aan het einde van het experiment geheel hersteld. Iloprost had geen significant effect op gemiddelde µPO2, maar ging het ontstaan van corticale microcirculatoire hypoxische gebieden tegen. Na 5 uur was de expressie van iNOS mRNA significant toegenomen in de nieren van alle dieren die LPS kregen toegediend. Alleen in de dieren die iloprost kregen was de iNOS mRNA expressie significant onderdrukt in de binnenste medulla. Concluderend, de prostacycline analoog iloprost herstelde de nierfunctie van endotoxemische ratten terug naar aanvangswaarden. Dit positieve effect van iloprost op de nierfunctie zou mogelijk kunnen worden toegeschreven aan een verbeterde intrarenale oxygenatie.
In het laatste experimentele hoofdstuk van dit proefschrift hebben we gekeken naar de effecten van een substantie waarvan geen directe effecten op vasculaire tonus of renale microcirculatie bekend waren. Het is aangetoond dat Activated Protein C (APC) positieve effecten heeft op het inflammatoire proces en de coagulatie tijdens sepsis. Inflammatie en coagulopathie hebben een negatieve invloed op microcirculatoire functie en hinderen het zuurstoftransport naar het weefsel. De hypothese van onze studie in hoofdstuk 5 was dat behandeling met APC de renale microvasculaire oxygenatie en nierfunctie verbetert in endotoxine-geïnduceerd acuut nierfalen in de rat. Twee uur na toediening van een LPS-bolus kregen ratten in toevoeging op vloeistofresuscitatie een continue infusie van 10 of 100 µg/kg/uur APC. Behandeling met APC 100 voorkwam een verdere achteruitgang van de gemiddelde arteriële bloeddruk en de renale bloedflow. APC, onafhankelijk van concentratie, had geen significant effect of de gemiddelde µPO2, maar voorkwam het ontstaan van corticale microcirculatoir hypoxische gebieden. Alle dieren die LPS kregen toegediend hadden een significante afname in kreatinineklaring. Alleen in de dieren uit de APC 100 groep was de nierfunctie aan het einde van het experiment significant hersteld. Concluderend, APC 100 leidde tot een significant herstel van nierfunctie in vergelijking tot standaard vloeistofresuscitatie in een rattenmodel van endotoxemie. Dit effect hing samen met een bescherming tegen het ontstaan van corticale
arteriële bloeddruk. Deze resultaten suggereren dat APC 100 infusie als adjudant bij standaard vloeistofresuscitatie bruikbaar zou kunnen zijn als strategie ter behoud van renale oxygenatie en nierfunctie in de vroege fase van sepsis.
Conclusie
In dit proefschrift presenteren we de resultaten van verschillende experimentele therapeutische strategieën gericht op behoud van nierfunctie in een rattenmodel van endotoxemie. We hebben een model ontwikkeld dat ernstige hemodynamische veranderingen en, enige uren na ontwikkeling van septische shock, verlies van nierfunctie laat zien. Het doel van onze studies was om enigszins de pathologie zoals die gezien word bij patiënten op de intensive care na te bootsen. Onze resuscitatie strategieën waren daarbij tevens gebaseerd op de hedendaagse klinische standaard waarbij vloeistofresuscitatie ter stabilisatie van hemodynamische parameters de primaire stap was. Alle experimentele behandelingen werden bovenop deze standaard vloeistoftherapie uitgevoerd.
In onze eerste studie waren we in staat om een verlies aan nierfunctie te demonstreren tijdens endotoxemie die reversibel was door vloeistofresuscitatie. Hoewel de gemiddelde µPO2 slechts weinig was gedaald tijdens endotoxemie konden we het ontstaan van corticale microcirculatoire hypoxische gebieden aantonen door een linksverschuiving in het corticale PO2 histogram. Daarnaast hebben we een correlatie laten zien tussen verminderde microvasculaire oxygenatie en nierfunctie, wat de these bewijst. Strategieën gericht op voorkomen of herstellen van de microvasculaire hypoxie hebben positieve effecten op de nierfunctie. Echter, het bewijs van een causale relatie tussen renale hypoxie en functionele consequenties ontbreekt nog. Meer onderzoek is nodig om een eventueel direct verband tussen renale weefselhypoxie en nierfunctiestoornissen in de pathogenese van acuut nierfalen bij sepsis aan te tonen.
Klinische implicatie
Voordat pogingen worden ondernomen om onze vindingen te vertalen naar septisch nierfalen bij patiënten is het belangrijk enige nadelen van ons specifieke proefdiermodel in acht te nemen. Hoewel zo goed mogelijk klinische condities werden nagebootst kan geen enkel proefdiermodel direct vertaald worden naar humane pathofysiologie in de kliniek. In kleine knaagdieren gaat endotoxemie vaak gepaard met een hypodynamische status, intrarenale vasoconstrictie en een afname in renale bloedflow. Dit is in tegenstelling tot de hyperdynamische respons die vaker gezien wordt in grote proefdieren en bij mensen. Derhalve moeten de resultaten van dierstudies met enige voorzichtigheid geïnterpreteerd worden voor wat betreft hun klinische relevantie.
Voordat de door ons voorgestelde therapieën ter bescherming van de nieren in mensen wordt getest lijkt het meer opportuun om de reproduceerbaarheid van onze resultaten te onderzoeken in bijvoorbeeld een varkensmodel van sepsis. Indien de uitkomst van zo’n studie ook positieve beschermende effecten zou aantonen dan zou daarmee een grote stap in de richting van een gerandomiseerde klinische trial gedaan zijn. Met name doordat alle door ons geteste farmaca reeds in klinisch gebruik zijn.
Vanwege het grote klinische belang van het vinden van nierfunctie beschermende of nierfunctie verbeterende therapieën zou de uitvoering van zulke klinische studies zeer interessant zijn.
L
ist of abbreviationsAKI acute kidney injury
APC activated protein C
ARF acute renal failure
Clearcrea creatinine clearance
CVP central venous pressure
DEX dexamethasone
DO2ren renal oxygen delivery
FR fluid resuscitation
GFR glomerular filtration rate
HR heart rate
Ilo iloprost
iNOS inducible nitric oxide synthase
LPS lipopolysaccharide
MAP mean arterial pressure
µPO2 microvascular PO2
NO nitric oxide
NOx concentration of nitrate/nitrite/S-nitrosothiols
NR non-resuscitation
O2ERren renal oxygen extraction
rvPO2 renal venous PO2
RBF renal blood flow
RVR renal vascular resistance
TC time control
TNa+ tubular sodium reabsorption
A
cknowledgementsThis manuscript would not be complete without acknowledging the people who made this work possible. I want to thank Professor Can Ince who gave me the opportunity to work in his research department in Amsterdam. His enthusiasm and the collection of interesting technology within his department made me travel to Amsterdam and spent there several years of my life. Looking back at this research period and seeing now the ultimate result, this thesis, I definitely conclude that this time was well spent. Also, I like to express my gratitude to all co-workers within the department of Translational Physiology who supported me with my work and made my stay unforgettable.
Secondly, I want to thank my husband Bert Mik for all the years of patience and mentorship that guided me through my research work. He built the technical devices we needed for the oxygen measurements and taught me how to use them. Without his positive thoughts and his personal investment in me, I probably would never have finished this manuscript. My thanks also go to Professor Klaus Unertl who supported my research and my training in anesthesiology from the first moment we met. Furthermore, I have to thank Dr. Boris Nohé. He confirmed my interest in basic science and guided me through the first steps of my academic work. My thanks also go to Professor Stolker who gave me a job in his department and who is fully supporting my current research. Furthermore, I want to thank the members of the promotion committee for their assessment of my thesis and their presence during the PhD ceremony.
Above all, I want to thank Hanni and Rolf who made it possible for me to have the career of my choice. I thank them for their guidance and efforts to make this career come true. Finally I want to thank my late great-grand nanny who always believed in me – I will never forget you.
L
ist of publicationsMik EG, Johannes T, Fries M
Clinical microvascular monitoring: a bright future without a future? Crit. Care Med. 2009; 37(11): 2980-1.
Johannes T, Mik EG, Klingel K, Goedhart PT, Zanke C, Nohe B, Dieterich HJ, Unertl KE, Ince C
Effects of 1400W and/or nitroglycerin on renal oxygenation and kidney function during endotoxaemia in anaesthetised rats. CEPP. 2009; 36 (9): 870–879.
Legrand M, Almac E, Mik EG, Johannes T, Kandil A, Bezemer R, Payen D, Ince C
L-NIL prevents renal microvascular hypoxia and increase of renal oxygen consumption after ischemia-reperfusion in rats. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2009; 296(5): F1109-17.
Mik EG, Ince C, Eerbeek O, Heinen A, Stap J, Hooibrink B, Schumacher CA, Balestra GM,
Johannes T, Beek JF, Nieuwenhuis AF, van Horssen P, Spaan JA, Zuurbier CJ
Mitochondrial oxygen tension within the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 2009; 46(6): 943-51. RaatNJ, HilariusPM, JohannesT, de KorteD, InceC, VerhoevenAJ
Rejuvenation of stored human red cells reverses the renal microvascular oxygenation deficit in an isovolemic transfusion model in rats. Transfusion. 2009; 49(3): 427-4.
Johannes T, Ince C, Klingel K, Unertl KE, Mik EG
Iloprost preserves renal oxygenation and restores kidney function in endotoxemia-related acute renal failure in the rat. Crit. Care Med. 37(4): 1423-32, 2009
Johannes T, Mik EG, Klingel K, Dieterich HJ, Unertl KE, Ince C
Low-dose dexamethasone supplemented fluid resuscitation reverses endotoxin-induced acute renal failure and prevents cortical microvascular hypoxia. Shock. 2009; 31(5): 521-528.
Johannes T, Mik EG, Ince C
Non-resuscitated endotoxemia induces microcirculatory hypoxic areas in the renal cortex in the rat. Shock. 2009; 31(1): 97-103.
Ploppa A, Ayers DM, Johannes T, Unertl KE, Durieux ME
The Inhibition of Human Neutrophil Phagocytosis and Oxidative Burst by Tricyclic Antidepressants. Anesth. Analg. 2008; 107(4): 1229-35.
Mik EG, Johannes T, Zuurbier C, Heinen A, Houben-Weerts JHPM, Balestra GM, Stap J, Beek, JF, Ince C
In vivo mitochondrial oxygen tension measured by a delayed fluorescence lifetime technique. Biophys. J. 2008; 95(8): 3977-90.
Legrand M, Mik EG, Johannes T, Payen D, Ince C
Renal hypoxia and dysoxia after reperfusion of the ischemic kidney. Mol. Med. 2008: 14(7-8): 502- 16.
Mik EG, Johannes T, Ince C
Johannes T, Mik EG, Nohe B, Unertl KE, Ince C
Acute Decrease in Renal Microvascular PO2 during Acute Normovolemic Hemodilution. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2007; 292(2): F796-803.
Johannes T, Mik EG, Nohe B, Raat NJH, Unertl KE, Ince C
Influence of fluid resuscitation on renal microvascular PO2 in a normotensive rat model of endotoxemia. Crit. Care. 2006; 10(3): R88.
Johannes T, Mik EG, Ince C
Dual-wavelength phosphorimetry for determination of cortical and sub-cortical microvascular oxygenation in rat kidney. J. Appl. Physiol. 2006; 100(4): 1301-10.
Nohe B, Johannes T, Reutershan J, Rothmund A, Haeberle HA, Ploppa A, Schroeder TH, Dieterich HJ
Synthetic Colloids Attenuate Leukocyte-Endothelial Interactions by Inhibition of Integrin Function. Anesthesiology. 2005; 103 (4): 759-767.
Nohe B, Schmidt V, Johannes T, Reutershan J, Schroeder TH, Dieterich HJ, Schroeder S Maldistribution of activated leukocytes during systemic inflammation. Perfusion. 2005; 18: 4-16. Nohe B, Johannes T, Schmidt V, Schroeder TH, Kiefer RT, Unertl K, Dieterich HJ
Effects of reduced shear stress on inflammatory reactions in vitro Effects of pathological flow conditions on leukocyte-endothelial interactions and monocyte tissue factor expression in human cell cultures. Anaesthesist. 2005; 54 (8): 773-780.
Nohe B, Johannes T, Dieterich HJ
Antiinflammatory effects of omega-3 fatty acids vary at different stages of inflammation. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2003; 285 (5): 2248-2249.
Nohe B, Ruoff H, Johannes T, Zanke C, Unertl K, Dieterich HJ
A fish oil emulsion used for parenteral nutrition attenuates monocyte-endothelial interactions under flow. Shock. 2002; 18 (3): 217-222.
Nohe B, Zanke C, Johannes T, Kiefer T, Dieterich HJ
Effects of magnetic cell separation on monocyte adhesion to endothelial cells under flow. APMIS. 2002; 110 (4): 299-308.
C
urriculum vitaeTanja Johannes was born on December 22, 1974 in Waiblingen, Germany. She attended pre- university education at Maria-Merian Gymnasium in Waiblingen. In 1996, she started her medical studies at Eberhard-Karls-University of Tübingen. During this time she developed interest in basic science and started to work on a research project at the Laboratory of Anesthesiology at the University of Tübingen. In 2002, this project was successfully rounded up by a doctoral thesis with the title “Einfluss einer parenteralen Fischölemulsion auf die Zelladhäsion und Tissue Factor Expression von Monozyten und Endothelzellen in vitro“ and graded with "summa cum laude“. In the same year she finished her medical studies and started training in Anesthesiology and Intensive Care Medicine at the Department of Anesthesiology and Intensive Care Medicine at the University of Tübingen. Besides clinical work she was always involved in research projects and from 2004 to 2006 she worked on the basis of a research grant in the Department of Translational Physiology at the Academic Medical Center, University Amsterdam, The Netherlands. Till today her research focus lies on pathophysiological changes in renal oxygenation in sepsis and hemodilution in various animal models. Her research was supported by different project grants and is published in numerous international journals. In 2009 she was registered as anesthesiologist. In the same year she took up her current position as medical staff member at the Department of Anesthesiology at Erasmus Medical Center, University of Rotterdam, The Netherlands. Tanja is married to Bert Mik with whom she has a little daughter named Maita.