155
9
Direct na de geboorte worden pasgeborenen geconfronteerd met een breed scala aan potentiële ziekteverwekkers. Verschillende bacteriën, virussen en parasieten vormen een bedreiging voor de gezondheid van het kind. Moederlijke bescherming wordt geboden in de vorm van maternale antistoffen (immunoglobulinen) die de placenta zijn gepasseerd in de laatste helft van de zwangerschap, en na de geboorte door de nieuwe aanvoer van antistoffen via de moedermelk. Hoewel deze maternale antistoffen enige bescherming bieden is het niet genoeg om de pasgeborene langdurig te beschermen. In de loop van de evolutie heeft de mens een adequaat immuunsysteem ontwikkeld dat het groeiende kind beschermd tegen deze ziekteverwekkers.
Bij falen van de afweer kunnen klinische verschijnselen van een zogenaamde afweerstoornis of immunodeficiëntie zich ontwikkelen. Patiënten hebben dan bijvoorbeeld vaker of heftiger last van uitgebreide of ernstige infecties. Er wordt onderscheid gemaakt tussen primaire en secundaire immuundeficiënties, hetgeen betekent dat de afweerstoornis al vanaf de geboorte aanwezig is, of later optreedt en het immuunsysteem in eerste instantie geheel normaal heeft gefunctioneerd maar gedurende het leven wordt aangetast.
Dit proefschrift richt zich op de primaire immuundeficiënties (PIDs), waarvan sommige vormen zo mild zijn dat ze jaren onopgemerkt kunnen blijven, en andere zo ernstig zijn dat ze vrijwel direct na de geboorte worden ontdekt omdat er klachten ontstaan.
Een ’primaire antistof deficiëntie (PAD)’ is de meest frequent voorkomende PID bij de mens. Het probleem berust op een verkeerde aanleg of het niet goed functioneren van de B cellen, die weliswaar in normale aantallen aangemaakt zijn maar niet (of niet goed) differentiëren naar hun eindstadium van plasmablast of plasmacell (PB of PC). Deze laatstgenoemde cellen van het afweersysteem zijn verantwoordelijk voor de productie van antistoffen (antilichamen). Bij de meeste patiënten met een PAD is het pathofysiologische mechanisme onbekend en ook kennis over de onderliggende genetische afwijking ontbreekt vaak.
Gelukkig is de behandeling van een PAD onafhankelijk van de genetische oorzaak en kan direct na het stellen van de diagnose worden gestart. De huidige behandeling bestaat meestal uit de substitutie van antistoffen (immuunglobulinen) als IVIG, intra veneus immuunglobuline product, of SCIG, subcutaan immuunglobuline product, eventueel in combinatie met een profylactische behandeling met antibiotica. Uiteraard zal alert gereageerd worden met aanvullende vroege diagnostiek en toediening van uitgebreide antibiotische behandeling bij een vermoedelijke acute intercurrente bacteriële infectie. Naast chronische en terugkerende infecties kunnen ernstige complicaties zoals auto-immuniteit, granulomateuze ontstekingen en zelfs maligniteiten ontstaan. In zogeheten ‘common variable immunodeficiency’ (CVID), de diagnose in het grootste deel van de PAD patiënten, is het zelfs zo dat in sommige gevallen immunosuppressieve medicijnen gebruikt moeten worden om de kans op deze lange-termijn schade door chronische niet-infectieuze ontstekingsreacties of effecten van autoimmuniteit te beheersen of te voorkomen.
Het verkrijgen van kennis over de pathofysiologie en van de onderliggende genetische afwijkingen in PADs is van grote waarde. Naast de intrinsieke drang te willen weten hoe het zit, geven de genetisch of functioneel goed getypeerde patiënten die aangedaan zijn in hun antistofvorming, ons een unieke mogelijkheid om meer inzicht in de normale B cel ontwikkeling en functie te verkrijgen. Testen van hun afweer gericht op hun B cel systeem, leert ons wat er gebeurt met
156
Chapter 9
9
de aangedane B cellen, mocht de antistofvorming met een duidelijk B cel defect gepaard gaan. Tevens kan deze informatie gebruikt worden bij het ontwikkelen van methoden voor een laboratorium test die voor vroege diagnose en daarmee betere behandeling zorgt.
In dit proefschrift introduceren wij een test, waarin we met een kleine hoeveelheid bloed de functie van B cellen kunnen bestuderen. We isoleren de cellen van interesse uit het bloed en kweken deze dan in het laboratorium waarbij we de cellen op verschillende manieren activeren en na een week kunnen we ze analyseren. Deze test hebben we gevalideerd voor diagnostiek en research en hebben referentiewaarden gegenereerd voor alle leeftijden. We hebben hiermee een manier in handen om B cel activatie, deling en differentiatie te bestuderen. Dit geeft ons de mogelijkheid om deze processen van de B cel te bestuderen bij patiënten waar de onderliggende genetisch oorzaak bekend is om het effect van het B cel defect goed te karakteriseren en vervolgens ter vergelijking dezelfde testen te doen bij patiënten met nog onbekende B cel problemen.
In hoofdstuk 2 introduceren wij deze test om te laten zien dat we in ons kweeksysteem in staat zijn B cellen te laten overleven, en te activeren tot cel proliferatie (cel deling) en differentiatie (rijping of ontwikkeling) tot plasmacellen. Door twee verschillende manieren van B cel activatie na te bootsen, namelijk T-cel-afhankelijke en T-cel-onafhankelijke activatie van de B cellen, wordt het natuurlijke proces van antistofvorming in de zogeheten perifere lymfe organen zoals lymfeklieren, Peyerse platen in de darmwand en in de milt zo goed mogelijk nagebootst. Naast de introductie van deze nieuwe methode, hebben we leeftijdsafhankelijke referentiewaarden bepaald. Dit was belangrijk omdat er grote verschillen zijn in B cel functie tussen leeftijdsgroepen, waarbij bekend is dat B cellen van jonge kinderen minder goed differentiëren naar plasmacellen.
Een interessante bevinding is dat B cellen uit bloed dat direct na de geboorte is afgenomen (navelstrengbloed) extra goed kunnen delen en opvallend veel IgM antistoffen produceren, hetgeen in het beng van het leven van de zuigeling een hele goede bescherming kan bieden (naast het IgG van de moeder dat via de placenta in de laatste helft van de zwangerschap aan de ongeboren vrucht wordt doorgegeven). Bij gezonde controles van ongeveer 3 maanden oud lijkt deze opvallende IgM productie in ons testsysteem niet meer aanwezig. Deze B cel functie zou de pasgeborene kunnen helpen om te gaan met de vele ziekteverwekkers waar het aan wordt blootgesteld direct na de geboorte als een soort ‘natuurlijke’ antistof.
In hoofdstuk 3 gebruiken we onze test op een heel andere manier dan in hoofdstuk 2. Naast gezonde controles die de normale situatie vertegenwoordigen, hebben we onze test gebruikt voor de karaterisering van de rijping en functionele karakteristieken van de B cellen van patiënten met een reeds genetisch goed gedefinieerde aandoening: de zogenoemde ‘class-switch’ recombinatie (CSR) defecten. Het CSR mechanisme is vereist voor de switch of verandering van de lage affiniteit IgM naar een Ig- isotype (IgG, IgA of IgE) met een hogere affiniteit. Patiënten met zulke CSR defecten hebben we vervolgens vergeleken met een grote groep patiënten met een ongedefinieerde CVID, waarbij nog onduidelijk is welk mechanisme ten grondslag ligt aan de B cel dysfunctie.
Door onze test uit te voeren en CVID te vergelijken met reeds bekende genetische afwijkingen kunnen we meer zeggen over het mogelijke werkingsmechanismen, en zo op elkaar gelijkende subgroepen van patiënten te maken binnen CVID. Deze functionele subgroepen geven de mogelijkheid om specifieker op zoek te gaan naar het onderliggende mechanisme van de ziekte en zo een mogelijke erfelijke factor te kunnen identificeren.
157
9
In hoofdstuk 4 is onze test aangepast zodat we hem hebben kunnen gebruiken voor een “high-throughput” screenings methode. Het kunnen nabootsen van de normale B cel ontwikkeling gaf ons de mogelijkheid om een grote groep compounds te kunnen screenen. Deze compounds zijn kleine moleculen met allemaal een specifiek remmend effect op elk een verschillend celproces. We hebben de effecten van bijna 200 compounds op B cel overleving, proliferatie en differentiatie bekeken. Screening op effecten kan mogelijk leiden tot de identificatie van signaalroutes en celprocessen die nog niet eerder geassocieerd zijn geweest met de B cel ontwikkeling in de mens. De identificatie van een compound met remmede effecten op de B cel zou aan de basis kunnen staan van de ontwikkeling van andere en/of nieuwe geneesmiddelen met als potentiële doelwit de B cel en uitscheiding van ziekmakende auto-antistoffen voor een (aanvullende) behandeling van auto- antistof-gemedieerde ziekten bij mensen (zoals bijvoorbeeld systemische lupus erythematosus, verschillende nierziektes and reuma).
We hebben uiteindelijk 4 compounds geïdentificeerd die verlaagde plasmablast vorming ten gevolg hadden. Deze hadden geen grote ongewenste effecten op andere cellen en behielden zelfs bij gebruik van lage concentraties hun effect. Interessant was dat twee van de vier geselecteerde compounds gericht zijn tegen de mTOR-AKT-PI3K signalerings route in de cel. Het bleken de mTOR remmers, temsirolimus en rapamycine te zijn, medicamenten die momenteel voor de behandeling van uitgezaaide niermaligniteiten en tegen afstoting van niertransplantatie worden gegeven. Onze gegevens tonen onbekende specifieke effecten van deze mTOR remmers op B -cel activering en differentiatie in plasmablasten, waar hun effect voorheen voornamelijk aan T cellen werd gekoppeld.
Concluderend hebben we een effectieve manier opgezet om te screenen wat de effecten zijn van diverse compounds op B cel overleving, proliferatie en differentiatie naar plasmablasten. De eerste resultaten zoals beschreven in hoofdstuk 4 laten remmende effecten van mTOR inhibitie zien, zelfs bij lage concentraties.
In hoofdstuk 5 beschrijven we de controverse rond het bestaan van neutrofiele granulocyten
met een uitgesproken B helper functie (NBH). We laten onze eigen data zien waaruit blijkt dat we
niet in staat zijn om eerder gepubliceerde gegevens te reproduceren. Deze NBH zijn een specifieke
subgroep van neutrofiele cellen die alleen in de menselijke milt zouden voorkomen met een zeer belangrijke en uitgesproken rol bij de differentiatie van milt B cellen. Onze groep had de unieke mogelijkheid om menselijke milt samples te verkrijgen. We bleken niet in staat de door anderen
gepubliceerde resultaten rond NBH te reproduceren en we laten zien dat dit komt door vervuiling
met andere type cellen in het gepubliceerde protocol. Daarom zetten we grote vraagtekens bij de gebruikte methoden en dus de geldigheid van de eerder gepubliceerde gegevens.
Onderzoek waarin deze eerder gepubliceerde gegevens worden tegengesproken is geen gemakkelijke taak en moet met grote zorg worden gedaan. Met dit hoofdstuk willen we ook benadrukken dat gegevens kritisch moeten worden geëvalueerd – ook wanneer de bewuste bloed en miltsamples zeer moeilijk te verkrijgen zijn en de wetenschappelijke beweringen dus niet gemakkelijk te toetsen of reproduceren lijken.
In hoofdstuk 6 & 7 worden twee bijzondere patiënten besproken met een PID, waarbij we met onze test laten zien dat B cel functie ernstig is aangedaan. Hoofdstuk 6 beschrijft een patiënt met een DOCK8 deficiëntie, dat uiteindelijk leidt tot het autosomaal-recessieve Hyper-IgE-syndroom (HIES). DOCK8 deficiëntie resulteert in gebrekkige antilichaamresponsen en ongestuurde IgE
158
Chapter 9
9
plasmacelexpansie in de lymfeknopen, als onderdeel van deze gecombineerde immunodeficiëntie waarbij zowel T als B cellen een gebrekkige cel functie blijken te bezitten.
In hoofdstuk 7 beschrijven we een nieuwe niet-volledige (hypomorfe) mutatie in het gen IL2RG, dat codeert voor de common γ-chain (CD132). Deze eiwitketen is essentieel voor een groot aantal verschillende interleukine receptoren. Eerder is al beschreven dat interleukines (voornamelijk IL-21) cruciaal zijn voor B cel activatie en differentiatie. In onze patiënt laten we echter ook zien dat stimulatie via de T-cel-onafhankelijke route, en dus zonder interleukines, gestoord is. B cel functies zijn duidelijk defect, wat de noodzaak van een functionele common γ-chain voor beide routes van B cel differentiatie weergeeft.
Concluderend beschrijven we in dit proefschrift een manier om B cel activatie, deling en differentiatie te bestuderen. Deze test hebben we gevalideerd voor diagnostiek en research en hebben referentiewaarden gegenereerd voor alle leeftijden. We laten zien dat deze test multifunctioneel inzetbaar is; voor het bestuderen van de leeftijdsafhankelijke B cel ontwikkeling, voor het karakteriseren van patiënten met bekende en onbekende B cel problemen en voor de gevolgen van het remming van intracellulaire signaalroutes en celprocessen op normale B cel ontwikkeling.