Dit proefschrift richt zich op de fysiologische functie van de galzouttransporter NTCP. NTCP is een levercel-specifieke transporter met een sterke affiniteit voor geconjugeerde galzouten, en NTCP heeft een centrale rol in efficiënte enterohepatische circulatie van galzouten. Recent is ook ontdekt dat NTCP een toegangspoort is voor het hepatitis B virus (HBV) en hepatitis D virus (HDV). In dit proefschrift hebben we de functionele rol van NTCP in de enterohepatische kringloop van galzouten bestudeerd door een genetische Ntcp-knockout muis of door een farmacologische NTCP-remmer te gebruiken. Onze resultaten suggereren dat remming van de galzoutopname door de lever therapeutische toepassingen kan hebben bij bepaalde cholestatische aandoeningen. Bovendien wordt hepatobiliair cholesteroltransport gestimuleerd door NTCP-remming. De algemene inleiding (hoofdstuk 1) biedt achtergrondkennis over de enterohepatische circulatie van galzouten, de pathofysiologie van cholestase en de huidige kennis van galzoutsignalering in relatie tot metabole processen.
NTCP in de enterohepatische kringloop van galzouten
De belangrijkste observatie die in hoofdstuk 2 wordt beschreven is de sterke stijging van de geconjugeerde galzoutconcentraties in het plasma van Ntcp-knockout muizen, hetgeen bewijst dat NTCP cruciaal is voor hepatocellulaire opname van galzouten in vivo. Het is opvallend dat een subset van volwassen NTCP-knockout muizen normale plasma galzoutconcentraties heeft, maar alle NTCP-knockout muizen hebben 3,5x meer tijd nodig om een vaste hoeveelheid taurocholaat te klaren.
Het eerste kind met een homozygote NTCP-mutatie werd in 2015 beschreven (1). Steeds meer NTCP-deficiënte personen worden beschreven (2-4), bijvoorbeeld met de homozygote mutatie R252H of S267F. Geconjugeerde galzoutconcentraties zijn verhoogd in het bloed van NTCP-deficiënte kinderen (circa 100 µM tot iets boven 1 mM), hetgeen kan aanhouden tot en met de volwassen leeftijd. De NTCP-variant S267F is met name interessant, omdat personen met deze mutatie minder vatbaar blijken voor chronische HBV-infectie, en een lager risico hebben op een leverziekte (bijv. cirrose/HCC) (5-7).
We hebben aangetoond dat het synthetische lipopeptide myrcludex B specifiek bindt aan hepatocyten en NTCP van de muis remt (hoofdstuk 2). De specifieke NTCP-remmer myrcludex B wordt getest in klinische studies voor chronische hepatitis B/D-infectie (8). Voornamelijk glycine geconjugeerde galzoutspecies bleken verhoogd in het bloed (tot 200 µM), zonder ernstige bijwerkingen (9, 10). In een aanvullende fase IIb studie bleek dat het plasma ALAT daalde in 239 hepatitis B/D geïnfecteerde patiënten die behandeld waren met myrcludex B (11).
Na het kloneren en functioneel karakteriseren van NTCP en galzout-transporterende OATPs, werd gedacht dat geconjugeerde galzouten exclusief getransporteerd werden door
3). Simulatiestudies van galzoutdynamiek door Cravetto et al (13) voorspelden dat plasma- galzoutconcentraties alleen stijgen als de fractionele leverextractie grotendeels (>70%) wordt verminderd. Een dergelijke situatie blijkt alleen op te treden als NTCP functioneel afwezig is of volledig geremd is door myrcludex B en als OATP (1A1)-gemedieerd transport verstoord wordt.
De opname van geconjugeerde galzouten door individuele humane OATP-isovormen werd in vitro aangetoond (14). Echter, overexpressie van een enkele humane OATP-isovorm (OATP1B1) bij muizen, waardoor niet-geconjugeerde bilirubineconcentraties normaliseren, laten de plasma galzoutspiegels niet dalen. We moeten benadrukken dat humane OATPs niet ‘ortholoog’ zijn aan de tegenhangers in de muis; humaan OATP1A2 heeft vier ‘familieleden’ in de muis (Oatp1a1/1a4/1a5 en 1a6), en OATP1B1 en OATP1B3 worden beschouwd als Oatp1b2 in de muis. De toename van plasma galzouten na NTCP-remming zal sterk afhangen van de postnatale ontwikkeling van transporters (16) en van het dagelijkse ritme van de enterohepatische galzoutcirculatie, beiden duidelijk verschillend tussen muis en mens (17, 18).
Wij hebben de cellulaire regulatie van galzoutopnametransporters in de lever onderzocht om het fenotype van NTCP-deficiënte muizen te begrijpen. De remming van de instroom van galzouten onderdrukt direct FXR-signalering in de lever en induceert galzoutsynthese via CYP7A1 (hoofdstuk 3), wat wijst op een verminderde intracellulaire blootstelling aan galzouten. Echter, intestinale FXR-activatie keert dit fenomeen om doordat geconjugeerde galzouten de darmcellen binnenkomen via de basolaterale zijde van de cel (vermoedelijk via OST α/β), zoals blijkt bij NTCP-deficiënte en myrcludex B behandelde muizen. Intestinale FXR-activatie bevordert de afgifte van het hormoon FGF15/19, dat CYP7A1 onderdrukt in de lever (19). We hebben aangetoond dat FGF19 de expressie van de basolaterale levergalzouttransporters onderdrukt in vitro (hoofdstuk 3). Langdurige AAV-gemedieerde overexpressie van FGF19 in vivo onderdrukt ook verschillende leden van de hepatische galzoutopname-machinerie. Afwezigheid van OATP1A1 regulatie in dit model kan worden veroorzaakt door een kleinere galzoutpool (of gewijzigde galzoutsamenstelling), waardoor indirect de expressie van galzouttransporters verandert. Aanvullende studies zijn nodig om de volledige regulatie van deze transporters te ontrafelen.
De drempel voor Fgf15-afgifte uit ileocyten lijkt bij muizen makkelijker te worden bereikt door hoge (millimolaire) concentraties van galzouten in het bloed. Echter, galzoutverhogingen zijn minder prominent in de mens, bijvoorbeeld meestal <200 µM bij galafvloed-stenose (20). Plasma FGF19 concentraties waren niet verhoogd bij gezonde individuen die gedurende 1 week met myrcludex B waren behandeld. Echter, de plasma C4 concentraties waren wel laag bij het eerst beschreven kind met NTCP-deficiëntie. Species-geassocieerde verschillen tussen FGF15/19 kunnen ook cruciaal zijn voor de regulatieprocessen. FGF15 wordt exclusief in het ileum van de muis gevormd, terwijl FGF19 in opvallend hoge concentraties vrijkomt in de humane galwegboom tijdens cholestase (21).
NTCP-remming is veelbelovend gebleken in bepaalde vormen van cholestase
Ch
ap
ter 6
modellen van leverschade (bijvoorbeeld na behandeling met oestrogenen, LPS of BDL) (22- 24), maar galzouten kunnen nog steeds in de levercel worden opgenomen. In hoofdstuk 4 tonen wij aan dat farmacologische NTCP-remming tekenen van cholestase vermindert. Helaas bestaat er geen ideaal experimenteel model voor cholestase in de mens, dus er werden vier verschillende muismodellen gebruikt om de myrcludex B behandeling bij cholestase te evalueren. De meest opvallende gunstige effecten van NTCP-remming werden gevonden in het DDC-model, waar porfyrine-pluggen hepatocellulaire ontsteking en onvolledige obstructieve cholestase veroorzaken (25). NTCP-remming vertraagt de hepatocellulaire proliferatie, wat pleit voor verdere analyse van verlaging van hepatocellulaire galzoutconcentraties in het kader van FXR-FGF15/19-signalering en hepatocarcinogenese (26). Myrcludex B toediening in muizen waar de totale galafvloed was onderbroken (BDL) veroorzaakte extreem hoge plasma galzoutconcentraties (~4 mM) en snel gewichtsverlies, wat eigenlijk niet voorkomt bij de meeste menselijke vormen van cholestase. In ieder geval mag NTCP-remming niet worden gebruikt bij gevorderde obstructieve cholestase. De PFIC-muismodellen zijn nuttig voor het nabootsen van de menselijke pathofysiologie van intrahepatische cholestase, zowel hepatocellulair (PFIC1) als cholangiocellulair/hepatocellulair (PFIC3). We analyseerden de galsamenstelling in de verschillende modellen hierboven en vonden dat verhoogde MDR2-gemedieerde fosfolipide uitscheiding plaatsvindt na myrcludex B behandeling. We geloven dat gal minder toxisch wordt na myrcludex B behandeling door verbeterde micelvorming en ontgiftiging van galzouten.
Uiteindelijk resulteerde NTCP-remming in minder instroom van galzouten in levercellen dat I) de ontstekingsreactie vermindert en II) de galsamenstelling verandert door de verhouding fosfolipiden/galzouten te verhogen. Het belang van hepatocellulaire galzoutaccumulatie als aanjager van cholestatisch letsel werd onlangs onderstreept door de TLR9-afhankelijke chemokine-respons en activatie van intracellulaire schadesensoren (27). In de klinische praktijk veroorzaken bijvoorbeeld PPAR-agonisten (fibraten) gunstige effecten in PBC door toegenomen MDR3-gemedieerde fosfolipiden excretie (28).
Wanneer men overweegt NTCP-remming bij cholestatische aandoeningen toe te passen, lijken PBC en PSC geschikte kandidaat-ziektes te zijn voor fase II-onderzoeken met myrcludex B. Deze cholangiopathieën hebben in de vroege stadia verhoudingsgewijs milde plasma galzoutverhogingen in vergelijking met galwegocclusie door stenen, vernauwingen of tumoren (20, 29), met meestal langzame progressie. In een dergelijk scenario zijn dagelijkse myrcludex B-injecties subcutaan onpraktisch en is een orale formulering die de lever bereikt wenselijker (30). NTCP-remming moet worden overwogen in combinatie met middelen (bijv. samen met UDCA of ASBT-remmers) die hepatocellulaire en cholangiocyt- integriteit bevorderen (31).
In de lever is de uitscheiding van cholesterol in gal sterk gekoppeld aan de galzoutdynamiek, gecoördineerd door FXR/LXR-afhankelijke routes. Acute effecten van myrcludex B op de cholesteroluitscheiding in gal werden in hoofdstuk 5 bestudeerd. NTCP-remming induceerde zowel fosfolipide- als cholesteroluitscheiding in wildtype muizen.
We hebben een nieuw concept bedacht om de hyperexcretie van lipiden na NTCP-remming in gal te verklaren. NTCP komt vrij homogeen tot expressie in het gehele leverparenchym, maar OATP-isovormen die pericentraal tot expressie komen (m.n. OATP1B2 en 1A4) zorgen voor veel galzoutopname na NTCP-remming. Onze studie suggereert dat een shift van galzoutopname naar meer pericentrale hepatocyten na NTCP-remming lipide-uitscheiding in gal kan stimuleren door toegenomen blootstelling van de canaliculaire membraan aan galzouten.
Het is opvallend dat stimulatie van uitscheiding van cholesterol in gal na NTCP-remming slechts gedeeltelijk afhankelijk is van ABCG5/8 en SR-b1, de belangrijkste membraantransporters die verantwoordelijk zijn voor de cholesterolexcretie in gal. Andere studies m.b.t. lipidenflux in de gal toonden aan dat toediening van diosgenine de cholesterolexcretie sterk verhoogde (~16x in Fvb muizen), zonder significante verandering van galzout noch fosfolipide-output (33, 34). Het mechanisme waarmee diosgenine, een plantsterol die lijkt op de structuur van galzouten, cholesterolexcretie stimuleert is niet ontrafeld, maar een groter aanbod van cholesterol aan de Abcg5/8 transporter lijkt aannemelijk.
Verhoogde cholesteroluitscheiding in de gal zorgt voor verzadiging (zogenaamde lithogeneciteit) van gal, vooral als de fosfolipiden laag zijn (35). NTCP-remming in wildtype muizen verhoogd tegelijkertijd de fosfolipiden- en cholesteroluitscheiding, waardoor cholesterolverzadigingsindex nauwelijks wordt verhoogd. Cholesterolexcretie in gal werd ook niet geïnduceerd in de cholestatische modellen, waardoor de kans op cholesterol kristallisatie en vorming van galstenen niet groter wordt (maar dit is hier niet verder onderzocht). In ieder geval is de canaliculaire fosfolipide-uitscheiding door MDR2 nodig voor extractie van cholesterol in gal (36, 37). We hebben aangetoond dat cholesterol in gal vrijwel afwezig is in MDR2-deficiente muizen behandeld met myrcludex B.
Samenvattend, de data in dit proefschrift geeft een beter begrip van de opname van geconjugeerde galzouten via NTCP in de lever. Dit onderzoeksveld is in opmars sinds de ontdekking van NTCP-deficiëntie bij mensen en de ontwikkeling van specifieke NTCP-remmers. We hebben aangetoond dat het remmen van deze transporter gunstige effecten heeft op bepaalde vormen van cholestase. We identificeerden ook een opvallend effect op de lipiden-samenstelling in gal na NTCP-remming. Naast lopende studies m.b.t. NTCP in het HBV/HDV-veld, zal NTCP- remming in de toekomst als therapeutische strategie bij metabole stoornissen getest moeten worden.