Elke individuele cel bevat DNA, de drager van de erfelijke informatie die is geschreven in een vierletterige code (het totaal aan DNA in de kern wordt genoom genoemd). De DNA- code beschrijft verschillende elementen. Een gen is bijvoorbeeld een stuk DNA dat een eiwit beschrijft, een molecuul dat een functie in of buiten de cel uitvoert. Wanneer de DNA- informatie van een gen wordt gelezen, produceert de cel het eiwit. Andere delen van het DNA bevatten weer andere informatie, zoals de code voor de regulatie van de eiwitexpressie of ruimtelijk vouwing van het DNA. Al deze informatie samen maakt dat het DNA twee meter lang is. Om dit in de celkern te passen wordt het strak opgevouwen op meerdere niveaus. De vouwing en de aanwezigheid van eiwitten en modificaties op het DNA (samen chromatine genoemd) hebben invloed op de functie van het DNA. Bijvoorbeeld, strak opgevouwen DNA is minder gemakkelijk te lezen dan losser gevouwen DNA.
Wijzigen van de DNA-code in cellen kan leiden tot gewijzigde functies. Deze veranderingen kunnen bijvoorbeeld leiden tot gunstige eigenschappen voor landbouwgewassen of kunnen ziekmakende genen in kankercellen uitschakelen. De ontwikkeling van nieuwe technologieën maakt het mogelijk het DNA van verschillende organismen op geselecteerde locaties aan te passen. De populairste techniek in de moleculaire biologie om genetische aanpassingen te maken is CRISPR/Cas9. Het CRISPR-systeem bestaat uit een gids-RNA dat een specifieke volgorde in het genoom (sequentie) herkent en de Cas9-nuclease die daar een nauwkeurig gedefinieerde dubbel-strengsbreuk (DSB) aanbrengt. Als reactie zal de cel deze breuk herstellen. In zoogdiercellen is het meest gebruikte reparatiemechanisme non-homologous end joining (NHEJ), die de gebroken uiteinden met elkaar verbindt. Deze reparatie is niet altijd nauwkeurig waarbij extra DNA-letters (nucleotiden) kunnen worden ingevoegd (inserties) of worden verwijderd (deleties) op de plaats van de breuk. Dit soort mutaties worden aangeduid als indels. Echter, de effectiviteit en het mutatiespectrum kunnen aanzienlijk variëren afhankelijk van de efficiëntie waarmee een DSB wordt geïntroduceerd en de manier waarop deze wordt gerepareerd. Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de genoombewerking door CRISPR/Cas9 en de factoren die van invloed zijn op de efficiëntie van deze methode.
Bij experimenten om het genoom te bewerken met CRISPR/Cas9 is het belangrijk om de frequentie van de geïntroduceerde indel-mutaties te kennen. Omdat die moeilijk te voorspellen is, is een eenvoudige en snelle test nodig om de geïnduceerde mutaties nauwkeurig te karakteriseren en te kwantificeren. In Hoofdstuk 2 beschrijven we de TIDE- methode. Dit is een snelle en gemakkelijk toepasbare methode die indels nauwkeurig identificeert en kwantificeert na een CRISPR/Cas9-bewerking. TIDE vereist slechts een paar PCR-reacties en twee standaard Sanger-sequencing reacties, een techniek is om de
volgorde van nucleotiden van een stuk DNA af te lezen. De sequentiepatronen worden vervolgens geanalyseerd door een speciaal ontwikkeld ontledingsalgoritme om de individuele mutaties te identificeren.
Voor het genereren van specifieke mutaties door middel van CRISPR/Cas9- genoombewerking kan een geïntroduceerde DSB ook hersteld worden met behulp van donor-DNA. Dit is een ontworpen sequentie die, op enkele gewenste mutaties na, bijna identiek is aan de locatie waar de breuk wordt gemaakt, de doelwitlocatie. In de aanwezigheid van het donor-DNA kunnen de ontworpen mutaties tijdens de reparatie in het genoom worden geïntegreerd. Dit proces verloopt via een ander reparatiemechanisme dat homology directed repair (HDR) wordt genoemd, en het gebruikt daarbij de overlappende sequentie tussen het genoom en het donor-DNA. Deze zeer nauwkeurige strategie is de laatste tijd steeds populairder geworden, vanwege de mogelijkheid om specifieke mutaties te creëren en ze te bestuderen of om ziekteverwekkende mutaties te corrigeren. In Hoofdstuk 3 bespreken we een tweede methode, TIDER, die de frequentie kan schatten van elke ontworpen mutatie(s).
Voor beide methoden die in Hoofdstuk 2 & 3 zijn gepresenteerd hebben we bijbehorende interactieve webtools ontwikkeld die door de snelle analyse rationeel de ontwerpstrategieën voor het bewerken van een genoom vergemakkelijken. TIDE en TIDER maken het eenvoudig om de werkzaamheid van een ontworpen gids-RNA te testen en om het type, aantal en frequentie van de verwachte mutaties te bepalen. Hoofdstuk 4 biedt gedetailleerde procedures en optimalisatiestappen om mogelijke problemen bij het gebruik van deze twee methoden te ondervangen.
Het is nog niet precies duidelijk hoe het proces van het knippen van het DNA door CRISPR/Cas9 en de daaropvolgende reparatie van de DSB verloopt. Hoe snel vinden deze gebeurtenissen plaats en hoe nauwkeurig is het DSB-herstel? We hebben een strategie ontwikkeld om de kinetiek en betrouwbaarheid van DNA-herstel op enkele locaties in menselijke cellen direct te meten (Hoofdstuk 5). Hiervoor hebben we een cellijn gemaakt met een nauwkeurig gecontroleerde, induceerbare Cas9 die het mogelijk maakte de vorming van DSB’s en hun herstel in de tijd te volgen in een locatie naar keuze. Percentages met intact, gebroken en hersteld DNA worden gekwantificeerd door een combinatie van DNA-sequencingtechnologie en een test om niet-gerepareerde, gebroken uiteinden te detecteren. De resultaten worden geanalyseerd in een wiskundig model dat de belangrijkste parameters voor reparatiekinetiek en -nauwkeurigheid schat. Onze aanpak onthulde dat reparatiesnelheden varieerden per doelwitsequentie, met halfwaardetijden tot ~10 uur, wat aangeeft dat de reparatie traag is. Bovendien laten onze gegevens zien dat reparatie van de DSB’s vaak foutief is. Interessant genoeg vonden we dat het spectrum van
&
geïntroduceerde indels tijdens reparatie in hoge mate afhankelijk is van de sequentie van het doelwit van de CRISPR. Dezelfde doelsequentie verwierf twee specifieke indels, die elk een apart mechanisme representeerde waarmee de breuk wordt hersteld. Door de indel- sequenties te bestuderen en een remmer te gebruiken konden we de gebruikte routes toekennen aan NHEJ en de microhomology-mediated end joining (MMEJ). Bovendien hebben we vastgesteld dat deze routes een verschillende reparatiekinetiek hebben. Daarom kan deze doelwitsequentie gebruikt worden als een verslaggever (reporter) van de voorkeur voor deze twee reparatiemechanismen.
In Hoofdstuk 6 onderzoeken we het effect van DNA-eiwitpakking op het knippen door Cas9 en de daaropvolgende reparatie. We hebben de reportersequentie van de reparatiemechanismen ingevoegd op ~1500 verschillende locaties in het genoom. De resultaten geven aan dat de chromatinestatus de indel-frequentie en de voorkeur van de herstelroute beïnvloedt. We hebben ontdekt dat DSB’s die dichtbij de periferie van de celkern gepositioneerd zijn (LAD's), vaker worden hersteld door de MMEJ-route dan DSB’s die dichterbij het centrum van de celkern worden gevonden (inter-LADs). In aanwezigheid van donor-DNA wordt de deelname aan het MMEJ-route meestal verminderd, hoewel DSB's in LAD's nog steeds met een hogere frequentie door MMEJ worden gerepareerd dan in inter-LAD's. Deze kwantitatieve analyses dragen bij aan een beter begrip van DSB-reparatie en de impact van chromatine op dit proces.
In Hoofdstuk 7 worden de resultaten besproken in het licht van de nieuwste ontwikkeling op het gebied van genoombewerking. Nieuwe onderzoeksstrategieën worden gepresenteerd die kunnen bijdragen aan een beter begrip van de invloed van de chromatineomgeving op het proces van herstel van een breuk in de dubbele streng.
ABBREVIATIONS
3C chromosome conformation capture
4-OHT 4-hydroxytamoxifen
A adenine
A-EJ alternative end joining
ATM ataxia telangiectasia-mutated protein
ATR ATM and Rad3-related kinase
BLESS in situ breaks labelling, enrichment on streptavidin, and next-generation sequencing
BLISS breaks labelling in situ and sequencing
bp base pair
C cytosine
Cas CRISPR-associated
ChIP chromatin immunoprecipitation
C-NHEJ classical non-homologous end joining
CRISPR clustered regularly interspaced short palindromic repeat
crRNA CRISPR RNA
CtIP CtBP-interacting protein
dCas9 catalytically dead Cas9
DDR DNA damage response
DNA-PK DNA-dependent protein kinase
DNMT DNA methyltransferase
Dox doxycycline
DSB double-strand break
FACS fluorescence activated cell sorting
G guanine
gDNA genomic DNA
GFP green fluorescent protein
gRNA guide RNA
H3K4me2 histone H3 dimethylation on lysine 4 H3K9me2 histone H3 dimethylation on lysine 9 H3K9me3 histone H3 trimethylation on lysine 9 H3K27me3 histone H3 trimethylation on lysine 27 H3K36me3 histone H3 trimethylation on lysine 36
H4K20 histone H4 lysine 20
HAT histone acetyltransferease
HDAC histone deacetylase
HDM histone demethylase
HDR homology directed repair
HMT histone methyltransferase
HP-1 heterochromatin protein 1
HR homologous recombination
&
indel insertions and deletions
IR ionizing radiation
IRES internal ribosome entry site
KAP-1 KRAB-associated protein 1
KI knock in
KO knock out
KRAB Kruppel-associated box domain
LAD lamina associated domain
LP landing pad
LM-PCR ligation-mediated PCR
Mb megabases
MMEJ microhomology-mediated end joining
MRN Mre11, Rad50, Nbs1
NGS next generation sequencing
NL nuclear lamina
Nm Neisseria meningitidis
PAM protospacer adjacent motif
PB PiggyBac
PuroR puromycin resistance cassette
RGENs RNA-guided endonucleases
RNAi RNA interference
RPA replication protein A
RPR repair pathway reporter
Sa Staphylococcus aureus
sgRNA single guide RNA
Sp Streptococcus pyogenes
ssDNA single-stranded DNA
ssODN single-stranded oligodeoxynucleotides
SSTR single-stranded template repair
St Streptococcus thermophiles
T thymine
TALEN transcription-activator-like effector nuclease
TIDE tracking of indels by decomposition
TIDER tracking of insertions, deletions and recombination events TRIP thousands of reporters integrated in parallel
U uracil
UMI unique molecular identifier
UTR untranslated region
tracrRNA transactivating CRISPR RNA
XLF XRCC4-like factor
XRCC4 X-ray cross-complementing protein 4
wt wild-type