124 125
Non-Hodgkin lymfoom (lymfeklierkanker) vormt met 40% de grootste subgroep van alle vormen van hematologische/bloedcel kankers. Diffuus grootcellig B-cel lymfoom (DLBCL) vormt daarvan weer de subgroep. Het blijkt dat deze zowel pathologisch als klinisch gezien er heterogeen is, met onder andere grote verschillen in respons op behandeling met chemotherapie. DLBCL kan met behulp van moleculair onderzoek ingedeeld worden in subcategorieën: ‘germinal centre B-cell like’ (GCB) DLBCL uitgaande van de kiemcentrum B-cellen in de lymfefollikels en ‘activated B-cell like’ (non-GCB) DLBCL, een later stadium B-cellen in de ontwikkeling op weg naar plasmacellen. GCB DLBCL patiënten hebben een betere overleving dan non-GCB DLBCL patiënten. Echter, binnen deze twee groepen zijn er nog grote verschillen in respons op chemotherapie en daarmee uitkomst van de ziekte. Naast de vele genetische factoren zoals activerende veranderingen van kankergenen zoals het bekende MYC gen en mutaties in specifieke intracellulaire signaleringsroutes, spelen hier ook veranderingen van eiwitten een rol die te maken hebben met de interactie tussen de tumorcellen en hun micro-omgeving. Hierbij moet onder andere gedacht worden aan de HLA eiwitten.
Het doel van dit proefschrift was om meer inzicht te krijgen in het biologisch gedrag van DLBCL. Als eerste hebben we onderzocht of er eiwitten zijn die verder onderscheid kunnen maken tussen GCB DLBCL en non-GCB DLBCL. Daarnaast hebben we gekeken of er verschillen zijn in immuun geassocieerde eiwitten tussen HLA positieve en HLA negatieve DLBCL gevallen. Ten slotte hebben we het secretoom, alle uitgescheiden eiwitten in de extracellulaire ruimte, van lymfoom cellijnen geanalyseerd. Al deze eiwit studies zijn gedaan met vloeistofchromatografie en massaspectrometrie (LC-MS).
In hoofdstuk 2 beschrijven we de proteomics analyse van 13 DLBCL samples. We hebben het proteoom, alle eiwitten in een cel, van de tumorcellen geanalyseerd met behulp van een speciale techniek: stabiel isotoop gelabelde aminozuren in cellijnen genaamd super-SILAC. SILAC is een proteomics methode waarbij alle eiwitten gelabeld worden door cellen te laten groeien in medium met zwaar gelabelde aminozuren; arginine en lysine. 14,16 Door twee samples te mengen, bijvoorbeeld
normaal weefsel en tumorweefsel, kan een kwantitatieve analyse worden gedaan op basis van de gemeten eiwit ratio van gelabelde en niet-gelabelde aminozuren. Super-SILAC is gebaseerd op hetzelfde principe met als toegevoegde waarde dat het mogelijk is om kwantitatieve verschillen te bepalen tussen verschillende niet gelabelde samples ten opzichte van een externe gelabelde referentie. Met deze
124 125
tussen GCB en non-GCB DLBCL patiënten. We hebben voor twee eiwitten,
respectievelijk GLMN en RPL23 significante verschillen aangetoond in onze validatie en replicatie analyses. Glomuline (GLMN) expressie was hoger in GCB type DLBCL en speelt een rol bij bloedvat ontwikkeling. Een verlaagde GLMN expressie zorgt voor een toename van bloedvaten. Expressie van ribosomaal eiwit L23 (RPL23) was verhoogd in non-GCB DLBCL. RPL23 kan zelf rechtstreeks geactiveerd worden door MYC terwijl het MYC kan activeren via de intracellulaire PI3K/AKT route waardoor een positieve feedback loop kan ontstaan. Overexpressie van RPL23 wordt vaker gezien bij het non-GCB DLBCL subtype, consistent met onze bevindingen. Tijdens de (latere) ontwikkeling van DLBCL treedt vaak verlies op van de
eiwitexpressie van HLA klasse I en HLA klasse II. Waarschijnlijk heeft dit verlies van HLA ook invloed op de samenstelling en functionaliteit van de micro-omgeving. HLA klasse I kan cytotoxische T cellen aanzetten tot een immuunrespons terwijl HLA klasse II T-helper cellen stimuleert. Verminderde expressie van HLA klasse I kan optreden als gevolg van mutaties en deleties in het β2 microglobuline gen. Verlies van HLA klasse II kan het gevolg zijn van homozygote deleties, verlies van CIITA expressie of (een fysiologische of ook door genetische veranderingen gedreven) plasmacel differentiatie. In hoofdstuk 3 hebben we met behulp van immuunhistochemie 42 GCB DLBCL and 35 non-GCB DLBCL tumoren geanalyseerd voor HLA klasse I en HLA klasse II expressie. We vonden dat gecombineerd verlies van HLA klasse I en HLA klasse II met name voorkomt in het non-GCB DLBCL subtype. Naar aanleiding van deze bevindingen hebben we in hoofdstuk 4 met behulp van proteomics gekeken naar eiwitten in de tumorcellen die positief of negatief geassocieerd zijn met HLA klasse I en II expressie. We hebben ons in deze studie gericht op eiwitten die te maken hebben met de immuunrespons. Daarmee beperkten we ons bewust tot (een beperkt aantal) eiwitten die direct upstream of downstream van de HLA eiwitten in de tumorcellen gedereguleerd zouden kunnen worden en tot eiwitten die indirect veranderd tot expressie zouden kunnen komen door een veranderende interactie met de micro-omgeving. De super-SILAC data, zoals beschreven in hoofdstuk 2, zijn daartoe opnieuw geanalyseerd, maar nu door het vergelijken van 8 HLA klasse I en HLA klasse II positieve DLBCL ten opzichte van
126 127
5 HLA klasse I en HLA klasse II negatieve DLBCL. Dit resulteerde in 74 eiwitten die differentieel tot expressie kwamen. Dertien hiervan hadden volgens de online gen- ontologie databank (DAVID) een rol in de immuunrespons. Vier van deze 13 eiwitten, MAVS, HMOX2, PPM1A and EIF4G1 kwamen tenminste tweevoudig verschillend tot expressie en werden uitgekozen voor immuunhistochemische validatie en replicatie. Helaas konden we voor geen van de vier eiwitten significante verschillen aantonen bij de immunohistochemische validatie en replicatie. Mogelijk hebben we een grotere serie nodig om verschillen in deze heterogene DLBCL subsets aan te kunnen tonen, zeker ook om eiwitten te vinden die indirect veranderd zijn door de gewijzigde interactie met de micro-omgeving. Immers, die interactie is erg complex en heterogeen. Voor zover we weten zijn er nog geen eerdere proteomics studies die onderzoek hebben gedaan naar verschillen in het proteoom tussen DLBCL met en zonder verlies van HLA klasse I en HLA klasse II. Verder zou proteomics analyse van de cellen in de micro-omgeving van de lymfoom cellen mogelijk ook meer inzicht kunnen geven in de onderliggende interacties.
In het laatste deel van dit proefschrift, hoofdstuk 5, hebben we het secretoom van 8 lymfoom cellijnen onderzocht met LC-MS. We hebben in totaal 3077 eiwitten geïdentificeerd, waarvan er op basis van predictie programma’s 1317 (43%) gesecreteerd worden. Gen ontologie analyse in de online database DAVID liet zien dat de meeste uit- en afgescheiden eiwitten onderdeel waren van de ontologie functiegroepen: cel metabolisme (21%), signaal transductie (9%), immuun respons (9%), cel cyclus (8%), transcriptie (6%), apoptose (3%), motiliteit (3%) en vaatnieuwvorming (1%). We hebben 4 eiwitten geselecteerd die onderdeel waren van de groep immuunrespons: CCL4, CXCL10, MIF en CD44. C-X-C Motief Chemokine Ligand 10 (CXCL10) is een chemokine die de ontstekingsreactie en groei van het lymfoom bevordert. Deze chemokine is geassocieerd met een hogere kans op beenmerg metastase en lymfeklier infiltratie. Macrofaag Migratie Inhibitie Factor (MIF) is een remmer van de cytotoxische T-cel respons die zorgt voor overleving van het lymfoom. CD44 is een eiwit dat een heel belangrijke rol speelt bij adhesie, activatie, recirculatie en homing van lymfocyten. Een hoge serum waarde van C-C Motief Chemokine Ligand 4 (CCL4) is geassocieerd met een slechte prognose in DLBCL. CCL4 serum waarden zouden mogelijk gebruikt kunnen worden om tijdens de behandeling de tumor response te kunnen meten.
126 127
verschillende soorten lymfomen, om voor elke patiënt de meest optimale therapie te kunnen bepalen, waarbij we over- of onderbehandeling kunnen vermijden.